JP3948627B2 - 電気化学的バイオセンサー - Google Patents

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Description

発明の分野
本発明は、電気化学的バイオセンサーに関するものである。より詳細には、改良された試料導入部を具備した電気化学的バイオセンサーに関するもので、前記試料導入部は試料導入通路部と通気部と余分空間部からなり、前記試料導入部は通気部と交差し、試料導入通路部と通気部が出会う地点に余分空間部が形成された構造をしている。また、本発明は、前記試料導入部を利用して血液試料の流動性を感知する方法を提供する。
発明の背景
糖尿病を診断して予防することにおいて、血液内のグルコース量を周期的に測定しなければならない必要性が増大している。従来、血液内グルコース量を測定する機器としては、ストリップ形測定機があり、作動原理は比色法(colorimetric method)または電気化学的方法(electrochemical method)に基づいている。
比色法は、下記反応式のグルコース酸化酵素-比色反応に依存する。
グルコース+ O2 -----> グルコン酸 + H2O2 (触媒: グルコース酸化酵素)
H2O2 + 発色体 -----> 生成物 (触媒: ペルオキシダーゼ)
前記反応をより詳細に記述すると、血液試料内のグルコースは、グルコース酸化酵素の触媒反応により酸化されグルコン酸及び過酸化水素を生成する。過酸化水素はペルオキシダーゼの触媒反応により酸素受容体(発色体)を酸化しながら水に還元される。その結果、酸化された発色体は発色し、発色強度を測定して血液試料のグルコースを定量する。
しかし、前記比色法は、血液試料の運搬、前処理、試料の量、反応時間及び発色開示時間等によって発色の強度変化が変化するためこれらを正確に調節しなければならない。そして、血液凝固または尿酸、アスコルビン酸及びビリルビン等の妨害物質によって発色反応が妨害を受けるという問題点を持っている。
前記比色法による問題点を解決するために、高い選択性と感度を持った、例えば、試料が混濁しても試料を別途の前処理なしに使用可能で短時間内に正確な測定が可能な電気化学的原理に基づいた電気化学的バイオセンサーが導入された
電子伝達媒介体に酸素を使用する比色法と電気化学的方法は、1世代バイオセンサーと呼ばれる。2世代電気化学的バイオセンサーは、電子伝達媒介体に有機金属化合物(例えばFe、Os、Ruとその誘導体等)とキノン、キノン誘導体、有機伝導性塩、またはビオローゲン等を使用する。2世代バイオセンサーは下記の式を根拠にしている。
グルコース+ GOx-FAD --> グルコン酸 + GOx-FADH2
GOx-FADH2 + MOX --> GOx-FAD + Mred
前記反応式で、GOxはグルコース酸化酵素を示し、GOx-FAD及びGOx-FADH2は各々グルコース酸化酵素の酸化状態及び還元状態を示す。そして、MOXとMredは、各々電子伝達媒介体の酸化された状態と還元された状態を示す。
反応式に示したように、グルコース酸化酵素の触媒作用によりGOx-FADをGOx-FADH2に還元させることによって、グルコースはグルコン酸に酸化される。この時、グルコース酸化酵素は電子伝達媒介体MOXに電子を伝達し、元の 状態に戻る。この反応で生成された還元電流が電極表面で測定される。
前記電気化学的バイオセンサーは、a)電極システム(作業電極、補助電極または基準電極)が形成された基板、b)電極システムに固着された電子伝達媒介体及び酸化酵素、c)試料導入部からなっている。これらは大きく分けて(1)作業電極、補助電極または基準電極が一緒に基板上に形成された平面形バイオセンサー、または(2)補助電極を上部基板に形成して作業電極と対面するように製作した対面形バイオセンサー、または(3)差等式平面形バイオセンサー、及び(4)差等式対面形バイオセンサーに分類される。
従来、試料導入部の例としては、大きく分けてi字形及びー字形構造に分類できる。
i字形試料導入部は、基本(base)基板、U形態にカットされた部分を持った薄いフイルム中間体(普通100〜500μm)、空気を除去するための通風口を持った基板を含む。このような形態の試料導入部を持ったバイオセンサーは、i形態の毛細管を通して速い液体試料導入を提供するが、U形態チャンネルをたびたび越えたり通風口周囲が完全に満たされない等の正確な試料の量を調節することが難しい短所があった。試料チャンネルを満たす現象は、ヘマトクリット値(hematocrit)により大きく変わる血液の流動性に相当な影響を受ける。また、i形態は、ストリップの正しくない使用により通風口を通して流れ出る血液によって使用者を容易く汚染し得る短所があった。
一字形試料導入部は、下部と上部基板間にストリップを横切る細い流動通路を形成するために配列されたスペーサによって形成される。即ち、一字形構造の試料導入部はセンサーの横側面からもう一方の横側面まで一直線の通路を形成した構造をしている。試料は一方の側面に形成された入口を通じて導入され、空間部内の空気はもう一方の側面に形成された出口を通して除去される。このような、形態のバイオセンサーは、試料を側面からが導入しなければならないため、時々、使用者に試料注入部で不便な位置でストリップを置くようにさせる問題点があった。
