ES2323888T3 - Biosensor electroquimico. - Google Patents
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Abstract
Un método para medir los niveles de glucosa en sangre, utilizando un biosensor electroquímico que se proporciona con una celda electroquímica de capa fina de tipo inverso, y dicha celda electroquímica de capa fina de tipo inverso consta de: un electrodo de trabajo (104) formado por un sustrato aislante plano (400); un electrodo auxiliar (105) formado por un sustrato aislante plano (300) separado de manera que se enfrenta al electrodo de trabajo (104); un electrodo para la determinación de la fluidez (107), situado a una distancia predeterminada del electrodo de trabajo (104) en el sustrato aislante plano (400, 300) utilizado para el electrodo de trabajo (104) o el electrodo auxiliar (105); un espaciador adhesivo (200), proporcionado con una parte para introducir la muestra (100) que tiene un microconducto, para separar espacialmente el electrodo de trabajo (104) y el electrodo auxiliar (105) al interponerse entre ellos; un electrodo conector (106), impreso con un material conductor grueso sobre una porción del electrodo auxiliar (105), para conectar de forma tridimensional el electrodo de trabajo (104) al electrodo auxiliar (105); y una capa de reactivo que contiene un mediador de transferencia de electrones y una enzima de oxidación, y dicho método consta de los pasos de: (1) introducir una muestra de sangre en la tira sensor insertada en el dispositivo de lectura; (2) aplicar respectivas diferencias de potencial predeterminadas entre el electrodo de trabajo (104) y el electrodo auxiliar (105), y entre el electrodo para la determinación de la fluidez (107) y el electrodo auxiliar (105); (3) provocar un primer cambio en la corriente entre el electrodo de trabajo (104) y el electrodo auxiliar (105) para permitir que estos electrodos tengan el mismo voltaje, a medida que se introduce la sangre; (4) detectar el flujo de la muestra de sangre con el electrodo de determinación de la fluidez (107) para provocar un segundo cambio en la corriente entre el electrodo auxiliar (105) y el electrodo de determinación de la fluidez (107) ajustando los voltajes del electrodo auxiliar (105) y el electrodo de determinación de la fluidez (107) al mismo valor, proporcionando así información sobre la diferencia de tiempo desde el cambio detectado por el electrodo de trabajo (104); (5) mezclar suficientemente la capa de reactivo con la muestra de sangre para aplicar un voltaje predeterminado entre el electrodo de trabajo (104) y el electrodo auxiliar (105) y provocar reacciones cíclicas en la celda electroquímica de capa fina de tipo inverso; y (6) determinar el nivel de glucosa en la muestra de sangre en base a la información de tiempo obtenida en el paso (4) y la corriente de estado estacionario obtenida en el paso (5).
Description
Biosensor electroquímico.
La presente invención está relacionada con un
método para medir los niveles de glucosa en sangre utilizando un
biosensor electroquímico.
Para el diagnóstico y profilaxis de la diabetes
mellitus, cada vez más se resalta la importancia de la
monitorización periódica de niveles de glucosa en sangre.
Actualmente, los biosensores de tipo tira diseñados para pequeños
aparatos de lectura portátil, que se basan normalmente en
colorimetría o electroquímica, permiten a los individuos monitorizar
fácilmente sus niveles de glucosa en sangre.
La electroquímica aplicada a los biosensores se
explica por la siguiente Fórmula de Reacción I, que representa la
utilización de un mediador de transferencia de electrones. Ejemplos
de mediadores de transferencia electrones incluyen: el ferroceno y
derivados del mismo, quininas y derivados de las mismas, metales de
transición que contengan compuestos orgánicos o inorgánicos, tales
como rutenio hexamina, polímeros que contengan osmio, ferricianida
de potasio, etc., sales orgánicas conductoras y viológeno.
Fórmula de Reacción
I
Glucosa +
GOx-FAD \rightarrow ácido glucónico +
GOx-FADH_{2} GOx-FADH_{2} +
M_{ox} \rightarrow GOx-FAD +
M_{red}
en la que, GOx representa oxidasa
de la glucosa; GOx-FAD y
GOx-FADH_{2} respectivamente representan un estado
oxidado y uno reducido de FAD asociado a glucosa (dinucleótido
flavina adenina), un cofactor requerido para la catálisis de la
oxidasa de la glucosa; y M_{ox} y M_{red} indican un estado
oxidado y uno reducido del mediador de transferencia de electrones,
respectivamente.
Como se muestra en la Fórmula de Reacción I, (1)
la glucosa en sangre se oxida a ácido glucónico por la catálisis de
la oxidasa de la glucosa, reduciéndose el cofactor FAD a FADH_{2}.
(2) Entonces, el cofactor reducido FADH_{2} transfiere electrones
al mediador, de forma que FADH_{2} vuelve a su estado oxidado, que
es FAD, y el mediador se reduce. El mediador reducido difunde a la
superficie de los electrodos. El potencial anódico aplicado al
electrodo de trabajo produce una serie de ciclos de reacción, y se
mide la corriente rédox, proporcional al nivel de glucosa.
Comparados con los biosensores basados en
colorimetría, los biosensores electroquímicos (por ejemplo, basados
en electroquímica) tienen la ventaja de no verse influenciados por
el oxigeno y de permitir el uso de muestras, incluso si son turbias,
sin pretratamiento de las mismas.
El documento G. Cui et al.,
Electroanalysis 2001 (13), 224 a 228, describe un sensor de glucosa
amperométrico de película de grosor diferencial con una membrana de
nitrocelulosa con enzima inmovilizada, en el que se utiliza
hexacianoferrato (III) como mediador.
El documento G. Cui et al., Talanta 54:
1105 a 1111 (2001), describe un electrodo sensor de glucosa
amperométrico desechable con una tira de nitrocelulosa con enzima
inmovilizada, en el que se utiliza cloruro de rutenio hexamina
(III) como mediador.
Aunque los biosensores electroquímicos son
cómodos para la monitorización y control de los niveles de glucosa
en sangre, su precisión depende enormemente de la presencia de
varias especies fácilmente oxidables, como ácido ascórbico,
acetaminofeno, ácido úrico, etc., en las muestras de sangre.
Otro importante sesgo de la medición resulta del
hematocrito sanguíneo (medida del volumen de glóbulos rojos como un
porcentaje del volumen total de sangre). Un sesgo dependiente del
nivel de hematocrito elevado puede conducir a juicios erróneos para
aquellos que regularmente deben monitorizar sus niveles de glucosa
en sangre con un biosensor desechable de tiras, posiblemente
causando incluso la muerte.
Se han sugerido métodos para reducir el sesgo de
la medición causado por el hematocrito sanguíneo, lo que incluye el
uso de una separación adicional de hematocrito; o una capa de
exclusión de eritrocitos dispensada en la capa del reactivo (JP
1134461, JP 2000338076 y US 5658444); un reactivo pantalla
imprimible/pasta para la separación de sangre formulada con una
matriz de sílice (US 6241862 B1), y un método de corrección
quimiométrico combinado con potenciales de doble excitación (WO
01/57510 A2).
Los métodos descritos, sin embargo, dificultan
la dispensación de los cócteles de reactivo en un electrodo de
trabajo, por lo que se requieren pasos extra durante el proceso de
manufacturación o una gran pérdida de reactivos para la impresión
de una capa de reactivo.
Para comodidad de los usuarios, es muy
importante medir con precisión los niveles de glucosa en una pequeña
muestra de sangre y en un corto periodo de tiempo utilizando un
biosensor. Una medida precisa en un volumen pequeño de muestra,
menos de 1 \mul, preferiblemente 0,5 \mul, o más preferiblemente
0,3 \mul, hace posible utilizar cualquier zona del cuerpo, por
ejemplo, el antebrazo, como lugar de extracción de sangre,
reduciendo así enormemente el dolor causado al paciente en las
extracciones de sangre.
El periodo de tiempo de respuesta para la medida
es preferiblemente de 10 s., más preferiblemente de 5 s. y más
preferiblemente de 3 s. Sin embargo, el objetivo deseable es casi
imposible de conseguir utilizando las técnicas conocidas hasta
ahora.
En el documento EP-A 1 186 778
se propuso un biosensor electroquímico apropiado para tales
mediciones, que consta de una composición de capas de reactivo que
puede reducir sustancialmente el sesgo de la medición procedente
del hematocrito, y otro en el documento US-A
2004/004.821, que consta de una parte para introducir la muestra
que incluye un conducto para introducir la muestra, un conducto de
descarga de aire y un vacío.
\vskip1.000000\baselineskip
Por lo tanto, es un objetivo de la presente
invención proporcionar un método para medir los niveles de glucosa
en sangre utilizando un biosensor, que pueda reducir notablemente el
sesgo de la medición que proviene del hematocrito en base a la
información de la fluidez de la muestra.
También es un objetivo de la presente invención
proporcionar un método para medir los niveles de glucosa en sangre
utilizando un biosensor, que disminuya la posibilidad de obtener
información incorrecta al excluir las muestras de sangre con una
fluidez anormalmente elevada o reducida.
También es un objetivo de la presente invención
proporcionar un método para medir los niveles de glucosa en sangre
utilizando un biosensor, que pueda detectar un cambio en la
velocidad de muestreo de la sangre causado por envejecimiento del
biosensor, proporcionando de ese modo información de control de
calidad tras la fabricación.
También es un objetivo de la presente invención
proporcionar un método para medir los niveles de glucosa en sangre
utilizando un biosensor, que permita que la muestra de sangre se
introduzca de forma rápida y constante, sin pretratamiento y se
analicen los niveles de glucosa en sangre de manera precisa y
rápida.
