KR20060089464A - 전기화학적 바이오센서 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 전기화학적 바이오센서를 이용하여 혈당을 측정하는 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 한 장의 평면 절연판에 코팅된 작동전극(104)과; 상기 작동전극(104)과 같은 평면 또는 다른 한 장의 평면 절연판에서 일정 간격 이격되어 있는 주입 시료의 유동성을 감지하는 유동감지전극(107)과; 상기 작동전극(104)과 대향하는 다른 한 장의 평면 절연판 위에 코팅된 보조전극(105)(기준전극)과; 미세유로가 형성된 시료도입부(100)를 구비하며 상기 작동전극(104)과 상기 보조전극(105)을 일정 간격 격리시켜 압착시키는 점착성 격리판과; 도체 물질을 두껍게 적층 구조로 인쇄하여 보조전극과 차원적으로 연결되는 부위가 형성되어 상기 작동전극(104)과 보조전극(105)을 연결시키는 전극연결부(106); 및 전자전달 매개체와 산화효소를 포함한 반응시약층으로 구성된 대면형의 박층전기화학셀(센서 스트립)을 구비한 전기화학적 바이오센서를 사용하여, (1) 센서 스트립(509)이 삽입된 측정기(500)에 채취한 혈액시료를 투입하는 단계; (2) 작동전극(104)과 보조전극(105) 사이 및 유동감지전극(107)과 보조전극(105) 사이에 일정한 전위차가 주어지는 단계; (3) 상기 시료의 유입이 작동전극(104)과 보조전극(105) 사이에 1차 전기적 변화를 유발하고 상기 전극들 간의 전압을 동일하게 조정하는 단계; (4) 유동감지전극(107)이 상기 시료의 유동을 감지하여 2차 전기적 변화를 일으키고 상기 보조전극(105)과 유동감지전극(107) 간의 전압을 동일하게 조정함으로써 작동전극(104)에서 1차 감지된 전기적 변화와의 시간 차이의 정보를 제공하는 단계; (5) 혈액 시료와 작동전극(104)에 놓인 시약이 충분히 섞이면 다시 작동전극(104)과 보조전극(105) 사이에 소정의 전압이 인가되어 대면형 박층전기화학셀 내 순환반응(cycling reaction)을 일으킨 후 도달한 정상전류 값을 읽는 단계; 및 (6) 단계 4에서 얻어진 시간 정보와 단계 5에서 얻어진 정상전류 값을 이용하여 시료 내에 존재하는 기질의 양을 측정하는 단계로 구성된 것을 특징으로 하는 전기화학적 바이오센서를 이용하여 혈당을 측정하는 방법에 대한 것이다.
본 발명에 의하면, 혈액의 적혈구용적률 차에 의한 의존 성향을 시료의 유동성 정보에 의하여 획기적으로 감소시키고, 비정상적으로 유동성이 낮거나 높은 혈액 시료를 구분해 냄으로써 사용자가 잘못된 정보를 얻을 가능성을 획기적으로 줄여주는 한편, 바이오센서 스트립의 사용 가능연한에 가까워짐에 따른 혈액주입 속도의 변화를 감지하여 스트립 제조의 품질관리의 편리성을 제공하며, 혈액시료를 전처리 과정없이 빠르고 일정하게 도입하여 사람으로부터 채혈된 소량의 시료로부터 수초 이내, 바람직하게는 5초 이내에 혈당의 측정 결과를 정확하고 빠르게 응답해 주는 이점을 제공한다.
바이오센서, 박층전기화학셀, 유동감지전극, 적혈구용적률, 감응막 조성물, 시료도입부, 여분공간부

Description

전기화학적 바이오센서{Electrochemical Biosensor}
도 1은 본 발명에 따른 바람직한 일례인 박층전기화학셀을 도시한 분해 사시도;
도 2는 본 발명에 따른 바람직한 일례인 대면형 바이오센서의 분해사시도;
도 3a는 본 발명에 따른 바람직한 일례인 시료도입부(100)가 도입되고 시료의 유동성 감지전극이 상판에 구비된 대면형 바이오센서의 분해사시도;
도 3b는 본 발명에 따른 바람직한 일례인 시료도입부(100)가 도입되고 시료의 유동성 감지전극이 하판에 구비된 대면형 바이오센서의 분해사시도;
도 4a는 상단에 측정 스트립이 삽입되어 있는 상태로 도시된 양방향 혈당측정기의 평면도;
도 4b는 본 발명에 따른 바람직한 일례인 바이오센서의 작동순서에 대한 내부 회로 구성도;
도 5는 본 발명에 따른 바람직한 일례인 대면형 바이오센서 전극의 순환전압전류도(cyclic voltammogram);
도 6은 본 발명에 따른 바람직한 일례인 대면형 전극과 평면형 전극을 비교한 대시간전류법적(chronoamperometric) 감응결과 그래프;
도 7은 본 발명에 따른 일례인 대면형 전극의 글루코오스 농도에 따른 대시간전류법적(chronoamperometric) 감응결과 그래프;
도 8은 본 발명에 따른 일례인 대면형 바이오센서의 방해물질에 의한 영향 측정도;
도 9는 본 발명에서 대면형 바이오센서의 포도당 표준용액에 대한 검정곡선 그래프;
도 10은 본 발명에서 대면형 바이오센서의 포도당 표준용액에 대한 정압전류법 동적 감응 곡선 그래프; 및
도 11은 본 발명의 대면형 바이오센서에서 시료 유동성과 적혈구용적률 사이의 관계를 도시한 곡선 그래프이다.
<도면의 주요 부분에 관한 부호의 설명>
100: 시료도입부 101: 시료도입 통로부
102: 통기부 103: 여분공간부
104: 작동전극 105: 보조전극 또는 기준전극
106: 전극연결부 107: 유동 감지 전극
108: 바이오센서 확인전극 200: 중간기판
300: 상부기판 301: 시료확인창
400: 하부기판 500: 혈당측정기
501: 측정기 본체 503: 액정표시패널
505: 전원 스위치 507: 조작 스위치
509: 상향 스트립 511: 스트립 삽입구
본 발명은 전기화학적 바이오센서를 이용하여 혈당을 측정하는 방법에 관한 것이다.
최근 당뇨병을 진단하고 예방하는데 있어서 혈액내의 포도당(혈당: blood glucose)의 양을 주기적으로 측정해야 할 필요성이 증대되고 있다. 이러한 혈당 측정은 손에 쥘 수 있는 휴대용 계측기를 이용하여 손쉽게 측정할 수 있으며, 구체적으로 각자가 스트립 형태의 바이오 센서를 사용하여 손쉽게 측정할 수 있다. 이러한 혈당 측정을 위한 바이오 센서의 작동원리는 비색 방법 또는 전기화학적 방법에 기초하고 있다.
이 중 전기화학적 방법은 하기 반응식 1에 의해 설명되어지며, 가장 큰 특징으로 전자전달매개체를 사용하는 것이다. 상기 전자전달매개체로는 페로센(ferrocene), 페로센 유도체; 퀴논(quinones), 퀴논 유도체; 전이금속함유 유기 및 무기물(헥사아민 루테늄, 오스뮴 함유 고분자, 포타슘 페리시아나이드 등); 및 유기 전도성 염(organic conducting salt), 비오로겐(viologen)과 같은 전자전달 유기물 등을 사용한다.
(1) 포도당 + GOx-FAD →글루콘산 + GOx-FADH2
(2) GOx-FADH2 + 전자전달매개체(산화상태) →GOx-FAD + 전자전달매개체(환원상태)
(상기 식에서, GOx는 당산화효소(Glucose oxidase)를 나타내고, GOX-FAD 및 GOX-FADH2는 각각 당산화효소의 활성부위인 FAD(flavin adenine dinucleotide)의 산화상태 및 환원상태를 나타낸다)
상기 반응식 1에서 보는 바와 같이, (1) 먼저 혈액내의 포도당은 당산화효소의 촉매작용에 의해 글루콘산으로 산화되게 된다. 이때 당산화효소의 활성 부위인 FAD가 환원되어 FADH2로 된다. (2) 그 후 환원된 FADH2는 전자전달매개체와의 산화환원반응을 통하여 FADH2는 FAD로 산화되고, 전자전달매개체는 환원되게 된다. 이렇게 형성된 환원상태의 전자전달매개체는 전극표면까지 확산되는데, 이때 작동 전극표면에서 환원상태의 전자전달매개체의 산화전위를 인가하여 생성되는 전류를 측정하여 혈당의 농도를 측정하게 된다.
상기와 같은 전기화학적 방법을 작동원리로 하는 바이오센서를 전기화학적 바이오센서라 한다. 이러한 전기화학적 바이오센서는 종래의 비색 방법에 의한 바 이오센서와는 달리 산소에 의한 영향을 줄일 수 있고, 시료가 혼탁하더라도 시료를 별도 전처리 없이 사용 가능하다는 장점을 갖는다.
이러한 전기화학적 바이오센서는 혈당 양을 감시하고 제어하는데 일반적으로 편리하게 사용되지만, 센서의 정확성은 혈액 시료에 존재하는 산화되기 쉬운 아스코르브산(ascorbic acid), 아세토아미노펜(acetaminophene) 및 요산(uric acid)과 같은 다양한 방해 종들에 의해 큰 영향을 받는다.
이외에 다른 심각한 오차는 적혈구용적률(혈액내의 적혈구용적률의 비의 양)에 의해 유발된다. 일회용 바이오센서 스트립을 사용하여 그들의 혈당 수준을 규칙적으로 측정하는 사람들에게 있어서, 적혈구용적률 수준에 큰 영향을 받는 바이오센서는 그 측정 결과에 있어서 틀린 판단을 가져오게 되고, 이러한 결과로 인해 심지어는 사용하는 사람들의 생명에 대한 위험을 초래할 수 있다.
종래, 바이오센서에서 이러한 적혈구용적률로부터 영향을 감소시키는 방법으로는 추가적으로 적혈구를 분리하거나; 시약층위에 적혈구를 제거하는 층을 도포하는 방법(JP 1134461, JP 2000338076 및 US 5658444); 규소충진물(silica filler)을 포함하여 스크린 인쇄가 가능한 시약/혈구분리 일체형 기능을 갖는 감응막을 사용하는 방법(US 6241862 B1); 그리고 적용전위를 두번 인가하여(the double excitation potentials) 나온 결과를 수학적으로 처리(chemometric method)하는 교정 방법(WO 01/57510 A2)과 같은 몇 가지 방법들이 제안되어왔다.
그러나, 상기 방법들은 그 제조 과정에서 여분의 단계나 그 시약 계층을 인 쇄하는 데 있어서 시약의 큰 손실을 가져올 수 있으며, 작동 전극 위에 시약 혼합물을 간단히 도포하기에는 어려움이 있다.