したがって、本発明の第一の観点は、電気化学的測定のためにストリップの端から正確な量の血液試料を速く導入できる試料導入部を具備した、電気化学的バイオセンサーを提供することである。
ヒトの血液は、赤血球、白血球そして、その他の蛋白質のような固体粒子(hematocrits)を含んでいるが、これらは血漿から分離できる。ヘマトクリット値は、全血の流動性と血液の電気伝導性を変化させるため、バイオセンサーの細長い毛細管通路を通じて血液が試料導入部を満たす時間は、血液内のヘマトクリット値に比例して変化する。
ゆえに、本発明の2番目の観点は、試料が毛細管を満たす時間を測定する流動 感知電極を具備して、与えられたヘマトクリット値の水準による誤差を訂正する方法を提供する電気化学的バイオセンサーに関することである。
発明の概要
本発明の目的は、生理的な試料を前処理過程なしに速く正確に導入できる試料導入部を具備した電気化学的バイオセンサーを提供することである。
本発明の他の目的は、流動性を変化させる成分(component)の影響を効果的に訂正する試料流動感知電極を具備した電気化学的バイオセンサーを提供することである。また、流動感知電極は、正常なヒトの血液と比較して非常に高いかまたは低い非正常的な粘度を持った正常的でない試料(abnormal sample)または気泡を含んだ試料を区分する(米国特許第5,284,658号)。
また異なった他の目的は、試料導入通路部、通気部、余分空間部からなり、試料導入通路部と通気部が交差し、試料導入通路部と通気部が出会う地点に余分空間部が形成され、さらに余分空間部は、流動感知電極が位置する場所に利用できる試料導入部を提供する。
発明の詳細な説明
図1は、試料導入部の好ましい一例を図示したものである。電気化学的バイオセンサーは、電気化学的バイオセンサーと試料導入通路の形成のために基板200、下部基板400と上部基板300からなっている。基板200(spacer)内部に形成された前記試料導入部100は、試料導入通路部101と通気部102がカギ形(垂直)に交差形成され、試料導入通路部101と通気部102が出会う地点に余分空間103が形成された構造をしている。これらは、下部基板400と異なる上部基板(またはカバー)300によって外部への露出が遮断された構造をしている。
本明細書で「試料導入通路部101」というのは、試料と接触してセンサー内部に試料を導入するための通路を意味する。「通気部102」と言うのは、空気が通過できる通路を意味する。試料が試料導入通路部に流入した時、試料導入部100内に存在する空気は通気部を通して排出される。このような通気部102は、毛細管現象による試料導入を可能にする。
一方、前記した余分空間103は、試料導入通路部101と通気部102が出会う地点で若干の余裕空間を提供することによって、試料導入通路部101が直角に曲がる隅の部位(または交差点部位)で発生し得る気泡形成現象を最小化する役割を果たす。試料導入通路部101が直角に曲がる隅の部位(または交差点部位)は、電極と接触する部分であり、ここに気泡形成現象が発生すると正確な測定が難しい問題点を持つことになる。
前記通気部102と試料導入通路部101の幅の比は、試料の速い導入を可能にするために1:2以下、最も好ましいのは、1:5〜1:2の範囲である。1:2以下に調整することによって、試料の量を減少させられるだけではなく、正確な量の試料が速い速度で通気部102に移動することによって試料の速い導入を可能にする。
前記試料導入通路部101と通気部102がなす角度(φ)は、図1に図示したように90°が好ましい。必ずしもこれに限定されるものではなく、約45°〜約135°、好ましくは約75°〜約105°の範囲内で適切に調節できる。
図1に示したように、余分空間103は、試料導入通路部101からの伝達地点の後ろに拡張する。そして、気泡が占領しない正確な試料量を保障するために、余分空間103を含む試料導入通路部101は、親水性処理が要求される。
試料導入部100の全体容積は、0.1〜3.0μl、好ましくは0.1〜1.0μl、最も好ましくは0.3〜0.7μlの範囲内で調節することである。試料の容積が0.1μl未満の場合、センサーの誤差範囲による影響を受けて正確な測定を保証できない問題点があり、試料の容積が3.0μlを超過した場合には過度な血液採取による問題点がある。本発明の具体的な例によれば、0.5μlの試料量を使用することが好ましい。
前記した構造の試料導入部100を具備した基板200は、ポリエステル、ポリ塩化ビニル及びポリカーボネート等の有機高分子材料にプレスを利用した成形により形成でき、好ましくは前記有機高分子材料で作られた両面テープにプレス金型を利用して形成でき、または、図1に示した図案にしたがって接着層をスクリーンプリントすることによって形成できる。
試料導入部100の作動原理を下記に詳細に説明する。