Los anteriores objetivos pueden lograrse
mediante la utilización de un método para medir los niveles de
glucosa en sangre, que utiliza un biosensor electroquímico que se
proporciona con una celda electroquímica de capa fina de tipo
inverso, y dicha celda electroquímica de capa fina de tipo inverso
consta de: un electrodo de trabajo formado por un sustrato aislante
plano, un electrodo auxiliar formado por un sustrato aislante plano
separado de forma que queda enfrentado al electrodo de trabajo, un
electrodo de determinación de la fluidez, situado a una distancia
predeterminada del electrodo de trabajo sobre el sustrato plano
aislante utilizado para el electrodo de trabajo o el electrodo
auxiliar, un separador adhesivo, que se proporciona con una parte
para la introducción de la muestra que tiene un
micro-conducto para separar espacialmente el
electrodo de trabajo y el electrodo auxiliar al interponerse entre
ellos; un conector de los electrodos, impreso con un material
conductor grueso en una porción del electrodo auxiliar, para
conectar de forma tridimensional el electrodo de trabajo al
electrodo auxiliar; y una capa de reactivo que contenga un mediador
de transferencia de electrones y una enzima de oxidación, cuyo
método consta de los pasos de: (1) introducir una muestra de sangre
en un dispositivo de lectura con un sensor de tira insertado; (2)
aplicar las respectivas diferencias de potencial predeterminadas
entre el electrodo de trabajo y el electrodo auxiliar y entre el
electrodo para la determinación de la fluidez y el electrodo
auxiliar; (3) provocar un primer cambio en la corriente entre el
electrodo de trabajo y el electrodo auxiliar permitiendo así que
esos electrodos tengan el mismo voltaje, mientras se introduce la
sangre; (4) detectar el flujo de la muestra de sangre con el
electrodo para la determinación de la fluidez para provocar un
segundo cambio en la corriente entre el electrodo auxiliar y el
electrodo para la determinación de la fluidez para ajustar el
voltaje del electrodo auxiliar y del electrodo de determinación de
la fluidez al mismo valor, proporcionando así información sobre la
diferencia de tiempo entre el cambio detectado por el electrodo de
trabajo; (5) mezclar de forma suficiente la capa de reactivo con la
muestra de sangre para que al aplicar un voltaje predeterminado
entre el electrodo de trabajo y el electrodo auxiliar provoque
reacciones cíclicas en la celda electroquímica de capa fina de tipo
inverso; y (6) determinar el nivel de glucosa en la muestra de
sangre en base a la información de tiempo obtenida en el paso (4) y
la corriente en el estado estacionario obtenida en el paso (5).
En este método, la muestra de sangre del paso
(1) oscila en volumen desde 0,1 a 0,7 \mul y se introduce en la
tira sensor sin pretratamiento.
En este método, las diferencias de potencial del
paso (2) son provocadas por un cambio eléctrico entre el electrodo
de trabajo y el electrodo auxiliar, y entre el electrodo de
determinación de la fluidez y el electrodo auxiliar tras la
aplicación de una corriente directa, una corriente alterna de baja o
alta frecuencia, una elevada impedancia o un pulso seleccionado de
entre ondas cuadradas, ondas piramidales, ondas semisinusoidales y
ondas Gaussianas.
En este método, el cambio eléctrico se atribuye
a un cambio en voltaje, corriente, impedancia o capacitancia.
\newpage
En este método, se evita que la muestra de
sangre y la capa de reactivo sufran reacciones rédox en el paso (3)
al controlar que el electrodo de trabajo y el electrodo auxiliar
tengan el mismo voltaje.
Preferiblemente, la parte del biosensor para
introducir la muestra contiene un conducto con una amplitud que
oscila de 0,5 a 2 mm y con una altura entre 50 a 250 \mum,
facilitando de ese modo la introducción de la muestra de
sangre.
En este método, la capa de reactivo que contiene
la enzima y el mediador de transferencia de electrones se forma en
el electrodo de trabajo o en el electrodo auxiliar.
En una realización preferible del método, la
capa de reactivo del biosensor se forma en el electrodo de trabajo
o el electrodo de determinación de la fluidez, o en ambos, y los dos
electrodos estén situados de forma que la constante de tiempo de la
corriente en estado estacionario esté entre 0,05 y 8,0, ambos
inclusive.
En una realización preferible del método, el
mediador de transferencia de electrones es cloruro de rutenio
hexamina (III), adaptado para facilitar la transferencia de
electrones de la enzima al aceptor final de electrones, y la capa
de reactivo además comprende un ácido graso o su sal y una sal de
amonio cuaternario, lo que reduce sustancialmente el sesgo
dependiente del nivel de hematocrito.
Según el método de la presente invención, una
muestra de sangre puede introducirse de manera rápida y constante,
sin pretratamiento y puede analizar los niveles de glucosa en sangre
de manera precisa en 5 s.
\vskip1.000000\baselineskip
La aplicación de las realizaciones preferidas de
la presente invención se entiende mejor en referencia a las figuras
que la acompañan, en las que se usan números de referencia para las
partes similares y correspondientes, en las que:
La Fig. 1 es una vista en perspectiva desmontada
que muestra una celda electroquímica de capa fina de acuerdo con
una realización preferible de la presente invención;
La Fig. 2 es una vista en perspectiva desmontada
que muestra un biosensor de tipo inverso de acuerdo con una
realización preferible de la presente invención;
La Fig. 3a es una vista en perspectiva
desmontada que muestra un biosensor electroquímico de tipo inverso
que se proporciona con una parte para introducir la muestra, en la
que se forma un electrodo de determinación de la fluidez en un
sustrato superior, de acuerdo con una realización preferible de la
presente invención;
La Fig. 3b es una vista en perspectiva
desmontada que muestra un biosensor electroquímico de tipo inverso
que se proporciona con una parte para introducir la muestra, en la
que se forma un electrodo de determinación de la fluidez en un
sustrato inferior, de acuerdo con una realización preferible de la
presente invención;
La Fig. 4a es una vista del plano de un
dispositivo de lectura bidireccional con una tira sensor
insertada;
La Fig. 4b es un diagrama de un circuito interno
que ilustra el proceso de la operación de un biosensor de acuerdo
con una realización preferible de la presente invención;
La Fig. 5 es un voltamograma cíclico de un
biosensor de tipo inverso de acuerdo con una realización preferible
de la presente invención;
La Fig. 6 es una gráfica cronoamperométrica que
muestra una comparativa entre el tiempo de respuesta de un
electrodo de tipo inverso de acuerdo con una realización preferible
de la presente invención y un electrodo de tipo plano;
La Fig. 7 es una gráfica cronoamperométrica que
muestra los resultados de tiempo de respuesta de un electrodo de
tipo inverso de acuerdo con una realización preferible de la
presente invención a varias concentraciones de glucosa;
La Fig. 8 es una gráfica que muestra la
influencia de los componentes de interferencia en un electrodo de
tipo inverso de acuerdo con una realización preferible de la
presente invención;
La Fig. 9 es una gráfica que muestra una curva
de calibración de un sensor de glucosa de tipo inverso con la
sensibilidad a una solución estándar de glucosa;
La Fig. 10 es una gráfica que muestra las curvas
dinámicas, obtenidas mediante un método cronoamperométrico, de un
sensor de glucosa de tipo inverso para las soluciones estándar de
glucosa; y
La Fig. 11 es una gráfica que ilustra la
relación entre la fluidez de la muestra (como función del tiempo) y
el nivel de hematocrito.
Debe hacerse referencia a las figuras, en las
que se usan los mismos números de referencia en las diferentes
figuras para designar los componentes iguales o similares.
El biosensor para medir los niveles de glucosa
en sangre de acuerdo con la presente invención tiene una celda
electroquímica de capa fina en la que un electrodo de trabajo 104 y
un electrodo auxiliar 105, respectivamente formados en dos
sustratos aislantes planos, se separan espacialmente el uno del otro
por un espaciador adhesivo por presión de 50-250
\mum de grosor, se encuentran enfrentados simétricamente o
asimétricamente, y se conectan eléctricamente el uno al otro a
través de una línea de conexión formada junto con el electrodo de
trabajo 104 en el mismo sustrato, siendo la línea de conexión de un
material conductor grueso impreso en una porción del mismo y
conectado de forma tridimensional al electrodo auxiliar 105 (ver:
Converse-type electrodes: E. K. Bauman et
al., Analytical Chemistry, Vol. 37, pág. 1378, 1965; K. B.
Oldham en "Microelectrodes: Theory and Applications," Kluwer
Academic Publishers, 1991).
En el espaciador fino, se proporciona un
micro-recorrido en escala de volumen de microlitos
para la inyección de la muestra de sangre en el espacio de
medición, definido por el electrodo de trabajo 104 y el electrodo
auxiliar 105, y que retiene la muestra en su interior. En el
espaciador fino, se coloca el electrodo de determinación de la
fluidez preferiblemente a una distancia predeterminada tal del
electrodo de trabajo (o del electrodo auxiliar 105) que la sangre
fluorada con un volumen corpuscular del 40% puede alcanzar el
electrodo de trabajo (o el electrodo auxiliar) a lo largo del
micro-recorrido de 0,5-2 mm de ancho
y 50-250 \mum de alto en unos 600 ms., y más
preferiblemente a una distancia predeterminada tal del electrodo de
trabajo (o del electrodo auxiliar 105) que la sangre no fluorada
puede alcanzar el electrodo a lo largo del
micro-recorrido de 0,5-2 mm de
ancho y 50-250 \mum de alto en 300 ms., y aún más
preferiblemente en 200 ms.
Con referencia a la Fig. 3a, se muestra un
biosensor de tipo inverso de acuerdo con una realización de la
presente invención en el que un electrodo de trabajo 104, formado
con un electrodo determinante de la fluidez 107 en el mismo
sustrato, se enfrenta a un electrodo auxiliar 105, que funciona como
electrodo de referencia, formado en un sustrato separado. La Fig.
3b muestra un biosensor de tipo inverso de acuerdo con otra
realización de la presente invención, en el que un electrodo
auxiliar, que funciona como electrodo de referencia, junto con un
electrodo de determinación de la fluidez 107 en el mismo sustrato,
se enfrenta a un electrodo de trabajo 104.
El biosensor tiene una estructura en la que
puede formarse una composición de capas de solución de reactivo en
el electrodo de trabajo 104 o en el electrodo auxiliar 105, y
preferiblemente en el electrodo de determinación de la fluidez 107,
así como en el electrodo de trabajo 104 o el electrodo auxiliar
105.