또한, 바이오센서를 사용함에 있어 소량의 시료로 정확하게 빠른 응답시간을 얻는 것은 사용자의 편리를 극대화 한다는 점에서 대단히 중요한 문제이다. 특히 1 ㎕ 이하의 소량의 시료, 바람직하게는 0.5 ㎕ 이하의 시료, 더 바람직하게는 0.3 ㎕이하의 시료를 사용하면 팔뚝과 같은 대체부위에서 혈액을 채취하여 측정이 가능하기 때문에 환자가 혈당을 측정하는데 따르는 고통을 최소화 할 수 있다.
측정결과에 대한 응답을 얻는 시간은 10초 이내가 바람직하며, 가능하면 5 초 이내가 바람직하고, 더 줄일 수 있다면 3초 정도의 시간이 가장 바람직한데, 현재까지 알려진 기술로는 이와 같은 목적을 달성하는 것이 거의 불가능하였다.
본 발명은 상기의 문제점을 극복하기 위한 것으로, 혈액의 적혈구용적률 차에 의한 의존 성향을 시료의 유동성 정보에 의하여 획기적으로 감소시킬 수 있고, 비정상적으로 유동성이 낮거나 높은 혈액 시료를 구분해 냄으로써 사용자가 잘못된 정보를 얻을 가능성을 획기적으로 줄여주는 한편, 바이오센서 스트립의 사용 가능연한에 가까워짐에 따른 혈액주입 속도의 변화를 감지하여 스트립 제조의 품질관리의 편리성을 제공하는데 그 목적이 있으며, 또한 혈액시료를 전처리 과정없이 빠르고 일정하게 도입하여 사람으로부터 채혈된 소량의 시료로부터 수초 이내에 혈당의 측정 결과를 정확하고 빠르게 응답해 주는 바이오센서를 이용한 혈당 측정 방법을 제공하는데 그 목적이 있다.
상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은, 한 장의 평면 절연판에 코팅된 작동전극(104)과; 상기 작동전극(104)과 같은 평면 또는 다른 한 장의 평면 절연판에서 일정 간격 이격되어 있는 주입 시료의 유동성을 감지하는 유동감지전극(107)과; 상기 작동전극(104)과 대향하는 다른 한 장의 평면 절연판 위에 코팅된 보조전극(105)(기준전극)과; 미세유로가 형성된 시료도입부(100)를 구비하며 상기 작동전극(104)과 상기 보조전극(105)을 일정 간격 격리시켜 압착시키는 점착성 격리판과; 도체 물질을 두껍게 적층 구조로 인쇄하여 보조전극(105)과 차원적으로 연결되는 부위가 형성되어 상기 작동전극(104)과 보조전극(105)을 연결시키는 전극연결부(106); 및 전자전달 매개체와 산화효소를 포함한 반응시약층으로 구성된 대면형의 박층전기화학셀(센서 스트립)을 구비한 전기화학적 바이오센서를 사용하여,
(1) 센서 스트립(509)이 삽입된 측정기(500)에 채취한 혈액시료를 투입하는 단계;
(2) 작동전극(104)과 보조전극(105) 사이 및 유동감지전극(107)과 보조전극(105) 사이에 일정한 전위차가 주어지는 단계;
(3) 상기 시료의 유입이 작동전극(104)과 보조전극(105) 사이에 1차 전기적 변화를 유발하고 상기 전극들 간의 전압을 동일하게 조정하는 단계;
(4) 유동감지전극(107)이 상기 시료의 유동을 감지하여 2차 전기적 변화를 일으키고 상기 보조전극(105)과 유동감지전극(107) 간의 전압을 동일하게 조정함으로써 작동전극(104)에서 1차 감지된 전기적 변화와의 시간 차이의 정보를 제공하는 단계;
(5) 혈액 시료와 작동전극(104)에 놓인 시약이 충분히 섞이면 다시 작동전극(104)과 보조전극(105) 사이에 소정의 전압이 인가되어 대면형 박층전기화학셀 내 순환반응(cycling reaction)을 일으킨 후 도달한 정상전류 값을 읽는 단계; 및
(6) 단계 4에서 얻어진 시간 정보와 단계 5에서 얻어진 정상전류 값을 이용하여 시료 내에 존재하는 기질의 양을 측정하는 단계로 구성된 것을 특징으로 하는 전기화학적 바이오센서를 이용하여 혈당을 측정하는 방법을 제공한다.
전기화학적 바이오센서를 이용한 혈당 측정 방법에 있어서, 단계 1의 혈액 시료는 0.1 ~ 0.7 ㎕의 소량 시료가 전처리 과정없이 센서 스트립(509)에 도입되는 것을 특징으로 한다.
전기화학적 바이오센서를 이용한 혈당 측정 방법에 있어서, 단계 1의 전위차는 작동전극과 보조전극, 유동감지전극과 보조 전극 간에 직류, 저주파 또는 고주파 교류, 고임피던스 또는 다양한 형태의 펄스의 인가로 유발되는 것을 특징으로 한다.
전기화학적 바이오센서를 이용한 혈당 측정 방법에 있어서, 상기의 전기적 변화는 전압, 전류, 임피던스 또는 커패시턴스의 변화에 의한 것임을 특징으로 한다.
전기화학적 바이오센서를 이용한 혈당 측정 방법에 있어서, 단계 3의 전극들 간의 전압을 동일하게 조정함으로써 상기 시료와 반응시약층 간의 산화환원 반응을 수초 동안 억제하는 것을 특징으로 한다.
전기화학적 바이오센서를 이용한 혈당 측정 방법에 있어서, 상기 바이오센서 중 시료도입부(100)에는 0.5 ~ 2㎜의 너비와 50 ~ 250㎛의 높이를 갖는 유로가 형성되어 시료의 도입을 용이하게 한 것을 특징으로 한다.
전기화학적 바이오센서를 이용한 혈당 측정 방법에 있어서, 상기 바이오센서 내 효소와 전자전달매개체를 포함한 반응시약층은 작동전극(104) 및 보조전극(105) 중 어느 하나의 전극에만 형성시켜 반응이 빠르게 일어나도록 한 것임을 특징으로 한다.
전기화학적 바이오센서를 이용한 혈당 측정 방법에 있어서, 상기 바이오센서 내 감응막 조성물은 작동전극(104) 및 유동감지전극(107) 중 어느 하나의 전극 또는 상기 모든 전극에 형성되고, 상기 전극간 간격은 정상전류 시간상수가 0.05 내지 8.0 의 범위로 조절되어 반응이 빠르게 이루어지도록 배열되는 것을 특징으로 한다.
전기화학적 바이오센서를 이용한 혈당 측정 방법에 있어서, 반응시약층 내 전자전달 매개체는 염화헥사아민루테늄(Ⅲ)인 것으로 전자전달을 용이하게 한 것이며, 상기 반응시약층은 효소 및 전자전달 매개체 외에 지방산 및 4차 암모늄염을 부가적으로 포함하여 적혈구용적률 차에 의한 의존 성향을 획기적으로 감소시킨 것을 특징으로 한다.
본 발명의 측정방법에 의하면, 혈액시료를 전처리 과정없이 빠르고 일정하게 도입하여 사람으로부터 채혈된 소량의 시료로부터 수초, 바람직하게는 5초 이내에 혈당의 측정 결과를 정확하고 빠르게 응답해 주는 이점을 얻을 수 있다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
혈당을 측정하기 위한 바이오센서는 다음과 같은 구성을 갖는다.
본 발명에 따른 혈당을 측정하기 위해 사용되는 바이오센서는 전극 구성에 있어서 두 장의 평면 절연판에 작동전극(104)과 보조전극(105)이 각각 따로 형성되어 있으며, 작동전극(104)이 있는 판에는 보조전극(105)과 연결이 가능한 연결도선이 형성되어 있고, 그 연결 도선의 일부에는 도체물질을 두껍게 적층 구조로 인쇄하여 보조전극(105)과 3차원적으로 연결되는 부위가 형성되어 있으며, 두 장의 평 면 절연판에 형성되어 있는 작동전극(104)과 보조전극(105)은 50 ~ 250 ㎛ 두께의 압력 점착성 격리판으로 대칭 또는 비대칭적으로 서로 마주 보는 위치에서 격리되어 박층전기화학셀(thin layer electrochemical cell)을 구성한다. (대면형 전극 참고 : E. K. Bauman et al., Analytical Chemistry, vol 37, p 1378, 1965; K. B. Oldham in "Microelectrodes: Theory and Applications," Kluwer Academic Publishers, 1991).
박층 격리판은 작동전극(104)과 보조전극(105)으로 형성된 측정 공간에 생체 시료를 주입하고 보유할 수 있는 전체 체적이 마이크로 리터 단위인 미세 유로가 형성되어 있다. 전극형성에 있어 박층격리판 내 유동감지전극(107)은 작동전극(104)(또는 보조전극(105))과 적절한 거리에 떨어져 있으며, 바람직하게는 혈구의 양이 40%이며 불소처리된 혈액이 0.5 - 2 mm 이내 너비와 50 - 250 μm 높이의 상기의 미세 유로를 따라 약 600 ms 이내에 도달할 수 있는 거리에 위치하며, 더욱 바람직하게는 불소처리 되지 않은 시료에 대하여 300 ms 이내에, 더욱 바람직하게는 200 ms 이내에 도달할 수 있는 거리에 위치한다.
한 장의 기판위에 형성된 작동전극(104)(또는 보조전극(105)) 및 유동감지전극(107)은 기준전극 겸 보조전극(105)(또는 작동전극(104))과 서로 마주 보고 있는 형태(대면형)로 구성되어 있다.
감응막 조성물은 작동전극(104) 또는 보조전극(105) 어느 한쪽에만 올라가 있도록 구성되어 있으나, 바람직하게는 감응막 조성물은 작동전극(104) 또는 작동전극(104)과 유동감지전극(107)에 올라가 있는 구조를 갖는 것을 특징으로 하는 바 이오센서이다.
그리고, 한 장의 기판 위에 작동전극(104) 또는 작동전극(104) 및 유동감지 전극에만 코팅된 감응막 조성물과 도체물질을 두껍게 적층구조로 인쇄하여 보조전극과 3차원적으로 연결되는 부위가 형성되는 전극연결부(106)가 형성된 하부기판과 시료도입 통로부(101)와 통기부(102)가 교차 형성되고, 시료도입 통로부(101)와 통기부(102)가 만나는 지점에 여분공간부(103)가 형성된 구조를 갖는 시료도입부(100)가 구비된 중간기판(박층 격리판) 및 하판의 유동감지전극(107) 위의 마주보는 위치에 순차 적층되는 기준전극 겸 보조전극(105)과 전극연결부(106)가 하나의 기판 아래에 형성된 상부 기판(300)이 순차 적층된 구조를 갖는 것을 특징으로 하는 바이오센서로서, 바람직하게는 반응시약층이 작동전극(104)에만 형성되어 있거나 또는 작동전극(104)과 유동감지 전극 위에만 형성되는 것을 특징으로 하는 바이오센서이다.
