TWI472755B - 利用交流阻抗法量測糖化蛋白比例之方法 - Google Patents

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利用交流阻抗法量測糖化蛋白比例之方法
本發明係有關於一種利用交流阻抗法量測糖化蛋白比例之方法。
糖尿病的控制常常以血糖的高低當做控制指標，以為血糖越接近正常值表示血糖控制的越好；而相關的血糖量測技術例如有中華民國專利第M384315號「非侵入式之光學檢測血糖測試機」、第I295566號「具採血槍結構的血糖檢測儀器」，或是美國專利公開第2009/0292186號「Method and System for Non-Invasive Optical Blood Glucose Detection Utilizing Spectral Data Analysis」等等，都是直接量測血液中的血糖值。
但其實血糖是會隨著時間及飲食量產生很大的變化的，血糖檢測數值只代表撿查時當時下的血中含糖數值，所以絕不能單以此血糖值做為絕對性糖尿病控制的指標。
而一般正常人紅血球中，血紅素(Hb)佔95%以上，當人體失去胰島素控制時，葡萄糖會大量釋出於血液中，而血液中的葡萄糖會緩慢的和Hb結合形成糖化血紅素(HbA1C)，由於HbA1C形成的 過程緩慢，需要時間累積形成，所以HbA1C的高低和每天的平均血糖濃度有關，不因飯前飯後的血糖濃度改變而立即變化，飯後採血也不會有很大的差異；因此根據葡萄糖和Hb結合的程度，WHO指示當糖化血紅素佔總血紅素量的6.5%以上可視為罹患糖尿病。
所以近幾年檢測HbA1C含量被廣泛應用於監控糖尿病患者之平均血糖值，又由於紅血球壽命約為3個月，所以一般認為HbA1C含量反應採血前3個月左右的血糖控制狀況，可用來監督血糖控制的情形，並可作為藥量調整的依據，又根據國際糖尿病協會(International Diabetes Federation)估計，目前全球糖尿病人口約近二億人，且預估至2025年全球糖尿病人數將超過三億人，因此HbA1C的檢測在未來具有龐大商機，是一種值得投入研發的技術，且快速方便的HbA1C檢測技術也能幫助糖尿病患精準控制體內血糖值，減少併發症的發生。
針對HbA1C的檢測相關技術而言，有美國專利第6582964號「Method and apparatus for rapid measurement of HbA1c」，是一種利用光學檢測的方法；或者是美國專利公開第US2010/0178659號「METHOD OF MEASURING HbA1c」，是一種利用酵素檢測的方法；另外，尚有利用電化學方式的量測方法，電化學量測方式有直流式及交流式兩種，針對生物感測器而言，主要是以直流式量測為主，例如美國專利第US7998017號「Systems and methods for replacing signal artifacts in a glucose sensor data stream」，而直流式量測方式主要是利用循環伏安法，但是在面對具有降低檢測電極表面導電性之表面改質後，其 檢測電極的電子轉移活動降低，此時利用循環伏安法無法適當使用在檢測電極與待測物間的量測。
交流阻抗量測法可以解決前述缺失，因此有使用交流阻抗量測糖化蛋白的發明，例如有美國專利第US 2011/0123399號「DEVICE FOR MEASURING PROTEINS USING BIOSENSOR」。
更進一步亦有使用交流電刺激作為治療糖尿病之技術手段，例如美國專利第US 2009/0254133號「Method for treatment of diabetes by electrostimulatioin」，其揭露可利用頻率介於0.00065赫茲至0.00085赫茲，且安培數介於20豪安培至1 atto(10-18)安培的交流電刺激達到治療控制胰島素依賴型糖尿病患者血糖的穩定。
