JPS5816693B2 - 電極 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、酵素の基質濃度を電気化学的に簡便に測定す
るなどに用いられる酵素電極の改良に関する。

本発明は、また酵素の活性を迅速に測定するための電極
にも関連している。

固定化された酸化還元酵素ならびに補酵素より構成され
た酵素電極の従来例として、文献（Ａｎ ａ ｌ、Ｃｈ
ｅｍ、４８（８）、１２４０．１９７６年）に述べられ
ているものがある。

これは酸化還元酵素として乳酸脱水素酵素、補酵素とし
てニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）、
集電体としてカーボンを用いる乳酸のセンサーである。

この原理は、第１図のように、電子伝達酵素触媒反応に
よって、基質である乳酸（Ａｎ２ ）が脱水素（酸化）
され、水素原子（電子）がＮＡＤ（酸化型）に移動し、
生じたＮＡＤＨ（還元型ＮＡＤ）を電極上で直接酸化す
る際のアノード電流を測定するものである。

基質である乳酸の濃度に応じて、ＮＡＤＨの酸化電流値
が変化するので、前記アノード電流の測定から基質濃度
を求めることができる。

上記文献には、この酵素、補酵素を固定化した電極とし
て、次の２種の構造を有するものが示されている。

（１）第２図のように、乳酸脱水素酵素１ならびに補酵
素２のＮＡＤをグルタルアルデヒドで半透膜５上に架橋
固定化し、この膜の酵素、補酵素固定面をカーボン集電
体３さ接触させた電極。

（２）第３図のように、高分子担体６として多糖類の１
種であるアガロースを用い、この担体上にＮＡＤを共有
結合で固定化し、この巨大分子化されたＮＡＤを、カー
ボン集電体とそれを覆った半透性膜５との間の空間部に
酵素とともに保持するようにした電極。

この場合、酵素は特に化学的修飾を加えていない。

なお４は化学結合を示す。

上記の酵素電極は、ＮＡＤＨの酸化電流値が精のオーダ
ーと小さいため、分析感度が低い。

また測定サンプルである乳酸含有液を注入してから、電
流値が定常値に達するまでに、１０分以上を要し、測定
値を得るのに時間がかかるなどの問題があった。

本発明は、上記の酵素電極の問題点を解決するもので、
補酵素を高分子担体に直接化学結合した状態で集電体と
混合することを特徴とする。

以下本発明をその実施例により説明する。

実施例 １ 補酵素としてＮＡＤ、ＮＡＤ固定化担体としてセルロー
ス誘導体のアミンヘキシルセルロース、集電体として結
晶性カーボンであるグラファイトを用いる。

まずＮＡＤは次式のととくジメチルスルホキシド（ＤＭ
ＳＯ）中で無水コハク酸と反応させ、分子中にカルボキ
シル基を導入する。

このＮＡＤ誘導体を、ジシクロへキシルカルボジイミド
（ＤＣＣ）の存存下で、アミノヘキシルセルロース（官
能基としてアミ７基を有する）と反応させ、アミド結合
によってＮＡＤをセルロース誘導体上に固定する。

