BRPI0609633B1

BRPI0609633B1 - espécies oxidáveis como uma referência interna em soluções de controle para biossensores

Info

Publication number: BRPI0609633B1
Application number: BRPI0609633A
Authority: BR
Inventors: Greg P Beer; Huan-Ping Wu
Original assignee: Bayer Healthcare Llc
Priority date: 2005-04-08
Filing date: 2006-04-07
Publication date: 2016-01-26
Also published as: RU2453843C2; JP2008536125A; PL2267150T3; US8002965B2; US20090014339A1; NO20075709L; CN102778487B; RU2007141387A; CN104407124A; CN101180403A; EP1869203B1; CA2603542C; EP2267150B1; US20110262942A1; CN102778487A; US20140147872A1; CA2603542A1; TW200641352A; DK2267150T3; ES2552083T3

Abstract

espécies oxidáveis como uma referência interna em soluções de controle para biossensores. o teste do desempenho de um medidor eletroquímico, usado para medir a presença de um analito em uma amostra biológica, particularmente, glicose em sangue integral, inclui a introdução de uma solução de controle contendo uma proporção predeterminada do analito e uma proporção predeterminada de um composto de referência interna. o composto de referência interna é selecionado de modo que seja oxidado a um potencial superior do que aquele usado para oxidar o analito, possibilitando distinguir a solução de controle de uma amostra biológica.

Description

"ESPÉCIES OXIDÁVEIS COMO UMA REFERÊNCIA INTERNA EM SOLUÇÕES DE CONTROLE PARA BIOSSENSORES" CAMPO DA INVENÇÃO

Esta invenção é dirigida, de uma maneira geral, ao campo de dispositivos médicos.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Mais especificamente, esta invenção se refere a biossensores, que são usados para medir a proporção de ana-litos em fluidos corpóreos. Os métodos ópticos são freqüen-temente usados para fazer essas medidas, mas a presente invenção se refere a aperfeiçoamentos em biossensores eletro-químicos. Ainda que o método descrito aqui possa ser aplicado à medida de outros analitos, incluindo colesterol, uréia, creatinina e creatina, a medida de glicose em sangue integral é de particular interesse. Embora a descrição aqui vá enfatizar a aplicação da invenção na medida de glicose, deve-se entender que a invenção tem aplicações mais amplas. A invenção se refere a um instrumento eletroquími-co no qual um potencial é aplicado a eletrodos em contato com uma amostra biológica e reagentes. A corrente resultante é medida, enquanto o analito está reagindo com os reagentes, e depois correlacionada com a proporção de um analito na a-mostra. Esses instrumentos são referidos como amperométri-cos, em contraste com os instrumentos colorimétricos, que medem a carga total em coulombs, produzidos da reação da a-mostra por integração da corrente por todo o tempo de medida. Os instrumentos amperométricos têm uma vantagem pelo fato de que eles são menos dependentes de volume e tempo. Não esperam que todo o volume do analito seja reagido, mas apenas fazem medidas no analito por amostragem da taxa de reação a um tempo predeterminado.

Muitos projetos para esses biossensores foram descritos na técnica, por exemplo, no pedido de patente U.S. 2001/0042683. Os eletrodos são descritos de uma maneira geral como o eletrodo de trabalho e como o contra-eletrodo. Os eletrodos ficam em contato com uma camada sólida contendo reagentes, que oxidam o analito na amostra, tal como glicose oxidase, e mediadores que reoxidam a enzima reduzida. O próprio mediador reduzido é oxidado no eletrodo de trabalho, que produz uma corrente mensurável. Essa corrente é usada para calcular a proporção de glicose na amostra sendo testada, uma vez que é uma medida indireta da oxidação de glicose na amostra, as reações podem ser descritas pelas seguintes etapas: Glicose + EOXid -> Ered + produto (ácido glucônico, gluconolactona) Ered + Medoxid ^ Medred E oxid Medred -> Medoxld + ne", em que EOXid e Ered são as formas oxidada e reduzida do centro de oxirreduçâo da enzima e Med0Xid e Medred são as formas oxidada e reduzida do mediador.

Para medir glicose, a enzima pode ser glicose oxidase e o mediador ferricianeto. A medida de outros analitos vai empregar enzimas e mediadores adequados. As combinações típicas de enzima, mediador e analito são listadas na Tabela 1. TABELA 1 - Sistemas de substratos, enzimas e medi-adores _ __ Para garantir medidas precisas, soluções de controle contendo proporções conhecidas de glicose são usadas para verificar que o instrumento está funcionando adequadamente. A composição das soluções de controle foi objeto de várias patentes e publicações. São representativas as patentes U.S. 3.920.580, 4.572.899, 5.028.542 e 5.605.837, os pedidos de patentes internacionais WO 93/21928, 95/13535 e 95/13536. Ainda que as soluções de controle contendo soro de sangue tenham sido usadas, as patentes mais recentes se preocuparam com a substituição das soluções de controle à base de soro com soluções isentas de soro, uma vez que as soluções isentas de soro são mais consistentes e estáveis do que aquelas contendo soro. A solução de controle deve conter uma concentração conhecida de glicose em uma matriz similar a soro, para determinar a precisão de ambos o biossensor en-zimático e o medidor do potenciômetro. Vai ser evidente que a composição deve ser estável por períodos mais longos de armazenamento, antes de uso.

As solucnp^ He -entrele devera servir para a finalidade de checar o funcionamento do sistema de monitoramento de glicose, mas devem ser, ao mesmo tempo, identificadas e separadas das leituras das amostras de sangue reais. Isso é porque as soluções de controle contêm proporções conhecidas de alíoose e proporcionam leituras que não têm qualquer fim terapêutico. Se as soluções de controle não podem ser identificadas e as suas respostas separadas daquelas das amostras de sangue pelo medidor de teste, as leituras de glicose das soluções de controle vão ser incluídas na história das medidas de glicose, o que pode levar a uma interpretação errada de uma condição diabética de paciente. Ou, se uma solução de controle for substituída por uma amostra de sangue, pode ser considerada erroneamente por um médico como indicando uma necessidade para mudança de tratamento. Além do mais, uma vez que a resposta de temperatura das soluções de controle é diferente daquela das amostras de sangue, a compensação de temperatura paras as medidas feitas em temperaturas diferentes de 25°C vai ser menos precisa, se um medidor de teste não puder distinguir entre as amostras de sangue e as soluções de controle. Portanto, é altamente desejável que o sistema de monitoramento de glicose detecte e i-dentifique, automaticamente, as soluções de controle, para separar as leituras de glicose das soluções de controle daquelas das amostras de sangue, e proporcione uma compensação de temperatura para ambas as amostras de sangue e as soluções de controle.

Pode haver várias p^fnni-es descrcvcr.de métedes de identiíicaçãc das soluções de controle por vários mecanismos. Na patente IJ.S. 5.723.284, a medida eletroquimica de glicose no sangue é discutida. A patente '284 proposta para modificar as soluções de controle, alterando a razão das leituras de momento, '“ornadas dos deis periedes de uxidaçãu separados por um período de repouso. 0 medidor vai reconhecer que uma solução de controle estava sendo medida e tomar a ação adequada, para impedir que os resultados sejam incluídos nos resultados das amostras de sangue. A patente '284 também ensina que a solução de controle deve ser tamponada em uma faixa de pH de 4,8 a 7,5, para que seja efetiva.

Outro método para determinar se uma solução de controle ou uma amostra de sangue está sendo medida para o seu teor de glicose é descrito no pedido de patente U.S. 2002/0139692A1 publicado. Um índice é determinado que se refere à diminuição de corrente elétrica para a natureza da amostra sendo testada.

As patentes U.S. 5.620.579 e 5.653.863, foram propostas para começar o teste de uma amostra ao proporcionar um pulso de potencial positivo inicial por um curto período, para reoxidar qualquer mediador reduzido prematuramente. Esse pulso inicial foi referido como um "período de queima".

Quando um potencial é aplicado pelos eletrodo de trabalho e contra-eletrodo e uma amostra líquida é introduzida no sensor, os reagentes secos são reidratados pela a-mostra liquida e a corrente começa a escoar, aumentando, tipicamente, a um pico e depois diminuindo pelo "período de queima", usua Imente de uma umarm ~e ccrca hc dez segunda». Durante esse período, o mediador previamente reduzido é reo-xidado para reduzir a tendência para resultados altamente incorretos. Se uma quantidade total de amostra não estiver presente, um erro adicional pode ser i nt mdu u í do, uma ve π aue todos os reage^t^s podem não ficar disponíveis ραία α reação, ou os eletrodo de trabalho e contra-eletrodo podem não ficar em contato completo com a amostra, reduzindo, desse modo, a corrente durante o período de "queima".

