CN115326900A - 一种生物传感器电极及其制备方法和在电化学检测alt的生物传感器中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种生物传感器电极及其制备方法和在电化学检测谷丙转氨酶的生物传感器中的应用。该生物传感器电极是在电极表面修饰负载丙酮酸氧化酶的MXene‑GO复合材料，其中，MXene‑GO复合材料具有催化活性，能实现化学信号到电信号的转化，同时MXene‑GO还具有大的比表面积，可增加酶的负载量，促进信号放大，进而提高检测灵敏度，降低检测限，检测范围广，且其制备方法简单，成本低廉。采用该电极应用于电化学检测ALT的生物传感器时，具有选择性好、灵敏度高、检测限低，且检测范围宽等优点。
Description
技术领域
本发明涉及一种生物传感器电极，具体涉及一种MXene-GO/POx修饰电极，还涉及其制备方法以及在电化学检测ALT的生物传感器中的应用，属于生物传感技术领域。
背景技术
谷丙转氨酶(ALT)是一种广泛存在于人体肝脏中的胞内酶，当肝功能受损时，肝脏细胞破裂，ALT释放到血液中，导致血液中ALT的浓度急剧上升。因此，ALT也是临床上评估肝功能的一个重要指标。
目前检测ALT的方法主要有比色法，分光光度法，化学发光，色谱，荧光，检测等，这些检测方法虽然检测结果可靠，但一般需要大型的分析仪器，试剂较为昂贵，处理方法较为复杂，并且对检测人员的要求较高，有一定的局限性。因此，开发一种操作处理简单，选择性好，灵敏度高，成本低廉的ALT检测方法具有重要意义。
发明内容
针对现有检测ALT方法存在的不足，本发明的第一个目的是在于提供一种生物传感器电极，其是MXene-GO/POx修饰的电极，其包含的MXene-GO复合材料具有催化活性，能实现化学信号到电信号的转化，同时MXene-GO还具有大的比表面积，可增加酶的负载量，促进信号放大，进而提高检测灵敏度，降低检测限，检测范围广。该电极用于电化学检测ALT的生物传感器时，具有选择性好、灵敏度高、检测限低、检测范围宽等优点。
本发明的第二个目的是在于提供一种生物传感器电极的制备方法，该方法简单，成本低廉，操作方便，可规模化生产。
本发明的第三个目的是在于提供一种生物传感器电极的应用，其用于电化学检测ALT的生物传感器。
为了实现上述技术目的，本发明提供了一种生物传感器电极，电极表面修饰有负载丙酮酸氧化酶的MXene-GO复合材料。所述MXene-GO复合材料由MXene溶液与GO溶液混合超声反应得到。该电极表面的MXene-GO复合材料具有催化性，能捕捉电活性物质，实现从化学信号到电信号的转化，同时还具有大的比表面积，可增加丙酮酸氧化酶的负载量，促进信号放大，进而提高检测灵敏度，降低检测限，检测范围广。
作为一个优选的方案，MXene-GO复合材料为碳化钛与氧化石墨的复合物。本发明的MXene为现有技术中常见的碳化钛材料，其可以通过以下方法制备得到：将HCl与LiF混合，再加入Ti3AlC2粉末搅拌，进行蚀刻反应，即得。
MXene是一种过渡金属化合物，具有手风琴状的多层结构，这一特点使其具有良好的导电性和较大的比表面积，由于其表面在蚀刻的时候引进了包括羟基、羧基等活性基团，使其同样具有良好的生物相容性和亲水性，将其与氧化石墨复合有利于提高生物传感器电极性能。
本发明还提供了一种生物传感器电极的制备方法，其包括以下制备步骤：
1)将MXene溶液与GO溶液混合在超声作用下反应，得到MXene-GO复合材料；
2)将MXene-GO复合材料涂覆于玻碳电极表面，得到MXene-GO修饰电极；
3)将丙酮酸氧化酶溶液与戊二醛溶液、牛血清蛋白溶液、壳聚糖溶液混合进行交联反应，得到混合酶溶液，将所述混合酶溶液涂覆于MXene-GO修饰电极表面，即得。