こうして作製したＮＡＤ固定化セルロースをグラファイ
ト粉末と混合し、プレス成型してＮＡＤ固定化電極を作
製した。

この電極を乳酸脱水素酵素を含む液中に浸漬し、ＮＡＤ
と酵素の結合体を作製した後、グルタルアルデヒドなど
の架橋試薬で処理して酵素を前記集電体に固定化する。

この補酵素、酵素固定化電極の構造模式図を第４図に示
す。

図において、１は酵素で、１ａはその基質結合サイト、
１ｂは補酵素結合サイトである。

２は補酵素、３は集電体、４は化学結合、６は高分子担
体を示す。

第５図は上記の電極７を組み入れた測定系を示す。

７′は電極７のリード線、８は参照電極（飽和甘木電極
）、ぎはそのリード線、９は対極、１０は緩衝液、１１
はセパレータ、１２は電槽である。

電極７を参照電極８に対して０．４Ｖの定電位に分極し
ておき、緩衝液中に乳酸を加えると、電極７に流れるア
ノード電流が増大する。

緩衝液中の乳酸濃度−６ｉ１０−３モル／ｌとなるよう
に乳酸を加えた場合のアノード電流の時間変化を第６図
に示す。

約１分で電流は定常値を示し、１２μＡの電流増が認め
られた。

緩衝液中の乳酸濃度と電流増加量との関係を第７図に示
す。

これから１０−４〜１０−３モル／ｌの乳酸濃度範囲で
、濃度と電流値との間に直線関係が認められ、本発明に
よる電極によって乳酸の定量が可能であることがわかる
。

実施例 ２ 実施例１と同様にして作製したＮＡＤ固定化電極を半透
性膜でおおい、との半透性膜とＮＡＤ固定化表面との空
間部に乳酸脱水素酵素を保持した電極を作製した。

この場合酵素は半透性膜によって集電体近傍に固定化さ
れていることになる。

この電極の構造模式図を第８図に示す。

５は半透性膜である。

この電極を用い、実施例１と同様の測定を行うと、Ｉ
Ｘ １０−３モル／ｌの乳酸濃度増加に対して約９μＡ
の電流増加が認められ、約２分で電流は定常値を示した
。

実施例 ３ 補酵素としてＮＡＤ 、ＮＡＤ固定化担体としてたんば
く質の１種であるアルブミン集電体としてグラファイト
を用いた。

まずＮＡＤとアルブミンを少量の水で混合した後、この
混合物にグルタルアルデヒドを加えると、ＮＡＤはアル
ブミン表面に固定できる。

反応はＮＡＤのアミン基とアルブミンのアミノ基とをグ
ルタルアルデヒドが架橋することによって起こるものと
考えられる。

以上のように作製したＮＡＤ固定化アルブミンをグルタ
ミン酸脱水素酵素を含む液中に浸漬し、ＮＡＤと酵素の
結合体を形成させた後、グルタルアルデヒドをさらに加
えて酵素を架橋固定化する。

このようにして作製した補酵素、酵素固定化アルブミン
粉末をグラファイト粉末と混合し、プレス成型して電極
を作製する。

この電極を用い、実施例１と同様の測定を行うと、Ｉ
Ｘ １０”−３モル／ｌのグルタミン酸の濃度増加に対
して約６μＡの電流増加が認められ、１分で電流は定常
値に達した。

そして２Ｘ１０−’〜３ Ｘ １０−３モル／ｌの濃度
範囲のグルタミン酸の定量が可能であった。

実施例 ４ 補酵素としてＮＡＤ、ＮＡＤ固定担体として粒径０．０
５μｍ程度のシリカガラス粉末集電体としてグラファイ
トを用いた。

まずシリカガラス表面を次式に示す手順で化学修飾する
。

このシリカガラス誘導体（ＩＩ）に対してＮＡＤならび
にソルビトール脱水素ｉ素をジアゾカップリングさせ、
補酵素ならびに酵素を固定したシリカガラスが作製でき
る。

この補酵素、酵素固定シリカガラス粉末をグラファイト
粉末と混合し、プレス成型し°Ｃ補酵素、酵素固定化電
極を作成する。

第９図に電極の構造模式図を示す。

３ａはガラス粉末を示す。

この電極を用い、実施例１と同様の測定を行うと、Ｉ
Ｘ １０−３モル／ｌのソルビトールに対して５μＡの
電流増が認められ、０．５分で電流は定常値に達した。

そしてＩ Ｘ １０−’〜２Ｘ１０−３ モル／ｌの濃
度範囲のソルビトールの定量が可能であった。

以上の例では、補酵素を有機系あるいは無機系高分子担
体に直接化学結合固定化し、この固定化担体を集電体と
混合して電極を作製している。

その際固定化酵素を組み合わせて、酵素基質の濃度を測
定しているが、以下に固定化酵素を組み合わせずに補酵
素のみを固定化した電極によって酵素の活性を測定した
例を示す。