Após o período de queima ter sido completado, um período de repouso é proporcionado a um potencial mais baixo ou sem potencial (circuito aberto). Durante esse período de repouso, a reação de oxidação de glicose continua a ocorrer e o mediador é reduzido. Depois, um potencial constante é aplicado de novo entre os eletrodo de trabalho e contra-eletrodo e a corrente é medida por um curto período, tipicamente em torno de dois a dez segundos. A corrente é inicialmente alta, mas diminui rapidamente na medida em que a difusão do mediador começa a controlar. A um momento predeterminado, a corrente medida é usada para determinar o teor de glicose da amostra. A adição de um composto de referência interna é uma prática comum em quimica analítica para proporcionar um sinal de referência quantitativo. Esse princípio operacional tem sido usado em um pedido de patente recém-publicado WO 2005/078118, no qual uma referência interna é adicionada ao sistema reagente para obter alguma formulação fim.

No Dedido He pater.tc internacional WO2Ü04/040286A1, propõe-se que a solução de controle inclua uma substância redutora selecionada de ácido úrico, bilirru-bina, ácido ascórbico, azul de metileno, bis (2-hidroxietil) iminotris (hidroxiiTiet.il ) metano, áci do N, N-bis '2-hidroxietil)-2-ami nom^tano sul fônico, e acetamidofeno, variando, desse modo, a razão das leituras de corrente tomadas de dois períodos de oxidação separados por um período de repouso e possibilitando a identificação da solução de controle .

Os presentes inventores buscaram um método de i-dentificação aperfeiçoado para a distinção de soluções de controle de amostras biológicas. Os seus métodos são descritos em detalhes abaixo.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Esta invenção proporciona um método para distinguir uma solução de controle de uma amostra biológica, durante a operação de um medidor eletroquimico por um índice quantitativo. Em uma modalidade, a invenção é uma solução de controle, que inclui proporções conhecidas de glicose, um sistema tampão com um valor de pH adequado, e um composto de referência interna. 0 composto de referência interna é adicionado à solução de controle para identificar a solução de controle pelo sistema de monitoramento de glicose. A invenção proporciona um método de detecção da presença do composto de referência interna, cálculo do índice quantitativo e identificação de que a solução de controle está sendo testada .

Em uma modalidade, o analito na amostra biológica é glicose em sangue integral e o mediador é ferricianeto de potássio. 0 composto de referência interna é oxidável a um potencial mais alto do que o potencial necessário para oxidar o mediador, que é usado para medir a oxidação do analito. A referência interna tem uma concentração predeterminada na solução de controle, juntamente com uma concentração predeterminada de glicose. 0 mediador relacionado com glicose e a referência interna são oxidados seletivamente no eletrodo por diferentes potenciais (baixos e altos). Quando a glicose é o analito, o composto de referência interna deve ser oxidável a um potencial de pelo menos 100 mV mais alto do que o potencial usado para reoxidar o mediador reduzido.

Os compostos de referência interna, úteis para medir glicose em soluções de controle, incluem quaisquer espécies oxidáveis no eletrodo a um potencial adequado, tais como compostos organometálicos, compostos de coordenação e compostos de aminas orgânicas. A proporção do composto de referência interna usada é relacionada com a proporção de glicose na solução de controle. De preferência, a proporção do composto de referência interna é selecionada de modo que a solução de controle possa ser reconhecida, quando a glicose na solução de controle for o máximo necessário para testar o medidor de glicose eletroquimico. Alternativamente, a proporção do composto de referência interna pode ser variada em relação à proporção de glicose.

As medidas comparativas feita em potenciais baixos e altos proporcionam um método para detectar o composto de referência interna e, desse modo, a solução de controle. Quando o protocolo de medida emprega dois períodos separados por um período de repouso, as voltagens alta e baixa podem ser aplicadas em gualquer um ou em ambos os períodos. Um potencial é aplicado a um sensor, que recebeu a solução de controle. A corrente produzida a um potencial capaz de oxidar o composto de referência interna é comparada com a corrente produzida, quando de um potencial capaz de oxidar apenas o analito (por exemplo, glicose), mas não o composto de referência interna. A razão entre as duas correntes medidas, designada o índice Diferencial (Dl), proporciona um meio para distinguir a solução de controle de uma amostra líquida desprovida do composto de referência interna.

Dl = ialta volt. / ibaixa volt. em que iaita voit. e ibaixa voit. são as correntes medidas em alta e baixa voltagens. Na voltagem mais alta, ambos o composto de referência interna e o mediador reduzido são oxidados, enquanto que na voltagem mais baixa apenas o mediador é oxidado.

Um valor de Dl de cerca de 1 indica que a amostra é desprovida do composto de referência interna e presume-se que seja uma amostra biológica, enquanto que um valor Dl significativamente superior a 1, de preferência, pelo menos cerca de 1,5, indica que a amostra é uma solução de controle .

Em outra modalidade, a invenção é um composto de referência interna, adequado para indicar a presença de uma solução de controle, que está sendo usada para testar a precisão de um sistema biossensor eletroquimico / potenciôme-tro. Quando o analito é glicose em sangue integral, o composto de referência interna pode ser um composto organometá-lico oxidável, um composto de coordenação ou uma amina orgânica .

Uma conseqüência da presente invenção é o aperfeiçoamento da consistência da corrente medida e da precisão da análise resultante. Se potenciais alto e baixo são aplicados durante o mesmo período de oxidação, tais como os períodos de queima e leitura usados na oxidação de glicose, é menos provável que fatores externos, tais como o movimento da a-mostra ou a temperatura ambiental, afetem o índice Diferencial. As leituras múltiplas da corrente desenvolvida a voltagens alta e/ou baixa podem aperfeiçoar a precisão dos resultados. Também, quando a presença de uma solução de controle foi determinada, um algoritmo de correção de temperatura particular para a solução de controle pode ser aplicado. Por uso de diferentes algoritmos de temperatura para a solução de controle e a amostra biológica (por exemplo, sangue integral), os resultados clínicos podem ser aperfeiçoados e valores de faixas de controle mais estreitas podem ser atribuídos.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A Figura 1 é uma vista detalhada de um biossensor de acordo com uma modalidade. A Figura 2 é uma vista montada do biossensor da Figura 1. A Figura 3 é uma representação gráfica de potencial versus tempo para um período de queima. A Figura 4 é uma representação gráfica de corrente versus tempo para o potencial aplicado como a Figura 3. A Figura 5 é um curva corrente - potencial cíclica descrita no Exemplo 1. A Figura 6 é um curva corrente - potencial cíclica descrita no Exemplo 2. A Figura 7 é um curva corrente - potencial cíclica descrita no Exemplo 3. A Figura 8 é um curva corrente - potencial cíclica descrita no Exemplo 4.

As Figuras 9A - E ilustram as seqüências de potenciais descritas no Exemplo 5.

As Figuras 10a - b são curvas corrente - potencial cíclicas descritas no Exemplo 6. A Figura 11 é uma representação gráfica de corrente versus tempo obtida no Exemplo 7. A Figura 12 é uma representação gráfica de corrente versus tempo obtida no Exemplo 8.

DESCRIÇÃO DETALHADA DOS DESENHOS

Descrição das modalidades preferidas A invenção vai ser descrita abaixo como aplicada à medida de teor de glicose de sangue integral, um método de interesse comercial. No entanto, o método da invenção tem outras aplicações nas quais outros analitos, tais como co- lesterol, uréia, creatinina e creatina, são encontrados em fluidos biológicos, tais como urina, saliva e fluido inters-ticial, e quando soluções de controle são usadas para checar a precisão de medidores eletroquimicos.

Biossensores eletroquímicos A presente invenção não é limitada a um projeto de biossensor particular entre os muitos que foram descritos na técnica. Um exemplo de um biossensor, que pode ser usado, é descrito na patente U.S. 6.531.040, que é ilustrada nas Figuras 1 e 2 . O biossensor 10 é mostrado em uma vista detalhada na Figura 1. Compreende uma base isolante 12, na qual se imprime em seqüência (tipicamente por técnicas de impressão em tela), um modelo de condutor elétrico 14, um modelo de eletrodo (partes 16 e 18), um modelo isolante (dielétrico) 20 e uma camada de reação 22, e completada por uma camada de cobertura 28. O capilar 30, formado entre a camada de cobertura 28 e a camada de reagente 22, proporciona um caminho de escoamento para a amostra de teste fluida. 0 biossensor é mostrado na Figura 2, na qual todos os elementos na base são mostrados no mesmo plano. A função da camada de reação 22 é promover uma reação quimica com glicose, ou outro analito na amostra de teste fluida, e produzir uma corrente elétrica, que é medida e correlacionada com a proporção do analito presente. A camada de reação 22 contém tipicamente uma enzima ou enzimas e um aceptor de elétrons. A enzima reage com o analito para produzir elétrons, que são transportados para a superfície do eletrodo de trabalho por um aceptor de elétrons. 0 acep-tor de elétrons, também referido como um mediador, que tem sua resposta reduzida à reação entre o analito e a enzima. A enzima na camada de reação pode ser combinada com um polímero hidrofílico, tal como poli (óxido de etileno). Uma enzima, que pode ser usada para reagir com glicose, é glicose oxidase, e o mediador pode ser um sal de ferricianeto, usado com um tampão mantendo um pH de cerca de 5 - 7. Outra enzima, que pode ser usada, é glicose desidrogenase, juntamente com um co-fator, tal como pirroloquinolina quinona (PQQ), usado com um tampão mantendo um pH de cerca de 6 - 8.