前記した構造の試料導入部100の主要な作用原理を説明すると次のとおりである。まず、試料導入通路部101の末端部分を試料と接触させると、毛細管現象により試料が試料導入通路部101に導入される。試料導入通路部101をすべて満たした試料は、余分空間103に供給され、再び通気部102に供給される。ここで、試料導入通路部101の幅に比べて通気部102の幅が1:2以下に調整することによって速い試料導入が可能になる。また、親水性余分空間をさらに設置することによって試料導入通路部101と通気部102が交差する部位でのエア-ポケット現象を防止できるようになる。
本発明の実施例によると、試料導入部100の全体容積が約0.5μlの時、試料充満にかかる時間は、ヘマトクリット値、試料保管状態そして使用された血液凝固防止剤の形態により差があり得るが、約200〜2000ms内に試料導入部が血液で充満される。普通、新鮮な血液試料を使用時、ヘマトクリット値の水準の影響により試料導入部の全体容積0.5μlを充満するのにかかる時間は、約200〜800msである。
前記した構造を持った試料導入部100は、多様な形態のバイオセンサーに導入できる。その例としては、平面形バイオセンサー、対面形バイオセンサーまたは、平面形差等式バイオセンサー、対面形差等式バイオセンサーまたは、流動感知電極を備えたバイオセンサーがあげられる。
図2は、前記した構造の試料導入部100が具備された平面形バイオセンサーの好ましい一例を図示した分解斜視図で、前記平面形バイオセンサーは、電子伝達媒介体及び酸化酵素が固着された作動電極104及び基準電極105が形成された下部基板400、試料導入通路部101と通気部102がカギ形に形成され、試料導入通路部101と通気部102が出会う地点に余分空間103が形成された構造をした試料導入部100が具備された試料導入スペーサ200、及び前記試料導入部が外部に露出することを防止するための上部基板(またはカバー)300が順に積層された構造を持っている。ここで、試料導入部100の構造は前記で言及したのと同じで、カギ形構造に限定されるものではなく、試料導入通路部101と通気部102が交差形成されれば満足される。余分空間103の構造また、前記で言及したように変化可能である。
前記した平面形バイオセンサーを製造する方法を記述すると、次のようになる。まず、下部基板400の上部に炭素または金属導体材質をストリップの長さ方向に対称形の電極(作動電極104及び基準電極105)を印刷、エッチングまたは蒸着する。その後、露出した電極上に電子伝達媒介体及び酸化酵素を分散させ固着させる。
このように構成された下部基板400上に、前記した構造の試料導入部100を具備した試料導入スペーサ200を数百マイクロメータ程度の厚みで電極の電気的連結部位を除外したすべての部分に接着させる。前記試料導入スペーサ200の材質は、絶縁性を持った物質なら特別に制限されないが、加工性及び成形性等を考慮した時、絶縁性高分子が好ましい。また、下部基板400と上部基板300の接着は接着剤または両面テープを利用して容易に成し遂げられる。試料導入スペーサ200上に上部基板(またはカバー)300を接着剤または両面テープ等を利用して試料導入スペーサ200の上部に圧着して組み立てることによって平面形バイオセンサーを製作できる。
図3は、前記した構造の試料導入部が具備された対面形バイオセンサーの好ましい一例を図示した分解斜視図である。前記対面形バイオセンサーは、電子伝達媒介体及び酸化酵素がコーティングされた作動電極104'及び電極連結部106が形成された下部基板400'、 試料導入部100が具備された試料導入スペーサ200'、及び基準電極兼補助電極105及び電極連結部106が裏面に形成された上部基板300'を順次積層した構造をしている。しかし、ここで、試料導入部100の構造は前記で言及したのと同様、カギ形構造に限定されるものではなく、前記に言及したように、試料導入通路部101と通気部102が交差形成され、その交差地点で余分空間部103が形成されれば満足され、余分空間部103の構造もまた、前記に言及したように変化可能である。
前記した試料導入部100を具備した対面形バイオセンサーの製造方法は、平面形バイオセンサーと同一な方法で製造できる。
図4は、前記した構造の試料導入部が具備された差等式平面形バイオセンサーの好ましい一例を図示した分解斜視図である。前記差等式平面形バイオセンサーは、両面に電子伝達媒介体及び酸化酵素がコーティングされた作動電極104及び補助電極兼基準電極105が形成された下部基板400a、試料導入通路部101と通気部102がカギ形に形成され、試料導入通路部101と通気部102が出会う地点に余分空間103が形成された構造をした試料導入部100が具備された試料導入スペーサ200a、200bが、下部基板400aの両面に各々積層され、前記試料導入部が外部に露出されることを防止するための上部基板(またはカバー)300a、300bが試料導入スペーサ200a、200bに各々積層された構造をしている。但し、ここで、試料導入部100の構造は、前記で言及したように、カギ形構造に限定されるものではなく、試料導入通路部101と通気部102が交差形成されれば満足され、余分空間103の構造もまた、前記に言及したように変化可能である。
