ES2828278T3 - Sistema de integración de recolección de lágrimas microfluídicas y análisis de flujo lateral de analitos de interés - Google Patents

Sistema de integración de recolección de lágrimas microfluídicas y análisis de flujo lateral de analitos de interés Download PDF

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Abstract

Un dispositivo microfluídico para analizar una muestra de fluido, el dispositivo que comprende: (a) una punta con forma para recibir un volumen de la muestra de fluido; (b) una entrada vertical (110) que comprende una primera válvula (806) y adyacente a un flujo horizontal de la muestra de fluido desde la punta de muestra y se ubica después de la punta; (c) una primera región de muestra (112, 203, 304, 409) ubicada después de la primera válvula (806), en donde la primera región de muestra (112, 203, 304, 409) está en comunicación fluídica con la punta y comprende al menos un transductor configurado para detectar una propiedad energética de la muestra de fluido con el fin de generar una primera lectura de muestra, en donde la primera lectura de muestra es indicativa de la osmolaridad de la muestra de fluido; (d) un depósito de fluido (105, 504) conectado de forma fluida a la entrada vertical (110), en donde el depósito de fluido (105, 504) contiene un fluido de transferencia; (e) una segunda válvula (108, 202, 306, 407, 802) que evita el flujo prematuro de fluido desde la primera región de muestra a una segunda región de muestra (103, 204, 301, 406, 807); y (f) la segunda región de muestra (103, 204, 301, 406, 807) está en comunicación fluídica con la primera región de muestra (112, 203, 304, 409) y se conforma para recibir al menos una porción de la muestra de fluido, en donde la segunda región de muestra (103, 204, 301, 406, 807) comprende un sustrato de detección (103, 204, 301, 406) configurado para detectar uno o más analitos en la muestra de fluido para generar una segunda lectura de muestra, en donde la introducción del fluido de transferencia desde el depósito (105, 504) a la primera región de muestra (112, 203, 304, 409) mueve al menos una porción de la muestra de fluido desde la primera región de muestra (112, 203,304, 409) a la segunda región de muestra (103, 204,301, 406).

Description

DESCRIPCIÓN
Sistema de integración de recolección de lágrimas microfluídicas y análisis de flujo lateral de analitos de interés
Antecedentes
Las lágrimas cumplen un papel esencial en el mantenimiento de la integridad de la superficie ocular, protegen contra el desafío microbiano y preservan la agudeza visual. Estas funciones, a su vez, dependen críticamente de la composición y estabilidad de la estructura de la película lagrimal, que incluye una base de mucina subyacente, un componente acuoso medio y una capa lipídica superpuesta. La alteración, la deficiencia o la ausencia de la película lagrimal pueden afectar gravemente al ojo. Si no se controlan con sustitutos de lágrimas artificiales o terapia de conservación de la película lagrimal, estos trastornos pueden provocar una desecación intratable del epitelio corneal, ulceración y perforación de la córnea, una mayor incidencia de enfermedades infecciosas y, en última instancia, un deterioro visual pronunciado y ceguera.
La queratoconjuntivitis sicca (KCS), u "ojo seco", es una afección en la que uno o más de los componentes de la estructura de la película lagrimal enumerados anteriormente están presentes en un volumen insuficiente o están desequilibrados de cualquier otra manera con los otros componentes. La tonicidad del fluido o la osmolaridad de las lágrimas aumenta en pacientes con KCS. El KCS está asociado con afecciones que afectan la salud general del cuerpo, como el síndrome de Sjogren, el envejecimiento y la deficiencia de andrógenos.