鑑於交流阻抗量測的優勢，因此本發明根據交流阻抗式電化學生物感測晶片可以針對生物分子自有的電特性響應出不同的頻率、電壓、電流、阻抗或相位的變化來區分生物分子間不同的變化，因此使用阻抗式電化學生物感測晶片配合使用交流阻抗法來分辨糖化蛋白與未糖化蛋白之差異，以糖化血紅素(HbA1C)與血紅素(Hb)為例，可用以判斷體內糖化血紅素佔總血紅素比例。
糖化蛋白與未糖化蛋白於一般性與人體組織細胞相容的鹽類溶液中進行檢測，可以避免糖化蛋白與未糖化蛋白被取出體外後產生變性，又考量鹽類溶液解離的帶電離子會對糖化蛋白與未糖化蛋白檢測上的訊號增益度提升及干擾造成影響，因此將鹽類溶液進行稀釋。
故，本發明為一種利用交流阻抗法量測糖化蛋白比例之方法，其步驟包括：對一對檢測電極通入交流電壓或交流電流，並將含糖化蛋白溶液完全覆蓋於檢測電極上，透過一交流阻抗檢測裝置得到電極間阻抗值；計算該阻抗值與一未含糖化蛋白溶液之阻抗值的阻抗差；將該阻抗差比對一交流阻抗差/糖化蛋白濃度關係式，即可獲得知糖化蛋白於含糖化蛋白溶液中的比例。
其中該交流阻抗差/糖化蛋白濃度關係式係藉由下列方式件建立：透過該交流阻抗檢測裝置得到A-不含糖化蛋白溶液，與B-前述不含糖化蛋白溶液溶入不同濃度之糖化蛋白兩者之阻抗值，並取A與B兩者之阻抗差，得到不含糖化蛋白溶液在溶入不同濃度之糖化蛋白後，與阻抗差的關係曲線，由此曲線得到檢測時需對應的交流阻抗差/糖化蛋白濃度關係式；又未含糖化蛋白溶液主要包含鹽類溶液及未糖化之蛋白質，該糖化蛋白與未糖化之蛋白質之總量定義為總蛋白，前述糖化蛋白於含糖化蛋白溶液中的比例係指在該鹽類溶液下，該糖化蛋白佔該總蛋白之比例。此外，前述糖化蛋白為糖化血紅素，前述未糖化之蛋白質為未糖化之血紅素，該糖化血紅素與該未糖化之血紅素之總量定義為總血紅素，該糖化蛋白佔總蛋白之比例係指在該鹽類溶液下，該糖化血紅素佔該總血紅素之比例。該糖化血紅素的比例係在總血紅素0%至10%之間。又該交流阻抗差/糖化蛋白濃度關係式係一交流阻抗差/糖化血紅素濃度關係式。
本發明之功效在於：利用預先建立的交流阻抗差/糖化蛋白濃度關係式，用在糖化血紅素(HbA1C)與未糖化之血紅素(Hb)的檢測時，可以輕易取 得糖化血紅素(HbA1C)佔總血紅素之比例，是一種可以快速、簡單且精準用以判定是否罹患糖尿病，或是用以觀察糖尿病患血糖控制狀況的檢測方式。
第一圖係為本發明實施例中，未糖化之血紅素溶於不同稀釋比例之鹽類溶液下，頻率對相對阻抗差dZ之阻抗譜。
第二圖係為本發明實施例中，不同濃度之Hb，其頻率對應阻抗差DeltaZ之阻抗譜。
第三圖係為本發明實施例中，不同濃度之HbA1C，其頻率對應阻抗差DeltaZ之阻抗譜。
第四圖係為本發明實施例中，Hb和HbA1C於相同濃度下頻率對應阻抗差DeltaZ之阻抗譜。
第五圖係為本發明實施例取固定頻段，HbA1C佔總血紅素不同比例下之濃度對應阻抗差DeltaZ之阻抗譜。
第六圖係為取第五圖曲線在固定濃度下，HbA1C佔總血紅素不同比例對應阻抗差之阻抗譜。
综合上述技術特徵，本發明利用交流阻抗法量測糖化蛋白比例之方法的主要功效可在下述實施例清楚呈現。
血紅素為一種蛋白質，故本實施例之糖化蛋白以糖化血紅素(HbA1C)為例，未糖化之蛋白質以未糖化之血紅素(Hb)為例，糖化血紅素(HbA1C)與未糖化之血紅素(Hb)總量為總血紅素。
首先要說明的是，在檢測Hb和HbA1C的交流阻抗時，Hb和HbA1C的檢測樣本需溶於鹽類溶液中，避免Hb和HbA1C被取出體外後產生變性，又考量鹽離子濃度太高對交流阻抗量測產生的影響干擾，因此本發明使用去離子水以稀釋法將濃度相當於生理食鹽水之鹽類溶液稀釋至體積百分比介於0.01%至90%之間，並且較佳的是將鹽類溶液稀釋至體積百分比為0.01%至1%之間，且前述鹽類溶液與人體組織細胞相容，例如可採用生理食鹽水或磷酸鹽緩衝溶液(PBS)，其中磷酸鹽緩衝溶液調製方式可將一錠PBS溶解於100毫升的去離子水中，前述一錠PBS包含有10毫莫耳磷酸鹽、137毫莫耳氯化鈉及2.7毫莫耳氯化鉀，再以去離子水將PBS溶液稀釋。