특히, 효소와 전자전달매개체를 포함한 반응시약층은 작동전극(104) 또는 보조전극(105) 어느 한 쪽에만 형성되어 있고, 전극간 간격은 바람직하게는 "정상전류 시간상수"(전자전달매개체의 확산 계수와 정상전류에 이르는 시간이 곱을 전극 간 간격의 제곱으로 나눈 비율)가 0.05 이상 8.0을 넘지 않도록 배열된다. 상기 반응시약층에는 지방산과 4차 암모늄염이 부가적으로 포함될 수 있다.
측정기와의 전기적 연결은 작동전극(104)이 있는 절연판에 형성된 작동전극(104)과 보조전극(105) 연결선들을 통하여 같은 평면에서 이루어지도록 설계되어 있다. 또한, 작동전극(104)이 있는 절연판 또는 보조전극(105)이 있는 절연판 중 한쪽에 시료의 유동성을 측정할 수 있는 기능의 유동감지전극(107)이 작동전극(104) 또는 보조전극(105)과 적절하게 떨어진 거리에 형성되어 있다.
또한, 상기 작동전극(104)과 보조전극(105)을 격리시키는 박층 격리막의 전단부에는 항상 일정량의 시료를 사용할 수 있는 유로 및 시료도입부(100)가 형성되어 있다. 구체적으로는, 시료도입 통로부(101)와 통기부(102)가 교차 형성되고, 시료도입 통로부(101)와 통기부(102)가 만나는 지점에 여분공간부(103)가 형성된 구조를 갖는 시료도입부(100)를 구비한다. ㄱ 자 형태의 시료도입부(100)는 바이오센서 스트립 전단부로부터 빠르고 정확하고 편리하게 혈액 시료의 도입을 가능하게 한다. 이러한 시료도입부(100)는 시료도입 통로부(101), 통기부(102) 그리고 시료도입 통로부(101)와 통기부(102)가 교차 형성되고, 시료도입 통로부(101)와 통기부(102)가 만나는 지점에 여분공간부(103)가 형성된 구조를 갖는다. 본 명세서에서 "교차 형성되어 있다"라 함은, 시료도입 통로부(101)와 통기부(102)가 일직선으로 배열되어 있는 것이 아니라 한 점에서 교차하는 구조로 되어 있음을 의미한다. 측정하는 동안 상기 여분공간부(103)는 일정하고 정확한 시료양이 통로 내에 충만될 수 있도록 제조되며 통기부(102)를 통해 과량의 시료를 방출하는데에도 도움을 준다. 즉, 상기 여분공간부(103)는 시료도입 통로부(101)가 꺽어지는 모서리 부위(또는 교차점 부위)에서 발생할 수 있는 기포 형성을 최소화하는 역할을 수행한다. 상기 부위에 기포가 형성되면 정확한 측정이 어려운 문제점이 있다. 더욱이, 상기의 기포가 차지 않는 정확한 시료의 양을 보장하기 위해 여분공간부(103)를 포함하는 시료도입 통로부(101)는 친수성 처리가 요구된다.
상기 시료도입 통로부(101)와 통기부(102)의 너비의 비는 시료의 빠른 도입을 가능하게 하기 위해 1/2 이하, 가장 바람직하게는 1/5 ~ 1/2의 범위로 조절되는 것이 바람직하다. 1/2 이하로 조정함으로써 정확한 시료의 양을 보장할 수 있을 뿐 아니라 시료가 빠른 속도로 통기부(102)로 이동할 수 있게 된다.
상기 시료도입 통로부(101)와 통기부(102)가 이루는 각도(φ)는 도 1a에 도시한 바와 같이 90°를 이루는 것이 바람직하나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니며, 45~135°, 바람직하게는 60~120°, 가장 바람직하게는 75~105°의 범위 내에서 적절히 조절될 수 있다.
시료도입부(100)가 시료를 수용할 수 있는 전체 용적은 0.1 ~ 3.0 ㎕로 조절되는 것이 바람직하나, 보다 바람직하게는 0.1 ~ 1.0 ㎕, 더욱 바람직하게는 0.3 ~ 0.7 ㎕의 범위 내에서 조절되는 것이다. 상기의 용적이 0.1 ㎕ 보다 작을 경우에는 센서의 오차 범위에 의해 영향을 받아 정확한 측정이 담보될 수 없으며, 상기의 용적이 3.0 ㎕를 초과하는 경우에는 과도한 혈액 채취로 인한 문제점이 있어 바람직하지 않다. 또한, 시료도입 통로부(101)는 유동감지전극(107)을 배치하는 장소로도 이용된다.
특히, 상기 시료도입부(100) 및 유로는 유동감지전극(107)을 사용하여 전혈시료의 유동성을 측정하기에 유리하다. 전혈에서 적혈구용적률은 전혈의 유동성과 전기전도성을 변화시키므로, 본 발며에서 제시한 ㄱ 자형의 모세관 통로를 통해 혈액이 흐르는 시간은 혈액 내의 적혈구용적률에 비례하여 변화한다. 이러한 혈액 시료의 유동성 변화는 유동감지전극(107)을 사용하여 감지함으로써 실제 혈액 내의 혈당 측정에서 적혈구용적률에 의한 오차를 정정하는데 사용된다. 또한, 수명이 오래된 스트립 전극의 경우 또는 작동전극(104)에 올려진 시약층의 조성이 부적절한 경우에 혈액의 흐름 속도가 크게 영향을 받는다. 그러므로, 유동감지전극(107)으로 측정한 시료의 흐름 속도는 바이오센서의 보관 연한에 대한 추정이나 제작 공정상의 오류를 교정하는데 사용될 수 있다.
박층전기화학셀의 입구에 시료는 작동전극(104)과 유동감지전극(107) 또는 유동감지전극(107)과 작동전극(104)을 순차 지나며, 전압, 전류, 임피던스 또는 커패시턴스의 전기적 변화를 2회 야기하여 시료가 셀의 유로를 지나는 시간에 대한 정보를 제공한다. 상기 바이오센서는 시료가 박층 전기화학셀의 미세유로 내에서 흐르는 속도로부터 시료에 포함된 기질의 양을 정밀하게 결정하거나, 바이오센서의 제작 또는 보관 상태를 결정하는데도 향상된 기능을 제공한다.
추가로, 바이오센서 중 상부 기판(300)에는 하부 기판(400)의 유동성감지전극이 일정 부분 보일 수 있도록 시료확인창(301)이 구비될 수 있다. 상기 시료확인창(viewing window)(301)으로부터 시료의 충만 여부를 시각적으로 확인하게 된다.
상술한 바와 같은 전극 구조는 생체에서 추출한 시료 안에 포함된 기질인 효소와 전자전달 매개체에 의하여 생성된 연속된 산화/환원 반응의 순환(cycling) 효과에 의해 수초 이내에 전류값이 정상상태(steady state)에 도달하며, 특징적으로는 2초 정도의 시간에 정상상태에 도달한다. 이 경우 빠른 반응이 일어나기 위해 작동전극 또는 보조전극의 한쪽에만 올라가는 시약층은 시료주입구를 통해 주입된 시료에 의해 쉽게 용해가 가능해야 한다.
본 발명에서 제시한 적절한 농도의 염화헥사아민루세늄(Ⅲ)은 Fe 계열의 전자전달 매개체보다 수십 배 빠른 전자전달이 가능하다. 염화헥사아민루세늄(Ⅲ)과 적절한 농도의 지방산 및 4차 암모늄염, 그리고 보조적인 효소분산제는 혈액과 섞일 때 빠르게 용해되고 혈액의 적혈구용적률 차에 의한 의존 성향을 획기적으로 감소시킬 수 있는 반응시약 조성물을 형성한다.
따라서, 상기의 바이오센서는 적혈구용적률의 양에 따른 측정오차를 감소시킬 수 있는 감응막 조성물을 갖추고 있다. 보다 상세하게는, 상기 감응막 조성물은 효소, 전자전달매개체, 수용성 고분자, 지방산 및 4차 암모늄 염을 포함한다.
상기 감응막 조성물은 아스코르브산, 아세토아미노펜 및 요산 등과 같은 혈액 내 방해물질에 따른 신호 크기 변화의 영향을 감소시키며, 또한 적혈구용적률 효과를 획기적으로 감소시킨다.
상기 효소는 상기 [반응식 1]에 나타낸 바와 같이, 측정하고자 하는 다양한 대사물질과 반응하여 환원된다. 이후 환원된 효소와 전자전달매개체와 반응하여 대사물질을 정량하게 된다.
본 발명은 혈당 측정 바이오센서를 실시예로 설명하지만, 혈당 검사의 적용과 동일하게 특정효소에 알맞은 전자전달 매개체를 도입함으로써 다양한 대사물질, 예를 들면 콜레스테롤, 락테이트, 크레아티닌, 단백질, 과산화수소, 알코올, 아미노산, GPT(glutamate pyruvate transaminase), GOT(glutamate oxaloacetate transmianse)와 같은 효소 등의 생체 시료, 환경시료, 농업·공업 시료 또는 식품 시료 중의 다양한 유기물 또는 무기물 농도도 동일한 방법으로 정량할 수 있다.
따라서, 본 발명은 감응막 조성물에 포함되는 효소의 종류를 달리함으로써 다양한 대사물질의 정량에 이용될 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들면, 혈당 산화효소, 락테이트 산화효소, 콜레스테롤 산화효소, 글루타메이트 산화효소, 호스래디쉬(horseradish) 퍼옥시다아제, 알코올 산화효소 등을 사용해서 콜레스테롤, 락테이트, 글루타메이트, 과산화수소 및 알코올의 정량을 수행할 수 있다. 바람직하게는, 당산화효소(glucose oxidase; GOx), 당탈수소화 효소(glucose dehydrogenase; GDH), 콜레스테롤 산화효소, 콜레스테롤 에스테르화 효소, 락테이트 산화효소, 아스코빅산 산화효소(ascorbic acid oxidase), 알코올 산화효소, 알코올 탈수소화효소, 빌리루빈 산화효소(bilirubin oxidase) 및 당탈수소화효소로 이루어진 군에서 선택된 산화효소를 사용한다. 본 발명의 실시예에서는 혈당 측정 바이오센서에서 사용되는 효소로 당산화효소 또는 당탈수소화효소를 사용하였다.