La osmolaridad de una película lagrimal es un indicador sensible y específico para el diagnóstico de KCS y otras afecciones. La osmolaridad de una muestra de fluido (como ejemplo no limitativo, una lágrima) se determina, como ejemplo no limitativo, por una técnica ex vivo llamada "depresión del punto de congelación", en la que los solutos o iones en un solvente (como un ejemplo no limitativo, agua), provocan una reducción del punto de congelación del fluido de lo que sería sin los iones. En el análisis de la depresión del punto de congelación, el punto de congelación de la muestra de fluido ionizado se encuentra cuando se detecta la temperatura a la que una cantidad de la muestra (generalmente en el orden de varios mililitros) comienza a congelarse en un recipiente (como ejemplo no limitativo, un tubo). Para medir el punto de congelación, se recolecta un volumen del fluido de muestra en un recipiente, como un tubo. A continuación, se sumerge una sonda de temperatura en el fluido de muestra y el recipiente se pone en contacto con un baño de congelación o un dispositivo de enfriamiento Peltier. La muestra se agita continuamente para lograr un estado líquido superenfriado por debajo de su punto de congelación. Después de la inducción mecánica, la muestra se solidifica, aumentando a su punto de congelación debido al calor termodinámico de fusión. La desviación del punto de congelación de la muestra desde 0 °C es proporcional al nivel de soluto en el fluido de muestra. Este tipo de dispositivo de medición a veces se denomina osmómetro.
Actualmente, se realizan mediciones de la depresión del punto de congelación ex vivo mediante la extracción de muestras de lágrimas del ojo mediante el uso de una micropipeta o tubo capilar y la medición de la depresión del punto de congelación que resulta de la osmolaridad elevada. Sin embargo, estas mediciones ex vivo suelen estar plagadas de muchas dificultades. Por ejemplo, para realizar un análisis de la depresión del punto de congelación de la muestra de lágrima, se debe recolectar un volumen relativamente grande, generalmente en el orden de 20 microlitros (|jL) de una película lagrimal. Debido a que no se obtienen más de aproximadamente 10 a aproximadamente 100 nanolitros (nL) de muestra de lágrimas en cualquier momento de un paciente con KCS, la recolección de cantidades suficientes de fluido para las técnicas convencionales ex vivo requieren que un médico induzca el reflejo lagrimal en el paciente. El reflejo lagrimal es causado por una irritación aguda o prolongada de la superficie ocular, similar a cuando una gran cantidad de suciedad se aloja en uno de los ojos. Las lágrimas reflejo son más diluidas, es decir, tienen menos iones solutos que las lágrimas que normalmente se encuentran en el ojo. Cualquier dilución de la película lagrimal invalida la capacidad de diagnóstico de una prueba de osmolaridad para el ojo seco y, por lo tanto, pone a disposición actualmente métodos ex vivo prohibitivos en un entorno clínico.
Una técnica similar ex vivo es la osmometría de presión de vapor, en la que se coloca un pequeño trozo circular de papel de filtro debajo del párpado del paciente hasta que se absorbe suficiente fluido. El disco de papel de filtro se coloca en una cámara sellada, con lo cual un sensor de temperatura refrigerada mide la condensación de vapor en su superficie. Finalmente, el sensor de temperatura se eleva al punto de condensación de la muestra. La reducción del punto de condensación proporcional al agua se convierte luego en osmolaridad. Debido a la inducción del reflejo lagrimal y los requisitos de gran volumen para los osmómetros de presión de vapor existentes, estas técnicas no son actualmente prácticas para la determinación del ojo seco.
El Osmómetro de Nanolitros Clifton (disponible en Clifton Technical Physics de Hartford, NY, EE. UU.) se ha usado ampliamente en entornos de laboratorio para cuantificar las concentraciones de solutos de pacientes con KCS, pero la máquina requiere una cantidad significativa de entrenamiento para operar. La operación de este instrumento generalmente requiere calibraciones de una hora y un técnico especializado para generar datos aceptables. El Osmómetro de Nanolitros Clifton también es voluminoso y relativamente costoso. Estas características le restan valor seriamente a su uso como osmómetro clínico.
Además, los cambios de parpadeo en la osmolaridad de la película lagrimal son una característica fundamental de la enfermedad del ojo seco. Estos cambios de parpadeo, impulsados por la evaporación y la pérdida de agua de una película lagrimal inestable, aumentan en amplitud con el aumento de la gravedad de la enfermedad, lo que lleva a un perfil de concentración caótico de analitos de interés entre parpadeos. La medición simultánea o en serie de la osmolaridad lagrimal y los analitos de interés es útil, ya que se puede compensar la variación biológica de la enfermedad del ojo seco mediante la normalización frente a la presión osmótica de la muestra.