Como se muestra en la Fig. 3a, el biosensor
electroquímico de acuerdo con una realización de la presente
invención consta de un sustrato inferior 400 con el cual se
construyen el electrodo de trabajo y el electrodo de determinación
de la fluidez, ambos recubiertos con una composición de capas de
solución de reactivo, y un conector de electrodos 106, fabricado en
un material conductor, para conectar de forma tridimensional el
electrodo de trabajo con el electrodo auxiliar; un sustrato
intermedio (espaciador fino) que se proporciona con el patrón de una
parte para introducir la muestra 100, que consta de una indentación
para introducir la muestra 101, un canal de descarga de aire 102 y
un espacio extra vacío, en el que la indentación para introducir la
muestra se cruza con el canal de descarga de aire, dejando el
espacio vacío en el cruce; y se construye un sustrato superior 300
en el que el electrodo auxiliar 105, que funciona como un electrodo
de referencia, junto con un conector de electrodos 106, en una
posición que corresponde a la del electrodo de determinación de la
fluidez del sustrato inferior, realizándose capas de todos los
sustratos citados en orden secuencial de forma que la estructura
del sustrato superior se enfrenta con la del sustrato inferior, y en
el que una capa de reactivo se forma preferiblemente en el
electrodo de trabajo 104 solo o en combinación con el electrodo de
determinación de la fluidez.
Particularmente, la capa de reactivo que
contiene una enzima y un mediador de transferencia de electrones
puede formarse sólo en el electrodo de trabajo 104 o en el electrodo
auxiliar mientras los dos electrodos están dispuestos de manera que
"la constante de tiempo de la corriente en estado estacionario"
(definida como una proporción entre producto del coeficiente de
difusión del mediador de transferencia de electrones y una
corriente de estado estacionario, y el cuadrado del espacio entre
los dos electrones) está entre 0,05 y 8,0, ambos inclusive.
Opcionalmente, la capa de reactivo también puede contener un ácido
graso y una sal de amonio cuaternario.
Por la línea de conexión entre el electrodo de
trabajo 104 y el electrodo auxiliar 105, se conecta un dispositivo
de lectura con el biosensor en el mismo sustrato que el electrodo de
trabajo 104. También se forma un electrodo de determinación de la
fluidez 107, posicionado sobre el sustrato de aislamiento del
electrodo de trabajo 104 o el sustrato de aislamiento del electrodo
auxiliar 105, que funciona en la medición de la fluidez de la
muestra, a una distancia apropiada del electrodo de trabajo 104 o
del electrodo auxiliar 105.
En un extremo del espaciador y para separar
espacialmente el electrodo de trabajo 104 del electrodo auxiliar
105, se forma una parte para introducir la muestra 100 para que se
introduzca una cantidad constante de muestra en el biosensor a
través de la misma. En detalle, la parte para introducir la muestra
100 consta de una indentación para introducir la muestra 101, un
canal de descarga de aire 102 y un espacio extra vacío 103. La
indentación para introducir la muestra 101 se cruza con el canal de
descarga de aire 102 por debajo del final de la indentación, con el
espacio extra vacío formado en el cruce. La parte para introducir la
muestra 100, formada por lo tanto con forma de r, permite que se
introduzca la muestra de sangre desde el inicio de la tira del
biosensor de forma precisa y cómoda. De manera notable, la
indentación para introducir la muestra 101 se comunica con el canal
de descarga de aire 102 de forma aproximadamente perpendicular,
ligeramente por debajo del final del canal en forma de indentación,
formando el espacio extra vacío 103 detrás del punto de
comunicación. El término "se cruza con" como se utiliza aquí
significa que la indentación para introducir la muestra 101 y el
canal de descarga de aire 102 no están situados de forma lineal,
sino que se cruzan el uno con el otro en un punto predeterminado.
Durante la medición, el espacio extra vacío 103 ayuda a mantener un
volumen constante y preciso de la muestra de sangre en la
indentación mientras se descarga el exceso de muestra a través del
canal de descarga de aire 102. Además, el espacio extra vacío 103
sirve para prevenir la formación de burbujas de aire, que a menudo
pueden ocurrir en el punto de comunicación entre la indentación para
introducir la muestra 101 y el canal de descarga de aire 102. La
formación de burbujas de aire puede ocasionar medidas imprecisas.
Para asegurar un muestreo exacto sin la formación de burbujas, se
requiere un tratamiento hidrofílico de la indentación para
introducir la muestra 101, incluyendo el espacio extra vacío
103.
La proporción entre la amplitud del canal de
descarga de aire 102 y la de la indentación para introducir la
muestra 101 no es superior a 1:2, y preferiblemente está en el rango
de 1:5 a 1:2. Una proporción inferior a 1:2 asegura la contención
de una cantidad exacta de muestra en la indentación para introducir
la muestra 101, y permite que la muestra avance al canal de
descarga de aire 102 a gran velocidad.
En la Fig. 1, se muestra que el ángulo de
comunicación (\Phi) entre la indentación para introducir la
muestra 101 y el canal de descarga de aire 102 es de 90º. Pero el
ángulo puede variar en un rango de entre alrededor de 45º y 135º,
preferiblemente en un rango de entre alrededor de 60º y 105º, y más
preferiblemente en un rango de entre alrededor de 75º y 105º.
La parte para introducir la muestra 100
preferiblemente tiene una capacidad para retener
0,1-3,0 \mul de muestra. Más preferiblemente, la
capacidad está en el rango de entre 0,1 y 1,0 \mul, y más
preferiblemente en el rango de entre 0,3 y 0,7 \mul. Un volumen
de muestra inferior a 0,1 \mul es demasiado reducido para dar una
medida precisa en el rango de error del biosensor. Por otro lado, un
volumen de muestra superior a 3,0 \mul es excesivo para el
muestreo. La indentación para introducir la muestra 101 se utiliza
como el lugar en el que se posiciona el electrodo de determinación
de la fluidez 107.
En cooperación con la parte para introducir la
muestra 100 y el recorrido, el electrodo de determinación de la
fluidez 107 actúa para medir la fluidez de las muestras de sangre
total. Como el hematocrito cambia la fluidez y la conductividad
eléctrica de la sangre total, el tiempo de muestro a través del
conducto capilar en forma de \Gamma indicado en la presente
invención varía proporcionalmente con el nivel del hematocrito de
las muestras de sangre total. El cambio en la fluidez de las
muestras de sangre, que se detecta mediante el electrodo de
determinación de la fluidez 107, puede usarse para corregir el sesgo
dependiente del nivel de hematocrito en las medidas de glucosa en
sangre. Asimismo, la fluidez de la sangre cambia enormemente en una
tira vieja o en el caso que la capa de reactivo formada en el
electrodo de trabajo 104 tenga una composición inapropiada. Por lo
tanto, la tasa de flujo de sangre detectada por el electrodo de
determinación de la fluidez 107 puede usarse para estimar el tiempo
de fabricación del biosensor o para corregir cualquier error
cometido durante la fabricación del mismo.
Al pasar una muestra de sangre por el electrodo
de trabajo 104 y el electrodo de determinación de la fluidez 107,
estén en orden secuencial o en orden inverso, desde la entrada de la
celda electroquímica de capa fina, provoca en dos ocasiones un
cambio eléctrico en el voltaje, corriente, impedancia o
capacitancia, proporcionando información sobre el periodo de tiempo
necesario para el paso de la muestra a través del conducto. Por lo
tanto, aprovechando la medida de la velocidad del flujo de una
muestra en el micro-recorrido de la celda
electroquímica de capa fina, el biosensor tiene la función de
determinar de manera precisa el nivel de un sustrato en la muestra
o dar información sobre el año de su fabricación o de errores.
Además, el biosensor de la presente invención
puede proporcionarse con una ventana de visualización 301 en el
sustrato superior 300, que se localiza sobre una porción del
electrodo de determinación de la fluidez en el sustrato inferior.
La ventana 301 hace posible que se determine visualmente si se ha
cargado muestra o no.
En la estructura del electrodo descrito
anteriormente, la corriente alcanza un estado estacionario en pocos
segundos debido al efecto cíclico de las reacciones rédox producidas
por una enzima, un sustrato contenido en la muestra, y un mediador
de transferencia de electrones. En este aspecto, la capa de reactivo
formada en el electrodo de trabajo o en el electrodo auxiliar ha de
disolverse fácilmente en la muestra introducida a través del canal
de la muestra.
Cuando se utiliza a una concentración correcta,
el cloruro de rutenio hexamina (III) puede transferir electrones
decenas de veces más rápido que los mediadores de transferencia de
electrones basados en Fe. De acuerdo con la presente invención, la
capa de reactivo se fabrica con una composición que consta de
cloruro de rutenio hexamina (III), un ácido graso, una sal de
amonio cuaternario, y un dispersante de enzima auxiliar, que se
disuelve fácilmente en la sangre y es capaz de reducir
sustancialmente el sesgo dependiente del nivel de hematocrito.
Por lo tanto, el biosensor de la presente
invención consta de una solución de una composición de reactivo en
capas capaz de reducir el error de la medición atribuido al nivel de
hematocrito de la sangre. Es decir, la solución de una composición
de reactivo en capas comprende una enzima, un mediador de
transferencia de electrones, un polímero soluble en agua, un ácido
graso y una sal de amonio cuaternario.
En el biosensor, la solución de una composición
de reactivo en capas funciona reduciendo notablemente el efecto del
hematocrito además de excluir la influencia de componentes de
interferencia tales como el ácido ascórbico, acetaminofeno y ácido
úrico.
Como se puede observar en la Fórmula de Reacción
I, la enzima reacciona con un metabolito de interés, reduciéndose
el cofactor. Entonces, el cofactor reducido transfiere electrones al
mediador de transferencia de electrones, analizando así
cuantitativamente el metabolito de interés.
Aquí, debe hacerse notar que la presente
invención, aunque se ha descrito en relación con los biosensores
para el análisis de niveles de glucosa en sangre, puede introducir
los enzimas y mediadores de transferencia de electrones apropiados
al sistema de electrodos para que puedan analizarse
cuantitativamente una gran variedad de muestras, lo que incluye
materiales biológicos, como metabolitos, por ejemplo, colesterol,
lactato, creatinina, proteínas, peróxido de hidrógeno, alcoholes,
aminoácidos, y enzimas, por ejemplo, la GPT (transaminasa de
glutamato piruvato) y la GOT (transaminasa de glutamato
oxaloacetato), materiales ambientales, materiales agrícolas e
industriales y materiales alimentarios. Es decir, puede analizarse
el nivel de metabolitos versátiles una vez se han seleccionado
enzimas apropiados conjuntamente con un mediador de transferencia de
electrones. Por ejemplo, del mismo modo que se utiliza la oxidasa
de la glucosa para el análisis cuantitativo del nivel de glucosa,
puede aplicarse la oxidasa del lactato para el lactato, la oxidasa
del colesterol para el colesterol, la oxidasa del glutamato para el
glutamato, la peroxidada de rábano picante para el peróxido de
hidrógeno, y la oxidasa de alcohol para el alcohol.