전자전달 매개체는 대사물질과 반응하여 환원된 효소와 산화환원 반응하여 환원된다. 상기 환원 상태의 전자전달 매개체는 전극표면까지 확산되는 것에 의해 전극표면에 산화전위를 인가시키고 전류를 발생시키는 역할을 수행한다.
종래 사용된 페로센(ferrocene), 페로센 유도체, 퀴논(quinones), 퀴논 유도체, 유기 전도성 염(organic conducting salt) 또는 비오로겐(viologen)을 배제하는 것은 아니나, 바람직하게는 염화헥사아민루세늄(Ⅲ)(hexaammineruthenium(Ⅲ )chloride), 포타슘페리시아나이드(potassium ferricyanide), 포타슘페로시아나이드(potassium ferrocyanide), 디메틸페로센(dimethylferrocene(DMF)), 페리시니움(ferricinium), 페로센모노카르복실산(ferocene monocarboxylic acid(FCOOH)), 7,7,8,8,-테트라시아노퀴노디메탄(7,7,8,8-tetracyanoquino-dimethane(TCNQ)), 테트라티아풀발렌(tetrathia fulvalene(TTF)), 니켈로센(nickelocene(Nc)), N-메틸아시디니움(N-methyl acidinium(NMA+)), 테트라티아테트라센(tetrathiatetracene(TTT)), N-메틸페나지니움(N-methylphenazinium (NMP+)), 하이드로퀴논(hydroquinone), 3-디메틸아미노벤조산(3-dimethylaminobenzoic acid(MBTHDMAB)), 3-메틸-2-벤조티오조리논하이드라존(3-methyl-2-benzothiozolinone hydrazone), 2-메톡시-4-알릴페놀(2-methoxy-4-allylphenol), 4-아미노안티피린(4-aminoantipyrin(AAP)), 디메틸아닐린(dimethylaniline), 4-아미노안티피렌(4-aminoantipyrene), 4-메톡시나프톨(4-methoxynaphthol), 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(3,3',5,5'-tetramethyl benzidine(TMB)), 2,2-아지노-디-[3-에틸-벤즈티아졸린 술포네이트] (2,2-azino- di-[3-ethyl-benzthiazoline sulfonate]), o-디아니지딘(o-dianisidine), o-톨루이딘(o-toluidine), 2,4-디클로로페놀(2,4-dichlorophenol), 4-아미노페나존(4-amino phenazone), 벤지딘(benzidine) 및 프루시안 블루(prussian blue)로 이루어진 혼합 전자가 화합물 중 선택된 것을 사용한다.
본 발명에서 바람직한 전자전달매개체로는 염화헥사아민루세늄(Ⅲ)인 것으로, 이는 형식전위가 충분히 낮아 혈액 내의 아스코르브산(ascorbic acid), 아세토 아미노펜(acetaminophene) 및 요산(uric acid)과 같은 다양한 방해 종들에 의한 영향을 최소화할 수 있다는 특성을 갖는다.
사용하는 효소의 특성이 더 잘 발현되게 하기 위하여 고체상태의 감응막 조성물에 대해 폴리비닐피롤리돈(polyvinyl pyrrolidone; PVP), 폴리비닐알코올 (polyvinyl alcohol; PVA), 폴리플루오로술폰에이트(perfluoro sulfonate), 하이드록시에틸 셀룰로오즈(hydroxyethyl cellulose; HEC), 하이드록시프로필 셀룰로오즈(hydroxypropyl cellulose; HPC), 카르복시메틸 셀룰로오즈(carboxy methyl cellulose; CMC), 셀룰로오즈 아세테이트(cellulose acetate) 또는 폴리아미드(polyamide) 등과 같은 고분자 중에서 선택된 하나 이상의 물질을 0.1 ~ 10 중량% 함유하도록 사용하는 것이 바람직하며, 보다 바람직하게는 PVP와 HPC가 사용될 수 있다.
또한, 본 발명의 감응막 조성물은 적혈구용적률(hematocrit)의 양에 따른 측정오차를 획기적으로 감소시킬 수 있는 물질로서 지방산 및 4차 암모늄 염을 함유한다.
지방산은 감응막 조성물에 첨가됨으로써 적혈구용적률 수준 의존 성향을 감소시키는 역할을 수행한다. 또한, 고농도 영역에서 바이오센서의 선형 동적 영역(linear dynamic range)을 줄이는 경향을 나타낸다.
상기 지방산은 물 또는 물에 섞이는 용액에 녹여서 조성물에 첨가하고, 고체 상태의 조성물에 대해서 0.1 ~ 20 중량%를 첨가한다. 본 발명에서 지방산은 C4 ~ C20의 탄소사슬을 갖는 지방산 또는 그의 지방산염을 사용하며, 바람직하게는 C6 ~ C12로 이루어진 알킬탄소사슬을 갖는 지방산 또는 그의 지방산염을 사용한다. 상기의 지방산들로는 포화지방산, 카프로산, 헵타노산, 카프릴산, 노나노산, 카프르산, 언데카노산, 라우르산, 트리디케노산, 마이리스티산, 펜타디케노산, 팔미트산, 헵타디케노산, 스테아르산, 논아데케노산 및 아라키드산을 포함한다.
또한, 상기의 지방산과 함께 4차 암모늄 염이 감응막 조성물에 첨가됨으로써 적혈구용적률 의존 성향을 더욱 줄일 수 있다.
바람직하게는, 에실트리메틸 암모니움(ecyltrimethylammonium), 마이리스틸트리메틸암모니윰(myristyltrimethylammonium), 세틸트리메틸 암모니윰(cetyltrimethylammonium), 옥타데실트리메틸 암모니윰(octadecyltrimethylammonium) 및 테트라헥실 암모니윰(tetrahexylammonium ) 등의 할로겐화 화합물과 같은 4차 암모늄염(quaternary ammonium salt)을 사용한다. 본 발명에서는 그 효과를 고려하여 고체상태의 감응막 조성물에 대하여 0.1~30 중량% 첨가한다.
본 발명에 따른 조성물로 조제된 감응막은 작동전극(104) 위에 분주기로 간단히 도포하여 형성시킬 수 있다. 이때 감응막 조성물의 양은 300~500 nl가 바람직하며, 보다 바람직하게는 200 nl 이하를 사용한다.
이하는 상기의 구성을 갖는 바이오센서를 이용하여 혈당을 측정하는 방법에 대하여 기술한다. 상기의 측정 방법은 센서 스트립(509)을 혈당 측정기(500)에 장착한 후 바이오센서를 작동시켜 다음과 같은 단계로 측정을 진행할 수 있다. 바이오센서의 작동 개념을 도 4b의 회로도로서 간략히 나타내었다.
단계 1은, 센서 스트립(박층 전기화학셀)(509)이 삽입된 측정기(500)에 환자의 팔뚝으로부터 채취한 혈액시료를 투입하는 것이다.
이때 환자로부터 혈액 시료를 채취할 때의 고통을 최소화하면서 채혈하기 위한 시료의 바람직한 양은 0.1 ~ 0.7 ㎕이며, 이들 시료가 전처리 과정없이 도입된다. 본 발명의 측정방법에 사용되는 바이오센서를 사용하면 상기 소량의 혈액 시료로부터도 정확하고 빠르게 혈당을 측정할 수 있게 된다. 이는 상기 바이오센서의 시료도입부(100)에는 0.5 ~ 2 ㎜의 너비와, 50 ~ 250 ㎛의 높이를 갖는 유로가 형성되어 있어 혈액 시료의 도입을 용이하게 하기 때문이다.
단계 2는, 작동전극(104)과 보조전극(105) 사이와 유동감지전극(107)과 보조전극(105) 사이에 일정한 전위차가 주어진다.
스트립이 측정기에 삽입되면(단계 1), 이를 바이오센서가 감지하여 작동전극(104)과 보조전극(105) 사이와 유동감지전극(107)과 보조전극(105) 사이에 미리 예정된 일정한 전위가 걸리게 된다. 이때 걸어주는 작동전극(104)과 유동감지전극(107)에 가해진 전위는 독립적이며, 전체 회로는 개방회로(open circuit)를 형성한다. 시료 주입에 의한 전기적 변화가 개방회로 상태에서 전위차로 나타나게 되 고, 상기 전위차 신호를 바이오센서의 측정 과정의 시작 신호로 사용하게 된다.
효소와 전자전달매개체를 포함한 반응시약층은 작동전극(104) 또는 보조전극(105) 중 어느 하나의 전극에만 형성되어 있고, 상기 전극간 간격은 정상전류 시간상수가 0.05 내지 8.0의 범위로 조절되도록 배열되는 것이 바람직하다. 이때, 상기 효소로는 바람직하게는 상술한 효소 중 당산화효소(glucose oxidase; GOx), 또는 당탈수소화효소(glucose dehydrogenase; GDH)를 사용한다. 또한, 상기 전자전달매개체로 바람직하게는 염화헥사아민루테늄(Ⅲ)을 사용한다. 더욱이, 상술한 바와 같이, 상기 반응시약층에는 지방산과 4차 암모늄염을 부가적으로 포함할 수 있다.
또한, 감응막 조성물은 작동전극(104) 또는 작동전극(104) 및 유동감지전극(107)에 형성되어 있고, 이들 전극간의 간격 역시 정상전류 시간상수가 0.05 내지 8.0의 범위로 조절되도록 배열되는 것이 바람직하다.
단계 3은, 상기 혈액시료의 유입이 작동전극(104)과 보조전극(105) 사이에 1차 전기적 변화를 유발하고 상기 전극들 간의 전압을 동일하게 조정하는 것이다. 상기 전압을 동일하게 하기 위하여 전류가 흐르게 되고, 상기 시료와 반응시약층 간의 산화환원 반응을 수초 동안 억제하게 된다. 본 발명에 따른 산화환원반응의 억제시간은 0.001 내지 3초의 범위 내에서 조절되는 것을 특징으로 한다.
스트립을 측정기에 삽입하였다 하여 전체 회로가 연결되는 것은 아니다. 즉, 시료도입부(100)를 통해 혈액 시료가 도입되면 1차 순간전류의 흐름이 감지되고 유동시간 측정이 시작된다. 스트립의 유로 입구에 주입된 시료는 전해질을 포함하여 스위치 역할을 하여 작동전극(104)과 보조전극(105) 사이의 전극연결부(106)를 통하여 전류가 흐르게 되며, 이 때 흐르는 전류는 작동전극(104)과 보조전극(105) 사이의 전압을 동일하게 하여 시료가 반응시약층과 섞이는 수 초 동안, 바람직하게는 3초, 더욱 바람직하게는 2초 이하의 시간동안 이들의 산화환원 반응을 억제한다. 상기 과정 동안의 회로는 닫힌회로(closed circuit)를 유지하도록 한다.