本发明采用MXene-GO复合材料作为基底材料，其对于过氧化氢类电活性物质具有良好的催化活性，能捕捉到生成的过氧化氢，实现从化学信号到电信号的转化，同时还具有大的比表面积，可增加酶的负载量，促进信号放大，进而提高检测灵敏度，降低检测限，检测范围广。另外，本发明利用壳聚糖这种生物相容性较好的具有吸附性功能的物质与戊二醛联用，戊二醛将酶上的氨基与牛血清蛋白及壳聚糖上的氨基交联，实现酶在电极上的固定，同时，壳聚糖具有良好的生物相容性和成膜性，有助于酶活性的保存及固定。
作为一个优选的方案，所述MXene溶液与GO溶液的质量比为1～2：2～1。
控制MXene溶液与GO溶液的质量比在合适的范围有利于获得性能较优的生物传感器电极。当MXene与GO的溶液质量比过大时，修饰电极对于丙酮酸的响应较小，随着该质量比值逐渐减小，修饰电极对于丙酮酸的响应也逐渐增强，但该比值较过小时，电极的背景电流也将变大，影响检测性能。
作为一个优选的方案，所述MXene溶液浓度为0.5～1mg/mL。所述GO溶液浓度为0.5～1mg/mL。
作为一个优选的方案，步骤1)中所述反应的温度为25～30℃，时间为0.5～1.5h。
作为一个优选的方案，所述丙酮酸氧化酶溶液的浓度为250～500U/mL。所述戊二醛溶液的浓度为0.25～2.5％w/w。所述牛血清蛋白溶液的浓度为10～50mg/mL。所述壳聚糖溶液的浓度为1～5mg/mL。丙酮酸氧化酶溶液、牛血清蛋白溶液、壳聚糖溶液和戊二醛溶液的体积比为8～12：4～6：4～6：1～3。
为了保证酶活性及稳定性，需控制丙酮酸氧化酶、戊二醛、牛血清蛋白和壳聚糖用量及浓度在合适的范围，其中，丙酮酸氧化酶浓度过小将影响电极灵敏度，浓度过大将导致酶的浪费；戊二醛、牛血清蛋白及壳聚糖浓度过小将使酶交联不完全，影响酶在电极表面稳定性，浓度过大修饰层过于黏稠，影响酶与底物接触及反应。
作为一个优选的方案，所述交联反应的温度为25～30℃，时间为10～40min。
本发明还提供了一种生物传感器电极的应用，其应用于电化学检测ALT的生物传感器。采用该电极的电化学检测ALT的生物传感器，基于ALT能催化L-丙氨酸与α-酮戊二酸之间的转氨反应产生丙酮酸，随后丙酮酸被丙酮酸氧化酶(POx)氧化产生H2O2，H2O2被复合材料催化产生氧化还原电流的原理，实现ALT浓度的电化学方法检测，具有选择性好、灵敏度高、检测限低、检测范围宽等优点。
作为一个优选的方案，所述电化学检测ALT的生物传感器采用方波伏安法检测ALT，所述方波伏安法的测定条件为：以含有焦磷酸硫胺素(TPP)、黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)和氯化镁的100mM磷酸盐缓冲溶液(PBS)为电解液，在0～-0.5V电压范围内，频率为10～20Hz。
在该方波伏安法测定条件下可实现对ALT浓度的精准测量，在正常人血清中的加标回收测试过程中，计算出的回收率较好。
与现有技术相比，本发明技术方案的优点在于：
(1)采用MXene-GO复合材料作为传感器电极基底材料，其具有催化性，能捕捉电活性物质，实现从化学信号到电信号的转化，同时还具有大的比表面积，可增加酶的负载量，促进信号放大，进而提高检测灵敏度，降低检测限，检测范围广。
(2)利用生物相容性较好且具有吸附性能的壳聚糖与戊二醛联用，将酶更好地固定化在电极表面，提高电极稳定性。
(3)基于MXene-GO复合材料负载丙酮酸氧化酶实现对ALT的检测，检测范围宽，并且可推广至其他传感器，用于对不同蛋白或小分子的浓度进行检测。
附图说明
图1为本发明ALT检测方法的原理示意图。
图2为实施例3中的传感器对空白样品、10mM丙酮酸、10mM过氧化氢和200u/LALT的响应对比图。