Preferiblemente, la enzima apropiada para su utilización en la
presente invención se selecciona del grupo que consta de GOx
(oxidasa de la glucosa), GDH (deshidrogenasa de la glucosa),
oxidasa del colesterol, la enzima esterasa del colesterol, la
oxidasa del lactato, oxidasa del ácido ascórbico, oxidasa del
alcohol, deshidrogenasa del alcohol, oxidasa de la bilirrubina,
deshidrogenasa de la glucosa. En los ejemplos de la presente
invención, el biosensor empleó la oxidasa de la glucosa o
deshidrogenasa de la glucosa para analizar los niveles de glucosa
en sangre.
Cuando reacciona con el cofactor de la enzima
reducido, el mediador de transferencia de electrones se reduce. La
difusión del mediador de transferencia de electrones reducido a la
superficie de los electrodos provoca la aplicación de un potencial
anódico al electrodo de trabajo, generando electricidad.
Como mediador de transferencia de electrones,
puede usarse el ferroceno o sus derivados, quinona o sus derivados,
sales conductoras orgánicas o viológeno. Preferiblemente, el
mediador de transferencia de electrones es un compuesto de valencia
mixta capaz de formar una pareja rédox, lo que incluye cloruro de
rutenio hexamina (III), ferricianida de potasio, ferrocianida de
potasio, DMF (dimetilferroceno), ferricino, FCOOH (ácido ferroceno
monocarboxílico), TCNQ
(7,7,8,8-tetracianoquinodimetano), TTF
(tetratiafulvaleno), Nc (niqueloceno), NMA+
(N-metilacidino), TTT (tetratiatetraceno), NMP+
(N-metilfenazino), hidroquinona, MBTHDMAB (ácido
3-dimetilaminobenzoico),
3-metil-2-benzotiozolinona
hidrazona,
2-metoxi-4-alilfenol,
AAP (4-aminoantipirina), dimetilanilina,
4-aminoantipireno, 4-metoxinaftol,
TMB (3,3',5,5'-tetrametilbencidina),
2,2-azino-di-[sulfonato de
3-etilbenziazolina], o-dianisidina,
o-toluidina, 2,4-diclorofenol,
4-aminofenazona, bencidina y azul Prusiano.
De estos, es preferible el cloruro de rutenio
hexamina (III) porque su potencial formal es suficientemente bajo
como para minimizar la influencia de varios componentes de
interferencia, tales como ácido ascórbico, acetaminofeno y ácido
úrico.
El polímero soluble en agua que ayuda a la
reacción de la enzima está contenido en una cantidad de entre el
0,1 y 10% en peso del peso total de la solución de una composición
de reactivo en capas en estado sólido. Ejemplos de polímeros
solubles en agua apropiados para su utilización en la presente
invención incluyen PVP (polivinilpirrolidona), PVA
(polivinilalcohol), perfluorosulfonato, HEC (hidroxietilcelulosa),
HPC (hidroxipropilcelulosa), CMC (carboximetilcelulosa), acetato de
celulosa y poliamidas, con preferencia por la PVP y HPC.
En la solución de una composición de reactivo en
capas de la presente invención se encuentran un ácido graso y una
sal de amonio cuaternario, representando un importante papel en la
reducción del sesgo dependiente del nivel de hematocrito.
Cuando se utiliza, un ácido graso tiende a
acortar el rango lineal dinámico de un biosensor, especialmente en
la región de elevada concentración, además de ayudar enormemente a
reducir el sesgo dependiente del nivel de hematocrito.
Antes de añadirse a la solución, se disuelve el
ácido graso en agua o en un solvente miscible en agua. El ácido
graso se utiliza en una cantidad de entre el 0,1 y 20% en peso del
total de componentes sólidos de la solución. Será apropiado un
ácido graso que contenga de 4 a 20 átomos de carbono o su sal. Es
preferible un ácido graso saturado con una cadena alquilo de
6-12 carbonos o su sal. Ejemplos de ácidos grasos
apropiados para su utilización en la presente invención incluyen el
ácido caproico, ácido heptanoico, ácido caprílico, ácido nonanoico,
ácido cáprico, ácido undecanoico y ácido láurico, ácido
tridecanoico, ácido mirístico, ácido pentadecanoico, ácido
palmítico, ácido heptadecanoico, ácido esteárico, ácido
nonadecanoico y ácido araquidónico.
En cooperación con el ácido graso, una sal de
amonio cuaternario puede reducir aun más el sesgo dependiente del
nivel de hematocrito.
Un ejemplo de sal de amonio cuaternario
apropiada son los compuestos haluro de dodeciltrimetilamonio,
miristiltrimetilamonio, cetiltrimetilamonio,
octadeciltrimetilamonio, tetrahexilamonio, etc. La sal de amonio
cuaternario se utiliza en una cantidad de entre el 0,1 y 30% en
peso del total de componentes de la solución de una composición de
reactivo en capas.
La capa de reactivo se forma en el electrodo de
trabajo simplemente dispensando una gota de la solución de una
composición de reactivo en capas con ayuda de un dispensador. La
gota de la composición de reactivo en capas es preferiblemente de
unos 300-500 nl o más preferiblemente 200 nl o
menos.
A continuación se proporcionará una descripción
de un método de medición de los niveles de glucosa en sangre
utilizando el biosensor de la presente invención. El método se
realiza de acuerdo con los siguientes pasos, utilizando un
dispositivo de lectura al que se le aplica una tira de sensor 509
como se muestra en la Fig. 4a. El concepto operativo del biosensor
está ilustrado esquemáticamente en el diagrama del circuito de la
Fig. 4b.
En el paso 1, una muestra de sangre tomada del
antebrazo se introduce en el dispositivo de lectura 500 en el que
se inserta la tira de sensor (celda electroquímica de capa fina)
509.
Un volumen de muestra apropiada para ensayo
cuantitativo con mínimo dolor para el paciente está en el rango de
entre 0,1 y 0,7 \mul. El biosensor de la presente invención no
sólo no requiere tratamiento de la muestra de sangre para el
análisis, sino que también permite una medida precisa y rápida de
los niveles de glucosa en sangre. Esto es atribuible parcialmente
al conducto que oscila entre 0,5 y 2 mm de anchura y entre 50 y 250
\mum de altura, y que se forma en la parte para introducir la
muestra 100 del biosensor, de forma que facilita la introducción de
las muestras de sangre mediante acción capilar.
En el paso 2, se dan respectivamente diferencias
en el potencial constante entre el electrodo de trabajo 104 y el
electrodo auxiliar 105, y entre el electrodo para determinar la
fluidez 107 y el electrodo auxiliar 105.
Tan pronto como el biosensor detecta la
inserción de la tira del biosensor en el dispositivo de lectura
(Paso 1), se aplican potenciales constantes predeterminados entre
el electrodo de trabajo 104 y el electrodo auxiliar 105, y entre el
electrodo de determinación de la fluidez 107 y el electrodo auxiliar
105. El potencial aplicado al electrodo de trabajo 104 es
independiente del aplicado al electrodo auxiliar 107, formando el
circuito total un circuito abierto. El cambio eléctrico relacionado
con la introducción de la muestra se convierte en una diferencia de
potencial en un estado de circuito abierto y la señal de diferencia
de potencial se utiliza como señal de inicio en el curso de la
medición del biosensor.
La capa de reactivo que contiene una enzima y un
mediador de transferencia de electrones se forma sobre el electrodo
de trabajo 104 o el electrodo auxiliar 105, y estos electrodos se
sitúan a una distancia tal que la constante de tiempo de la
corriente en estado estacionario está en el rango de entre 0,05 y
8.0. Para la medida de los niveles de glucosa en sangre, se emplea
la GOx (oxidasa de la glucosa) o GDH (deshidrogenasa de la glucosa)
en el biosensor. Además se selecciona el cloruro de rutenio hexamina
(III) como mediador de transferencia de electrones. Por la razón
mencionada anteriormente, la capa de reactivo puede contener un
ácido graso y una sal de amonio cuaternario.
La solución de una composición de reactivo en
capas se dispensa sólo en el electrodo de trabajo 104, o tanto en
el electrodo de trabajo 104 como en el electrodo que determina la
fluidez 107, y estos electrodos se sitúan preferiblemente a una
distancia tal que la constante de tiempo de la corriente en estado
estacionario está en el rango de entre 0,05 y 8,0.
En el paso 3, la introducción de la muestra de
sangre provoca un cambio eléctrico primario entre el electrodo de
trabajo 104 y el electrodo auxiliar 105, y se controla que los
electrodos tengan el mismo voltaje. Para conseguir el mismo
voltaje, se permite que fluya una corriente entre ellos mientras la
reacción rédox entre la muestra y la capa de reactivo se limita
unos pocos segundos. La limitación de la reacción rédox se mantiene
de forma continua durante entre 0,001 y 3 s.
La inserción de la tira en el dispositivo de
lectura no conduce a la conexión del circuito total. Cuando una
muestra de sangre se introduce a través de la parte para introducir
la muestra 100, se detecta el flujo de una corriente primaria
instantánea y se inicia la medida del periodo de tiempo de flujo. La
muestra introducida a la boca del conducto de la tira contiene
electrolitos, que sirven para iniciar el circuito de flujo de
corriente entre el electrodo de trabajo 104 y el electrodo auxiliar
105 a través del conector de electrodos que hay entre ellos.
Igualando el voltaje entre el electrodo de trabajo 104 y el
electrodo auxiliar 105, la corriente limita la reacción rédox de la
muestra durante el periodo de tiempo en el que la muestra se mezcla
con la capa de reactivo, preferiblemente durante 3 s. y más
preferiblemente durante 2 s. o menos. Durante este paso, el
circuito permanece cerrado.