단계 4는, 혈액 시료가 유동감지전극(107)에 닿으면 유동감지전극(107)이 상기 혈액 시료의 유동을 감지하여 2차 전기적 변화를 일으키고 다시 상기 보조전극(105)과 유동감지전극(107) 간의 전압을 동일하게 조정함으로써 작동전극(104)에서 1차 감지된 전기적 변화와의 시간 차이의 정보를 제공하는 것이다.
시료가 여분공간부(103)에 접촉함과 동시에 2차 순간전류가 감지되고, 1차 및 2차 순간전류 사이의 시간 간격이 기록된다. 즉, 박층 전기화학셀의 입구에 주입된 시료는 작동전극(104)과 유동감지전극(107) 또는 유동감지전극(107)과 작동전극(104)을 순차 지나며 전압, 전류, 임피던스 또는 커패시턴스의 전기적 변화를 2회 야기하여 시료가 셀의 유로에서 흐르는 시간에 대한 정보를 제공한다.
유동감지전극(107)은 작동전극(104)과 적절한 거리에 떨어져 있으며, 바람직하게는 혈구의 양이 40%이며 불소 처리된 혈액이 0.5 ~ 2 ㎜ 이내의 너비와 50 ~ 250 ㎛ 높이의 유로를 따라 약 600 ms 이내에 도달할 수 있는 거리에 위치하는 것이 바람직하다. 불소 처리되지 않은 시료에 대하여는 300 ms 이내에, 보다 바람직 하게는 200 ms 이내에 도달할 수 있는 거리에 위치한다.
본 발명의 바이오센서 중 시료도입부(100) 및 유로는 유동감지전극(107)을 사용하여 전혈시료의 유동성을 측정하기에 유리하다. 시료의 유동성은 여분공간부(103) 또는 통기부(102) 어느 한 쪽에 위치할 수 있는 유동성감지전극과 시료 도입구로부터 처음으로 만나는 지점의 전극 사이에서 시료가 채워지는 속도로서 결정된다.
전기화학셀 내 50 ~ 250 ㎛ 두께의 박층 격리판에 형성된 유로는 일정량의 시료가 있을 수 있는 직선 구조의 시료도입 통로부(101)와 모세관 작용을 도우는 통기부(102)가 있는 구조를 갖는다. 전혈에서 적혈구용적률은 전혈의 유동성과 전기전도성을 변화시키므로, 본 발명의 바이오센서 중 중간 격리판에서 제시한 ㄱ 자형의 모세관 통로를 따라 혈액이 흐르는 시간은 혈액 내의 적혈구용적률에 비례하여 변화한다. 이러한 혈액 시료의 유동성 변화는 유동감지전극(107)을 사용하여 감지함으로써 실제 혈액 내의 혈당 측정에서 적혈구용적률에 의한 오차를 정정하는데 사용될 수 있다. 또한, 수명이 오래된 스트립 전극의 경우 또는 작동전극(104)에 올려진 시약층의 조성이 부적절한 경우에도 혈액의 흐름 속도가 크게 영향을 받으므로 유동감지전극(107)으로 측정한 시료의 흐름 속도는 바이오센서의 보관 연한에 대한 추정이나 제작의 공정상 오류를 교정하는데 사용될 수 있다. 시료 충만 시간(X)과 적혈구용적률 간의 관계식(fitting eguation)은 하기 수학식 1과 같다.
[수학식 1]
Y = -72.23 + 0.58691X - 0.00084073 X2 - 1.1211x10-6 X3 + 5.7521x10 -9 X4 - 9.1172x10-12 X5
유동감지전극(107)은 혈액 시료의 비정상적인 유동성을 구별해 낸다. 이는 시료의 적혈구용적률이 너무 낮거나 높은 수준을 가지거나 공기 방울 형성으로 인한 혈액 시료의 잘못된 도입 등으로 인해 발생할 수 있다. 이 경우, 측정 장치에서 프로그램에 의한 경고 메세지나 오류 코드가 나타나게 된다.
단계 5는, 혈액 시료와 작동전극(104)에 놓인 시약이 충분히 섞이면 다시 작동전극(104)과 보조전극(105)에 소정의 전압이 인가되어 상기 전극 간에 전위차가 발생하도록 하여 대면형 박층 전기화학셀 내 순환반응(cycling reaction)을 일으킨 후 도달한 정상전류 값을 읽는 것이다. 이때, 정상상태는 수초 이내, 바람직하게는 2초 ~ 10초 이내에 도달하게 된다. 본 발명의 대면형 전극은 종래 평면형 전극에 비해 시료에 대한 빠른 응답속도와 높은 평형 상태전류(steady-state current)를 얻을 수 있다. 대면형 전극은 사용한 전자전달매개체의 반응속도 및 전자전달 속도가 적절하면 빠르게 정상전류를 제공한다.
단계 6은, 단계 4에서 얻어진 시간정보와 단계 5에서 얻어진 정상전류 값을 이용하여 시료 내에 존재하는 기질의 양을 결정하는 것이다. 본 발명에 의한 혈당 측정에 소요되는 전체 시간이 5초 이내, 바람직하게는 4초 이내, 보다 바람직하게는 3초 이내에 이루어지도록 수행되는 특징을 가진다.
본 발명의 혈당 측정은 생체에서 추출한 시료 안에 포함된 기질이 효소와 전자전달매개체에 의하여 연속적 산화/환원반응를 겪도록 만들고, 이 반응 과정에서 이동하는 전자들의 양을 측정하여 기질의 양을 정량함으로써 달성될 수 있다. 더욱이, 시료가 박층전기화학셀의 미세유로 내에서 흐르는 속도로부터 시료에 포함된 기질의 양을 더 정밀하게 결정하거나 바이오센서의 제작 또는 보관 상태를 결정하는데 도움을 준다.
상기 단계 1 내지 6의 과정은 다음과 같은 과정으로도 진행될 수 있다.
(1) 스트립이 삽입된 측정기에 혈액시료가 유입되면(단계 1),
(2) 작동전극(104)과 보조전극(105) 사이와 유동감지전극(107)과 보조전극(105) 사이에 일정한 높은 주파수의 교류전압를 걸어준다. 이때 걸어주는 작동전극(104)과 유동감지전극(107)에 가해진 전압은 독립적이며, 전체 회로는 개방회로(open circuit)를 형성한다(단계 2). 작동전극(104)과 보조전극(105)에 또는 유동감지전극(107)과 보조전극(105)에 교류전압을 가한 상태에서 시료 주입에 의한 전기적 변화가 커패시턴스로 나타나 상기 변화를 바이오센서의 측정 과정의 시작 신호로 사용한다.
(3) 스트립의 유로 입구에 주입된 시료는 작동전극(104)과 보조전극(105) 사이의 1차 커패시턴스를 변화시키며, 이 때의 커패시턴스 변화는 작동전극(104)과 보조전극(105) 사이에 동일한 전압을 걸리게 하여 시료가 반응시약층과 섞이는 수 초 동안, 바람직하게는 3초, 더 바람직하게는 2초 이하의 시간동안산화환원 반응을 억제한다. 이 과정 동안의 회로는 닫힌회로(closed circuit)를 유지하도록 한다(단계 3).
(4) 시료가 유동감지전극(107)에 닿으면 2차 커패시턴스 변화가 일어나며, 이 변화는 다시 보조전극(105)과 유동감지전극(107) 사이의 전압을 동일하게 조정하고, 처음 작동전극(104)에서 감지된 변화와의 시간 차이의 정보를 제공한다(단계 4).
(5) 혈액 시료와 작동전극(104)에 놓인 시약이 충분히 섞이면 다시 작동전극(104)과 보조전극(105) 사이의 전압차이를 일정 수준 이상 나게 하여 대면형 박층전기화학셀의 특징적인 순환반응(cycling reaction)이 일어나도록 하고 수 초 이내, 바람직하게는 2초 이내에 도달한 정상전류 값을 읽는다(단계 5).
(6) 단계 4에서 얻어진 시간정보와 단계 5에서 얻어진 정상전류의 값을 사용하여 시료 내에 존재하는 기질의 양을 결정한다. 전체 측정 시간은 5초 이내, 바람직하게는 4초 이내, 더 바람직하게는 3초 이내에 이루어지도록 한다.
또 다른 방법으로는,
(1) 스트립이 삽입된 측정기에 혈액시료가 유입되면, 작동전극(104)과 보조전극(105) 사이와 유동감지전극(107)과 보조전극(105) 사이의 고임피던스 입력(high impedance input) 회로의 측정기가 활성화된다(단계 1).
(2) 스트립의 유로 입구에 주입된 시료는 전해질을 포함하여 전극과 시료간의 계면에서 1차적인 전위차를 형성하고(단계 2),
(3) 이 변화를 읽어 작동전극(104)과 보조전극(105) 사이에 동일한 전압이 걸리게 하여 시료가 반응시약층과 섞이는 수 초 동안, 바람직하게는 3초, 더 바람직하게는 2초 이하의 시간동안산화환원 반응을 억제한다. 이 과정 동안의 회로는 닫힌회로(closed circuit)를 유지하도록 한다(단계 3).
(4) 시료가 유동감지전극(107)에 닿으면 2차 전압변화가 일어나며, 이 변화는 다시 보조전극(105)과 유동감지전극(107) 사이의 전압을 동일하게 조정하고, 처음 작동전극(104)에서 감지된 변화와의 시간 차이의 정보를 제공한다(단계 4).
(5) 혈액 시료와 작동전극(104)에 놓인 시약이 충분히 섞이면 다시 작동전극(104)과 보조전극(105) 사이의 전압차이를 일정 수준 이상 나게 하여 대면형 박층전기화학셀의 특징적인 순환반응(cycling reaction)이 일어나도록 하고 수 초 이내, 바람직하게는 2초 이내에 도달한 정상전류 값을 읽는다.
(6) 단계 4에서 얻어진 시간정보와 단계 5에서 얻어진 정상전류의 값을 사용하여 시료 내에 존재하는 기질의 양을 결정한다. 전체 측정 시간은 5초 이내, 바람직하게는 4초 이내, 더 바람직하게는 3초 이내에 이루어지도록 한다.
위에 제시한 방법 이외에도 작동전극(104)과 보조전극(105), 유동성감지전극과 보조전극(105) 사이에 직류, 저주파 또는 고주파 교류, 고임피던스 또는 다양한 형태의 펄스, 바람직하게는 직사각형파, 삼각파, 반정현파, 가우스파 등을 사용하 여 전체 측정 과정을 조절할 수 있다. 다만, 이때 시료 주입 시 발생하는 전기적 변화에 의한 시료주입시간 결정은 작업-기준전극 겸 보조전극(105) 간에 걸리는 과정 및 전류를 측정하는 과정과는 무관하게 진행되고, 측정이 끝난 후 시료가 작동-유동성감지전극 사이를 여행한 시간에 대한 정보를 화학반응에서 측정된 전기화학적 변화를 교정하는데 사용하며, 이는 미리 입력된 정보를 처리하는 소프트웨어로 행한다.