As duas partes 16, 18 do modelo do eletrodo proporcionam os respectivos eletrodo de trabalho e contra-eletrodo, necessários para a determinação eletroquímica da concentração do analito. Um aspecto do projeto mostrado é que os eletrodo de trabalho e contra-eletrodo são configurados de modo que a grande parte do contra-eletrodo seja localizada a jusante (em termos da direção de escoamento de fluido ao longo do caminho de escoamento), a partir da parte exposta do eletrodo de trabalho 16a. 0 sub-elemento contra-eletrodo 18a, no entanto, é posicionado a montante do elemento superior eletrodo de trabalho 16a, de modo que, quando uma quantidade da amostra de fluido de teste (por exemplo, uma amostra de sangue integral), inadequada para cobrir completamente o eletrodo de trabalho, entra no espaço capilar, uma conexão elétrica se forma entre o sub-elemento contra-eletrodo 18a e a parte exposta do eletrodo de trabalho 16a, devido à condutividade da amostra de sangue integral A área do centra eletrodo, nu entanto, que é disponível para contato pela amostra de sangue integral, é tão pequena que apenas uma corrente muito fraca pode passar entre os eletrodos e, desse modo, pelo detector de corrente. Quando o sinal recebido estiver abai.no de um certo nível predeterminado, c dispositivo sensor informa ao usuário que sangue insuficiente entrou na cavidade do sensor e que outro teste deve ser conduzido, ou que mais sangue deve ser adicionado. Ainda que as dimensões particulares dos eletrodos não sejam críticas, a área do sub-elemento contra-eletrodo 18a é tipicamente menor do que cerca de 10% do que daquela do eletrodo operacional e, mais especificamente, inferior a cerca de 6%.

Os eletrodo de trabalho e contra-eletrodo são geralmente impressos usando tinta de eletrodo, que é de uma espessura de geralmente cerca de 14 μιη (0,00055') e contém, tipicamente, carvão eletroquimicamente ativo. Os componentes da tinta condutora podem ser uma mistura de carvão e prata, que é selecionada para proporcionar um caminho de resistência condutiva baixa entre os eletrodos e o medidor, com o qual estão em conexão operante, por contato com o modelo condutor em uma extremidade de rabo de peixe 26 do sensor. O contra-eletrodo pode ser compreendido de prata / cloreto de prata, embora carvão seja o preferido. Para melhorar a re-produtibilidade da leitura do medidor, o modelo dielétrico isola os eletrodos das amostra de teste de fluido, exceto em uma área definida próxima ao centro do modelo do eletrodo 24. Com referência à Figura 2, uma área definida é importan- te nesse tipo de determinação eletroquímica, porque a corrente medida depende não apenas da concentração do analito e da área da camada de reação 22, mas também da área do eletrodo de trabalho 16a, que é exposta à amostra de teste contendo analito.

Uma camada dielétrica típica 20 compreende um mo-nômero, oliqômero ou polímero modificado com acrilato curado por UV, e é de uma espessura de cerca de 10 μπι (0,0004'). A camada dielétrica também pode ser curável por umidade ou curável termicamente. Uma tampa ou cobertura 28 é adaptada para conformar-se com a base, para formar um espaço para receber a amostra de teste de fluido, no qual os eletrodo de trabalho e contra-eletrodo estão situados. A tampa 28 proporciona um espaço côncavo 30, e é formada tipicamente por estampaqem em relevo de uma folha plana de material deformá-vel. A tampa 28 é perfurada para proporcionar uma ventilação de ar 32 e unida à base 12 em uma operação de vedação. A tampa e a base podem ser unidas por soldaqem sônica, na qual a base 12 e a tampa 28 são primeiro alinhadas e depois comprimidas conjuntamente entre um elemento de vedação térmica vibratório ou corneta e um mordente estacionário. O contato é feito apenas com as reqiões não estampadas, planas da tampa. A enerqia ultra-sônica de um cristal ou outro transdutor é dissipada como calor na junta polimérica, propiciando a ligação dos materiais termoplásticos. A tampa e a base estampadas também podem ser unidas por uso de um material adesivo no lado inferior da tampa. O método de união da tampa e da base é des^ri tn ma d s detalhadamente na patente U.3. 5.798.031.

Os materiais adequados para a base isolante 12 incluem, policarbonato, poli (tereftalato de etileno), polímeros acrílicos e de vinila dimensionaImente estáveis, e misturas poliméricas tal corne policarbonato / poli (nereítaiato de etileno), e estruturas de folhas metálicas (por exemplo, um laminado de náilon / alumínio / poli (cloreto de vinila). A também é tipicamente fabricada de um. material de folha polimérica deformável, tal como policarbonato, ou um grau es-tampável de poli (tereftalato de etileno), polí (tereftalato de etileno) modificado com glicol, ou uma composição de folha metálica (por exemplo, uma estrutura de folha de alumínio) .

Outros projetos de sensores eletroquímicos podem ser usados na presente invenção. Os exemplos de um sensor eletroquímico, que pode ser usado para medir concentrações de glicose, são aqueles usados nos sistemas Healthcare's As-censia DEX e ELITE da Bayer. Mais detalhes desses sensores eletroquímicos podem ser encontrados nas patentes U.S. 5.120.420 e 5.320.732. Outros sensores eletroquímicos, que podem ser usados em um sistema de monitoramento amperométri-co, são descritos na patente U.S. 5.429.735.

Os sensores eletroquímicos podem ser localizados em um instrumento de dispensação de sensor de glicose no sangue, portando uma pluralidade de sensores ou elementos de teste. Um exemplo de um grupo de sensores, colocado em um instrumento de d í spen <= = çã o de sensor, c descrito íu patente U.S. 5.660.791.

Medida de glicose em sangue integral Em. um biossensor típico para medida do teor de glicose de sangue integral, os eletrodo de trabalhe e con-tra-elet rodo são revestidos com uma camada única de leagente por co-impressão ou co-deposição. A camada de reagente vai incluir tipicamente alguns polímeros e os ingredientes reativos, isto é, uma enzima que oxida a glicose na amostra de sangue, e um mediador, isto é, um composto de oxirredução que reoxida a enzima, após ela ter sido reduzida por oxida-ção de glicose. O mediador reduzido conduz elétrons da reação enzimática de oxidação de glicose para o eletrodo de trabalho e é reoxidado na superfície do eletrodo. O diferencial de voltagem aplicado entre os dois eletrodos resulta no mediador passando elétrons para o eletrodo de trabalho, criando uma corrente mensurável que é proporcional à quantidade de glicose na amostra. O biossensor também pode compreender múltiplas camadas de reagentes, ou pode compreender diferentes camadas de reagentes múltiplas em cada eletrodo, os eletrodo de trabalho e contra-eletrodo.

Como descrito acima, os sensores amperométricos aplicam um potencial fixo pelos eletrodos e a corrente produzida é medida por um período de tempo predeterminado, que pode ser muito curto, isto é, de 5 a 10 segundos, para corrigir a tendência que pode apresentar devido à redução prematura do mediador. Em um sistema preferido, um potencial é aplicado por dois períodos de tempo, separados por um perío- do de repouso, ilma representação gráfico representa ti *ά uo potencial versus tempo para o primeiro ou "período de queima" é apresentada na Figura 3. A Figura 4 mostra uma representação gráfica representativa da corrente versus tempo que resulta. A corrente aumenta a um pi cc, enquanto que a amestra está reidratando a camada de reagente, por.tiitixido que as reações de oxidação e redução ocorram, e depois diminui na medida em que a difusão começa controlar. Após esse breve período, o potencial aplicado é removido ou pelo menos reduzido, durante um período de repouso, enquanto que a oxidação de glicose e a redução do mediador continuam. Depois, o potencial é reaplicado por um segundo período e a corrente medida pelo período de "leitura" (por exemplo, dez segundos). Uma vez que o mediador reduzido está presente em consequência da oxidação concomitante da enzima, a corrente produzida inícialmente é alta, mas depois diminui rapidamente e se a-proxima de uma condição controlada por difusão em estado constante. A corrente registrada ao final do curto período de "leitura" é usada para determinar o teor de glicose da amostra de sangue, por uma correlação obtida previamente entre a corrente ao final do período de leitura e a glicose contida nas amostras de teste tendo concentrações conhecidas .

