JP5247043B2 - 試料中のチオレドキシン類の濃度に関する情報取得装置、ストレス度情報取得装置及びストレス度判定方法 - Google Patents
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Description
Yoshio Sumida, Toshiaki Nakashima, Takaharu Yoh, Yoshiki Nakajima, Hiroki Ishikawa, Hironori Mitsuyoshi, Yoshikuni Sakamoto, Takeshi Okanoue, Kei Kashima, Hajime Nakamura, Junji Yodoi Journal of Hepatology 2000, 33, 616-622.
(1)試料溶液を収容し得る反応領域。
(2)反応領域中に設置された酵素電極。
(3)反応領域に収納された試料溶液と酵素電極との反応を電気的変化として検出することにより、先の挙げた項目の少なくとも1つの測定を行うための反応検出手段。
(A)チオレドキシン類の酸化体を還元する酵素反応に関連して移動する電子の量を、電流、電荷量で評価する方法。
(B)チオレドキシン類の酸化体を還元する酵素反応に関連して移動する電子の量を、媒介物質を利用して電極において電流、電荷量で評価する方法。
(C)チオレドキシン類の酸化体を還元する酵素反応に関連して酸化される媒介物質の酸化体/還元体の比を電極において、電流、電荷量、電位、電圧で評価する方法。
(1)計測対象者からの試料中におけるチオレドキシン類の酸化体と還元体とを区別してこれらの濃度を測定して得られる第1の情報。
(2)この第1の情報とストレス度との関係に関する第2の情報。
(1)チオレドキシン類の酸化体の濃度
(1−1)試料を用いて測定したチオレドキシン類の酸化体の濃度。
(1−2)試料中に含まれる酸化体と還元体の合計としてのチオレドキシン類全濃度から還元体の濃度を引いて得られる濃度。
(1−3)試料中に含まれる酸化体と還元体の合計としてのチオレドキシン類全濃度と、酸化体と還元体の濃度比から得られる酸化体の濃度。
(2)チオレドキシン類の還元体の濃度
(2−1)試料を用いて測定したチオレドキシン類の還元体の濃度。
(2−2)酸化体と還元体の合計としてのチオレドキシン類全濃度から酸化体の濃度を引いて得られる濃度。
(2−3)試料中に含まれる酸化体と還元体の合計としてのチオレドキシン類全濃度と、酸化体と還元体の濃度比から得られる酸化体の濃度。
(3)チオレドキシン類の酸化体と還元体の濃度比
(3−1)試料を用いて測定した酸化体と還元体の濃度から求めた比。
(3−2)酸化体と還元体の合計としてのチオレドキシン類全濃度と、酸化体の濃度から求めた比。
(3−3)酸化体と還元体の合計としてのチオレドキシン類全濃度と、還元体の濃度から求めた比。
(3−4)チオレドキシンの活性部位の電位、もしくは活性部位の電位に関連して電位が変化する物質の電位を測定して得られる比。
ネルンストの式:
(E=E0+(RT/nF)ln(aO/aR)
E:電極電位
E0:標準電極電位
R:気体定数
T:絶対温度
n:反応に関与する電子数
F:ファラデー定数
aO:酸化体の活量
aR:還元体の活量
なお、チオレドキシン類の全量を測定する方法として、酵素を使用しない方法を組み合わせてもよい。そのような方法としては、酵素免疫測定法(ELISA)などを挙げることができる。
1.酸化ストレスの発生、
2.生体による酸化ストレスの検知、
3.チオレドキシンの誘導、及び
4.チオレドキシンの濃度増大
のように、複数のステップを経由する間接的なものである。
1.酸化ストレスの発生。
2.チオレドキシン還元体による酸化ストレスの消去とチオレドキシン酸化体の生成。
3.チオレドキシンの酸化体の濃度(あるいは酸化体/還元体比)の上昇。
更に、生体による酸化ストレスの検知やチオレドキシンの誘導といった個人差が大きいと考えられる過程を含まない点に着目した。そして、これらの着目点に基づいて、チオレドキシンの酸化体の濃度、あるいは酸化体と還元体の濃度比を指標として酸化ストレスを評価する方法に到達した。
(1)x、yの2軸において存在する象限によってストレス度を分類して評価する方法。