Las técnicas existentes para medir los analitos dentro de la película lagrimal requieren la recolección de grandes volúmenes de película lagrimal, ya sea mediante toques repetidos de la superficie ocular con una esponja, al colocar papel de filtro similar a una tira de Schirmer debajo del párpado de un paciente o mediante citología de impresión conjuntival donde el papel se presiona contra la conjuntiva para despegar posteriormente una capa superficial de células. En entornos de investigación, los microlitros de lágrimas se recolectan mediante el uso de muestreo repetido en un tubo capilar, pero esta técnica requiere un entrenamiento especial y, en algunos casos, requiere diez minutos o más en un paciente con ojo seco para obtener los volúmenes requeridos para ejecutar los ensayos existentes. Todas estas técnicas introducen el riesgo del reflejo lagrimal, que produce un fluido hipoosmolar sesgado hacia la salida lagrimal en lugar de la lágrima basal que refleja más las contribuciones de toda la superficie ocular y la glándula de Meibomio.
Debería ser evidente a partir de la discusión anterior que las técnicas integradas de recolección y medición para analitos de interés y osmolaridad lagrimal generalmente no están disponibles en un entorno clínico y no pueden alcanzar los pequeños volúmenes disponibles en la mayoría de los pacientes. Por tanto, existe la necesidad de técnicas de medición de analitos y osmolaridad a escala de nanolitros mejoradas y clínicamente factibles. La presente invención satisface esta necesidad con dispositivos que tienen una variedad de mejoras para análisis de volumen pequeño.
El documento US2008/264152 A1 (Sullivan) describe sistemas de medición de película lagrimal que incluyen un dispositivo de procesamiento que recibe un chip de muestra que comprende una región de muestra configurada para contener un volumen alícuota de fluido de muestra, el dispositivo de procesamiento configurado para realizar análisis de osmolaridad y de uno o más biomarcadores dentro de la muestra de fluido, en donde el análisis de biomarcadores incluye la normalización de los valores de concentración de biomarcadores
Zimmerman M. y otros (2008) "Valves for autonomous capillary systems" Microfluidos y Nanofluidos vol 5 pp 395 - 402, describe válvulas capilares humectables con algunas funcionalidades mejoradas, como retrasar y detener líquidos en microcanales. Las válvulas emplean una geometría que cambia abruptamente de la trayectoria del flujo para retrasar un frente de llenado de líquido en movimiento en un microcanal humectable.
Fei H. y otros (2014) "Automating fluid delivery in a capillary microfluidic device using low-voltage electrowetting valves" Microfluidos y Nanofluidos vol 16 pp 879 - 886, describe un dispositivo microfluídico polimérico capilar multicapa integrado con tres válvulas de electrohumectación normalmente cerradas para el suministro de fluidos temporizado. El canal microfluídico consta de dos capas flexibles de tereftalato de polietileno unidas por una cinta espaciadora adhesiva sensible a la presión. Los canales se estampan en la cinta espaciadora mediante el uso de ablación láser. Cada válvula contiene dos electrodos de plata impresos por inyección en serie. El flujo capilar dentro del microcanal se detuvo en el segundo electrodo que se modificó con una monocapa hidrófoba (válvula cerrada). Cuando se aplica un potencial a través de los electrodos, la monocapa hidrófoba se vuelve hidrófila y permite que el flujo continúe (válvula abierta).
El documento US 2008/038839 (Vincent y otros) describe un método y un aparato para suministrar uno o más fluidos. Los fluidos se pueden suministrar secuencialmente desde un recipiente común a un proceso químico, biológico o bioquímico.
Resumen de la invención
La presente descripción proporciona sistemas, métodos y dispositivos para analizar muestras de fluidos, tales como muestras de lágrimas.
Los enfoques descritos en la presente descripción permiten la detección de una o más propiedades de una muestra de fluidos de interés (como ejemplos no limitativos, osmolaridad, concentración de analito o ambos) mediante el uso de un solo dispositivo microfluídico, que produce de esta manera una o más lecturas de muestra que, en algunas modalidades, se cuantifican y usan para diagnosticar varias afecciones médicas. En ciertas modalidades, la invención permite realizar una pluralidad de análisis diferentes en un solo volumen de muestra, que aumenta de esta manera la velocidad, versatilidad y conveniencia de las pruebas diagnóstico. Además, los sistemas, métodos y dispositivos de la presente descripción son adecuados para su uso con pequeños volúmenes de muestra (como ejemplos no limitativos, volúmenes de microlitros o nanolitros), lo que es particularmente beneficioso para aplicaciones en las que solo están disponibles cantidades limitadas de muestra como ejemplo no limitativo, muestras de película lagrimal para el análisis de afecciones oculares.