実施例 ５ 実施例１と同様にして作製したＮＡＤ固定化電極を実施
例１と同様の測定系に組み入れる。

ただし緩衝液中には酵素基質、ここではエチルアルコー
ルを０．１モル／ｌの濃度に溶解させておく。

そして参照電極ｌこ対し０．４Ｖの定量位ｔこＮＡＤ固
定化電極を分極させておき、アルコール脱水素酵素を加
えるとアノード電流が増大し、４分後には定常値に達し
た。

そして電流増加分は加える酵素の量にほぼ比例しており
、゛１〜２０ユニット／ｍｌの酵素濃度範囲で０．２〜
３，５μＡの電流値の増大が認められ、この電極で酵素
の活性測定が可能であることがわかる。

本発明による酵素、補酵素固定化電極は、従来の電極に
比較して定常電流値に達する時間が短く、また得られる
電流値も大である。

このことは従来電極と本発明による電極の構造模式図を
比較してみれば容易にわかる。

すなわち、本発明にｊる電極では集電体上で直接酸化さ
れるべき補酵素が担体に結合された状態で、常に集電体
と混合近接した状態で存在しているため、効率良く酸化
を受けることになる。

従来電極で、第２図の場合、いったん半透膜上に結合さ
れた補酵素を、集電体に膜を近づけることによって集電
体と接触させているにすぎず、補酵素と集電体との接触
確率は著しく小さい。

第３図の場合、補酵素は高分子担体に結合し高分子化さ
れており、高分子担体と集電体との立体反撥のため補酵
素自体が集電体と接する確率は小となる。

本発明では、さらに固定化酵素を組み合わさずに補酵素
のみを固定した電極を用いて酵素の活性を測定すること
も可能となる。

これは半透膜を用いて補酵素を保持する方式では不可能
である。

すなわち半透膜内へ補酵素を保持しても、酵素自体は高
分子であるためそれが膜内へ拡散して補酵素と結合体を
作ることはできず、第１図に示した反応は起こらない。

従来の電極では補酵素の固定ｌこ半透膜を用いることが
必須であり、本発明では補酵素の固定そのものには半透
膜を必要とせず、溶液中の酵素は補酵素と結合体を形成
できるため、酵素の活性の測定が可能となるわけである
。

以上のように、本発明によれば、酵素の基質濃度あるい
は酵素活性をきわめて迅速簡便に測定することが可能と
なる。

なお実施例では、集電体としてカーボンの例をあげたが
、その他５ｎ０２ 、 Ｉｎ２Ｏ３、ＷＯ３、’ｒｉｏ
□粉末も用いることができる。

また有機系固定化担体としてはセルロース、アルブミン
をあげたが、その他セファロース、セファデックス等を
用いることも可能である。

また、無機系固定化担体としてはガラスのみをあげたが
、アルミナ、シリカアルミナ、ゼオライトなどの金属酸
化物を用いることもできる。

また絶縁体のみならず上述の５ｎ０２゜Ｉｎ２Ｏ３等半
導性金属酸化物を用いることも当然可能である。

【図面の簡単な説明】

第１図は酵素反応と電極反応の関連を示す模式図、第２
図および第３図は従来の酵素、補酵素固定化電極の構造
模式図、第４図、第８図および第９図は本発明による酵
素、補酵素固定化電極の構造模式図、第５図は測定系の
略図、第６図は乳酸添加によるアノード電流の時間変化
を示す図、第７図は乳酸濃度とアノード電流増分との関
係を示す。 １・・・・・・酵素、２・・・・・・補酵素、３・・・
・・・集電体、４・・・・・・化学結合。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 少なくとも酸化還元酵素の補酵素と電子集電体とを
   有し、前記補酵素が高分子担体に直接化学結合された状
   態で前記集電体と混合されていることを特徴とする電極
   。 ２ 少なくとも酸化還元酵素とその補酵素と電子集電体
   とを有し、前記補酵素か高分子担体に直接化学結合され
   た状態で前記集電体と混合されており、さらに前記酸化
   還元酵素が集電体上もしくはその近傍に固定化されてい
   ることを特徴とする電極。