En el Paso 2, cuando contacta la muestra de
sangre, el electrodo que determina la fluidez 107 detecta su fluidez
para provocar un cambio eléctrico secundario, que conduce a un
control en el mismo voltaje entre el electrodo auxiliar 105 y el
electrodo que determina la fluidez 107. Por lo tanto, se detecta la
información sobre la diferencia de tiempo entre el cambio eléctrico
primario y el secundario.
Tan pronto como la muestra contacta con el
espacio extra vacío 103, se detecta una segunda corriente
instantánea y se registra el espacio de tiempo entre la primera y
la segunda corriente instantánea. En detalle, cuando se ha
introducido en la boca de la celda electroquímica de capa fina, la
muestra pasa por el electrodo de trabajo 104 y el electrodo que
determina la fluidez 107 en orden secuencial o en orden inverso,
provocando dos veces un cambio eléctrico en voltaje, corriente,
impedancia o capacitancia, lo que conduce a la información sobre el
periodo de tiempo de flujo de la muestra a través del conducto.
El electrodo que determina la fluidez 107 se
posiciona preferiblemente a una distancia predeterminada del
electrodo de trabajo 104 de forma que la sangre fluorada con un
volumen corpuscular del 40% puede alcanzar el electrodo de trabajo
a lo largo del conducto de 0,5-2 mm de ancho y de
50-250 \mum de alto, en unos 600 ms. y que la
sangre no fluorada puede alcanzar el electrodo a lo largo del
conducto de 0,5-2 mm de ancho y de
50-250 \mum de alto, en unos 300 ms. y más
preferiblemente en 200 ms.
Junto al electrodo que determina la fluidez 107,
la parte para introducir la muestra 100 y el conducto forman una
estructura apropiada para medir la fluidez de las muestras de sangre
total. La fluidez de una muestra se determina como una función de
la velocidad a la que la muestra llena el espacio entre el primer
punto de contacto del electrodo cerca de la boca de la parte para
introducir la muestra 100 y el electrodo que determina la fluidez
107, que se localiza en el vacío 103 o en el canal de descarga de
aire 102.
El conducto formado en el espaciador fino de
50-250 \mum de grosor consta de una indentación
lineal para la introducción de la muestra 101, en la que se
mantiene un volumen constante de muestra, y un canal de descarga de
aire 102 que colabora en la acción capilar de la parte para
introducir la muestra 100. Como el hematocrito cambia la fluidez y
la conductividad eléctrica de la sangre total, el periodo de tiempo
del paso de la sangre a través del canal capilar en forma de
\Gamma de la tira biosensor varía proporcionalmente con el nivel
de hematocrito en las muestras de sangre total. Una vez detectadas
por el electrodo que determina la fluidez 107, tales variaciones en
la fluidez de las muestras de sangre pueden usarse para corregir el
sesgo dependiente del nivel de hematocrito en las medidas de
glucosa en sangre. Además, la fluidez de la sangre cambia
enormemente en una tira vieja o en el caso que la capa de reactivo
formada en el electrodo de trabajo 104 tenga una composición
inapropiada. Por consiguiente, la tasa de flujo de sangre detectada
por el electrodo que determina la fluidez 107 puede usarse para
estimar el tiempo en que se fabricó el biosensor o para corregir un
error cometido durante la fabricación del mismo.
A continuación se proporciona una ecuación de
ajuste entre el tiempo de llenado de la muestra X y el nivel de
hematocrito Y:
Fórmula
Matemática
Y = -72.23 +
0.58691X – 0.00084073 X^{2} - 1.1211x10^{-6} X^{3} +
5.7521x10^{-9} X^{4} - 9.1172x10^{-12}
X^{5}
El electrodo que determina la fluidez 107
distingue la fluidez anormal de las muestras de sangre, que puede
resultar de un hematocrito demasiado alto o bajo de las muestras de
sangre o de la introducción de una burbuja en la muestra de sangre.
En tales casos anormales, aparecen mensajes de alerta o códigos de
error de acuerdo con el programa instalado en el dispositivo de
lectura.
En el Paso 5, cuando la muestra de sangre se ha
mezclado suficientemente con la capa de reactivo en el electrodo de
trabajo 104, se aplica un voltaje predeterminado entre el electrodo
de trabajo 104 y el electrodo auxiliar 105 provocando de ese modo
reacciones cíclicas en la celda electroquímica de capa fina de tipo
inverso, seguidas de la lectura de la corriente en estado
estacionario así obtenida. El estado estacionario se alcanza en
segundos, por ejemplo, 2-10 s. Comparado con los
electrodos de tipo plano convencionales, los electrodos de tipo
inverso de la presente invención tienen ventajas en términos de
tiempo de respuesta rápido y de elevada corriente en estado
estacionario. Aunque depende de la tasa de reacción y de la tasa de
transferencia de electrones del mediador de transferencia de
electrones utilizado, los electrodos de tipo inverso proporcionan
corrientes de estado estacionario en poco tiempo.
En el Paso 6, aprovechando la información de
tiempo obtenida en el Paso 4 y la corriente de estado estacionario
obtenida en el Paso 5, el biosensor determina el nivel del sustrato
en la muestra. De acuerdo con la presente invención, la medida de
los niveles de glucosa en sangre se realiza en 5, preferiblemente en
4 s., y más preferiblemente en 3 s.
Como se ha descrito anteriormente, la medida de
los niveles de glucosa en sangre de acuerdo con la presente
invención se consiguen sometiendo el analito de interés procedente
de la sangre a ciclos continuos de reacciones rédox con la ayuda de
una enzima apropiada y un mediador de transferencia de electrones, y
luego determinando la cantidad de electrones transferidos durante
las reacciones para analizar cuantitativamente el sustrato. Además,
la información sobre la velocidad a la que la muestra fluye a través
del micro-recorrido de la celda electroquímica de
capa fina ayuda a determinar con bastante más precisión la cantidad
de sustrato y a obtener información sobre la fabricación o estado
de almacenamiento del biosensor.
Alternativamente, los Pasos 1 a 6 pueden
modificarse como sigue:
(1) Se introduce una muestra de sangre en la
tira insertada del dispositivo de lectura (Paso 1).
(2) Se aplican voltajes alternos con altas
frecuencias constantes entre el electrodo de trabajo 104 y el
electrodo auxiliar 105, y entre el electrodo que determinan la
fluidez 107 y el electrodo auxiliar 105. Los voltajes aplicados al
electrodo de trabajo 104 y al electrodo que determina la fluidez 107
son independientes, formando el circuito total un circuito abierto
(Paso 2). Mientras se aplican voltajes alternos entre el electrodo
de trabajo 104 y el electrodo auxiliar 105, y entre el electrodo
que determina la fluidez 107 y el electrodo auxiliar 105, la
introducción de la muestra resulta en un cambio eléctrico de la
capacitancia, de forma que puede utilizarse como señal de inicio en
el curso de la medida del biosensor.
(3) la muestra introducida en la boca del
conducto en la tira provoca un cambio primario en la capacitancia
entre el electrodo de trabajo 104 y el electrodo auxiliar 105. Al
darse la aplicación del mismo voltaje en el electrodo de trabajo y
el electrodo auxiliar 105, ese cambio de capacitancia provoca que la
reacción rédox se detenga durante varios segundos, durante los
cuales la muestra se mezcla con la capa de reactivo, preferiblemente
durante 3 s. o menos, más preferiblemente durante 2 s. o menos.
Durante este proceso, el circuito se mantiene cerrado (Paso 3).
(4) Cuando la muestra entra en contacto con el
electrodo que determina la fluidez 107, ocurre un cambio secundario
de capacitancia y permite que el electrodo auxiliar 105 y el
electrodo que determina la fluidez 107 tengan el mismo voltaje,
proporcionando la información sobre la diferencia de tiempo desde el
cambio detectado por el electrodo de trabajo 104 (Paso 4).
(5) Cuando la muestra de sangre se ha mezclado
suficientemente con la capa de reactivo en el electrodo de trabajo
104, se aplica una diferencia de potencial predeterminada constante
entre el electrodo de trabajo 104 y el electrodo auxiliar 105 para
iniciar así las reacciones cíclicas características de la celda
electroquímica de capa fina tipo inverso. En pocos segundos,
preferiblemente en 2 segundos, la corriente que fluye entre los
electrodos alcanza un estado estacionario y se lee (Paso 5).
(6) El nivel del sustrato en la muestra
analizada se determina en la base a la información de tiempo
obtenida en el Paso 4, y la corriente en estado estacionario se lee
en el Paso 5. El proceso entero, desde la introducción de una
muestra hasta la determinación del nivel de sustrato, se realiza
completamente en segundos, preferiblemente en 4 segundos, y más
preferiblemente en 3 segundos.
\vskip1.000000\baselineskip
Otra realización del método puede conseguirse
como sigue.
(1) Cuando se introduce una muestra de sangre en
la tira insertada en el dispositivo de lectura, se activan
circuitos de entrada de alta impedancia entre el electrodo de
trabajo 104 y el electrodo auxiliar 105, y entre el electrodo que
determina la fluidez 107 y el electrodo auxiliar 105 en el
dispositivo de lectura (Paso 1).
(2) Como la muestra introducida a la boca del
conducto en la tira contiene electrolitos, se crea una diferencia de
potencial primaria en la interfase entre el electrodo y la muestra
(Paso 2).
(3) Este cambio se detecta para dar lugar a la
aplicación del mismo voltaje al electrodo de trabajo, provocando
que la reacción rédox se detenga durante unos segundos, durante los
cuales la muestra se mezcla con la capa de reactivo,
preferiblemente durante 3 s. o menos, y más preferiblemente durante
2 s. o menos. Durante este proceso, se mantiene el circuito cerrado
(Paso 3).
(4) Cuando la muestra entra en contacto con el
electrodo que determina la fluidez 107, ocurre un cambio secundario
de voltaje y se permite que el electrodo auxiliar 105 y el electrodo
que determina la fluidez 107 tengan el mismo voltaje, proporcionado
información sobre la diferencia de tiempo desde el cambio detectado
por el electrodo de trabajo 104 (Paso 4).