본 발명의 측정방법에 의하면, 혈액의 적혈구용적률 차에 의한 의존 성향을 시료의 유동성 정보에 의하여 획기적으로 감소시킬 수 있고, 비정상적으로 유동성이 낮거나 높은 혈액 시료를 구분해 냄으로써 사용자가 잘못된 정보를 얻을 가능성을 획기적으로 줄여주는 한편, 바이오센서 스트립의 사용 가능연한에 가까워짐에 따른 혈액주입 속도의 변화를 감지하여 스트립 제조의 품질관리의 편리성을 제공할 수 있다. 또한, 본 발명의 측정방법은 혈액시료를 전처리 과정없이 빠르고 일정하게 도입하여 사람으로부터 채혈된 소량의 시료로부터 5초 이내에 혈당의 측정 결과를 정확하고 빠르게 응답해 주는 이점을 제공한다.
또한, 상술한 시료도입부(100)가 구비된 바이오센서는 다음과 같은 여러 가지 장점을 제공한다. (1) 혈액시료를 모세관 현상으로 빠르게 빨아들일 때 교차점 부위에 여분공간부(103)를 만들어 약간의 여유 공간을 둠으로써 시료도입 통로부(101)가 꺾어지는 구석부위에서 발생할 수 있는 기포 형성 현상을 최소화 할 수 있으며, (2) 시료 도입부(100)가 가느다란 입구와 통기부(102)에 의해 잘 에워싸여 있고, 전체 시료 통로의 윗부분이 상부 기판(300)(또는 커버)으로 덮여 있으므로 센서를 측정하는 기구물에 장착하거나 탈착 시 도입된 시료가 누출되어 손에 묻는 일이 줄어들어 위생적이며, 측정시간 동안 시료 증발에 의한 농도의 변화를 최소화하여 분석적인 재현성을 향상시킬 수 있다. 그리고, (3) 시료통로부와 통기부(102)가 개략적으로 수직인 형태로 이어지는 시료도입부(100)를 가진 바이오센서들은 예정되어진 양의 혈액 시료의 빠른 도입이 가능하고 바이오센서의 정확성과 신뢰도 및 재현성을 향상시킬 수 있다. (4) 마지막으로, 시료 도입부(100)는 센서의 끝 부분에서 시료를 도입할 수 있도록 고안된 것이어서, 채혈부위에서 측정할 혈액과 쉽게 접촉할 수 있으므로 시료도입이 훨씬 편리하다는 장점을 갖는다.
이하, 본 발명을 실시예에 의하여 보다 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 하기 실시예에 의하여 한정되거나 제한되는 것은 아니다. 그러므로, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 아니하는 범위 내에서 본 발명을 자유롭게 변형 및 변경할 수 있으며, 이 또한 본 발명의 범위에 속함은 자명하다.
<실시예 1> 지방산을 사용하지 않은 감응막 시약의 준비
염화헥사아민루세늄(Ⅲ) 30 mg(41.6 중량%)과 카르복시메틸셀룰로오즈(carboxy methyl cellulose) 1 mg(1.4 중량%), Triton X-100(1.4 중량%) 1 mg, 그 리고 당산화효소 40 mg(55.6 중량%)을 포함한 혼합물을 pH 6.4 인 1㎖ PBS 완충용액에 녹이고, 용액 내에 남아있는 미립자들은 걸러서 제거하였다. 상기 얻어진 시약용액을 공기압축 분주기(EFD XL100)의 주사기 내에 보관하였다.
<실시예 2> 지방산을 사용한 감응막 시약의 준비
염화헥사아민루세늄(Ⅲ) 30 mg(23.6 중량%)과 카르복시메틸 셀룰로오즈(carboxy methyl cellulose) 1 mg(0.8 중량%), 폴리비닐피롤리돈(polyvinyl pyrrolidone; PVP) 5 mg(4 중량%), Triton X-100 1 mg(0.8 중량%), 라우르산(lauric acid) 20 mg(15.7 중량%), 브롬화미리스틸트리메틸암모늄(myristyltrimethylammonium bromide) 30 mg(23.6 중량%), 그리고 당산화효소 40 mg(31.5 중량%)을 포함한 혼합물을 pH 6.4 인 1㎖ PBS 완충용액에 녹이고, 용액 내에 남아있는 미립자들은 걸러서 제거하였다. 상기 얻어진 시약용액을 공기압축 분주기(EFD XL100)의 주사기 내에 보관하였다.
<실시예 3>
본 실시예는 혈당 측정 방법을 기술한다. 도 2 내지 도 3a, 도 3b의 보조전극(105)을 박층 전기화학셀형 바이오센서의 기준전극으로 사용하였다. 혈당 측정용 박층 전기화학셀은 다음과 같이 제조된다.
도 2 내지 도 3a, 도 3b에서와 같은 형태의 작동전극(104)과 도체물질을 두껍게 적층구조로 인쇄하여 보조전극과 3차원적으로 연결되는 부위가 형성되는 전극 연결부(106)를 탄소 반죽으로 스크린 프린팅한 후 140℃에서 5 분간 열처리하였다. 그 후, 전극연결부(106)의 끝 부분에 은반죽을 중간 기판(200) 전극의 두께가 되도록 스크린 프린팅하여 회로연결부를 완성하였다. 상부 기판(300) 전극을 탄소 반죽으로 기준전극 겸 보조전극(105)으로 스크린 프린팅하여 하부 기판(400) 전극 제작시와 동일한 조건에서 열처리하였다. 기준전극 겸 보조전극(105)의 끝 부분을 은반죽으로 회로연결부를 형성시켜 대면형 바이오센서의 상부기판 전극을 제작하였다.
폴리에스테르 재질의 양면테이프에 도 2 내지 3에 도시된 모양의 시료도입 통로부(101), 통기부(102) 및 여분공간부(103)와 유동감지전극(107)의 끝 부분이 상기 여분공간부(103)에 위치하도록 중간 기판(200)을 프레스 금형으로 제작하였다. 시료도입 통로부(101)와 통기부(102)의 너비의 비는 2:1이 되도록 조절하였다. 상기와 같이 형성된 시료도입부(100)가 시료를 수용할 수 있는 전체 용적이 0.5 ㎕가 되도록 제작하였다.
도 2 내지 3a, 3b에 보인 바와 같이, 바이오센서를 완성하기 위하여 전극이 인쇄된 하부 기판(400) 위에 중간 기판(200)을 압착하여 조립하였다. 그 다음, 노출된 시료통로 부위의 작동전극(104) 위에 상기 실시예 1 또는 2에 따른 감응막 시약 용액을 도포한 후 45℃에서 30 분간 건조시켰다. 효소 혼합물이 건조된 후 중간 기판(200)의 윗면을 상부 기판(300) 전극으로 회로연결부가 잘 연결되도록 압착하여 대면형 바이오센서를 제작하였다. 이때, 도 3a의 경우는 유동감지전극이 상판에 구비된 대면형 전극을, 도 3b의 경우는 유동감지전극이 하판에 구비된 대면형 바이오센서 전극을 제작하였다.
상기 제작된 센서로 혈당 농도를 측정하기 위하여, 환자의 팔뚝에서 혈액 시료 0.5㎕를 스트립으로 채혈하였고, 상기 스트립이 측정기의 스트립 삽입구 내로 삽입되면 측정기가 작동하기 시작한다. 상기 스트립이 측정기에 삽입되면 셀 내 200mV의 전위차가 작동전극(104)과 보조전극(105)(기준전극) 간에 인가된다.
구체적으로, 스트립이 삽입된 측정기 작동순서는 다음과 같다.
센서 스트립(509)이 삽입된 측정기(500)에 채취한 혈액시료를 투입하면(단계 1), 작동전극(104)과 보조전극(105) 사이 및 유동감지전극(107)과 보조전극(105) 사이에 일정한 전위차가 주어지고(단계 2), 스트립의 시료 도입부를 통해 유입된 상기 시료가 작동전극(104)과 보조전극(105) 사이에 1차 전기적 변화를 유발하고 상기 전극들 간의 전압을 동일하게 조정하게 되고(단계 3), 유동감지전극(107)이 상기 시료의 유동을 감지하여 2차 전기적 변화를 일으키고 상기 보조전극(105)과 유동감지전극(107) 간의 전압을 동일하게 조정함으로써 작동전극(104)에서 1차 감지된 전기적 변화와의 시간 차이의 정보를 제공하며(단계 4), 혈액 시료와 작동전극(104)에 놓인 시약이 충분히 섞이면 다시 작동전극(104)과 보조전극(105) 사이에 200mV의 전압이 인가되어 대면형 박층전기화학셀 내 순환반응(cycling reaction)을 일으킨 후 도달한 정상전류 값을 읽은 후(단계 5), 단계 4에서 얻어진 시간 정보와 단계 5에서 얻어진 정상전류 값을 이용하여 시료 내에 존재하는 기질의 양을 측정함으로써(단계 6) 혈당을 측정하였다.
즉, 이와 같은 일련의 과정을 통해 본 발명의 바이오센서는 혈액내의 혈당의 양을 쉽고 빠르며 정확하게 측정할 수 있다.
<실험예 1> 대면형 글루코오즈 센서의 주사속도에 따른 순환전압전류도(cyclic voltammogram)
실시예 3에 의해서 제작된 대면형 전극을 사용하여 서로 다른 주사속도에 따른 순환전압전류도를 알아보았다.
실험조건은 0.05 mM[Fe(CN)6/[Fe(CN))6]4- 용액이 포함된 1 M KCl 용액 하에서 실행되었다. 그 결과, 3 mV/s 이하의 주사 속도에서 본 발명에 의한 전극은 미소전극의 평형상태 전류성격을 가지는 S 곡선을 나타내었다. 자세하게는, 한계조건하에서 두전극 표면의 농도가 제로가 되며 전류는 전위와 독립적이고 한계 전류는 전위와 독립적이게 된다. 주사 속도가 커짐에 따라, 가역과 비가역사이의 이력현상(hysteresis)은 커지게 된다. v가 20 mV/s보다 크거나 같게 될 때의 CV는 본 발명에 사용한 대면형 전극에서 S 신호가 아닌 평면형 전극의 신호와 같은 형상을 보여준다. 그 결과를 도 5에 나타내었다. CV에서 피크 분리(peak separation)는 약 55 mV이고 이러한 값은 전극과 [Fe(CN)6]3-/4- 사이의 높은 가역적인 전자전달 과정을 나타내는 것이다.