En consecuencia, la presente invención proporciona un dispositivo para analizar una muestra de fluidos como se establece en las reivindicaciones.
En algunas modalidades, los dispositivos comprenden además un mecanismo de medición que controla el flujo del volumen desde la primera región de muestra a la segunda región de muestra. En algunas modalidades, el mecanismo de medición comprende una válvula pasiva o una válvula activa. Las válvulas pasivas ilustrativas no limitativas incluyen una o más características geométricas que restringen el flujo de fluido a la segunda región de muestra. En algunas modalidades, la válvula pasiva se compone de una discontinuidad en la hidrofilicidad del sustrato receptor. En algunas modalidades, una válvula pasiva es superada por un volumen de fluido presurizado. En algunas modalidades, una válvula pasiva como se describe en la presente descripción se activa al menos por la energía mecánica de un fluido. En algunas modalidades, el fluido es uno o más líquidos, uno o más gases o sus combinaciones. En algunas modalidades, el fluido es el fluido de muestra, un fluido de lavado o un fluido de transferencia. En algunas modalidades, una válvula pasiva como se describe en la presente descripción no requiere ninguna fuente de energía externa a los elementos del sistema como se describe en la presente descripción para su correcto funcionamiento. En algunas modalidades, una válvula pasiva no requiere energía adicional que no sea la energía del fluido y/o la energía de la acción capilar, o la energía transformada de la misma. Alternativamente o en combinación, el mecanismo de medición comprende una válvula activa, en algunas modalidades. En algunas modalidades, la válvula activa comprende un electrodo que tiene un recubrimiento hidrófobo (como ejemplo no limitativo, una monocapa autoensamblada de alcanotiol (SAM)). En algunas modalidades, se aplica un voltaje al electrodo para provocar la disolución del recubrimiento hidrófobo, que permite de esta manera el flujo del volumen en la segunda región de muestra. En algunas modalidades, una válvula activa como se describe en la presente descripción requiere una fuente de energía eléctrica de elementos internos o externos al dispositivo o sistema como se describe en la presente descripción para su correcto funcionamiento. En algunas modalidades, una válvula activa requiere energía adicional además de la energía del fluido y/o la energía de la acción capilar, o la energía transformada de la misma. En algunas modalidades, la válvula como se describe en la presente descripción es unidireccional. En otras modalidades, la válvula se configura para para permitir el paso de volumen de fluido en ambas direcciones. En algunas modalidades, la válvula pasiva o la válvula activa incluye una o más seleccionadas de: una válvula equilibrada, una válvula de punta y una válvula de ventilación.
En algunas modalidades, la primera región de muestra comprende un canal capilar. En algunas modalidades, al menos un transductor se sitúa en una pared del canal capilar. En algunas modalidades, al menos una pared del canal capilar comprende una capa de adhesivo sensible a la presión. En algunas modalidades, la capa de adhesivo sensible a la presión interactúa con el volumen para retrasar el flujo del volumen a través del canal capilar.
En algunas modalidades, la muestra de fluido comprende fluido lagrimal.
En algunas modalidades, la segunda lectura de la muestra es indicativa de la concentración de uno o más analitos en la muestra de fluido.