(5) Cuando la muestra se ha mezclado
suficientemente con la capa de reactivo en el electrodo de trabajo
104, se aplica una diferencia de potencial predeterminada constante
entre el electrodo de trabajo 104 y el electrodo auxiliar 105,
iniciando así las reacciones cíclicas características de la celda
electroquímica de capa fina de tipo inverso. En segundos,
preferiblemente en 2 segundos, la corriente que fluye entre los
electrodos alcanza un estado estacionario y se lee (Paso 5).
(6) El nivel del sustrato en la muestra
analizada se determina en base a la información de tiempo obtenida
en el Paso 4 y la corriente en estado estacionario leída en el Paso
5. El proceso entero, desde la introducción de la muestra hasta la
determinación del nivel de sustrato, se realiza completamente en
segundos, preferiblemente en 4 segundos, y más preferiblemente en 3
segundos.
\vskip1.000000\baselineskip
Además pueden aplicarse corrientes directas,
corrientes alternas de baja o alta frecuencia, altas impedancias, o
varios tipos de pulsos, tales como ondas cuadradas, ondas
piramidales, ondas semisinoidales u ondas Gaussianas, entre el
electrodo de trabajo 104 y el electrodo auxiliar 105, y entre el
electrodo que determina la fluidez 107 y el electrodo auxiliar 105
para analizar cuantitativamente el sustrato de interés. En estos
casos, sin embargo, la determinación del tiempo de muestreo basada
en el cambio químico que ocurre tras la introducción de la muestra
es independiente del tiempo necesario para aplicar y medir las
señales eléctricas entre el electrodo de trabajo 104 y el electrodo
de referencia y auxiliar 105, pero se utiliza para corregir el
cambio electroquímico causado por las reacciones químicas, junto a
la información sobre el tiempo de trayecto de la muestra entre el
electrodo de trabajo y el electrodo que determina la fluidez. Esto
se realiza con un software preinstalado.
El método de medida de acuerdo con la presente
invención puede reducir sustancialmente el sesgo dependiente del
nivel de hematocrito, al aprovechar la información sobre la fluidez
de la muestra, además de reducir la posibilidad de obtener
información errónea al excluir las muestras de sangre de fluidez
anormalmente alta o baja. Además, el biosensor por sí mismo puede
detectar, el cambio en la velocidad de muestreo de la sangre
causada por el envejecimiento del mismo, proporcionando de este modo
la información de control de calidad tras la fabricación. Además,
el método de medida de la presente invención tiene la ventaja de que
la muestra de sangre puede introducirse de forma rápida y
constante, sin pretratamiento y pueden analizarse de manera precisa
los niveles de glucosa en sangre en 5 s.
Los biosensores que se proporcionan con la parte
para introducir la muestra 100 gozan de las siguientes ventajas:
(1) El fenómeno bolsillo de aire, que puede
aparecer en el punto de comunicación entre la indentación para
introducir la muestra y el canal de descarga de aire tras la rápida
introducción de la muestra mediante la acción capilar, se elimina
por el espacio extra vacío proporcionado detrás del punto de
comunicación.
(2) Como la parte para introducir la muestra 100
está bien unida a la boca estrecha y al canal de descarga de aire,
y el conducto entero se cubre con el sustrato superior 300, casi no
existe la posibilidad de que los biosensores de la presente
invención pierdan la muestra introducida y puedan manchar la mano
del usuario con la muestra. Además, los biosensores pueden mantener
una concentración de muestra consistente con una mínima evaporación,
mejorando así la reproducibilidad analítica.
(3) Los biosensores proporcionados con la parte
para introducir la muestra 100, en la que la indentación para
introducir la muestra 101 comunica con el canal de descarga de aire
102 en una manera aproximadamente perpendicular, son capaces de
introducir rápidamente una cantidad predeterminada de sangre
muestreada e incrementar la precisión y la reproducibilidad.
(4) Finalmente, los biosensores de la presente
invención son más cómodos durante el muestreo de sangre porque la
parte para introducir la muestra 100, adaptada a la punta, puede
entrar en contacto fácilmente con partes del cuerpo.
\vskip1.000000\baselineskip
Puede proporcionarse una mayor comprensión de la
presente invención con los siguientes ejemplos que se exponen para
ilustrar, pero que no pretenden limitar la presente invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Se disolvió una mezcla que contenía 30 mg de
cloruro de rutenio hexamina (III) (41,6% en peso), 1 mg de
carboximetilcelulosa (1,4% en peso), 1 mg de Triton
X-100 (1,4% en peso), y 40 mg de oxidasa de la
glucosa (55,6% en peso) en 1 ml de tampón PBS (pH 6,4), seguido de
la eliminación por filtración de las partículas no disueltas. La
solución de reactivo así obtenida se puso en la jeringa de un
dispensador neumático (EFD XL100).
\vskip1.000000\baselineskip
Se disolvió una mezcla que contenía 30 mg de
cloruro de rutenio hexamina (III) (32,6% en peso), 1 mg de
carboximetilcelulosa (0,8% en peso), 5 mg de polivinilpirrolidona
(4% en peso), 1 mg de Triton X-100 (0,8% en peso),
20 mg de ácido láurico (15,7% en peso), 30 mg de bromuro de
miristiltrimetilamonio (23,6% en peso), y 40 mg de oxidasa de la
glucosa (31,5% en peso) en 1 ml de tampón PBS (pH 6,4), seguido de
la eliminación por filtración de las partículas no disueltas. La
solución de reactivo así obtenida se puso en la jeringa de un
dispensador neumático (EFD XL100).
\vskip1.000000\baselineskip
En este ejemplo, se describe un método para
medir los niveles de glucosa en sangre. El electrodo auxiliar 105
mostrado en las Fig. 2 y 3b se usó como electrodo de referencia en
el biosensor de tipo celda electroquímica de capa fina. Se fabricó
una celda electroquímica de capa fina para la medición de los
niveles de glucosa en sangre como sigue.
Como se muestra en las Fig. 2, 3a y 3b, se
imprimió por serigrafía una pasta conductora de carbono en un
electrodo de trabajo 104, y un conector de electrodos 106, que es
suficientemente grueso para conectar de forma tridimensional con un
electrodo auxiliar, y entonces se secó a 140ºC durante cinco
minutos. Luego, se imprimió por serigrafía una pasta de plata en un
conector de circuito, en uno de los extremos del conector de
electrodos 106 hasta el grosor de la mitad del sustrato 200.
Asimismo, se imprimió por serigrafía con pasta de carbono un
electrodo de referencia (auxiliar) 105 sobre el sustrato superior
300 y se secó en las mismas condiciones que el electrodo del
sustrato inferior 400. Finalmente, se imprimió por serigrafía una
pasta de plata al final del electrodo de referencia 105 para
proporcionar un conector de circuito.
El sustrato intermedio 200, en el que se fijan
la indentación para introducir la muestra 101, el canal de descarga
de aire 102 y el espacio extra vacío 103, de tal manera que el
extremo del electrodo que determina la fluidez 107 se posiciona en
el espacio extra vacío, se preparó presionando una cinta adhesiva de
poliéster de doble cara. En esta conexión, la estructura del
sustrato intermedio se diseñó de forma que la proporción de la
anchura del canal de descarga de aire 102 respecto a la indentación
para introducir la muestra 101 era de 2:1 y la parte para
introducir la muestra 100 tenía una capacidad de 0,5 \mul.
Para ensamblar los sustratos en el biosensor,
como se muestra en las Fig. 2, 3a y 3b, el sustrato intermedio se
presionó contra el sustrato inferior 400 con el electrodo impreso,
seguido de la aplicación de la solución de una composición de
reactivo en capas preparada en el Ejemplo 1 o 2 al electrodo de
trabajo 104 expuesto a través del conducto de la muestra. Tras el
secado del electrodo de trabajo a 45ºC durante 30 min., el sustrato
superior 300 se presionó contra el sustrato intermedio 200 de forma
que los conectores del circuito formados en los respectivos
sustratos se ponen en contacto uno con otro, obteniéndose así un
biosensor de tipo inverso. Las Fig. 3a y 3b muestran biosensores
que tienen el electrodo que determina la fluidez formado en el
sustrato inferior y el sustrato superior, respectivamente.
Para medir los niveles de glucosa en sangre
utilizando el sensor fabricado, se tomaron 0,5 \mul de sangre del
antebrazo de un paciente con una tira del sensor. Tan pronto como la
tira se introdujo en el dispositivo de lectura, éste empezó a
operar. La inserción de la tira en el dispositivo de lectura provocó
una diferencia de potencial de 200 mV a aplicar al electrodo de
trabajo 104 y al electrodo auxiliar 105 en la celda.
En más detalle, la tira insertada en el
dispositivo de lectura funcionó como sigue.
Cuando la muestra de sangre se introdujo, al
combinar la tira del sensor con el dispositivo de lectura 500,
(Paso 1), ocurrió una diferencia de potencial predeterminada entre
el electrodo de trabajo 104 y el electrodo auxiliar 105, y entre el
electrodo que determina la fluidez 107 y el electrodo auxiliar 105
(Paso 2). La muestra introducida en la boca del conducto en la tira
provocó un cambio primario en la señal eléctrica entre el electrodo
de trabajo 104 y el electrodo auxiliar 105, lo que conduce a que se
aplique el mismo voltaje al electrodo de trabajo y al electrodo
auxiliar 105 (Paso 3). Luego, cuando se detectó el flujo de la
muestra, el electrodo que determina la fluidez 107 generó un cambio
eléctrico secundario, que también provocó que el electrodo auxiliar
105 y el electrodo que determina la fluidez 107 tuvieran el mismo
voltaje, proporcionando información sobre la diferencia de tiempo
desde que se detectó el cambio mediante el electrodo de trabajo 104
(Paso 4). Cuando la muestra de sangre estaba suficientemente
mezclada con la capa de reactivo en el electrodo de trabajo 104, se
aplicaron 200 mV entre el electrodo de trabajo 104 y el electrodo
auxiliar 105 iniciando así las reacciones cíclicas en la celda
electroquímica de capa fina de tipo inverso, seguido de la lectura
de la corriente así obtenida (Paso 5). Finalmente, el nivel del
sustrato en la muestra se determinó en base a la información de
tiempo obtenida en el Paso 4 y la corriente en estado estacionario
leída en el Paso 5 (Paso 6).