(2)2軸のx、y座標と原点を頂点とする三角形の面積で評価する方法。
(3)図1のように2軸で座標上の位置を用いる方法。
(4)x、y、zの3軸において、x、y、z座標と原点を頂点とする四面体の体積によって評価する方法。
(5)図2のように多軸で描き出される図形の形状を用いてパターンを評価する方法。
NADPH酵素電極系
図3は、本発明のチオレドキシン類の酸化体、還元体に関する濃度、もしくは、酸化体と還元体の濃度比を測定する装置の一例を示す図である。図3において上面として示された部分は、各部材を上方から下方に順に展開して得られる平面図を示している。また、図3の断面として示されている図は、装置の垂直方向における断面図である。図3は、酵素電極を用いたチオレドキシンの酸化体濃度センサの感応部の基本構造の一例を示している。
NADPH比色系
図7は、本発明のチオレドキシン類の酸化体、還元体に関する濃度、もしくは酸化体と還元体の濃度比を測定する装置、具体的には、比色法を用いたチオレドキシンの酸化体、還元体濃度センサの基本工程を説明するための図である。このセンサは、反応領域を構成するセルと、セル中で生じる反応に基づく光学的変化を測定するための光源と受光素子を有する検出手段とを有する。このセンサを用いた測定処理は、大きくは、光学セルの導入工程、試料導入工程、反応工程、検出工程、排出工程からなる。光学セル導入工程では、反応試薬を導入した光学セルをホルダに固定する。反応試薬の一例としては、チオレドキシン還元酵素、NADPHを溶解させたリン酸緩衝液が挙げられる。また、濃度、量の一例としては、チオレドキシン0.1ユニット、NADPH 50nmolを含む0.1 Mリン酸緩衝液pH7.0を0.5mLが挙げられる。試料導入工程では、光学セルに試料が導入される。導入される試料の量は、一例として0.5 mLが挙げられる。反応工程では、溶液は攪拌され、セルは、酵素反応に適した温度 (例えば25℃)に保持される。このときの反応時間は、チオレドキシンの酸化体が全て還元体へと変化するのに充分な時間(例えば20分間)をかけてもよいし、試料の導入からの時間を正確に計測して、変化中の吸光度を観測してもよい。検出工程では、単色光源、多色の光源、多色の光源をグレーティング等で分光した光を光学セルに透過させ、透過光を受光素子で検出する。排出工程では、測定の終了した光学セルを排出する。
前処理
C 型肝炎患者、および健常者の上腕から血液を採取、3000rpm、10分遠心分離し血清を取得する。この血清中のチオレドキシンの酸化体および、還元体濃度を実施例1の電極を用いて測定する。一方で、同様の血清のチオレドキシン濃度を市販のサンドイッチ ELISA 法(レドックスバイオサイエンス社製キット)で測定する。このときの測定結果は図11のような傾向をもつ。すなわちチオレドキシンの酸化体濃度を指標とした場合は、チオレドキシン全体の濃度を指標とした場合と比較して個人差が小さく、酸化ストレスに対する応答性が向上する。この理由は、測定されるチオレドキシン濃度全体と酸化ストレスの関係が、1.酸化ストレスの発生、2.生体による酸化ストレスの検知、3.チオレドキシンの誘導、4.チオレドキシンの濃度増大、のように、複数のステップを経由する間接的なものである。これに対し、チオレドキシンの酸化体濃度は、チオレドキシンが酸化を受けることによって直接上昇し、加えられた酸化ストレスを直接に反映する。そのために、チオレドキシンの全体量を測定するよりも個人差が少なく、レスポンスのよい酸化ストレスの評価が可能になるためであると考えられる。
ストレス評価
図12は、酸化ストレスの評価の一例として、縦軸にチオレドキシンの総濃度、横軸にチオレドキシンの酸化体/還元体の比をとったものである。ここで、記号Aで示される領域に属する人物は、強い酸化ストレスを受けている可能性があると考えられ、これが疾患に起因する場合には、医薬としてのチオレドキシンの投与により症状が改善する可能性があると考えることができる。次に、記号Bで示される領域に属する人物は、チオレドキシン濃度は高いものの、強い酸化ストレスは受けていない、もしくは、かつて強い酸化ストレスを受けていたものの、現在では低下している可能性があると考えることができる。また、この記号Bで示される領域に属する人物が、酸化ストレスを生じる疾患にかかっていた場合でも、医薬としてのチオレドキシンの投与により症状が改善する可能性は高くないと考えることができる。