請參閱第一圖所示，使用檢測電極量測在不同頻率之下，Hb溶於不同稀釋比例之鹽類溶液時之交流阻抗，並繪出相對阻抗差(dZ)的阻抗譜來說明本發明選用前述鹽類溶液的原因，相對阻抗差(dZ)的概念以公式(i)表示：
其中dZ為相對阻抗差，ZHb為含有Hb之鹽類溶液的阻抗值，Zbg為純鹽類溶液的阻抗值；其中圖示中的參數設定為輸入交流電壓20mV，頻率42Hz至1MHz，Hb濃度為0.2mg/ml。
由第一圖的阻抗譜中可看出，當鹽類溶液之鹽濃度越高，相對阻抗差dZ就越小，因此考量Hb的檢測樣本需溶於鹽類溶液中， 又考量鹽離子濃度太高對交流阻抗量測產生的影響干擾，使得相對阻抗差dZ變得不明顯，因此以稀釋法將前述鹽類溶液稀釋至體積百分比介於0.01%至90%之間，且較佳是介於0.01%至1%之間。
再請參閱第二圖及第三圖所示，將不同濃度的Hb與HbA1c在不同頻率下繪出阻抗差的曲線，並取其中相同濃度0.04mg/ml的阻抗譜作比較，如第四圖所示，可以看出二者在相同濃度下有不同的阻抗差，在頻率5.3kHz時，Hb阻抗差約為23.8kΩ、HbA1c阻抗差約為256.5KΩ，兩者之間有極大差異，因此預期在相同濃度0.04mg/ml下，混合不同比例之Hb與HbA1c溶於前述鹽類溶液，其阻抗差將介於二者之間。
請參閱第五圖及第六圖所示，根據前述實驗結果，本發明方法以糖化血紅素及血紅素為例：首先，對一對檢測電極通入交流電壓或交流電流，用以檢測：A-不含糖化血紅素溶液，與B-前述不含糖化血紅素溶液溶入不同濃度之糖化血紅素，透過交流阻抗檢測裝置得到其兩者之阻抗值，其中前述不含糖化血紅素溶液主要包含鹽類溶液及未糖化之血紅素，之後再取A與B兩者之阻抗差，而得到不含糖化血紅素溶液在溶入不同濃度之糖化血紅素後，與阻抗差的關係曲線，並由此曲線得到檢測時需對應的交流阻抗差/糖化血紅素濃度關係式；進一步，並可做交流電壓或交流電流之全頻譜掃描，且頻譜區間介於1Hz至1MHz之間，本實施例則取前述頻譜區間之固定頻段5.3KHz之下的阻抗值，來進行糖化血紅素比例與阻抗差之比對分析。
要再說明的是：前述不含糖化血紅素溶液溶入不同濃度之糖化血紅素係指在鹽類溶液中溶入不同比例之糖化血紅素與未糖化之血紅素，有鑒於WHO建議HbA1C超過6.5%可視為罹患糖尿病，因此本實施例取樣區間為糖化血紅素的比例在總血紅素0%至10%之間，並且，使總血紅素溶在鹽類溶液之濃度控制在大於0.001毫克/毫升小於1毫克/毫升之間，如第五圖所示，當總血紅素在鹽類溶液中的濃度介於0.001毫克/毫升至1毫克/毫升之間時，其斜率大，表示其靈敏度較佳，又取第五圖所示曲線之特定濃度時，即可獲得第六圖所示曲線。
當實際上用於檢測糖化血紅素比例時，係對一對檢測電極通入交流電壓或交流電流，將含糖化血紅素溶液完全覆蓋於檢測電極上，透過前述交流阻抗檢測裝置得到電極間阻抗值，並計算該阻抗值與前述預先量測之未含糖化血紅素溶液之阻抗值的阻抗差，將該阻抗差比對該交流阻抗差/糖化血紅素濃度關係式，即可獲得知糖化血紅素於含糖化血紅素溶液中比例，由於前述未含糖化血紅素溶液包含有鹽類溶液及未糖化之血紅素，因此，糖化血紅素於含糖化血紅素溶液中之比例係指在該鹽類溶液下，該糖化血紅素佔該總血紅素之比例，因此我們即可據以了解使用者體內血紅素糖化的狀況，用以作為判斷是否罹患糖尿病，或者是用以觀察糖尿病患血糖控制狀況。
綜合上述實施例之說明，當可充分瞭解本發明之操作、使用及本發明產生之功效，惟以上所述實施例僅係為本發明之較佳實施例，當不能以此限定本發明實施之範圍，即依本發明申請專利範圍及創作說明內容所作簡單的等效變化與修飾，皆屬本發明涵 蓋之範圍內。

Claims (13)