図5は、前記した構造の試料導入部が具備された差等式対面形バイオセンサーの好ましい一例を図示した分解斜視図で、前記差等式対面形バイオセンサーは両面に電子伝達媒介体及び酸化酵素がコーティングされた作動電極104及び電極連結部106が形成された下部基板400b、試料導入通路部101と通気部102がカギ形に形成され、試料導入通路部101と通気部102が出会う地点に余分空間103が形成された構造を持った試料導入部100が具備された試料導入スペーサ200a'、 200b'が、前記下部基板400bの両面に各々積層され、基準電極兼補助電極105'及び電極連結部106が形成された上部基板(またはカバー)300a'、300b'が試料導入スペーサ200a'、200b'に各々積層された構造をしている。但し、ここで試料導入部100の構造は前記で言及したように、カギ形構造に限定されるものではなく、試料導入通路部101と通気部102が交差形成されれば満足され、余分空間103の構造もまた、前記に言及したように変化可能である。
図6は、前記した構造の試料導入部と試料流動感知能力を具備した対面形バイオセンサーの好ましい一例を図示した分解斜視図である。前記対面形バイオセンサーは流動感知電極107、電子伝達媒介体及び酸化酵素がコーティングされた作動電極104'、電極連結部106が形成された下部基板400'、試料導入通路部101と通気部102がカギ形に形成され、試料導入通路部101と通気部102が出会う地点に余分空間103が形成された構造をした試料導入部100が具備された試料導入スペーサ200'、及び基準電極兼補助電極105'及び電極連結部106が裏面に形成された上部基板300'を順次積層した構造をしている。前記流動感知電極107は、作動電極の後ろの余分空間103または通気部102に配置して、下部基板で全血試料の流動性を測定するためのものである。ヘマトクリット値は、全血の流動性と血液の電気伝導性を変化させるため、バイオセンサーの細長い毛細管通路を通じて血液が試料導入部100を満たす時間は、血液内のヘマトクリット値に比例して変化する。このような血液試料の流動性は、試料導入時に試料導入口近くでの一番目の電極接触と流動感知電極107の間で試料が満たされる速度の関数として決定されるため、実際の血液内の血糖測定でヘマトクリット値による誤差を訂正するのに使用できる。但し、ここで試料導入部100の構造は前記に言及したように、カギ形構造に限定されるものではなく、試料導入通路部101と通気部102が交差形成されれば満足され、余分空間103の構造もまた、前記に言及したように変化させられる。
バイオセンサーの下部基板及び上部基板の材質は、セラミック、ガラス板または高分子材料が使用でき、好ましくは、ポリエステル、ポリ塩化ビニル及びポリカーボネート等の有機高分子材料を使用できる。
前記基準電極、作動電極及び補助電極の材料は、導電性物質であれば特別に制限されない。導電性物質の例としては、エポキシ、銀/塩化銀、炭素及び特定の酸化-還元対またはその他の添加剤が補強された電導性炭素等をあげられる。前記基準、補助及び作動電極は、導電性物質を基板上にスクリーンプリント、物理的蒸気着床またはエッチングするか、導体テープの付着等によって形成できる
前記した構造を持った試料導入部100が具備された電気化学的バイオセンサーは、(1)血液試料を毛細管現象によって速く吸い込む時、交差点部位に余分空間を設けて若干の余裕空間を置くことによって、試料導入通路部が直角に曲がる隅部位で発生し得るエア-ポケット現象を最小化できる。(2)試料導入部100が細い入口と通気部により良く取り囲まれていて、全体試料通路の上部分が上部基板(またはカバー)で覆われているため、センサーを測定する器具に装着したり脱着する時、導入された試料が漏出して手に付くことが減り、衛生的であり、測定の間の試料蒸発による濃度の変化を最小化し、分析的再現性を向上させられる。そして、(3)試料通路部と通気部が概略的に垂直な形態に作られた試料導入部100を持ったバイオセンサーは、予定された量の血液試料の速い導入が可能で、バイオセンサーの正確性と信頼度そして再現性を向上させられる。このような点は、一般的なi-形態のバイオセンサーと対照的である。(4)最後に、本発明で提示する形態の試料導入部100は、センサーの端部分で 試料を導入できるように考案されたものであり、採血部位で測定する血液と容易く接触できるため、試料導入がずっと便利である長所を持っている。
作動電極に固定する電子伝達媒介体の例として、従来から広く使用されてきたフェロセン(ferrocene)、フェロセン誘導体、キノン(quinones)、キノン誘導体、有機伝導性塩(organic conducting salt)、またはビオロゲン(viologen)を含む。