결론적으로, 상기의 결과는 선형 스윕형 전기량계(linear sweep voltammeter) 상의 평면 확산쪽의 반구형(hemispherical) 확산 변화 효과에 의한 뷸규칙으로 형성된 미소전극(random assembled microelectrode)의 연구결과와 유사한 결과를 보인다. 이는 본 발명에 사용하는 탄소전극이 불규칙한 크기의 탄소 알갱이가 모여서 하나의 전극을 구성하는 미소전극과 유사한 성질을 가짐을 제시하고 있다.
<실험예 2> 대면형 글루코오즈 센서와 평면형 센서의 대시간전류법적(Chronoamperometric) 감응시간 비교
실시예 3에 의해 제작된 대면형 전극과 전극들이 하나 절연체에 위에 형성된 평면형 전극의 대시간전류법적 감응비교 결과는 다음과 같다.
대면형 전극은 평면형 전극에 비해 시료에 대한 빠른 응답속도와 높은 평형상태 전류(steady-state current)를 얻을 수 있었다. 결과를 도 6에 나타내었다. 대면형 전극은 사용한 전자전달매개체의 반응속도 및 전자전달 속도가 적절하면 빠르게 정상전류를 제공한다. 이 때 전극의 배열과 반응시약층의 조합에 따라 변화하는 정상전류의 조건을 판단하기 위하여 정상전류 시간상수 (t* = Dt/d2)를 사용한다.
본 발명의 일실시예로서 제작한 바이오센서의 감응 곡선은 정상전류에 이르는 시간이 약 2초 정도이며, 전자전달매개체 염화헥사아민루테니움(Ⅲ)의 확산계수는 1.8x10-5 cm2/s, 전극 간 간격은 약 100 μm이므로, t* = 0.36가 됨을 알 수 있다.
기존의 연구결과(J. F. Cassidy et al., Analyst, 118, 415 (1993))에 의하면 t*>0.01의 조건을 만족할 때 정상전류에 이를 수 있다. 본 발명에서 제시하는 바이오센서의 t*는 0.05 이상 8.0 이하의 조건을 만족한다.
도 7은 글루코오즈 농도가 2.77 에서 33.3 mM 까지에서 2.77 mM 증가에 따른 대면형 전극의 대시간전류법적 감응 결과를 나타낸다. 비록 이러한 반응시간은 글루코오즈 농도가 진해질수 록 증가하였다. 그러나, 도 7에서 알 수 있는 것과 같이, 결정범위 내에서 2 초이내의 빠른 평형상태 전류(steady-state current)를 얻을 수 있었고, 이와 같은 더 빠르고 완전한 평형전류상태 응답은 신속한 데이터 처리와 함께 센서의 분석적 이행을 향상시킬 수 있게 된다.
<실험예 3> 대면형 글루코오스 센서에서의 방해물질에 의한 영향 검증
실시예 3에 의해 제작된 평균값 0.5 ㎕ 시료도입부(100)를 가진 대면형 글루코오스 센서에서의 글루코오스, 아스코르브산, 아세토아민노펜 및 요산과 같은 방해물질 및 완충용액에 대한 영향을 측정하였다.
구체적으로, (a) 글루코오스 177 mg/dL를 PBS 완충용액(PBS Buffer pH 7.4)에 녹인 용액, 방해 물질인 (b) 글루코오스 177 mg/dL + 아세토아민노펜 660 μM, (c) 글루코오스 177 mg/dL + 아스코르브산 570 μM, (d) 글루코오스 177 mg/dL + 요산 916 μM을 포함하는 각각의 용액에 대한 감응 전류를 측정하였다.
이때, 전체 감응 전류는 기준전극 대비 인가전위 +0.2 V 전위를 작동전극(104)에 걸고 5초 후에 대시간전류법의 감응을 읽어서 측정하였다. 결과를 도 8에 나타내었다.
도 8에서 볼 수 있듯이, 글루코오스 177 mg/dL를 PBS 완충용액(PBS Buffer pH 7.4)에 녹인 용액에 대한 측정결과(a 직선)와 방해 물질에 대한 영향을 알아보기 위해 각각 글루코오스 177 mg/dL에 아세토아민노펜 660 μM(b 직선), 아스코르브산 570 μM(c 직선), 요산 916 μM(d 직선)을 포함하는 용액에 대한 측정결과는 큰 차이가 없었다. 이러한 결과로부터, 기준전극(Ag/AgCl) 대비 인가전위 0.2 V에서는 전기화학적 바이오센서에 대한 방해물질들의 작용이 미미함을 알 수 있다.
<실험예 4> 대면형 글루코오스 센서의 글루코오스 표준용액에 대한 검정
실시예 3에 의해 제작된 대면형 글루코오스 센서를 이용하여 글루코오스 표준용액에 대한 검정테스트를 수행하였다.
구체적으로, 각각의 글루코오스 농도가 0, 50, 150, 300, 450 및 600 mg/dL인 표준용액에서 각 농도당 10 회씩 기준전극 대비 인가전위 0.2 V에서 전류값을 측정하였다. 이때, 센서도입부에 적용된 시료의 양은 0.5 ㎕이며, 시료가 도입부를 채우는데 걸리는 시간은 약 200 ms 이내였다. 측정은 시료가 시료도입부(100)를 채운 후 2초의 반응시간을 주고, 다음 0.2 V의 전압을 3초간 가하여 5초에서의 전류 값을 읽었다. 결과를 도 10에 나타내었다.
도 10은 정압전류법 측정의 동적 감응 곡선으로서, 각각의 곡선들은 글루코오스 0 mg/dL(a 곡선), 50 mg/dL(b 곡선), 150 mg/dL(c 곡선), 300 mg/dL(d 곡선), 450 mg/dL(e 곡선) 및 600 mg/dL(f 곡선)을 나타낸 것이다.
도 10에서 보는 바와 같이, 본 발명의 바이오센서는 빠른 시간에 정상전류(steady state current)에 도달하여 측정에 대한 결과가 신속하고 정확할 수 있음을 보여준다.
또한, 본 발명의 바이오센서에서 얻을 수 있는 감응 기울기는 0.093[㎂/(mg/dL)]이고, 선형성은 0.997으로, 본 발명의 바이오센서가 탁월한 직선성 감응을 보여주었다(도 9 참조).
<실험예 5> 혈액 유동성 측정과 적혈구용적률 성향 보정
실시예 3에 의해 제작된 유동감지 전극이 구비된 대면형 글루코오스 센서를 이용하여 혈액 유동성 측정과 적혈구용적률 성향 보정 테스트를 수행하였다.
구체적으로, 200 mV의 전위를 작동전극(104)과 유동감지전극(107)에 인가하였다. 시료도입부(100)를 통해 혈액시료가 도입되면 1차 순간전류의 흐름이 감지되고 유동시간 측정이 시작된다. 시료가 여분공간부(103)에 접촉함과 동시에, 2차 순간전류가 감지되고, 제 1 및제 2의 순간전류 사이의 시간 간격이 기록된다. 이러한 시료도입시간과 적혈구용적률 사이의 상관관계를 도 11에 나타내었다. 실험은 180 mg/dL 혈당과 다양한 양의 적혈구용적률 수준을 포함하는 플루오르화 소디움(sodium fluoride)으로 처리된 전혈을 사용해서 실시하였다.
실험 결과, 하기 수학식 1과 같은 관계식(fitting equation)을 얻을 수 있었다.
Y = -72.23 + 0.58691X - 0.00084073 X2 - 1.1211x10-6 X3 + 5.7521x10 -9 X4 - 9.1172x10-12 X5
(상기 식에서, Y 는 유동성 감지전극을 사용해서 측정되어진 시료 충만시간 X로부터 얻은 추정된 적혈구용적률 수준이다)
하기 표 1은 시료 충만 시간의 속도로부터 추정되어진 적혈구용적률 수준을 보여준다.
실시예 3에 의해 제작된 바이오센서의 시료 충만 시간으로부터 추정되어진 적혈구용적률 수준
준비된 시료의 적혈구용적률 (%) 속도 (ms) 추정된 적혈구용적률 (%)
30 % 326 30.3 %
35 % 352 32.8 %
40 % 530 41.8 %
45 % 634 44.0 %
50 % 1129 50.1 %
55 % 1791 54.7 %
독립적인 실험으로 보정 곡선은 다양한 적혈구용적률 수준에서 전혈을 사용해 얻어졌고, 그리고 적혈구용적률 수준과 감응 기울기 사이의 상관관계는 표 2에 공식화되었다.
서로 다른 적혈구용적률 수준에서 보정 곡선
적혈구용적률 관계식 (y = 전류 μA; X = 혈당
30 % y = 0.035934 x + 1.7228
35 % y = 0.030559 x + 1.31815
40 % y = 0.025831 x + 1.0137
45 % y = 0.021752 x + 0.80945
50 % y = 0.018322 x + 0.7054
55 % y = 0.015539 x + 0.70155
이와 같은 방식으로 유도된 수정항은 40% 적혈구용적률 수준을 가지는 전혈에 대해 측정되어진 혈당 수준을 재보정하는데 이용되고, 결과적으로 이러한 보정을 거친 바이오센서들은 적혈구용적률에 영향을 받지 않고 혈당 농도의 측정을 할 수 있다. 즉, 측정기는 처음 시료도입 속도를 읽고 혈액시료 내의 적혈구용적률을 결정한다. 그리고, 표에서 일치하는 보정곡선을 찾아서 측정되어진 전류 값으로부터 보정된 혈당 수준을 결정하게 된다.
표 3은 이와 같은 방식으로 실행한 실험의 결과를 보여준다.
전혈에서 혈당 농도
적혈구용적률 (%) 혈당 YSI 2300 (mg/dL) 적혈구용적률 영향을 보정한 혈당치 (mg/dL)
30 % 111 117
202 186
381 392
35 % 138 141
200 207
276 277
40 % 107 112
196 195
266 264
45 % 103 105
190 189
367 363
50 % 102 107
142 143
253 256
55 % 125 144
241 240
332 331
시료도입 속도는 유동감지전극(107)으로 측정하였고, 전혈의 혈당 수준을 계산하기 위해 표 2의 보정곡선을 이용하였다.
유동감지전극(107)은 또한 혈액시료의 비정상적인 유동성을 구별해 내었다. 이런 현상은 너무 낮거나 높은 적혈구용적률 수준을 가진 시료거나 공기 방울 형성으로 인한 혈액 시료의 잘못된 도입 등에서 발생할 수 있다. 측정시 이러한 경우는 측정 장치에서 프로그램에 의해 경고 메시지나 오류코드가 나타내게 한다.