Soluções de controle Como discutido acima, várias abordagens foram consideradas para garantir que uma solução de controle proporcione leituras precisas e que possa ser distinguida de uma amostra biológica. A presente invenção emprega uma espécie oxidável (isto é, uma referência interna), que é oxidável apenas em voltagens mais altas do que aquelas usadas para medidas de glicose (ou outro analito). Isso significa que a um baixo potencial, adequado para oxidar inteiramente o mediador relacionado com a glicose, mas não o composto de referência interna, apenas a glicose vai ser medida. No entanto, quando o potencial é suficientemente alto para oxidar o composto de referência interna adicionado, tanto a glicose quanto o composto de referência interna vão ser oxidados. Embora a glicose seja oxidada no potencial mais alto, a medida feita a uma voltagem mais baixa já é limitada por difusão e não depende da quantidade total de glicose oxidada pela enzima. É viável, no entanto, adicionar essa espécie de referência interna a uma solução de controle e usá-la para identificar a solução como um controle e não como uma amostra biológica. A diferença entre as correntes medidas nas voltagens alta e baixa pode ser comparada para indicar a presença da característica de referência interna da solução de controle. 0 índice Diferencial (Dl) seguindo os componentes de corrente relativos à glicose e ao composto de referência interna é: Dl — (ialta volt. / ibaixa volt.) _ [ (iref. int íglicose) / iglicose] — 1 + (iref. int / íglicose) em que: iaita voit. é a corrente medida na voltagem mais alta e ibaixa voit. é a corrente medida na voltagem mais baixa.

Segue-se qne se e refercr.cíô interna nau estiver presente (tal como nas amostras de sangue), iT>?f a-;t deve ser zero e a i5its voil. vai ser substancialmente igual à i^aixa voit. · Desse modo, o valor de Dl vai se aproximar de i. Quando a referência interna estiver presente, o valor de Dl vai ser maior do que 1, dependendo da proporção do composto de referência relativa à proporção de glicose. Se a proporção de referência interna adicionada à solução de controle proporcionar uma corrente similar àquela da oxidação do mediador relacionado com glicose, o valor de Dl pode ser cerca de 2. A referência interna pode ser incluída em uma proporção adequada para controlar as soluções correspondentes a uma alta concentração de glicose. É típico usar várias soluções de controle correspondentes às concentrações baixa, normal e alta de glicose, para testar um medidor de glicose. Se, por exemplo, a proporção da referência interna for selecionada de modo que o valor de Dl seja igual ou superior a 1,75 para a concentração de glicose mais alta na solução de controle, a corrente da referência interna vai ser relativamente grande, comparada com a corrente para a glicose na solução de controle de menor teor de glicose. Então, a mesma proporção da referência interna usada com uma solução de controle tendo uma baixa concentração de glicose vai proporcionar um valor de Dl ainda maior. Esses valores de Dl ainda maiores vão proporcionar uma confiança mais alta na presença de uma solução de controle, em vez de uma amostra biológica, tal como sangue integral. Claramente, um índice quantitativo, tal como o valor de Dl, tem uma vantagem em relação aos métodos mais qualitativos rom base r.a ferina da curva de Luiiente versus tempo nos períodos de queima ou leitura, como sugerido em outras patentes. A adição de uma referência interna oxidada a uma voltagem mais alta proporciona um resultado que é independente da reação enrimátiea e da composição da solução de controle.

Em uma modalidade, a proporção do composto de referência interna adicionada à solução de controle é relacionada com a proporção de glicose presente. Isto é, a proporção da referência interna na solução de controle é proporcional à concentração de glicose, para manter um valor Dl aproximadamente constante. Um processo é usar o suficiente da referência interna para proporcionar um Dl igual ou superior a cerca de 1,5, quando a proporção máxima de glicose, a cerca de 300 mg/dL, é usada. Então, a proporção da referência interna é reduzida, de modo que as soluções de controle contendo concentrações mais baixas de glicose mantêm um valor de Dl igual ou superior a 1,5, A adição de uma referência interna para controlar as soluções possibilita distinguir facilmente entre as soluções de controle e as amostras biológicas e proporciona uma precisão aperfeiçoada da análise. Os compostos de referência interna podem ser qualquer composto oxidável eletroquimica-mente a um potencial desejável. É importante entender que nem todos os compostos oxidáveis quimicamente são oxidáveis eletroquímicamente a um potencial adequado, ou a qualquer potencial oxidável. As espécies oxidáveis quimicamente (por exemplo, em uma solução homogênea) podem não ser oxidáveis eletroauimi.caineptp a um potencial adequado, porque a bctixei-ra de cínética de transferência de elétrons no eletrodo tem que ser superada. Desse modo, um. agente redutor por natureza química pode não ser oxidável eietroquimicarnente no eletrodo. Dependendo do potencial de oxirredução do mediador nc sistema sensor de reagente, cs compostos de referência interna com diferentes potenciais de oxirredução vão ser necessários. Por exemplo, se o mediador no sistema reagente for hexamina de rutênio (Ru (NH3) 6+3) , o composto de coordenação de ferrocianeto de potássio ou os compostos organometá-licos de ferroceno e os seus derivados podem ser usados como a referência interna na solução de controle. Por outro lado, se o mediador for ferricianeto no sistema reagente, então outros compostos, tal como bis-tris ou 4-aminobenzonitrila, podem ser usados como a referência interna na solução de controle. Em cada caso, o composto de referência interna vai ter um potencial de oxirredução que seja pelo menos 100 mV mais alto do que o potencial de oxirredução do mediador.

Os exemplos dos compostos de referência interna incluem, mas não são limitados a, aminas orgânicas, tais como ácido 3-(N-morfolino) propano sulfônico (MOPS), ácido N-(2-hidroxietil) piperazina-N'-(2-etano sulfônico) (HEPES), ácido 2-(hidróxi-1,1-bis (hidroxímetil) etilamino) etano sulfônico (TES), ácido 2-morfolinoetano sulfônico (MES), bis (2-hidroxietil) amino-tris (hidroximetil} metano (Bis-Tris), 4-aminobenzonitrila, ácido 4-aminobenzóico e 4-iodoanilina. Nos exemplos abaixo, Bís-Tris e vários outros compostos são mostrados como =enHo uma referência interna útil paid uso em soluções de controle contendo glicose.

Embora Bis-Tris possa ser usado como uma referência interna, também pode servir como um tampão. 0 pH da solução de controle é um fator importante na reação na qual a glicose é oxi dada per uma enzima, tal como glicose oxiaase. Para a medida de glicose, um pH de cerca de 5 a 7 é preferido, quando glicose oxidase é usada, enquanto que um pH de cerca de 6 - 8 é preferido quando se usa glicose desidroge-nase. Um tampão é usualmente proporcionado para garantir que a oxidação de glicose prossegue na taxa esperada. Uma vantagem da presente invenção é que o composto de referência e o tampão podem ser separados, cada um servindo a uma função diferente, propiciando, desse modo, a otimização de cada função (tampão e referência interna) separadamente. Os tampões podem ser selecionados daqueles compatíveis com o rea-gente enzimático. Os exemplos incluem, mas não sao limitados a, tampão de citrato e tampão de fosfato.

Os materiais políméricos usados para reproduzir as propriedades fluidificantes do sangue podem incluir poli (ó-xido de etileno), poli (metacrilato de hídroxietila), poli-vinilpirrolidona (PVP), goma xantana, em proporções de 12 a 20% em peso. A glicose está tipicamente presente nas soluções de controle nas proporções equivalentes a cerca de 30 a 400 mg/dL, uma faixa que abrange o teor de glicose esperado das amostras de sangue.

Outros adi t- i vnc poder:, incluir seis, t. ....u;.. , co- rantes, agentes antimicrobianos, polímeros, agentes espes-santes e tensoativos.

Modo de operação da solução de controle Vai ser óbvio que a introdução de um material de referência inferna, cxidávei a uma voltagem mais alta do que a usada para oxidar o mediador relacionado com glicose, via tornar necessária a aplicação da voltagem mais alta em algum ponto, durante o protocolo de medida. Quando dois períodos são usados como descrito acima, isto é, os períodos de "queima" e "leitura", várias combinações de etapas potenciais dentro e por ambos os períodos de queima e leitura podem ser usadas, para proporcionar tanto um valor de Dl identificando a solução de controle e uma corrente, das quais o teor de glicose da solução de controle pode ser determinado. No método mais simples, uma alta voltagem é aplicada durante o período de queima e uma baixa voltagem é aplicada durante o período de leitura. Desse modo, o índice Diferencial é: Dl = ( íqueima / íleitura) Quando a referência interna está presente, a corrente medida durante o período de queima vai incluir a corrente resultante da oxidação da referência interna mais a corrente resultante do mediador relacionado com a glicose. A corrente medida durante o período de leitura vai ser apenas aquela resultante da oxidação da glicose, uma vez que a voltagem vai ser muito baixa para oxidar a referência interna. Desse modo, a razão da corrente de queima para a corrente de leitura reflete n 'rslnr da corrente dc referência interna contra a corrente da medida de glicose.