好ましくは、ヘキサアミンルテニウム(III)クロライド(hexaammineruthenium(III)chloride)、カリウムフェリシアニド(potassium ferricyanide)、カリウムフェロシアニド(potassium ferrocyanide)、ジメチルフェロセン(dimethylferrocene (DMF))、フェリシニウム(ferricinium)、フェロセンモノカルボン酸(ferocene monocarboxylic acid (FCOOH))、7,7,8,8,-テトラシアノキノジメタン(7,7,8,8-tetracyanoquino- dimethane (TCNQ))、テトラチアフルバレン(tetrathia fulvalene(TTF))、ニッケロセン(nickelocene(Nc))、N-メチルアクリジニウム(N-methyl acidinium(NMA+))、テトラチアテトラセン(tetrathiatetracene(TTT))、N-メチルフェナジニウム(N-methylphenazinium (NMP+))、ヒドロキノン(hydroquinone)、3-ジメチルアミノ安息香酸(3-dimethylaminobenzoic acid(MBTHDMAB))、3-メチル-2-ベンゾチアゾリノンヒドラゾン(3-methyl-2-benzothiozolinone hydrazone)、2-メトキシ-4-アリルフェノール(2-methoxy-4-allylphenol)、4-アミノアンチピリン(4-aminoantipyrin(AAP))、ジメチルアニリン(dimethylaniline)、4-アミノアンチピレン(4-aminoantipyrene)、4-メトキシナフトール(4-methoxynaphthol)、3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン(3,3',5,5'-tetramethyl benzidine(TMB))、2,2-アジノ-ジ-[3-エチル-ベンズチアゾリンスルホナート] (2,2-azino-di-[3-ethyl-benzthiazoline sulfonate])、o-ジアニシジン(o-dianisidine)、o-トルイジン(o-toluidine)、2,4-ジクロロフェノール(2,4-dichlorophenol)、4-アミノフェナゾン(4-amino phenazone)、ベンジジン(benzidine)、プルシアンブルー(prussian blue)等の混合電子価化合物をあげられる。最も好ましいのは、ヘキサアミンルテニウム(III)クロライドである。それは、(1)水溶液内での酸化-還元状態が安定で可逆的である。(2)還元された電子伝達媒介体は、酸素と反応しない。(3)電子伝達媒介体の形式電位が充分に低く、血液内のアスコルビン酸、アセトアミノフェン及び尿酸のような多様な妨害種による影響を最小化できる。(4)還元された電子伝達媒介体の酸化がpHに敏感でない。(5)電気化学的妨害物質のアスコルビン酸、アセトアミノフェン及び尿酸と反応しない、という特性を持つからである。
本発明は、血糖測定バイオセンサーを実施例に説明するが、グルコースの適用と同一に特定酵素を導入することによって多様な代謝物質、例えば、コレステロール、乳酸、クレアチニン、蛋白質、過酸化水素、アルコール、アミノ酸、酵素、例えば、GPT(グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ)、GOT(グルタミン酸オキサロ酢酸トランスアミナーゼ)等の生体試料と環境試料、農工業試料または食品試料中の多様な有機物または無機物濃度もまた、同一な方法で定量できる。したがって、本発明は、作動電極にコーティングする酵素の種類を変えることによって多様な代謝物質の定量に利用できることを理解されなければならない。例えば、グルコース酸化酵素、乳酸酸化酵素、コレステロール酸化酵素、グルタミン酸酸化酵素、西洋ワサビペルオキシダーゼ、及びアルコール酸化酵素等を使用してコレステロール、乳酸、グルタミン酸、過酸化水素及びアルコールの定量を行なうことができる。
以下、実施例によって本発明を詳細に説明する。但し、下記実施例は発明を例示するだけのものであり、本発明が実施例によって限定されるものではない。
実施例1：平面形バイオセンサーの組立
ポリエステル下部基板400上に導電性炭素ペーストを線対称形にスクリーンプリントして、2個の電極(作動電極;104及び補助電極(または基準電極)105を形成した。2電極間の間隔は、125μmにした。その後、140℃で5分間熱処理をした。
ポリエステル材質の両面テープに金型プレスして、試料導入通路部101、通気部102及び余分空間103を持った試料導入部100を形成した。試料導入通気部102と通路部101は、カギ型形態をなすようにし、その比は、1:2に調整した。余分空間部103は、試料導入通路口の延長線上に形成するようにした。また、試料導入部の全体容積、即ち、試料導入通路部、通気部及び余分空間の総容積は、0.5μlになるようにした。
試料導入口100を具備した試料導入スペーサ200として、ポリエステル材質の両面テープを、前記ポリエステル下部基板400の間に入れて圧着し、バイオセンサーの骨組みを製造した。ヘキサアミンルテニウム(III)クロライド0.015mg、分散剤(カルボキシメチルセルロース: CMC)0.015mg、界面活性剤(商品名: Triton X-100)0.01mg及びグルコース酸化酵素40mgを混合した水溶液をバイオセンサーを形成するために電極に適用した後、生成された積層物を45℃で30分間乾燥させた
酵素混合物が乾燥後、試料導入スペーサ200の上面を上部基板300に圧着して図2に図示した平面形バイオセンサーを製作した。
実施例2：対面形バイオセンサーの組立