これは、すでに還元体のチオレドキシンが体内に多く存在する状況下で、さらに外部からチオレドキシンを投与しても酸化ストレスが低減される可能性はそれほど高くないと考えられるためである。次に、記号Cで示される領域に属する人物は、どちらの指標からも強い酸化ストレスを受けていない可能性が高いものと考えることができる。最後に、記号Dで示される領域に属する人物は、チオレドキシン全体の濃度のみの判断では、強い酸化ストレスを受けていない可能性が高いものと判断される可能性が高い。しかし、最近に強い酸化ストレスを受けた可能性、すなわちチオレドキシンが誘導され、チオレドキシンの全体濃度上昇するまでの過渡期にある可能性、また、チオレドキシンの誘導能の低い体質である可能性があると考えることができる。この記号Dで示される領域に属する人物が、酸化ストレスを生じる疾患にかかっていた場合、医薬としてのチオレドキシンの投与により症状が改善する可能性は高いと考えることができる。
酵素電極還元体測定系
図15は、本発明のチオレドキシン類の還元体、酸化体に関する濃度、もしくは、酸化体と還元体の濃度比を測定する装置の一例を示す図である。測定電極部位の基本構造は、図3において示されたものと同様で、作用極8の調製法が異なること、試薬層10がないこと、酵素層14があることが異なる。この相違点を中心に調製法について以下に説明する。
図19は、本発明のチオレドキシン類の酸化体、還元体に関する濃度、もしくは酸化体と還元体の濃度比を測定する装置、具体的には、修飾電極を用いたチオレドキシンの酸化体、還元体濃度センサの基本工程を説明するための図である。このセンサは、反応領域を構成するセルと、セル中で生じる反応に基づく電気化学的変化を測定するための電気化学測定セルを有する検出手段とを有する。このセンサを用いた測定処理は、大きくは、試料の導入工程、薬剤導入工程、反応工程、反応溶液導入工程、検出工程、排出工程からなる。試料導入工程では、反応容器に一定量の測定試料が導入される。薬剤導入工程では、反応に用いられる薬剤が反応容器に導入される。反応試薬の一例としては、チオレドキシン還元酵素、NADPHを溶解させたリン酸緩衝液が挙げられる。反応工程では、反応工程では、溶液は攪拌され、セルは、酵素反応に適した温度に保持され、試料と加えられた薬剤との反応が行われる。このときの反応時間は、チオレドキシンの酸化体が全て還元体へと変化するのに充分な時間(例えば20分間)をかけてもよいし、試料の導入からの時間を正確に計測して、変化中のシグナルを後の検出工程で観測してもよい。その後の、反応溶液導入工程では、電気化学セルが反応セルを兼ねていない場合には、反応後の溶液は、電気化学セルに移される。検出工程ではポテンショスタットから金電極に電位が印加され、応答電流、電荷が検出、記録される。その後、排出工程では、測定後の反応液が排出される。
2 反応槽壁
3 基板
4 絶縁層
5 試料導入口、エア排出口
6 反応槽
7 参照極
8 作用極
9 対極
10 試薬層
11 リード
12 集電パッド
13 スルーホール
14 酵素層
Claims (4)
- チオレドキシンの酸化体を測定するための測定装置と、
前記チオレドキシンの酸化体の濃度から酸化ストレス度を分類する分類手段とを有し;
前記チオレドキシンの酸化体を測定するための測定装置は、
チオレドキシン還元酵素と検出部とを有し、
前記検出部は、前記チオレドキシン還元酵素が前記チオレドキシンの酸化体と反応したことを検出する検出部である
ことを特徴とする酸化ストレス度分類装置。 - 前記検出部は、導電部材と前記チオレドキシン還元酵素とを有する酵素電極である
ことを特徴とする請求項1に記載の酸化ストレス度分類装置。 - 前記検出部は、前記チオレドキシン還元酵素を収容するための収容部と前記収容部を透過した光を受光する受光部である
ことを特徴とする請求項1に記載の酸化ストレス度分類装置。 - 前記収容部は試料を収容するための光学セルであり、
前記受光部は前記光学セルを透過した光を受光するための受光素子である
ことを特徴とする請求項3に記載の酸化ストレス度分類装置。
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