Alternativamente, ambas as voltagens alta e baixa podem ser aplicadas durante o período de queima, para detectar a presença da referência interna, enquanto que apenas uma baixa voltagem. é usada durante o período de leitura. Es-sa combinação de etapas potenciais vai ainda manter o princípio operacional de considerar a razão da corrente de uma alta voltagem para aquela de uma baixa voltagem. Uma variação distinta na corrente vai ser observada, quando uma variação é feita de uma baixa voltagem para uma alta voltagem, ou vice-versa. A "baixa" voltagem não precisa ser idêntica àquela usada no período de leitura, para medir a glicose. A voltagem comparativa pode ser meramente mais baixa do que a necessária para oxidar a referência interna. Uma vez que o período de queima corresponde a um tempo no qual a amostra está hidratando os reagentes, a corrente pode variar durante o período de queima, como sugerido no diagrama genérico da Figura 4. Consequentemente, pode haver uma vantagem para se fazer mais de uma excursão entre as voltagens alta e baixa, para garantir que os valores de Dl não sejam afetados pelas variações na disponibilidade de reagente, durante o período de queima.

Em outro método alternativo, uma alta voltagem (isto é, uma que oxida a referência interna) é usada durante uma parte do período de leitura. Desse modo, o D.I pode ser determinado durante o período de leitura por medida das correntes alta e baixa, apenas durante o período de leitura.

Esse método pode proporcionar una vantagem pelo IaLo de que qualquer variação na disponibilidade de reagente observada no período de queima seja evitada. De novo, o uso de .mais de uma excursão entre as voltagens baixa e alta pode ser vantajoso.

Fm. outra modalidade da invenção, a ciclização rre-qüente de potencial entre as voltagens alta e baixa é usada para afetar a forma da corrente versus tempo, durante o período de leitura, que é mostrada genericamente na Figura 4. A curva mostra tipicamente um rápido decaimento da corrente provocada pela depleçâo do mediador reduzido na ou próximo da superfície do eletrodo. Desse modo, o teor de glicose total é determinado por correlação com a corrente limitada por difusão, em vez de medida da glicose total na solução de controle. É evidente que o tempo selecionado como uma medida da glicose é importante, se medidas consistentes e precisas vão ser obtidas.

Em geral, as soluções de controle da invenção vão conter um composto, que pode ser oxidado eletroquimicamente a um maior potencial do que aquele necessário para oxidar glicose. Uma vez que a oxidação do mediador relacionado com a glicose (por exemplo, ferricianeto de potássio) requer um potencial de 200 mV relativo ao potencial no contra-eletrodo de ferricianeto, o potencial de oxidação para o composto de referência interna deve ser pelo menos 400 mV, relativo ao mesmo contra-eletrodo. Por exemplo, usando-se Bis-Tris como a referência, o potencial de oxidação é cerca de 600 mV, se o contra-eletrodo for suportado pela redução de ferriciane- to. Outros exempl η·= incluem 4-amir.cbenzonitriIa, áoiuo 4-aminobenzóico, 4-iodoanilina, que podem ser oxidados em uma faixa de potencial de + 400 a + 600 mV, relativa ao potencial no contra-eletrodo suportado pela redução do ferricíane-to.

Um método de examinar c efeito da adição de uma referência interna às soluções de controle é o uso de volta-metria cíclica. Em vez de aplicar um potencial fixo, uma voltagem variável é usada, varrendo de negativa à positiva relativa ao contra-eletrodo. Os exemplos apresentados a seguir ilustram o conceito e a aplicação de referência interna e o seu método de autodetecção de soluções de controle.

Exemplo 1 Uma solução aquosa contendo NaCl 50 mM foi comparada com outra solução contendo NaCl 50 mM e Bis-Tris 50 mM, como uma referência interna. Um segundo conjunto de amostras contendo a mesma composição, mas incluindo 350 mg/dL de glicose, foi testado. Nenhuma enzima ou mediador foi incluído, de modo que a oxidação de glicose não ocorreu. A Figura 5 mostra corrente versus potencial, na medida em que a diferença de potencial foi alternada entre - 400 mv e + 1.200 mV a 25 mV/s versus um eletrodo de referência de prata / cloreto de prata, usando a estação de trabalho eletroquímica da CH Instrument Co. Pode-se notar que a corrente não começou a escoar entre os eletrodos, até que fosse atingida uma diferença de potencial de + 600 mV. Para as amostras não contendo Bis-Tris, a corrente de oxidação é substancialmente zero por toda a faixa de potencial. Por outro lado, quando Bis- Tris estava presente, houve una corrente significativa a -r 800 mV, começando a cerca de +600 mV. Pode-se concluir que a oxidação de biossensores é a mesma com e sem. glicose presente, quando nenhuma enzima e mediador estão presentes. Quando da comparação das correntes volumét ri cas a + 8 00 mV entre os curvas corrente - potencial com o sem Bis-Tris na Figura 5, as soluções contendo Bis-Tris 50 mM foram claramente dis-tinguidas.

Exemplo 2 Nesse exemplo, os testes do Exemplo 1 foram repetidos, como mostrado na Figura 6, exceto que o contra-eletrodo era de carbono com uma camada de ferricianeto de potássio, em vez do contra-eletrodo de Ag / AgCl2 usado no Exemplo 1. A oxidação do Bis-Tris não é afetada pela presença ou ausência de glicose, quando não estão incluídos enzima e mediadores. No entanto, a corrente de oxidação começa a aumentar após + 400 mV e atinge um valor significativo a + 600 mV. Desse modo, comparadas com os aspectos voltamétricos na Figura 5, as correntes de fundo se mantêm substancíalmen-te iguais a zero, sem a referência interna. A única diferença é o aumento da corrente de oxidação a um potencial mais baixo. Essa diferença é inteiramente devido ao contra-eletrodo diferente. É significativo que não haja nenhuma corrente de oxidação abaixo de + 400 mV. Desse modo, o Bis-Tris pode ser observado como sendo claramente distinto da oxidação de glicose, que começa logo acima do potencial zero, como vai ser observado no exemplo seguinte.

Exemplo 3 Os Exemplos i e 2 apresentados nas 7 i ·-. ·., _ o 5 e 6 mostram a presença da referência interna (Bis-Tris) em soluções com ou sem glicose, mas na ausência da glicose oxidase e do mediador necessários para detectar a presença de glicose. No exemplo mostrado na Figura 7, as soluções des Exemplos 1 e 2 foram usadas, mas a glicose oxidase e o ferricia-neto de potássio (mediador) são incluídos, de modo que quando glicose está presente, é oxidada como é nos sensores ele-troquímicos de glicose. Comparando-se a Figura 7 com a Figura 6, as características voltamétricas observadas nos curvas corrente - potencial cíclicos (modelos de corrente versus potencial) diferem significativamente. Os picos na corrente de oxidação ocorrendo em torno de zero volt indicam que a glicose está sendo oxidada. Quando nenhuma glicose estava presente, apenas uma pequena corrente foi produzida acima de 0 mV, devido a alguma atividade de fundo. Quando glicose, a 350 mg/dL, está presente, uma quantidade de corrente significativa é produzida com os picos característicos acima e abaixo de 0 mV. Uma condição de estado constante foi atingida a cerca de + 400 mV, que pode ser usado para correlacionar-se com a proporção de glicose presente. A ambos os níveis de glicose de 0 e 350 mg/dL, as correntes de oxidação antes de 400 mV são iguais, com e sem a adição do composto de referência interna. Quando o potencial atinge + 600 mV, a corrente observada com as soluções contendo Bis-Tris é sempre mais alta do que aquela sem Bis-Tris, se a concentração de glicose foi igual a 0 ou 350 mg/dL. Desse modo, a solução de controle, que mntpm o composto dc referência internei, pode ser identificada.

Exemülo 4 _____à_.__ O Bis-Tris foi usado como um composto de referência nos Exemplos 1-3. Nesse exemplo, vários outros compostos de referência interna sãc apresentados. A Figura 8 mostra curvas corrente - potencial cíclicos de três compostos de referência interna adicionais, ácido 4-aminobenzóico, 4-aminobenzonitrila e 4-íodoanilina. Esses três curvas corrente - potencial cíclicos foram obtidos de tiras de sensores (w) de glicose comerciais da Ascensia AUTODISC (DEX). As três espécies de referência interna foram adicionadas individualmente a uma solução equivalente à de controle de polímero PVP a 20 - 24%, pH 5 - 5,5 em tampão de citrato, mas sem glicose. As concentrações de ácido 4-aminobenzóico, 4-aminobenzonítríla e 4-iodoanilina foram de cada um deles de 50 mM. Pode-se notar da Figura 8, que, enquanto que os primeiros picos de oxidaçao à direita depois do zero são substancialmente idênticos, as correntes após + 0,3 volt diferem, dependendo do composto de referência interna incluído. Na Figura 8, o potencial entre 0,1 V e 0,3 V é considerado como baixo potencial, que é usado para medir glicose por o-xidação apenas do mediador. O potencial partindo de + 0,4 volt a 0,8 volt é considerado o potencial alto, responsável por oxidação de ambos o mediador e a referência interna. Na região de potenciais de + 0,3 a + 0,8, todas as correntes são mais altas quando uma referência interna estava presente do que quando nenhuma referência interna tinha sido adicionada à solução de controle.