図3と同じ形態の作動電極104'と電極連結部106を炭素ペーストでスクリーンプリントした後、140℃で5分間熱処理した。その後、電極連結部106の端部分に銀ペーストを試料導入スペーサ電極の厚みになるようにスクリーンプリントして回路連結部を完成する。上部基板電極は、炭素ペーストで基準電極兼補助電極105'をスクリーンプリントして下部基板電極製作時と同様な条件で熱処理する。基準電極兼補助電極105'の端部分は、銀ペーストで回路連結部106を形成して対面形バイオセンサーの上部基板電極を製作した。
ポリエステル材質の両面テープに図3に図示された模様の試料導入通路部101、通気部102及び余分空間103を含む試料導入スペーサ200'を金型プレスで製作した。通気部102と試料導入通路部101の幅の比は、1:4になるように調節した。このように形成された試料導入部の全体容積は、0.5μlになるように製作した。
バイオセンサーを完成するために、電極が印刷された下部基板400'上に試料導入スペーサ200'を圧着して組み立てた。次に、露出した試料通路部位の電極上に適用する溶液の総容積を1mlにする時、ヘキサアミンルテニウム(III)クロライド0.015mg、分散剤(カルボキシメチルセルロース: CMC)0.015mg、界面活性剤(商品名: Triton X-100)0.01mg及びグルコース酸化酵素40mgを混合した水溶液を滴下した後、45℃で30分間乾燥させた。
酵素混合物が乾燥した後、試料導入スペーサ200'の上面を上部基板300'電極に、下部基板400'の回路連結部と良く連結されるように圧着して図3に図示した対面形バイオセンサーを製作した。
実施例3：差等式平面形グルコースセンサーの組立
実施例1と同じ方式で差等式平面形グルコースセンサーを製作した。 図4に図示したように、下部基板400a裏面に実施例1で使用したヘキサアミンルテニウム(III)クロライドとグルコース酸化酵素の代りに少量の牛血清アルブミン(BSA)を差動作動電極104に固定した後、各々の上部基板300a、300bを圧着して差等式平面形グルコースセンサーを完成した。
実施例4：差等式対面形バイオセンサーの組立
実施例2と同じ方式で差等式対面形グルコースセンサーを製作した。 図5に図示したように、下部基板400b裏面に実施例1で使用したヘキサアミンルテニウム(III)クロライドとグルコース酸化酵素の代りに少量の牛血清アルブミン(BSA)を差動作動電極104'に固定した後、各々の上部基板電極300a'、300b'を圧着して差等式対面形グルコースセンサーを完成した。
実施例5：流動性感知電極を具備したバイオセンサーの組立
図6に図示したように、流動感知電極107を使用することを除いて、実施例2と同じ方式で対面形グルコースセンサーを製作した。流動感知電極は、同じ炭素ペーストを使用してスクリーンプリント方法で製作した。流動感知電極の端部分は、試料導入部分の余分空間103に位置する。
実験例1：対面形グルコースセンサーでの妨害物質の影響
図7は、グルコース177mg/dLと最大臨床値より5倍高い濃度(即ち、アスコルビン酸570μM、アセトアミノフェン660μM、尿酸916μM)で妨害物質を含んでいるホスファート緩衝標準溶液(pH7.4)に対する全体感応電流を示したものである。この時、全体感応電流は、作動電極104'(対比基準電極105')に+0.2V電位をかけた後、5秒毎にクロノアンペロメトリー法の感応を読んで測定した。試料は、実施例2により製作した対面形グルコースセンサーのセンサー導入部100に注入し、適用した試料の平均容積は、0.5μlだった。図7のヒストグラムは、印加電位+0.2Vでは、妨害物質の存在による影響を受けないことを示している。
実験例2：グルコース標準溶液に対する対面形グルコースセンサーの補正曲線
実施例2により製作した対面形グルコースセンサーを利用して、グルコース標準溶液に対する検定テストを行なった。具体的には、各々のグルコース濃度の標準溶液で各濃度当り10回ずつ基準電極対比印加電位0.2Vで電流値を測定した。この時、センサー導入部に適用した試料の量は、0.5μlで、試料が導入部を満たすのにかかる時間は、約200ms以下だった。測定は、試料が試料導入部を満たした後、2秒の反応時間を与え、次に0.2 Vの電圧を3秒間加え、5秒での電流値を読んだ。 図9は、クロノアンペロメトリー法測定の動的感応曲線で、各々の曲線はグルコース0mg/dL(a曲線)、50mg/dL(b曲線)、150mg/dL(c曲線)、300mg/dL(d曲線)、450mg/dL(e曲線)及び600mg/dL(f曲線)を示したものである。
本発明のバイオセンサーで得られる感応傾きは、0.093[μA/(mg/dL)]で、線形性は0.997であり、本発明のバイオセンサーが卓越した直線性感応を示した。
実験例3：血液流動性測定
流動感知電極を具備したバイオセンサーを実施例5により製作した。200mVの電位を作動電極104'と流動性感知電極107に適用した(基準電極105'に対し)。試料通路部101を通じて血液試料が導入されると瞬間電流の流れが感知され、流動時間測定が始まる。試料が余分空間103に接触すると同時に、二回目の瞬間電流が感知され、最初と二回目の瞬間電流間の時間間隔が記録される。このような試料導入時間とヘマトクリット値間の相関関係を図10に示した。実験は、180mg/dL血糖と多様な量のヘマトクリット値水準を含むフッ化ナトリウム(sodium fluoride)で処理された全血を使用して実施した。 実験の結果、下記の数学式1の関係式(fitting equation)が得られた。