  1. 一種利用交流阻抗法量測糖化蛋白比例之方法，步驟包括：對一對檢測電極通入交流電壓或交流電流，並將一含糖化蛋白溶液完全覆蓋於該檢測電極上，透過一交流阻抗檢測裝置得到電極間阻抗值；計算該阻抗值與一未含糖化蛋白溶液之阻抗值的阻抗差；將該阻抗差比對一交流阻抗差/糖化蛋白濃度關係式，獲得知糖化蛋白於該含糖化蛋白溶液中之比例，其中該交流阻抗差/糖化蛋白濃度關係式係藉由下列方式建立：透過該交流阻抗檢測裝置得到A-不含糖化蛋白溶液，與B-前述不含糖化蛋白溶液溶入不同濃度之糖化蛋白兩者之阻抗值，並取A與B兩者之阻抗差，得到不含糖化蛋白溶液在溶入不同濃度之糖化蛋白後，與阻抗差的關係曲線，由此曲線得到檢測時需對應的交流阻抗差/糖化蛋白濃度關係式。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之利用交流阻抗法量測糖化蛋白比例之方法，其係對檢測電極通入一交流電壓或交流電流以獲得含糖化蛋白溶液及不含糖化蛋白溶液之阻抗值，進一步可做交流電壓或交流電流之全頻譜掃描，且頻譜區間介於1Hz至1MHz之間。
  3. 如申請專利範圍第2項所述之利用交流阻抗法量測糖化蛋白比例之方法，對檢測電極通入一交流電壓或交流電流，進一步取前述頻譜區間之固定頻段下的阻抗值，來進行糖化蛋白比例與阻抗差之比對分析。
  4. 如申請專利範圍第1項所述之利用交流阻抗法量測糖化蛋白比例 之方法，其中未含糖化蛋白溶液係包含一鹽類溶液及一未糖化之蛋白質。
  5. 如申請專利範圍第4項所述之利用交流阻抗法量測糖化蛋白比例之方法，其係預先對該鹽類溶液以去離子水進行稀釋，其稀釋體積百分比範圍為大於0.01%小於90%。
  6. 如申請專利範圍第4項所述之利用交流阻抗法量測糖化蛋白比例之方法，前述糖化蛋白與未糖化之蛋白質之總量定義為總蛋白，前述糖化蛋白於含糖化蛋白溶液中之比例係指在該鹽類溶液下，該糖化蛋白佔該總蛋白之比例。
  7. 如申請專利範圍第6項所述之利用交流阻抗法量測糖化蛋白比例之方法，前述糖化蛋白為糖化血紅素，前述未糖化之蛋白質為未糖化之血紅素，該糖化血紅素與該未糖化之血紅素之總量定義為總血紅素，該糖化蛋白佔總蛋白之比例係指在該鹽類溶液下，該糖化血紅素佔該總血紅素之比例。
  8. 如申請專利範圍第7項所述之利用交流阻抗法量測糖化蛋白比例之方法，其總血紅素在鹽類溶液之濃度係控制在大於0.001毫克/毫升小於1毫克/毫升。
  9. 如申請專利範圍第8項所述之利用交流阻抗法量測糖化蛋白比例之方法，其糖化血紅素的比例在總血紅素0%至10%之間。
  10. 如申請專利範圍第1項所述之利用交流阻抗法量測糖化蛋白比例之方法，其中該糖化蛋白為糖化血紅素，該含糖化蛋白溶液為一含糖化血紅素溶液，該未含糖化蛋白溶液係包含一鹽類溶液及一未糖化之血紅素，該糖化血紅素與該未糖化之血紅素之總量定義為總血紅素，該糖化蛋白於含糖化蛋白溶液中之比例係指在該鹽類溶液下，該糖化血紅素佔該總血紅素之比例。
  11. 如申請專利範圍第10項所述之利用交流阻抗法量測糖化蛋白比例之方法，其中糖化血紅素的比例在總血紅素0%至10%之間。
  12. 如申請專利範圍第10項所述之利用交流阻抗法量測糖化蛋白比例之方法，其中該交流阻抗差/糖化蛋白濃度關係式係一交流阻抗差/糖化血紅素濃度關係式，其係藉由下列方式件建立：透過該交流阻抗檢測裝置得到A-不含糖化血紅素溶液，與B-前述不含糖化血紅素溶液溶入不同濃度之糖化血紅素兩者之阻抗值，並取A與B兩者之阻抗差，得到不含糖化血紅素溶液在溶入不同濃度之糖化血紅素後，與阻抗差的關係曲線，由此曲線得到檢測時需對應的交流阻抗差/糖化血紅素濃度關係式。
  13. 如申請專利範圍第10項所述之利用交流阻抗法量測糖化蛋白比例之方法，其係對檢測電極通入一交流電壓或交流電流以獲得含糖化血紅素溶液及不含糖化血紅素溶液之阻抗值，進一步可做交流電壓或交流電流之全頻譜掃描，且頻譜區間介於1Hz至1MHz之間。
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