Exemplo 5 Há muitos modos de combinar 05 potenciais alto e baixo para oxidar e medir a referência interna, para detectar a presença de uma solução de controle, enquanto ainda medindo a concentração de glicose. As Figuras 9A - E mostram algumas das seqüências de potenciais (formas de onda) para combinação dos potenciais alto e baixo. Em cada caso, um período de queima é seguido por um período de espera, e depois por um período de "leitura", como descrito acima. A Figura 9A mostra uma seqüência de potenciais para a sequência de potenciais Queima - Espera - Leitura simples. A Figura 9B mostra uma seqüência de potenciais com a baixa voltagem na primeira metade do período de Queima, seguido por uma alta voltagem no mesmo período de Queima. Na Figura 9C, uma seqüência de potenciais, com a voltagem alta na primeira metade do período de Queima, é seguida por uma baixa voltagem no mesmo período de Queima. A Figura 9D mostra uma seqüência de potenciais, com a voltagem alta na primeira metade do período de Leitura, seguida por uma baixa voltagem no mesmo período de Leitura. Na Figura 9E, uma seqüência de potenciais similar é mostrada com a baixa voltagem na primeira metade do período de Leitura, seguida por uma alta voltagem no mesmo período de Leitura.

Exemplo 6 As Figuras 10a - b ilustram o efeito do aumento da concentração da referência interna, nesse caso o Bis-Tris.

Na Figura 10a, a solução equivalente à dc controle íiõt-v é, sem glicose) contendo NaCl 50 mM rnostra o efeito do aumento da concentração de referência interna de 0 a 50 mM e a 100 mM de Bis-Tris (com HaCl 10Q mM) . A presença de Bis-Trís é claramente visível e o aumento na concentração aumenta ainda mais a corrente a + 600 mV. Na Figura 1CB, glicose a 550 mg/dL está presente na solução de controle da mesma composição, como indicado pelos fortes picos logo acima de 0 mV. Uma vez que a corrente de glicose é ainda notável em torno de + 600 mV, a detecção da presença de Bis-Tris requer uma maior quantidade do que quando nenhuma glicose está presente. Desse modo, a concentração da referência interna deve ser tal que uma indicação clara da sua presença pode ser detectada, quando a solução de controle contém uma alta concentração de glicose. Então, quando a solução de controle contém uma concentração de glicose mais baixa, a presença da referência interna vai ser ainda mais evidente.

Exemplo 7 Para esse exemplo, os testes foram conduzidos por comparação das soluções de controle com e sem adição de Bis-Tris, como a referência interna, e uma amostra de sangue integral. Em todos os três casos, as amostras foram tiras de teste comerciais Ascensia AUTODISC®. A seqüêncía do teste foi a de aplicar um potencial de + 400 mV por 4 segundos, depois + 600 mV por 4 segundos, repouso em circuito aberto (sem potencial aplicado ao eletrodo) por 5 segundos, e depois aplicação de + 200 mV por 5 segundos. Os perfis de corrente para os três tipos de amostras são apresentados na Fi- qura 11. 0 índice ni fe-rencial (Dl) fci calculado paia duas comparações. Caso I-a: a corrente medida a 8 segundos do período de queima é comparada com a corrente a 4 segundos do período de queima. Caso I-b: a corrente medida a 3 segundos do período de queima é comparada com a corrente a 2 segundos do período de leitura. Nenhuma glicose foi adicionada à solução de teste de NaCl 100 mM e Bis-Tris 100 mM ou à amostra de sangue integral. O caso I-a é equivalente à seqüência da Figura 9B, enquanto que o caso I-b é equivalente à Figura 9A. Os valores de Dl e as variações relativas dos valores de Dl desses testes são apresentados na Tabela 2. Em ambos os casos, o valor de Dl da solução de controle, com a referência interna Bis-Tris, é da ordem de 500% dos valores de Dl encontrados quando a solução de controle e a amostra de sangue integral não continham qualquer referência interna. Esses resultados indicam que a solução de controle com a referência interna pode ser facilmente detectada, comparada com uma solução de controle ou sangue integral carente do composto de referência.

Tabela 2 - Valores de Dl e % de variação de valor de Dl a 0 de glicose.

Exemplo 8 Os testes do Exemplo 7 foram repetidos, mas a solução de controle continha 350 mg/dL de glicose e a amostra de sangue integral 400 mg/dL de glicose. A mesma seqüência de potenciais foi usada para esse teste. Os perfis de corrente típicos para as três amostras são apresentados na Figura 12 para altas concentrações de glicose. Os valores de Dl e a variação relativa dos valores de Dl são registrados na Tabela 3. Os valores de Dl na Tabela 2, para os casos II-a e ΙΙ-b, são iguais àqueles do Exemplo 7 e são, desse modo, as variações relativas dos valores de Dl com a referência interna àquele sem a referência interna e as amostras de sangue integral. Para a alta concentração de glicose de 350 mg/dL, o valor de Dl para a solução de controle com a referência interna é da ordem de 100% mais alto do que aquele das amostras de sangue integral. A diferença de Dl garante que a solução de controle com uma referência interna pode ser distinguida de uma solução de controle carente da referência interna e da amostra de sangue integral.

Tabela 3 - Valores de Dl e percentuais de variação de valores de Dl a um alto teor de glicose.

Protocolos para teste da solução de controle A comparação das correntes produzidas durante os períodos de queima e leitura podem ser feitas de muitos modos. Algumas seqüências de teste são ilustradas no Exemplo 5 e na Figura 9. Na alternativa mais simples, uma medida é feita no potencial necessário para oxidar o composto de referência interna, e outra medida é feita no potencial mais baixo usado para oxidar o analito. Depois, o índice Diferencial é calculado e, com base nos resultados, o medidor ele-troquímico registra que ou uma solução de controle ou que uma amostra biológica está sendo testada. De preferência, a primeira medida é feita durante a parte posterior do período de queima e a segunda durante o período de leitura, mas ambas as medidas podem ser feitas durante o período de queima ou durante o período de leitura. 0 período de tempo necessário para obter leituras de corrente pode ser variado, por exemplo, entre cerca de 1 e 10 segundos. No entanto, desde que as leituras de corrente sejam suficientemente longas para representar adequadamente a presença do composto de referência interna ou a glicose, qualquer período de tempo pode ser usado.

Para confiabilidade adicional nos resultados, mais de um período pode ser usado para ambos os potenciais alto e baixo. Isto é, o potencial para oxidação da referência interna, isto é, + 600 mV para o Bis-Tris, e o potencial para oxidação de glicose, isto é, + 200 - 400 mV, podem ser aplicados mais de uma vez durante o período de queima ou o período de leitura. É também viável aplicar potenciais que são mais altos do que os que são necessários para a oxidação do ana-lito ou da referência interna. Isto é, se o potencial de o-xidação for para o mediador de glicose é + 200 mV, por exemplo, depois um potencial de + 200 mV e o mais alto pode ser usado, com o limite sendo no potencial no qual a referência interna é oxidada.

Em uma modalidade, variações múltiplas nos potenciais aplicados são usadas para proporcionar uma indicação mais consistente nos potenciais alto e baixo. Além do mais, a alternância dos potenciais tem a vantagem de uniformizar as curvas de corrente versus tempo e aperfeiçoar a precisão. Por exemplo, o potencial aplicado pode ser alternado entre os valores alto e baixo a cada 1 segundo, durante os períodos de queima e/ou leitura.

Processo alternativo A

Um método de distinguir uma solução de controle de uma amostra biológica, durante operação de um sensor eletro-químico medindo a proporção de um analito na dita solução de controle e na dita amostra biológica, o método compreendendo os atos de: (a) adicionar à dita solução de controle um composto de referência interna, o dito composto sendo adaptado para ser oxidado eletroquimicamente a um potencial mais alto do que o potencial necessário para medir a oxidação do dito analito, o dito composto de referência interna sendo adicionado em uma proporção relativa a uma proporção predeterminada de analito na dita solução de controle, suficiente para indicar a presença do dito composto de referência interna na solução de controle; (b) introduzir a dita solução de controle contendo o dito composto de referência interna e a dita proporção predeterminada do dito analito a um sensor eletroquímico, o dito sensor tendo eletrodos de trabalho e de referência, e uma camada de reação contendo os reagentes para oxidação do dito analito; (c) pelo menos por uma vez aplicação de um potencial aos ditos eletrodos do dito sensor eletroquímico, suficiente para oxidar o dito composto de referência interna e o dito analito e medir a corrente elétrica resultante; (d) pelo menos por uma vez aplicação de um potencial ao dito sensor eletroquimico mais baixo do que o potencial de (c) , o dito potencial sendo suficiente para medir a oxidação do dito analito e não suficiente para oxidar o dito composto de referência interna e medir a corrente elétrica resultante; (e) calcular um índice Diferencial (Dl) definido como Dl = (ialta volt. / ibaixa voit.) , em que: iaita volt. é a cor- rente medida em (c) e ibaixa voit. é a corrente medida em (d) ; (f) determinar que uma solução de controle está presente quando o índice Diferencial de (e) é suficientemente maior do que 1, para distinguir o composto de referência interna da proporção predeterminada de analito; e (g) determinar que uma amostra biológica está presente quando o índice Diferencial de (e) é cerca de 1.