<실험예 6> 시약 층에 함유된 지방산에 의한 감소된 적혈구용적률 방해작용
실시예 3에 의해 바이오센서 스트립을 제작하였다. 헤파린(heparin; 혈액응고 방지제)으로 처리한 전혈시료는 혈장과 적혈구용적률로 원심분리기를 이용하여 분리하고, 20, 40, 60 %의 세가지 다른 적혈구용적률 수준의 혈액시료를 얻기 위해 다시 섞었다. 혈당 측정에 대한 적혈구용적률의 영향은 실시예 1과 2에서 준비된 시약층을 사용한 바이오센서를 사용하여, 세 가지 다른 혈당 농도에서 평가되었다. 결과를 표 4 및 표 5에 나열하였다.
혈당 측정에서 실시예 1 의 감응막 시약층을 사용한 바이오센서에서관측된 적혈구용적률 영향
시료 1 2 3
적혈구용적률 수준 20 40 60 20 40 60 20 40 60
YSI 혈당 수준 (mg/dL) 137 126 113 264 238 228 389 377 339
실시예 1의 시약을 사용한 바이오센서 175 125 88 365 231 146 544 369 114
40 % 적혈구용적률 수준의 성향 % 관계 29 0 -22 42 0 -34 43 0 -66
40 % 적혈구용적률 결과에 비해 벗어난 정도 = (본 발명 바이오센서에 의한 혈당 수준/ YSI 장비에 의한 혈당 수준)/(40 %적혈구용적률에서 본 발명 바이오센서에 의한 혈당 수준/40 %적혈구용적률에서 YSI 장비에 의한 혈당 수준)-1 ×100
혈당 측정에서 실시예 2의 감응막 시약 조성을 사용한 바이오센서에서 측정된 적혈구용적률의 영향성
시료 1 2 3
적혈구용적률 수준 20 40 60 20 40 60 20 40 60
YSI 혈당 수준 (mg/dL) 120 111 107 212 199 191 435 398 374
실시예 2의 시약을 사용한 바이오센서 133 114 99 241 201 185 423 382 334
40 % 적혈구용적률 수준의 성향 % 관계 8 0 -10 13 0 -4 1 0 -7
실험결과, 실시예 2에 의해 준비된 시약을 사용한 바이오센서는 실질적으로 적혈구용적률 영향이 뚜렷이 감소되고 임상학적 허용 범위 내에 있는 40 % 적혈구용적률 수준에 대한 상대오차를 보임을 분명히 알 수 있다.
상기의 구성을 갖는 본 발명의 측정방법에 의하면, 혈액의 적혈구용적률 차에 의한 의존 성향을 시료의 유동성 정보에 의하여 획기적으로 감소시킬 수 있고, 비정상적으로 유동성이 낮거나 높은 혈액 시료를 구분해 냄으로써 사용자가 잘못된 정보를 얻을 가능성을 획기적으로 줄여주는 한편, 바이오센서 스트립의 사용 가능연한에 가까워짐에 따른 혈액주입 속도의 변화를 감지하여 스트립 제조의 품질관리의 편리성을 제공할 수 있다. 또한, 본 발명의 측정방법은 혈액시료를 전처리 과정없이 빠르고 일정하게 도입하여 사람으로부터 채혈된 소량의 시료로부터 수초 이내, 바람직하게는 5초 이내에 혈당의 측정 결과를 정확하고 빠르게 응답해 주는 이점을 제공한다.
또한, 상기의 측정 과정을 도입한 바이오센서는 전처리 과정 없이 빠르고 일정하게 도입할 수 있는 시료도입부(100)를 구비하고, 추가로 전혈시료의 유동성을 측정할 수 있는 유동감지전극(107)을 구비한 것으로, 구조가 단순하고 제조가 용이하며, 0.1 ~ 0.7 ㎕의 소량 시료를 전처리 과정이 필요 없이 일정하게 도입할 수 있으며, 전극간의 재현성이 뛰어나며, 전극 형성에 있어 작동전극(104)과 보조전극(105)이 서로 대칭 또는 비대칭으로 마주보는 대면형 형태로 두전극의 간격은 수백 μm 이내인 박층전기화학셀(thin layer electrochemical cell) 구조로 이루어져 생체에서 추출한 시료 안에 포함된 기질인 효소와 전자전달매개체에 의하여 생성된 연속된 산화/환원 반응의 순환(cycling) 효과에 의해 2초 이내에 전류가 정상상태(steady state)에 도달한다. 이 경우 빠른 반응이 일어나기 위해 작동전극(104) 또는 보조전극(105)의 한쪽에만 올라가는 시약층은 시료주입구를 통해 주입된 시료에 의해 쉽게 용해가 가능해야 하는데, 본 발명은 루세늄을 전자전달 매개체로 사용함으로써 Fe 계열보다 10 배 빠른 전자전달이 가능하였고 쉽게 용해되는 장점이 있다. 그리고, 상기 바이오센서에 사용되는 반응시약에 있어서는 적혈구용적률에 따른 측정오차를 획기적으로 감소시킨 감응막 조성물을 사용함으로써 혈액 내 방해물질과 혈액 내의 전극활성 물질, 또한 적혈구용적률에 따른 신호크기 변화의 영향을 획기적으로 감소시키는 이점을 얻을 수 있다.

Claims (13)

  1. 한 장의 평면 절연판에 코팅된 작동전극과; 상기 작동전극과 같은 평면 또는 다른 한 장의 평면 절연판에서 일정 간격 이격되어 있는 주입 시료의 유동성을 감지하는 유동감지전극과; 상기 작동전극과 대향하는 다른 한 장의 평면 절연판 위에 코팅된 보조전극과; 미세유로가 형성된 시료도입부를 구비하며 상기 작동전극과 상기 보조전극을 일정 간격 격리시켜 압착시키는 점착성 격리판과; 도체 물질을 두껍게 적층 구조로 인쇄하여 보조전극과 차원적으로 연결되는 부위가 형성되어 상기 작동전극과 보조전극을 연결시키는 전극연결부; 및 전자전달 매개체와 산화효소를 포함한 반응시약층으로 구성된 대면형의 박층전기화학셀을 구비한 전기화학적 바이오센서를 사용하여,
    (1) 센서 스트립이 삽입된 측정기에 채취한 혈액시료를 투입하는 단계;
    (2) 작동전극과 보조전극 사이 및 유동감지전극과 보조전극 사이에 일정한 전위차가 주어지는 단계;
    (3) 상기 시료의 유입이 작동전극과 보조전극 사이에 1차 전기적 변화를 유발하고 상기 전극들 간의 전압을 동일하게 조정하는 단계;
    (4) 유동감지전극이 상기 시료의 유동을 감지하여 2차 전기적 변화를 일으키고 상기 보조전극과 유동감지전극 간의 전압을 동일하게 조정함으로써 작동전극에서 1차 감지된 전기적 변화와의 시간 차이의 정보를 제공하는 단계;
    (5) 혈액 시료와 작동전극에 놓인 시약이 충분히 섞이면 다시 작동전극과 보 조전극 사이에 소정의 전압이 인가되어 대면형 박층전기화학셀 내 순환반응(cycling reaction)을 일으킨 후 도달한 정상전류 값을 읽는 단계; 및
    (6) 단계 4에서 얻어진 시간 정보와 단계 5에서 얻어진 정상전류 값을 이용하여 시료 내에 존재하는 기질의 양을 측정하는 단계로 구성된 것을 특징으로 하는 전기화학적 바이오센서를 이용하여 혈당을 측정하는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 단계 1의 혈액 시료는 0.1 ~ 0.7 ㎕의 소량 시료가 전처리 과정없이 센서 스트립에 도입되는 것을 특징으로 하는 측정 방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 단계 1의 전위차는 작동전극과 보조전극, 유동감지전극과 보조 전극 간에 직류; 저주파 또는 고주파 교류; 고임피던스 또는 직사각형파, 삼각파, 반정현파 및 가우스파 중에서 선택된 펄스의 변화로 유발되는 것을 특징으로 하는 측정 방법.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 전기적 변화는 전압, 전류, 임피던스 또는 커패시턴스의 변화에 의한 것임을 특징으로 하는 측정 방법.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 바이오센서 중 시료도입부에는 0.5 ~ 2㎜의 너비와 50 ~ 250㎛의 높이를 갖는 유로가 형성되어 시료의 도입을 용이하게 한 것을 특징으로 하는 측정 방법.
  6. 제 1 항에 있어서, 단계 3의 전극들 간의 전압을 동일하게 조정함으로써 상기 시료와 반응시약층 간의 산화환원 반응을 수초 동안 억제하는 것을 특징으로 하는 측정 방법.
  7. 제 1 항에 있어서, 상기 바이오센서 내 효소와 전자전달매개체를 포함한 반응시약층은 작동전극 및 보조전극 중 어느 하나의 전극에만 형성시켜 빠른 반응이 일어나도록 한 것임을 특징으로 하는 측정 방법.
  8. 제 7 항에 있어서, 상기 효소는 당산화효소 또는 당탈수소화효소인 것을 특징으로 하는 측정 방법.
  9. 제 7 항에 있어서, 상기 전자전달 매개체는 염화헥사아민루테늄(Ⅲ)으로 전자전달을 용이하게 한 것임을 특징으로 하는 측정 방법.
  10. 제 7 항에 있어서, 상기 반응시약층이 지방산 및 4차 암모늄염을 부가적으로 포함하여 적혈구용적률 차에 의한 의존 성향을 더 감소시킨 것을 특징으로 하는 측정 방법.
  11. 제 10 항에 있어서, 상기 지방산은 C4 ~ C20의 사슬을 갖는 염으로 카프로산, 헵타노산, 카프릴산, 노나노산, 카프르산, 언데카노산, 라우르산, 트리디케노산, 마이리스티산, 펜타디케노산, 팔미트산, 헵타디케노산, 스테아르산, 논아데케노산 및 아라키드 산으로 이루어진 그룹 중에서 선택되며, 고체상태의 조성물에 대하여 0.1 ~ 20 중량% 포함되는 것을 특징으로 하는 측정 방법.
  12. 제 10 항에 있어서, 상기 4차 암모늄염은 도데실트리메틸암모니윰, 에실트리메틸 암모늄, 마이리스틸트리메틸암모늄, 세틸트리메틸 암모늄, 옥타데실트리메틸 암모늄 및 테트라헥실 암모늄 등의 할로겐 화합물 그룹 중에서 선택되며, 고체 상태의 조성물에 대하여 0.1 ~ 30 중량% 포함하는 것을 특징으로 하는 측정 방법.
  13. 제 1 항에 있어서, 상기 바이오센서 내 감응막 조성물은 작동전극 및 유동감지전극 중 어느 하나의 전극 또는 상기 모든 전극에 형성되고, 상기 전극간 간격은 정상전류 시간상수가 0.05 내지 8.0 의 범위로 조절되어 빠른 반응을 도울 수 있도록 배열되는 것을 특징으로 하는 측정 방법.
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