En algunas modalidades, el volumen está dentro de un intervalo de aproximadamente 10 nL a aproximadamente 10 pL, como dentro de un intervalo de aproximadamente 50 nL a aproximadamente 250 nL. En algunas modalidades, el volumen está dentro de un intervalo entre dos de los siguientes: aproximadamente 10 nL, aproximadamente 20 nL, aproximadamente 30 nL, aproximadamente 40 nL, aproximadamente 50 nL, aproximadamente 60 nL, aproximadamente 70 nL, aproximadamente 80 nL, aproximadamente 90 nL, aproximadamente 100 nL, aproximadamente 150 nL, aproximadamente 200 nL, aproximadamente 250 nL, aproximadamente 300 nL, aproximadamente 400 nL, aproximadamente 500 nL, aproximadamente 600 nL, aproximadamente 700 nL, aproximadamente 800 nL, aproximadamente 900 nL, aproximadamente 1 pL, aproximadamente 2 pL, aproximadamente 3 pL, aproximadamente 4 pL, aproximadamente 5 pL, aproximadamente 6 pL, aproximadamente 7 pL, aproximadamente 8 pL, aproximadamente 9 pL o aproximadamente 10 pL. En algunas modalidades, el volumen no es más de aproximadamente 20 pL, aproximadamente 250 nL, aproximadamente 200 nL o aproximadamente 50 nL. En algunas modalidades, el volumen no es más de aproximadamente 10 nL, aproximadamente 20 nL, aproximadamente 30 nL, aproximadamente 40 nL, aproximadamente 50 nL, aproximadamente 60 nL, aproximadamente 70 nL, aproximadamente 80 nL, aproximadamente 90 nL, aproximadamente 100 nL, aproximadamente 150 nL, aproximadamente 200 nL, aproximadamente 250 nL, aproximadamente 300 nL, aproximadamente 400 nL, aproximadamente 500 nL, aproximadamente 600 nL, aproximadamente 700 nL, aproximadamente 800 nL, aproximadamente 900 nL, aproximadamente 1 pL, aproximadamente 2 pL, aproximadamente 3 pL, aproximadamente 4 pL, aproximadamente 5 pL, aproximadamente 6 pL, aproximadamente 7 pL, aproximadamente 8 pL, aproximadamente 9 pL o aproximadamente 10 pL.
En los dispositivos de la invención, el depósito de fluido de transferencia está en comunicación fluídica con la primera región de muestra. La introducción del fluido de transferencia desde el depósito en la primera región de muestra hace que al menos una porción del volumen se desplace de la primera región de muestra a la segunda región de muestra. En algunas modalidades, se usa un flujo controlado para hacer coincidir la velocidad de absorción capilar del sustrato microporoso con la velocidad de bombeo del fluido desde el depósito. En otras modalidades, un pulso de aire desplaza el fluido en la primera región de muestra hacia la segunda región de muestra.
En algunos ejemplos fuera del alcance de la presente invención, la muestra de fluido se deja incubar con un reactivo (como ejemplos no limitativos, un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo, o un sitio de unión de anticuerpo biosintético, como un scFv, aptámero, un cuerpo, péptido, PNA, nanopartícula funcionalizada, etc.) dentro de la primera región de muestra, para facilitar la detección de un analito en la segunda región de muestra. En algunas modalidades, el reactivo está contenido dentro del sustrato microporoso u otra capa intermedia tal como una almohadilla de conjugado de vidrio, con lo cual la rotura de la válvula pasiva introduce el fluido de muestra en una región de incubación sobre el sustrato microporoso. En otras modalidades, el fluido de muestra fluye primero a través del área de transducción de la primera o segunda región de muestra, seguido de la rehidratación y el transporte de una molécula de detección aguas arriba mediante el uso del fluido del depósito.
En algunos ejemplos fuera del alcance de la presente invención, el sustrato de detección incluye un sustrato microporoso y un volumen de fluido que fluye a través del sustrato microporoso. En algunas modalidades, el sustrato de detección comprende un sustrato microporoso y, durante la operación, al menos una porción del volumen atraviesa el sustrato microporoso. En algunas modalidades, el sustrato microporoso tiene una geometría configurada para facilitar un frente de fluido sustancialmente uniforme ya que al menos una porción del volumen atraviesa el sustrato microporoso en la dirección del flujo. En algunas modalidades, el volumen de fluido incluye uno o más líquidos, uno o más gases o sus combinaciones. En modalidades adicionales, el volumen de fluido incluye al menos la muestra de fluido. En algunas modalidades, el volumen de fluido es mayor o igual que un volumen mínimo para generar al menos una lectura válida de muestra. En algunas modalidades, el volumen de fluido es mayor o igual que un volumen mínimo para generar al menos una lectura válida de muestra de la primera región de muestra y al menos una lectura válida de muestra de la segunda región de muestra. En algunas modalidades, el sustrato microporoso tiene una geometría conformada para generar o aumentar la homogeneización del flujo del volumen a medida que fluye a través del sustrato microporoso. En algunas modalidades, el sustrato microporoso tiene una geometría en forma de reloj de arena. En algunas modalidades, el sustrato microporoso tiene un canal en forma de serpentina central rodeado por canales de rehidratación de longitud de trayectoria más lineales y más cortos. En algunas modalidades, el sustrato microporoso comprende una pluralidad de aberturas para aumentar la homogeneización del flujo. En otras modalidades, el sustrato microporoso se conforma para efectuar la rehidratación preferencial de las áreas de alta resistencia. En otras modalidades más, el sustrato microporoso se conforma para permitir que un flujo de rehidratación se mueva a través de áreas de baja resistencia o longitud de trayectoria baja mientras que el fluido de muestra se retrasa a través de áreas de mayor resistencia o mayor longitud de trayectoria.