图3为实施例3中不同浓度ALT对应的方波伏安曲线和标准曲线图。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下文将结合说明书附图和较佳的实施例对本发明作更全面、细致地描述，但本发明的保护范围并不限于以下具体的实施例。
除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解的含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。
除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
实施例1
本实施提供一种生物传感器电极制备方法，其包括以下步骤：
(1)MXene的合成：通过LiF与HCl蚀刻Ti3AlC2得到MXene。取8mL的6M HCl溶液，在磁力搅拌的作用下，加入200mg LiF粉末，直到粉末完全溶解后再缓慢加入Ti3AlC2粉末200mg。然后将反应混合物在40℃下反应48h，之后用蒸馏水反复清洗，离心分离，直到离心后上清液的pH约为7，然后将最终产品冷冻干燥，得到MXene粉末。
(2)复合材料MXene-GO的合成：将MXene粉末超声30min分散在去离子水中，即得MXene溶液。将浓度为0.5mg/mLMXene溶液与浓度为1mg/mLGO溶液按照质量比1:2混合，在25℃温度下超声1h，即得MXene-GO复合材料。
(3)MXene-GO修饰电极制备：取MXene-GO复合材料5μL，悬涂在玻碳电极表面，室温下干燥，即得MXene-GO修饰电极。
(4)POx的固定化：将10μL浓度为250U/LPOx酶溶液与5μL浓度为50mg/mL的BSA溶液，5μL浓度为5mg/mL的壳聚糖溶液混合，25℃温度下超声10min，再加入2μL浓度为2.5％w/w戊二醛溶液，25℃温度下超声10min，得到交联后的混合酶溶液，之后取混合酶溶液5μL，悬涂在MXene-GO修饰电极表面，室温下干燥，即得MXene-GO/POx修饰电极。
实施例2
本实施提供一种生物传感器电极制备方法，其包括以下步骤：
(1)MXene的合成：通过LiF与HCl蚀刻Ti3AlC2得到MXene。取8mL的6M HCl溶液，在磁力搅拌的作用下，加入200mg LiF粉末，直到粉末完全溶解后再缓慢加入Ti3AlC2粉末200mg。然后将反应混合物在40℃下反应48h，之后用蒸馏水反复清洗，离心分离，直到离心后上清液的pH约为7，然后将最终产品冷冻干燥，得到MXene粉末。
(2)复合材料MXene-GO的合成：将MXene粉末超声30min分散在去离子水中，即得MXene溶液。将浓度为1mg/mLMXene溶液与浓度为0.5mg/mLGO溶液按照质量比2:1混合，在30℃温度下超声1h，即得MXene-GO复合材料。
(3)MXene-GO修饰电极制备：取MXene-GO复合材料5μL，悬涂在玻碳电极表面，室温下干燥，即得MXene-GO修饰电极。
(4)POx的固定化：将10μL浓度为500U/LPOx酶溶液与5μL浓度为25mg/mL的BSA溶液，5μL浓度为2mg/mL的壳聚糖溶液混合，30℃温度下超声10min，再加入2μL浓度为0.25％w/w戊二醛溶液，30℃温度下超声10min，得到交联后的混合酶溶液，之后取混合酶溶液5μL，悬涂在MXene-GO修饰电极表面，室温下干燥，即得MXene-GO/POx修饰电极。
实施例3
采用实施例1得到的MXene-GO/POx修饰电极制备生物传感器，用于电化学检测人血清中的谷丙转氨酶(ALT)，以下是ALT检测方法，其步骤包括：
(1)ALT测试溶液的制备：在pH＝7的100mM的PBS，加入50μΜTPP，5μM FAD，1mM氯化镁，10mMα-酮戊二酸，100mM L-丙氨酸。