Y = -72.23 + 0.58691X - 0.00084073X2 - 1.1211x10-6X3 + 5.7521x10-9X4 - 9.1172x10-12X5
(前記式中、Yは流動性感知電極を使用して測定された試料充満時間Xから得た推定されるヘマトクリット値の水準である。)
下記の表1は、試料充満時間の速度から推定されるヘマトクリット値水準を示す。
（表１）実施例5により製作されたバイオセンサーの試料充満時間から推定されるヘマトクリット値水準
Figure 0003948627
独立的な実験で、補正曲線は多様なヘマトクリット値水準で全血を使用して得た。そして、ヘマトクリット値水準と感応傾き間の相関関係は、表2に公式化された。
（表２）
Figure 0003948627
これと同じ方式で誘導された補正常数は、40%ヘマトクリット値水準を持った全血に対して測定される血糖水準を再補正するのに利用され、結果的にこのような補正を経たバイオセンサーは、ヘマトクリット値に影響を受けず血糖濃度の測定ができる。即ち、測定器は、始めの試料導入速度を読み、血液試料内のヘマトクリット値を決定し、そして、表で一致する補正曲線を探して測定された電流値から補正された血糖水準を決定する。このようなヘマトクリット値水準を補正して得た血糖水準は、YSI 2300で得られた値と近接していることを示すことが分かる。 表3は、このような方式で実行した実験の結果を示す。
（表３）全血の血糖濃度、試料導入速度は、流動感知電極を使用して測定した。全血の血糖水準を計算するために表2の補正曲線を利用する。
Figure 0003948627
流動性感知電極はまた、血液試料の非正常的な流動性を区別する。このような現象は、非常に低いか高いヘマトクリット値水準を持った試料や気泡形成による血液試料の間違った導入等から発生し得る。測定時、このような場合は、測定装置からプログラムにより警告メッセージや誤謬コードが現れるようにする。
本発明の好ましい態様の適用は、添付の図面への参照によって最も良く理解され、図面における類似の参照番号は、類似かつ対応する部分に用いられる。
本発明による試料導入部が具備された電気化学的バイオセンサーの好ましい一例を図示した分解斜視図である。 本発明の第1の態様による平面形バイオセンサーの好ましい一例を図示した分解斜視図である。 本発明の第2の態様による対面形バイオセンサーの好ましい一例を図示した分解斜視図である。 本発明の第3の態様による差等式平面形バイオセンサーの好ましい一例を図示した分解斜視図である。 本発明の第4の態様による差等式対面形バイオセンサーの好ましい一例を図示した分解斜視図である。 本発明による試料導入部と流動感知電極が具備された電気化学的バイオセンサーの好ましい一例を図示した分解斜視図である。 対面形グルコースセンサーでの多様な妨害物質による影響を示したグラフである。 a：グルコース b：グルコース + アセトアミノフェン (660 μM) c：グルコース + アスコルビン酸 (570 μM) d：グルコース + 尿酸 (916 μM) 対面形グルコースセンサーのグルコース標準溶液に対する検定曲線を示したグラフである。 対面形グルコースセンサーのグルコース標準溶液に対するクロノアンペロメトリー法測定の動的感応曲線を示したものである。 試料流動性(時間に対する関数として)とヘマトクリット値 (hematocrit)水準間の関係を描写したグラフである。

Claims (16)

  1. 試料導入通路部、通気部、および余分空間部を含む試料導入部を具備した電気化学的平面形バイオセンサーであって、
    試料導入スペーサ；
    試料導入スペーサと連結され、表面に作動電極及び基準電極が印刷され、電子伝達媒介体及び酸化酵素が提供される下部基板；ならびに
    試料導入スペーサに積層され、試料導入チャンネルを形成する上部基板をさらに含み、
    ここで、試料導入部が試料導入スペーサの一方の末端に形成され、試料導入通路部と通気部が交差形成され、試料導入通路部と通気部が出会う地点に余分空間部が形成され、該余分空間部が試料導入通路部の伝達地点の後ろに拡張されているバイオセンサー。
  2. 試料導入通路部、通気部、および余分空間部を含む試料導入部を具備した電気化学的対面形バイオセンサーであって、
    試料導入スペーサ；
    試料導入スペーサに連結され、表面に作動電極及び電極連絡部が印刷され、電子伝達媒介体及び酸化酵素が提供される下部基板；ならびに
    試料導入スペーサに積層され、内部表面に基準電極及び電極連絡部が印刷される上部基板をさらに含み、
    ここで、試料導入部が試料導入スペーサの一方の末端に形成され、試料導入通路部と通気部が交差形成され、試料導入通路部と通気部が出会う地点に余分空間部が形成され、該余分空間部が試料導入通路部の伝達地点の後ろに拡張されているバイオセンサー。