A través de esta sucesión de pasos, los
biosensores de la presente invención pueden medir los niveles de
glucosa en sangre de forma fácil, rápida y precisa.
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Ejemplo experimental
1
Usando los electrodos de tipo inverso fabricados
en el Ejemplo 3, se examinó el voltamograma cíclico según la
velocidad de escaneo.
Se realizó una prueba en una solución de KCl 1 M
que contenía [Fe
(CN)_{6}/[Fe(CN))_{6}]^{4-} 0,05 mM. A
velocidades de escaneo de 3 mV/s o menos, los electrodos de la
presente invención mostraban curvas S, que son características de
las corrientes de estado estacionario en microelectrodos. Bajo una
condición limitante, la concentración en las superficies de los dos
electrodos llegaba a cero mientras la corriente entre ellos era
independiente del potencial, y también la corriente limitante era
independiente del potencial. A medida que la velocidad de escaneo
aumentaba, también aumentaba la histéresis entre un estado
reversible y uno irreversible. Cuando el v alcanzó o superó los 20
mV/s, el CV en los electrodos de tipo inverso de la presente
invención mostró el mismo tipo de señal que los electrodos de tipo
plano, pero no una señal en forma de S. Los resultados se muestran
en la Fig. 5. La separación de picos ocurrió a un CV de unos 55 mV,
que representan un proceso de transferencia de electrones altamente
reversible entre el electrodo y la [Fe
(CN)_{6}]^{3-/4-}.
En conjunto estos resultados son similares a los
del estudio de microelectrodos ensamblados al azar debido al cambio
de la difusión hemisférica a difusión lateral en un voltámetro de
escaneo lineal, lo que sugiere que los electrodos de carbono de la
presente invención tienen propiedades similares a las de los
microelectrodos formados de partículas de carbono de tamaño
aleatorio.
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Ejemplo experimental
2
El tiempo de respuesta cronoamperométrica de los
electrodos de tipo inverso fabricados en el Ejemplo 3 se comparó
con el de los electrodos de tipo plano, que se colocan en un
sustrato aislante, como sigue:
Comparado con los electrodos de tipo plano, los
electrodos de tipo inverso mostraron velocidades superiores de
respuesta a la muestra y corrientes en estado estacionario
superiores. Los resultados se proporcionan en la Fig. 6. Si la tasa
de reacción y la tasa de transferencia de electrones del mediador de
transferencia electrones utilizado eran apropiadas, los electrodos
de tipo inverso proporcionaban corrientes en estado estacionario en
un periodo de tiempo muy corto. En relación con esto, se introdujo
la constante de tiempo de estado estacionario (t* = Dt/ d^{2})
para determinar el estado de la corriente de estado estacionario que
varía con la localización de los electrodos y con la composición de
la capa de reactivo.
En la curva de respuesta de un biosensor
fabricado según una realización de la presente invención, el tiempo
necesario para alcanzar una corriente en estado estacionario era de
alrededor de 2 s., y el coeficiente de difusión del mediador de
transferencia de electrones cloruro de rutenio hexamina (III) era de
1,8 x 10^{-5} cm^{2}/s, con un espacio de 100 \mum entre los
electrodos, de forma que t* = 0,36.
Resultados previos de investigación (J. F.
Cassidy et al., Analyst, 118, 415 (1993)) muestran que una
corriente en estado estacionario se obtiene cuando t* > 0,01.
Los biosensores propuestos en la presente invención cumplen la
condición de que 0,05 \leq t* \leq 8.
La Fig. 7 muestra los resultados de tiempo de
respuesta cronoamperométrica a medida que la concentración de
glucosa aumenta desde 2,77 a 33,3 mM. El tiempo de respuesta aumenta
con la concentración de glucosa. Sin embargo, como se muestra en la
gráfica, todos los casos analizados resultaron en determinaciones de
la corriente en estado estacionario en 2 s. Esta respuesta rápida y
completa de corriente en estado estacionario hace posible procesar
los datos a una tasa mejorada y aumentar el implemento analítico de
los electrodos.
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Ejemplo experimental
3
Se midió la influencia de los componentes de
interferencia, tales como ácido ascórbico, acetaminofeno y ácido
úrico, en un sensor de glucosa de tipo inverso que tiene una parte
para introducir la muestra 100 de 0,5 \mul, fabricado como se ha
descrito en el ejemplo 3.
Concretamente, se midieron las corrientes de
respuesta respectivas a (a) una solución de 177 mg/dL de glucosa en
tampón fosfato (pH 7,4), (b) una solución de 177 mg/dL de glucosa +
acetaminofeno 660 \muM en tampón PBS, (c) una solución de 177
mg/dL de glucosa + ácido ascórbico 570 \muM en tampón PBS y (d)
una solución de 177 mg/dL de glucosa + ácido úrico 916 \muM en
tampón PBS.
Las corrientes se determinaron mediante la
lectura de la respuesta cronoamperométrica 5 segundos después de la
aplicación de un potencial de +0,2 V al electrodo de trabajo 104
(frente al electrodo de referencia). Los resultados se muestran en
la Fig. 8.
Como se ve en la Fig. 8, no existe una
diferencia notable entre los resultados de las soluciones de tampón
PBS que contienen sólo glucosa 177 mg/dL (línea a) y en combinación
con acetaminofeno 660 \muM (línea b), con ácido ascórbico 570
\muM (línea c) o con ácido úrico 916 \muM (línea d). En
consecuencia, estos datos muestran que los sensores no se ven
significativamente afectados por la presencia de los materiales de
interferencia al potencial aplicado de
+0,2 V.
+0,2 V.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo experimental
4
Se analizó la sensibilidad a soluciones de
glucosa estándar del sensor de glucosa de tipo inverso preparado en
el Ejemplo 3.
En detalle, se midieron los valores de corriente
diez veces a cada concentración de glucosa 0, 50, 150, 300, 450 o
600 mg/dL en presencia de un campo eléctrico para el potencial
aplicado de 0,2 V respecto al electrodo de referencia. La cantidad
de muestra aplicada en la parte para introducir la muestra fue de
0,5 \mul y el tiempo de llenado no fue superior a 200 ms. Las
mediciones se realizaron 2 s. después de la introducción de la
muestra aplicando 0,2 V durante 3 s., y los valores de corriente se
leyeron en 5 s. Los resultados se representan en la Fig. 10.
La Fig. 10 muestra las curvas de respuesta
dinámica obtenidas a concentraciones de glucosa de 0 mg/dL (curva
a), 50 mg/dL (curva b), 150 mg/dL (curva c), 300 mg/dL (curva d),
450 mg/dL (curva e) y 600 mg/dL (curva f).
Como es evidente a partir de las curvas, el
biosensor de la presente invención puede alcanzar corrientes en
estado estacionario, lo que asegura una medición rápida y
precisa.
En el biosensor de la presente invención, la
pendiente era de 0,093 [\muA/ (mg/dL)] y el coeficiente de
correlación era de 0,997. Con estos resultados se demostró que el
biosensor electroquímico tiene una sensibilidad lineal excelente
(Fig. 9).
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Ejemplo experimental
5
Usando un sensor de glucosa de tipo inverso
proporcionado con un electrodo que determina la fluidez, fabricado
como en el Ejemplo 3, se realizaron ensayos de medición de la
fluidez de la sangre y de corrección del sesgo del hematocrito.
Se aplicó un potencial de 200 mV al electrodo de
trabajo 104 y al electrodo que determina la fluidez 107 (frente al
electrodo de referencia 105). Cuando las muestras de sangre se
introdujeron a través de la indentación para introducir la muestra
101, se detectó un primer cambio repentino en la corriente, y se
inicia el tiempo de medición. En el momento en el que la muestra
alcanzó el espacio vacío 103, se detectó un segundo aumento de la
corriente y se registró el intervalo de tiempo entre el primer y el
segundo aumento de la corriente. La relación entre el tiempo de
entrada de la muestra y el nivel de hematocrito se muestra en la
Fig. 11. El experimento se realizó con sangre total tratada con
fluoruro de sodio que contenía 180 mg/dL de glucosa y con niveles
de hematocrito varia-
bles.
bles.
La ecuación de ajuste se obtuvo mediante el
resultado anterior.
\vskip1.000000\baselineskip
Fórmula matemática
I
Y = -72.23 +
0.58691X – 0.00084073 X^{2} - 1.1211x10^{-6} X^{3} +
5.7521x10^{-9} X^{4} - 9.1172x10^{-12}
X^{5}
(en la que Y es el nivel de
hematocrito estimado a partir del tiempo de llenado de la muestra X
medido con el electrodo determinante de la
fluidez)
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
\newpage
La Tabla 1 muestra el nivel de hematocrito
estimado a partir de la velocidad de tiempo de llenado de la
muestra.
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\vskip1.000000\baselineskip
En un experimento separado, se obtuvieron curvas
de calibración con varios niveles de hematocrito en la sangre total
y se formuló la relación entre el nivel de hematocrito y la
pendiente de respuesta en la Tabla 2, a continuación.
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\vskip1.000000\baselineskip
Los factores de corrección derivados de esta
manera se utilizaron para recalibrar el nivel de glucosa medida
respecto a sangre total con un nivel de hematocrito del 40%, lo que
resulta en un biosensor que puede proporcionar concentraciones de
glucosa independientemente del hematocrito. El dispositivo detecta
en primer lugar la velocidad de introducción de la muestra, y luego
determina el nivel de hematocrito en la muestra de sangre. El
aparato aprovecha las curvas de calibración correspondientes para
determinar el nivel de glucosa a partir de las corrientes medidas.
La Tabla 3 muestra los resultados del experimento realizado como se
ha indicado anteriormente.
La velocidad de entrada de la muestra se midió
con el electrodo que determina la fluidez y las curvas de
calibración de la Tabla 2 se utilizaron para estimar el nivel de
glucosa en la sangre total.
El electrodo que determina la fluidez también
discriminó las muestras de sangre de fluidez inusual, es decir,
muestras con niveles de hematocrito demasiado elevados o demasiado
reducidos, y la introducción incorrecta de muestras de sangre
debido a la formación de burbujas de aire. En tales casos, puede
programarse el dispositivo de lectura para que emita un mensaje de
alerta o un código de error para esa medición.