(2)不同浓度ALT孵育：将浓度为0.5u/L，1u/L，50u/L，100u/L，200u/L，300u/L，400u/L的ALT分别加到ALT测试溶液之中，37℃水浴孵育40min。
(3)方波伏安法检测：以孵育后的ALT测试液为电解液，在0～-0.5V电压范围内，以15Hz的频率进行测定，得到各电极的峰电流值，然后将各电极的峰电流值与对应的ALT浓度作标准曲线，得到测量ALT浓度的标准曲线。
(4)正常人血清中的加标回收测试：取正常人的血清0.5mL，加入4.5mL ALT测试液中，分别加入不同的ALT的量：0u/L，2u/L，20u/L，200u/L，然后37℃水浴条件下孵育40min，用方波伏安法测峰电流值，与标准曲线比对得到测量浓度值，计算出回收率在103.93％～97.35％，回收率较好。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种生物传感器电极，其特征在于：电极表面修饰有负载丙酮酸氧化酶的MXene-GO复合材料。
2.根据权利要求1所述的一种生物传感器电极的制备方法，其特征在于：所述MXene-GO复合材料为碳化钛与氧化石墨的复合物。
3.权利要求1或2所述的一种生物传感器电极的制备方法，其特征在于：包括以下制备步骤：
1)将MXene溶液与GO溶液混合在超声作用下反应，得到MXene-GO复合材料；
2)将MXene-GO复合材料涂覆于电极表面，得到MXene-GO修饰电极；
3)将丙酮酸氧化酶溶液与戊二醛溶液、牛血清蛋白溶液及壳聚糖溶液混合进行交联反应，得到混合酶溶液，将所述混合酶溶液涂覆于MXene-GO修饰电极的表面，即得。
4.根据权利要求3所述的一种生物传感器电极的制备方法，其特征在于：所述MXene溶液与GO溶液的质量比为1～2：2～1。
5.根据权利要求3或4所述的一种生物传感器电极的制备方法，其特征在于：所述MXene溶液浓度为0.5～1mg/mL；
所述GO溶液浓度为0.5～1mg/mL。
6.根据权利要求3所述的一种生物传感器电极的制备方法，其特征在于：步骤1)中，所述反应的温度为25～30℃，时间为0.5～1.5h。
7.根据权利要求3所述的一种生物传感器电极的制备方法，其特征在于：
所述丙酮酸氧化酶溶液的浓度为250～500U/L；
所述戊二醛溶液的浓度为0.25～2.5％w/w；
所述牛血清蛋白溶液的浓度为10～50mg/mL；
所述壳聚糖溶液的浓度为1～5mg/mL；
丙酮酸氧化酶溶液、牛血清蛋白溶液、壳聚糖溶液和戊二醛溶液的体积比为8～12：4～6：4～6：1～3。
8.根据权利要求3或7所述的一种生物传感器电极的制备方法，其特征在于：
所述交联反应的温度为25～30℃，时间为10～40min。
9.权利要求1所述的一种生物传感器电极的应用，其特征在于：应用于电化学检测ALT的生物传感器。
10.根据权利要求9所述的一种生物传感器电极的应用，其特征在于：所述电化学检测ALT的生物传感器采用方波伏安法检测ALT，所述方波伏安法的测定条件为：以含有焦磷酸硫胺素(TPP)、黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)和氯化镁的100mM磷酸盐缓冲溶液(PBS)为电解液，在0～-0.5V电压范围内，频率为10～20Hz。
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| CN116080057A (zh) * | 2023-03-06 | 2023-05-09 | 可孚医疗科技股份有限公司 | 一种甘油三酯生物传感器、纳米金导电复合材料及其制备方法 |
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