Processo alternativo B 0 método do processo alternativo A, em que o dito índice Diferencial determinado em (f) é igual ou superior a 1,5.

Processo alternativo C O método do processo alternativo A, no qual o dito composto de referência interna é adicionado em uma proporção proporcional à proporção do analito na dita solução de controle .

Processo alternativo D 0 método do processo alternativo C, no qual o dito composto de referência interna é adicionado em uma proporção de modo que o índice Diferencial é igual ou superior a 1,5, quando a proporção do analito é o máximo usado na dita solução de controle.

Processo alternativo E 0 método do processo alternativo A, no qual o potencial de (c) é aplicado antes do potencial de (d) ser a-plicado.

Processo alternativo F 0 método do processo alternativo A, no qual o potencial de (d) é aplicado antes do potencial de (c).

Processo alternativo G 0 método do processo alternativo A, no qual os potenciais de (c) e (d) são aplicados mais de uma vez.

Processo alternativo H O método do processo alternativo A, no qual o dito analito é medido por aplicação de um primeiro potencial suficiente para oxidar o dito analito, por um primeiro período de tempo predeterminado, seguida pela aplicação de um segundo potencial insuficiente para oxidar o dito analito e inferior àquele do dito primeiro potencial, por um segundo período de tempo predeterminado, e seguida por aplicação de um terceiro potencial mais alto do que o dito segundo potencial e suficiente para oxidar o dito analito, por um terceiro período de tempo predeterminado.

Processo alternativo I 0 método do processo alternativo H, no qual o dito potencial de (c) é aplicado durante o dito primeiro período de tempo predeterminado, e o dito potencial de (d) é aplicado durante o dito terceiro período de tempo predeterminado.

Processo alternativo J 0 método do processo alternativo H, no qual ambos o dito potencial de (c) e o dito potencial de (d) são aplicados durante o dito primeiro período de tempo predeterminado .

Processo alternativo K 0 método do processo alternativo H, no qual ambos o dito potencial de (c) e o dito potencial de (d) são aplicados durante o dito terceiro período de tempo.

Processo alternativo L 0 método do processo alternativo H, no qual o dito potencial de (d) é aplicado durante o dito primeiro período de tempo predeterminado, e o dito potencial de (c) é aplicado durante o dito terceiro período de tempo predeterminado.

Processo alternativo M O método do processo alternativo H, no qual os ditos potenciais de pelo menos um de (c) e (d) é aplicado mais de uma vez.

Processo alternativo N 0 método do processo alternativo A, no qual o dito analito é glicose e a dita amostra biológica é sangue integral .

Processo alternativo 0 0 método do processo alternativo A, no qual o dito composto de referência interna é um composto organometálico oxidável, um composto de coordenação ou um composto de amina orgânica.

Processo alternativo P O método do processo alternativo 0, no qual u diLu composto de referência interna é o dito composto de amina orgânica, o dito composto de amina orgânica sendo ácido 3-(N-morfolino) propano sulfônico, ácido N-(2-hidroxietii) pi-perazina-N1 -(2-etano sulfônico), ácido 2-(hidrcxi-1,1-bis fhidroximet.il.) etilamino) etanc sulfônico, ácido 2-morfolinoetano sulfônico, bis (2-hidroxietil) amino-tris (hidroximetil) metano (Bis-Tris), 4-aminobenzonitrila, ácido 4-aminobenzóico ou 4-iodoanilina.

Processo alternativo Q 0 método do processo alternativo P, no qual o dito composto de referência interna é Bis-Tris.

Processo alternativo R 0 método do processo alternativo 0, no qual o dito composto de referência interna é o dito composto organometá-iico oxidável, o dito composto organometálico oxidável sendo ferroceno ou derivados de ferroceno.

Processo alternativo S 0 método do processo alternativo 0, no qual o dito composto de referência interna é o dito composto de coordenação, o dito composto de coordenação sendo ferrocianeto de potássio.

Processo alternativo T 0 método do processo alternativo N, no qual a glicose é oxidada por glicose oxidase, e no qual a dita solução de controle contém um tampão capaz de manter um pH entre 5 e 7 .

Processo alternativo U 0 método do processo alternativo N, no qual a glicose é oxidada por glicose desidrogenase, e no qual a dita solução de controle contém um tampão capaz de manter um pH entre 6 e 8.

Modalidade alternativa V

Uma solução de controle para uso em teste de um sistema eletroquimico para medir a proporção de um analito em uma amostra biológica, a solução de controle compreendendo : (a) uma proporção predeterminada do dito analito; e (b) uma proporção predeterminada de um composto de referência interna, o dito composto de referência interna sendo adaptado para ser oxidado a um potencial mais alto do que o potencial requerido para oxidar o dito analito, a dita proporção predeterminada do dito composto de referência interna sendo proporcional à dita proporção predeterminada de analito, de modo que a presença do dito composto de referência interna é detectável.

Modalidade alternativa W A solução de controle da modalidade alternativa V, na qual o dito analito é glicose e a dita amostra biológica é sangue integral.

Modalidade alternativa X A solução de controle da modalidade alternativa W, na qual o dito composto de referência interna é um composto organometálico oxidável, um composto de coordenação ou um composto de amina orgânica.

Modalidade ^ 1 Y A solução de controle da modalidade alternativa X, na qual o dito composto de referência interna é o dito composto de referência interna é o dito composto de amina orgânica, o dito composto de amina orgânica sendo ácido 3- {N · morfolinoi pr^pano sulfônico, ácido N- ;2-hidroxiecii) pipe-razina-N'-(2-etano sulfônico), ácido 2-(hidróxi-1,1-bis (hi-droximetil) etilamino} etano sulfônico, ácido 2-morfolinoetano sulfônico, bis (2-hidroxietil) amino-tris (hidroximetil) metano (Bis-Tris), 4-aminobenzonitrila, ácido 4-aminobenzóico ou 4-iodoanilina.

Modalidade alternativa Z A solução de controle da modalidade alternativa Y, na qual a dita referência interna é Bis-Tris.

Modalidade alternativa AA A solução de controle da modalidade alternativa Y, na qual o dito composto de referência interna é o dito composto organometálico oxidável, o dito composto organometáli-co oxidável sendo ferroceno ou derivados de ferroceno.

Modalidade alternativa BB A solução de controle da modalidade alternativa X, na qual o dito composto de referência interna é o dito composto de coordenação, o dito composto de coordenação sendo ferrocianeto de potássio.

Modalidade alternativa CC A solução de controle da modalidade alternativa W, na qual a glicose é oxidada por glicose oxidase, e um tampão é incluído para manter o pH entre 5 e 7.

Modalidade alternativa DD A solução de controle da modalidade alternativa W, na qual a glicose é oxidada por glicose desidrogenase, e um tampão é incluído para manter o pH entre 6 e 8.

Modalíd_ade alternativa EE

Um ccrnp· ·-- ··· de referência interna paia adição a uma solução de controle, usada para testar um medidor ele-troquímico de glicose, a dita referência interna compreendendo um composto químico que é oxidável a um potencial mais alto do que aquele necessário para medir a oxidação de glicose .

Modalidade alternativa FF A referência interna da modalidade alternativa EE, em que a dita referência interna é oxidável a um potencial pelo menos 100 mV maior do que o potencial necessário para medir a oxidação de glicose.

Modalidade alternativa GG A referência interna da modalidade alternativa EE, em que o dito composto de referência interna é um composto organometálico oxidável, um composto de coordenação ou um composto de amina orgânica.

Modalidade alternativa HH A referência interna da modalidade alternativa GG, na qual o dito composto de referência interna é ácido 3-(N-morfolíno) propano sulfônico, ácido N-{2-hidroxietil) pipe-razina-N'-(2-etano sulfônico), ácido 2-(hidróxi-1,1-bis (hi-droxímetil) etilamino) etano sulfônico, ácido 2-morfolinoetano sulfônico, bis (2-hidroxietil) amino-tris (hidroximetil) metano (Ri^-Tris), l-amincbenzcnitríia, á^ido 4-aminobenzóíco e 4-iodoanilina.

Modalidade alternativa II A referência interna da modalidade alternativa HH, na qual o dito composto de referência interna é Bis-Tris.