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Ejemplo Experimental
6
Las tiras del biosensor se prepararon como en el
Ejemplo 4. Las muestras de sangre total heparinizada se
centrifugaron para separar el plasma y los corpúsculos, que se
mezclaron de nuevo para obtener muestras de sangre de tres niveles
diferentes de hematocrito, del 20, 40 y 60%. Se evaluó el efecto del
hematocrito en la medida de glucosa a tres concentraciones
diferentes de glucosa utilizando los biosensores preparados con las
capas de reactivo de los Ejemplos 1 y 2. Los resultados se exponen
en las Tablas 4 y 5.
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Los resultados resumidos en la Tabla 5 muestran
que el biosensor basado en el reactivo del Ejemplo 2 muestra una
respuesta de interferencia por la variación de los niveles de
hematocrito (desde el 20% al 60%) sustancialmente reducida, cuyo
sesgo de medición es inferior al 10% en relación a un nivel de
hematocrito del 40%.
Como se ha descrito aquí anteriormente, el
método de medición de acuerdo con la presente invención puede
reducir sustancialmente el sesgo producido por el hematocrito, al
aprovechar la información de la fluidez de la muestra, además de
disminuir la posibilidad de obtener información errónea al excluir
las muestras de sangre de fluidez anormalmente elevada o reducida.
Además, el propio biosensor puede detectar los cambios en la
velocidad de muestreo de la sangre provocados por el envejecimiento
del mismo, proporcionando de este modo información de control de
calidad tras la fabricación. Además, el método de medida de la
presente invención tiene la ventaja de que la muestra de sangre se
introduce de forma rápida y constante, sin necesidad de
pretratamiento y que analiza de manera precisa los niveles de
glucosa en sangre en segundos, preferiblemente en 5 s.
Además, el biosensor, que se proporciona con una
parte para introducir la muestra 100 que permite que la muestra se
introduzca de forma rápida y constante, sin pretratamiento, y con un
electrodo que determina la fluidez 107 capaz de detectar la fluidez
de las muestras de sangre total, tiene una estructura simple y puede
fabricarse fácilmente. Pueden introducirse unos 0,1 - 0,7 \mul de
muestra de forma constante en el biosensor sin pretratamiento. Los
electrodos del biosensor muestran una excelente reproducibilidad. El
biosensor se basa en una estructura de celda electroquímica de capa
fina, de tipo inverso, en la que el electrodo de trabajo 104 y el
electrodo auxiliar 105 están enfrentados el uno con el otro de
forma simétrica o asimétrica, con un hueco de varios centenares de
\mum localizado entre los electrodos. En esta estructura de
electrodo, la corriente alcanza un estado estacionario en 2 s.
debido al efecto cíclico de las reacciones rédox formadas por una
enzima, un sustrato contenido en la muestra y un mediador de
transferencia de electrones. Al respecto, la capa de reactivo
formada en el electrodo de trabajo o en el electrodo auxiliar se
disuelve fácilmente en la muestra introducida a través del canal de
la muestra. El cloruro de rutenio hexamina (III) que se utiliza en
la presente invención puede transferir electrones decenas de veces
más rápido que los mediadores de transferencia de electrones
basados en Fe y se disuelve fácilmente. Además, la composición de la
capa de reactivo empleada en el biosensor puede reducir
sustancialmente el sesgo en la medición que se obtiene a causa del
hematocrito, eliminando así la influencia de componentes de
interferencia, componentes activadores de los electrodos y del
hematocrito.
Claims (13)
1. Un método para medir los niveles de glucosa
en sangre, utilizando un biosensor electroquímico que se proporciona
con una celda electroquímica de capa fina de tipo inverso, y dicha
celda electroquímica de capa fina de tipo inverso consta de:
un electrodo de trabajo (104) formado por un
sustrato aislante plano (400);
un electrodo auxiliar (105) formado por un
sustrato aislante plano (300) separado de manera que se enfrenta al
electrodo de trabajo (104);
un electrodo para la determinación de la fluidez
(107), situado a una distancia predeterminada del electrodo de
trabajo (104) en el sustrato aislante plano (400, 300) utilizado
para el electrodo de trabajo (104) o el electrodo auxiliar
(105);
un espaciador adhesivo (200), proporcionado con
una parte para introducir la muestra (100) que tiene un
micro-conducto, para separar espacialmente el
electrodo de trabajo (104) y el electrodo auxiliar (105) al
interponerse entre ellos;
un electrodo conector (106), impreso con un
material conductor grueso sobre una porción del electrodo auxiliar
(105), para conectar de forma tridimensional el electrodo de trabajo
(104) al electrodo auxiliar (105); y
una capa de reactivo que contiene un mediador de
transferencia de electrones y una enzima de oxidación, y dicho
método consta de los pasos de:
(1) introducir una muestra de sangre en la tira
sensor insertada en el dispositivo de lectura;
(2) aplicar respectivas diferencias de potencial
predeterminadas entre el electrodo de trabajo (104) y el electrodo
auxiliar (105), y entre el electrodo para la determinación de la
fluidez (107) y el electrodo auxiliar (105);
(3) provocar un primer cambio en la corriente
entre el electrodo de trabajo (104) y el electrodo auxiliar (105)
para permitir que estos electrodos tengan el mismo voltaje, a medida
que se introduce la sangre;
(4) detectar el flujo de la muestra de sangre
con el electrodo de determinación de la fluidez (107) para provocar
un segundo cambio en la corriente entre el electrodo auxiliar (105)
y el electrodo de determinación de la fluidez (107) ajustando los
voltajes del electrodo auxiliar (105) y el electrodo de
determinación de la fluidez (107) al mismo valor, proporcionando así
información sobre la diferencia de tiempo desde el cambio detectado
por el electrodo de trabajo (104);
(5) mezclar suficientemente la capa de reactivo
con la muestra de sangre para aplicar un voltaje predeterminado
entre el electrodo de trabajo (104) y el electrodo auxiliar (105) y
provocar reacciones cíclicas en la celda electroquímica de capa
fina de tipo inverso; y
(6) determinar el nivel de glucosa en la muestra
de sangre en base a la información de tiempo obtenida en el paso
(4) y la corriente de estado estacionario obtenida en el paso
(5).
2. El método de acuerdo con la reivindicación 1,
en el que la muestra de sangre del paso (1) oscila entre un volumen
de 0,1 y 0,7 \mul, y se introduce en la tira sensor sin
pretratamiento.
3. El método de acuerdo con la reivindicación 1,
en el que las diferencias de potencial del paso (2) se provocan
mediante un cambio eléctrico entre el electrodo de trabajo (104) y
el electrodo auxiliar (105), y entre el electrodo de determinación
de la fluidez (107) y el electrodo auxiliar (105), tras la
aplicación de una corriente directa, una corriente alterna de alta
o baja frecuencia, una impedancia elevada, o un pulso seleccionado
de entre las ondas cuadradas, ondas piramidales, ondas
semisinusoidales y ondas Gaussianas.
4. El método de acuerdo con la reivindicación 1,
en el que un cambio eléctrico se atribuye a un cambio de voltaje,
corriente, impedancia o capacitancia.
5. El método de acuerdo con la reivindicación 1,
en el que la parte para introducir la muestra del biosensor tiene
un conducto con una anchura que oscila entre 0,5 y 2 mm y una altura
entre 50 y 250 \mum, facilitando así la introducción de la
muestra de sangre.
6. El método de acuerdo con la reivindicación 1,
en el que se impide que la muestra de sangre y la capa de reactivo
desarrollen reacciones rédox en el paso (3), cuando se controla que
el electrodo de trabajo (104) y el electrodo auxiliar (105) tengan
el mismo voltaje.
\newpage
7. El método de acuerdo con la reivindicación 1,
en el que la capa de reactivo que contiene la enzima y el mediador
de transferencia de electrones se forma sobre el electrodo de
trabajo (104) o sobre el electrodo auxiliar (105).
8. El método de acuerdo con la reivindicación 7,
en el que se utiliza la oxidasa de la glucosa o deshidrogenasa de la
glucosa como enzima.
9. El método de acuerdo con la reivindicación 7,
en el que el mediador de transferencia de electrones facilita la
transferencia de electrones desde la enzima al aceptor final de
electrones y es cloruro de rutenio hexamina (III).
10. El método de acuerdo con la reivindicación
7, en el que la capa de reactivo comprende además un ácido graso o
su sal y una sal de amonio cuaternario para reducir además el sesgo
dependiente del nivel de hematocrito.
11. El método de acuerdo con la reivindicación
10, en el que el ácido graso tiene una cadena alquilo de 4 a 20
carbonos, preferiblemente en el que el ácido graso se selecciona de
entre el grupo que consta de ácidos grasos saturados que tienen 6 a
12 átomos de carbono, más preferiblemente en el que el ácido graso
se selecciona del grupo que consiste en el ácido caproico, ácido
heptanoico, ácido caprílico, ácido nonanoico, ácido cáprico, ácido
undecanoico, ácido láurico, ácido tridecanoico, ácido mirístico,
ácido pentadecanoico, ácido palmítico, ácido heptadecanoico, ácido
esteárico, ácido heptadecanoico, ácido esteárico, ácido
nonadecanoico y ácido araquidónico, y más preferiblemente en el que
el ácido graso o su sal se añade en una cantidad de entre el 0,1 y
el 20% en peso de todos los componentes sólidos.
12. El método de acuerdo con la reivindicación
10, en el que la sal de amonio cuaternario se selecciona del grupo
que consiste en los compuestos haluro del dodeciltrimetilamonio,
miristiltrimetilamonio, cetiltrimetilamonio,
octadeciltrimetilamonio y tetrahexilamonio, y se añade
preferiblemente en una cantidad de entre el 0,1 y el 30% en peso de
todos los componentes sólidos.
13. El método de acuerdo con la reivindicación
1, en el que la capa de reactivo del biosensor se forma en el
electrodo de trabajo (104) o el electrodo de determinación de la
fluidez (107), o en ambos, y los dos electrodos se sitúan de manera
que la constante de tiempo de la corriente en estado estacionario
está entre 0,05 y 8,0, ambos inclusive.
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