En la presente descripción se describen métodos para analizar una muestra de fluido que comprenden: introducir un volumen de la muestra de fluido en una primera región de muestra; detectar una propiedad energética del volumen dentro de la primera región de muestra mediante el uso de al menos un transductor, generar de esta manera una primera lectura de muestra; hacer fluir al menos una porción del volumen a una segunda región de muestra; y detectar uno o más analitos en al menos una porción del volumen dentro de la segunda región de muestra mediante el uso de un sustrato de detección, que genera de esta manera una segunda lectura de muestra.
Los métodos pueden comprender además controlar el flujo de fluido desde la primera región de muestra a la segunda región de muestra mediante el uso de un mecanismo de medición. En algunas modalidades, el mecanismo de medición puede comprender una válvula pasiva. El mecanismo de medición puede comprender una o más características geométricas que restringen el flujo de fluido a la segunda región de muestra.
El método puede detener adicionalmente el flujo de fluido mediante el uso de una discontinuidad en la hidrofilicidad del sustrato receptor. Alternativamente o en combinación, el mecanismo de medición puede comprender una válvula activa. La válvula activa puede comprender un electrodo que tiene un recubrimiento hidrófobo (como ejemplo no limitativo, una monocapa autoensamblada de alcanotiol (SAM)). Puede aplicarse un voltaje al electrodo para provocar la disolución del recubrimiento hidrófobo, que permite de esta manera al flujo fluir a la segunda región de muestra.
Puede usarse un fluido de lavado presurizado para superar una válvula pasiva y transportar el fluido de muestra a la segunda región de muestra. La primera región de muestra puede comprender un canal capilar. Al menos un transductor se puede situar en una pared del canal capilar. Al menos una pared del canal capilar puede comprender una capa de adhesivo sensible a la presión. La capa de adhesivo sensible a la presión puede interactuar con el volumen para retrasar el flujo del volumen a través del canal capilar.
En los métodos descritos, la muestra de fluido puede comprender fluido lagrimal.
En los métodos descritos, la primera lectura de la muestra puede indicar la osmolaridad de la muestra de fluido. La segunda lectura de la muestra puede indicar la concentración de uno o más analitos en la muestra de fluido. La primera lectura de la muestra puede indicar la osmolaridad de la muestra de fluido, y la segunda lectura de la muestra es indicativa de la concentración de uno o más analitos en la muestra de fluido.
En algunos métodos descritos, el volumen está dentro de un intervalo de 10 nL a aproximadamente 10 pL, como dentro de un intervalo de aproximadamente 50 nL a aproximadamente 250 nL. En algunos métodos, el volumen está dentro de un intervalo entre dos de los siguientes: aproximadamente 10 nL, aproximadamente 20 nL, aproximadamente 30 nL, aproximadamente 40 nL, aproximadamente 50 nL, aproximadamente 60 nL, aproximadamente 70 nL, aproximadamente 80 nL, aproximadamente 90 nL, aproximadamente 100 nL, aproximadamente 150 nL, aproximadamente 200 nL, aproximadamente 250 nL, aproximadamente 300 nL, aproximadamente 400 nL, aproximadamente 500 nL, aproximadamente 600 nL, aproximadamente 700 nL, aproximadamente 800 nL, aproximadamente 900 nL, aproximadamente 1 pL, aproximadamente 2 pL, aproximadamente 3 pL, aproximadamente 4 pL, aproximadamente 5 pL, aproximadamente 6 pL, aproximadamente 7 pL, aproximadamente 8 pL, aproximadamente 9 pL o aproximadamente 10 pL. En algunos métodos, el volumen no es más de aproximadamente 20 pL, aproximadamente 250 nL, aproximadamente 200 nL o aproximadamente 50 nL. En algunos métodos, el volumen no es más de aproximadamente 10 nL, aproximadamente 20 nL, aproximadamente 30 nL, aproximadamente 40 nL, aproximadamente 50 nL, aproximadamente 60 nL, aproximadamente 70 nL, aproximadamente 80 nL, aproximadamente 90 nL, aproximadamente 100 nL, aproximadamente 150 nL, aproximadamente 200 nL, aproximadamente 250 nL, aproximadamente 300 nL, aproximadamente 400 nL, aproximadamente 500 nL, aproximadamente 600 nL, aproximadamente 700 nL, aproximadamente 800 nL, aproximadamente 900 nL, aproximadamente 1 pL, aproximadamente 2 pL, aproximadamente 3 pL, aproximadamente 4 pL, aproximadamente 5 pL, aproximadamente 6 pL, aproximadamente 7 pL, aproximadamente 8 pL, aproximadamente 9 pL o aproximadamente 10 pL.