Modalidade alternativa JJ A referência interna da modalidade alternativa GG, na qual o dito composto de referência interna é o dito composto organometálico oxidável, o dito composto organometáli-co oxidável sendo ferroceno ou derivados de ferroceno.

Modalidade alternativa KK A referência interna da modalidade alternativa GG, na qual o dito composto de referência interna é o dito composto de coordenação, o dito composto de coordenação sendo ferrocianeto de potássio.

Ainda que a invenção seja suscetível a várias modificações e formas alternativas, as modalidades específicas são mostradas por meio de exemplo nos desenhos e descritos em detalhes. Deve-se entender, no entanto, que não se tem intenção de limitar a invenção às formas particulares descritas, mas, ao contrário, a invenção é cobrir todas as modificações, equivalentes e alternativas incluídas nos espírito e âmbito da invenção, como definido pelas reivindicações em anexo.

Claims

1. Método para distinguir uma solução de controle de uma amostra biológica durante a operação de um sensor eletroguimico gue mede a guantidade de um analito na dita solução de controle e na dita amostra biológica, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende as etapas de: (a) adicionar à dita solução de controle um composto de referência interna, o dito composto de referência interna possuindo um potencial de oxidação mais alto do que o potencial de oxidação do dito analito; (b) introduzir a dita solução de controle contendo o dito composto de referência interna e uma quantidade predeterminada do dito analito em um sensor eletroquimico, o dito sensor tendo um eletrodo de trabalho e um contra-eletrodo, e um reagente; (c) pelo menos uma vez, aplicar um potencial ao dito sensor eletroquimico, o referido potencial sedo pelo menos tão alto quanto o potencial de oxidação do dito composto de referência interna e o dito analito e medir a corrente elétrica resultante; (d) pelo menos uma vez, aplicar um potencial ao dito sensor eletroquimico, mais baixo do que o potencial de (c), o dito potencial sendo suficiente para oxidar o dito analito e não suficiente para oxidar o dito composto de referência interna e medir a corrente elétrica resultante; (e) calcular um índice Diferencial (Dl) definido COmO Dl (ialta volt. / Ibaixa volt. ) r SIR que : ialta volt. S a COr — rente medida em (c) e ibaixa voit. é a corrente medida em (d) ; (f) determinar que uma solução de controle está presente quando o índice Diferencial de (e) é suficientemente maior do que 1, para distinquir o dito composto de referência interna da dita quantidade predeterminada de analito; e (q) determinar que uma amostra biolóqica está presente quando o índice Diferencial de (e) é cerca de 1, em que o potencial de (d) é aplicado antes do potencial de (c) .

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito índice Diferencial determinado em (f) é iqual ou superior a 1,5.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a quantidade do dito composto de referência interna depende da quantidade do analito presente na dita solução de controle.

4. Método, de acordo com a reivindicação 3, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito composto de referência interna é adicionado em uma quantidade de modo que o índice Diferencial é iqual ou superior a 1,5, quando a quantidade do analito é a máxima usada na dita solução de controle.

5. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que os potenciais de (c) e (d) são aplicados mais de uma vez.

6. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito analito é medido por aplicação de um primeiro potencial suficiente para oxidar o dito analito, por um primeiro período de tempo predetermina- do, seguida pela aplicação de um segundo potencial insuficiente para oxidar o dito analito e inferior àquele do dito primeiro potencial, por um segundo período de tempo predeterminado, e seguida por aplicação de um terceiro potencial mais alto do que o dito segundo potencial e suficiente para oxidar o dito analito, por um terceiro período de tempo predeterminado .

7. Método, de acordo com a reivindicação 6, CARACTERIZADO pelo fato de que ambos o dito potencial de (c) e o dito potencial de (d) são aplicados durante o dito primeiro período de tempo predeterminado.

8. Método, de acordo com a reivindicação 6, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito potencial de (c) e o dito potencial de (d) são aplicados durante o dito terceiro período de tempo.

9. Método, de acordo com a reivindicação 6, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito potencial de (d) é aplicado durante o dito primeiro período de tempo predeterminado, e o dito potencial de (c) é aplicado durante o dito terceiro período de tempo predeterminado.

10. Método, de acordo com a reivindicação 6, CARACTERIZADO pelo fato de que os ditos potenciais de pelo menos um de (c) e (d) é aplicado mais de uma vez.

11. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito analito é glicose e a dita amostra biológica é sangue integral.

12. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito composto de referência interna é um composto organometálico oxidável, um composto de coordenação ou um composto de amina orgânica.

13. Método, de acordo com a reivindicação 12, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito composto de referência interna é o dito composto de amina orgânica, o dito composto de amina orgânica sendo ácido 3-(N-morfolino) propano sulfô-nico, ácido N-(2-hidroxietil) piperazina-N'-(2-etano sulfô-nico), ácido 2-(hidróxi-1,1-bis (hidroximetil) etilamino) etano sulfônico, ácido 2-morfolinoetano sulfônico, bis (2-hidroxietil) amino-tris (hidroximetil) metano (Bis-Tris), 4-aminobenzonitrila, ácido 4-aminobenzóico ou 4-iodoanilina.

14. Método, de acordo com a reivindicação 13, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito composto de referência interna é Bis-Tris.

15. Método, de acordo com a reivindicação 12, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito composto de referência interna é o dito composto organometálico oxidável, o dito composto organometálico oxidável sendo ferroceno ou derivados de ferroceno.

16. Método, de acordo com a reivindicação 12, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito composto de referência interna é o dito composto de coordenação, o dito composto de coordenação sendo ferrocianeto de potássio.

17. Método, de acordo com a reivindicação 11, CARACTERIZADO pelo fato de que a glicose é oxidada por glicose oxidase, e no qual a dita solução de controle contém um tampão capaz de manter um pH entre 5 e 7.

18. Método, de acordo com a reivindicação 11, CARACTERIZADO pelo fato de que a glicose é oxidada por glicose desidrogenase, e no qual a dita solução de controle contém um tampão capaz de manter um pH entre 6 e 8.

19. Solução de controle para uso no método conforme definido na reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que a solução de controle compreende: (a) uma quantidade predeterminada do dito analito; e (b) uma quantidade predeterminada de um composto de referência interna, o dito composto de referência interna possuindo um potencial de oxidação mais alto do que o potencial de oxidação do dito analito, a dita quantidade predeterminada do dito composto de referência interna sendo dependente da dita quantidade predeterminada de analito, de modo que a solução de controle esteja associada a um índice Diferencial (Dl) suficientemente maior do que 1, Dl sendo definido como DX (ialta volt. / ibaixa volt. ) t Sm que ibaixa volt. s uma corrente elétrica resultante da aplicação de um primeiro potencial suficiente para medir a oxidação do referido analito e insuficiente para oxidar o referido composto de referência interna e iaita voit. é uma corrente elétrica resultante da aplicação de um segundo potencial aplicado após o primeiro potencial, suficiente para oxidar o referido composto de referência interna e o referido analito.

20. Solução de controle, de acordo com a reivindicação 19, CARACTERIZADA pelo fato de que o dito analito é glicose e a dita amostra biológica é sangue integral.

21. Solução de controle, de acordo com a reivindicação 20, CARACTERIZADA pelo fato de que o dito composto de referência interna é um composto organometálico oxidável, um composto de coordenação ou um composto de amina orgânica.

22. Solução de controle, de acordo com a reivindicação 21, CARACTERIZADA pelo fato de que o dito composto de referência interna é o dito composto de amina orgânica, o dito composto de amina orgânica sendo ácido 3-(N-morfolino) propano sulfônico, ácido N-(2-hidroxietil) piperazina-N'-(2-etano sulfônico), ácido 2-(hidróxi-1, 1-bis (hidroximetil) etilamino) etano sulfônico, ácido 2-morfolinoetano sulfônico, bis (2-hidroxietil) amino-tris (hidroximetil) metano (Bis-Tris), 4-aminobenzonitrila, ácido 4-aminobenzóico ou 4-iodoanilina.

23. Solução de controle, de acordo com a reivindicação 22, CARACTERIZADA pelo fato de que a dita referência interna é Bis-Tris.

24. Solução de controle, de acordo com a reivindicação 21, CARACTERIZADA pelo fato de que o dito composto de referência interna é o dito composto organometálico oxidável, o dito composto organometálico oxidável sendo ferroceno ou derivados de ferroceno.

25. Solução de controle, de acordo com a reivindicação 21, CARACTERIZADA pelo fato de que o dito composto de referência interna é o dito composto de coordenação, o dito composto de coordenação sendo ferrocianeto de potássio.

26. Solução de controle, de acordo com a reivindicação 20, CARACTERIZADA pelo fato de que a glicose é oxidada por glicose oxidase, e um tampão é incluído para manter o pH entre 5 e 7.

27. Solução de controle, de acordo com a reivindicação 20, CARACTERIZADA pelo fato de que a glicose é oxidada por glicose desidrogenase, e um tampão é incluído para manter o pH entre 6 e 8.