  3. 試料導入通路部、通気部、および余分空間部を含む試料導入部を具備した電気化学的差等式平面形バイオセンサーであって、
    一対の試料導入スペーサ；
    試料導入スペーサ間に連結され、両表面に作動電極及び基準電極がそれぞれ印刷され、一つの面には、酸化酵素と電子伝達媒介体が、もう一つの面には、BSAと電子伝達媒介体がそれぞれ提供される下部基板をさらに含み；
    一対の上部基板が、試料導入スペーサの両側に積層され試料導入チャンネルを形成し、
    ここで、試料導入部が各々の試料導入スペーサの末端に形成され、試料導入通路部と通気部が交差形成され、試料導入通路部と通気部が出会う地点に余分空間部が形成され、該余分空間部が試料導入通路部の伝達地点の後ろに拡張されているバイオセンサー。
  4. 試料導入通路部、通気部、および余分空間部を含む試料導入部を具備した電気化学的差等式対面形バイオセンサーであって、
    一対の試料導入スペーサ；
    試料導入スペーサ間に連結され、両表面に作動電極がそれぞれ印刷され、一つの面には、酸化酵素と電子伝達媒介体が、もう一つの面には、BSAと電子伝達媒介体がそれぞれ提供される下部基板をさらに含み；
    基準電極及び電極連絡部を内部表面に有する一対の上部基板が、試料導入スペーサの両方に積層され試料導入チャンネルを形成し、
    ここで、試料導入部が各々の試料導入スペーサの一方の端に形成され、試料導入通路部と通気部が交差形成され、試料導入通路部と通気部が出会う地点に余分空間部が形成され、該余分空間部が試料導入通路部の伝達地点の後ろに拡張されているバイオセンサー。
  5. 試料導入通路部、通気部、および余分空間部を含む試料導入部を具備した電気化学的対面形バイオセンサーであって、
    試料導入スペーサ；
    試料導入スペーサに連結され、表面に作動電極、電極連絡部及び流動感知電極が印刷され、電子伝達媒介体及び酸化酵素が提供される下部基板；ならびに
    試料導入スペーサに積層され、 基準電極及び電極連絡部が内部表面に印刷された上部基板をさらに含み、
    ここで、試料導入部が試料導入スペーサの一方の端に形成され、試料導入通路部と通気部が交差形成され、試料導入通路部と通気部が出会う地点に余分空間部が形成され、該余 分空間部が試料導入通路部の伝達地点の後ろに拡張されているバイオセンサー。
  6. 通気部と試料導入通路部の幅の比が、1:2 以下である、請求項1〜５のいずれか一項に記載の電気化学的バイオセンサー。
  7. 通気部と試料導入通路部の幅の比が、1:5 から1:2である、請求項1〜５のいずれか一項に記載の電気化学的電気化学的バイオセンサー。
  8. 試料導入部が、0.1μl〜 3.0μlの試料を導入するための容量を有する、請求項1〜５のいずれか一項に記載の電気化学的バイオセンサー。
  9. 試料導入部が、0.1μl〜 1.0μlの試料を導入するための容量を有する、請求項1〜５のいずれか一項に記載の電気化学的バイオセンサー。
  10. 試料導入部が、0.3μl〜 0.7μlの試料を導入するための容量を有する、請求項1〜５のいずれか一項に記載の電気化学的バイオセンサー。
  11. 試料導入通路部と通気部がなす角度が、45°〜135°である、請求項1〜５のいずれか一項に記載の電気化学的バイオセンサー。
  12. 試料導入通路部と通気部がなす角度が、75°〜105°である、請求項1〜５のいずれか一項に記載の電気化学的バイオセンサー。
  13. 試料導入通路部と通気部がなす角度が、90°である、請求項1〜５のいずれか一項に記載の電気化学的バイオセンサー。
  14. グルコース酸化酵素、乳酸酸化酵素、コレステロール酸化酵素、グルタミン酸酸化酵素、西洋ワサビペルオキシダーゼ、及びアルコール酸化酵素からなる群から選択される酸化酵素をさらに含む、請求項1〜５のいずれか一項に記載の電気化学的バイオセンサー。
  15. ヘキサアミンルテニウム(III)クロライド、カリウムフェリシアニド、カリウムフェロシアニド、ジメチルフェロセン、フェリシニウム、フェロセンモノカルボン酸、7,7,8,8,-テトラシアノキノジメタン、テトラチアフルバレン、ニッケロセン、N-メチルアクリジニウム、テトラチアテトラセン、N-メチルフェナジニウム、ヒドロキノン、3-ジメチルアミノ安息香酸、3-メチル-2-ベンゾチアゾリノンヒドラゾン、2-メトキシ-4-アリルフェノール、4-アミノアンチピリン、ジメチルアニリン、4-アミノアンチピレン、4-メトキシナフトール、3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン、2,2-アジノ-ジ-[3-エチル-ベンズチアゾリンスルホナート] 、o-ジアニシジン、o-トルイジン、2,4-ジクロロフェノール、4-アミノフェナゾン、ベンジジン、プルシアンブルーからなる群から選択される電子伝達媒介体をさらに含む、請求項1〜５のいずれか一項に記載の電気化学的バイオセンサー。
  16. 電子伝達媒介体が、ヘキサアミンルテニウム(III)クロライドである、請求項１５記載の電気化学的バイオセンサー。
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