Algunos métodos pueden comprender además introducir un fluido de transferencia en la primera región de muestra para desplazar al menos una porción del volumen de la primera región de muestra a la segunda región de muestra. El fluido de transferencia puede introducirse desde un depósito en comunicación fluídica con la primera región de muestra. Puede usarse un mecanismo de bombeo para empujar el flujo desde el depósito a una velocidad que coincida sustancialmente con la velocidad de absorción capilar del sustrato microporoso. Un pulso de aire puede desplazar fluido en la primera región de muestra a la segunda región de muestra.
En algunos métodos, la muestra de fluido se deja incubar con una molécula de detección o reactivo de ensayo (como ejemplos no limitativos, un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo, un sitio de unión de anticuerpo biosintético que incluye un sFv, aptámero, un cuerpo, péptido, PNA, nanopartículas funcionalizadas o similares) dentro de la primera región de muestra. En otros métodos, la molécula de detección se contiene dentro del sustrato microporoso u otra capa intermedia como una almohadilla de conjugado de vidrio, con lo cual la rotura de la válvula pasiva introduce el fluido de muestra en una región de incubación sobre el sustrato microporoso. En otros métodos, el fluido de muestra fluye primero sobre el área de transducción de la primera o segunda región de muestra, seguido de la rehidratación y el transporte de una molécula de detección aguas arriba mediante el uso del fluido del depósito.
En algunos métodos, el sustrato de detección comprende un sustrato microporoso y el fluido fluye a través del sustrato microporoso. En algunos métodos, el sustrato de detección comprende un sustrato microporoso y al menos una porción del volumen atraviesa el sustrato microporoso. En algunos métodos, el sustrato microporoso tiene una geometría configurada para facilitar un frente de fluido sustancialmente uniforme ya que al menos una porción del volumen atraviesa el sustrato microporoso en la dirección del flujo. En algunos métodos, el sustrato microporoso tiene una geometría en forma de reloj de arena. En algunos métodos, la geometría del sustrato microporoso tiene un canal en forma de serpentina central rodeado por canales de hidratación de longitud de trayectoria más lineales y más cortos. En algunos métodos, la geometría del sustrato microporoso comprende una pluralidad de aberturas para aumentar la homogeneización del flujo. En otros métodos, el sustrato microporoso se moldea para efectuar una rehidratación preferencial de las áreas de alta resistencia. En otros métodos más, el sustrato microporoso se conforma para permitir que un flujo de hidratación se mueva a través de áreas de baja resistencia o longitud de trayectoria baja mientras que el fluido de muestra se retrasa a través de áreas de mayor resistencia o mayor longitud de trayectoria.
En la presente descripción se describen métodos para tratar o controlar una afección ocular en un individuo que lo necesita, que comprenden: introducir un volumen de una muestra de película lagrimal del individuo en una primera región de muestra de un dispositivo de análisis; detectar una propiedad energética del volumen dentro de la primera región de muestra mediante el uso de al menos un transductor, generar de esta manera una primera lectura de muestra; hacer fluir al menos una porción del volumen a una segunda región de muestra del dispositivo de análisis; detectar uno o más analitos en al menos una porción del volumen dentro de la segunda región de muestra mediante el uso de un sustrato de detección, que genera así una segunda lectura de muestra; y ajustar un plan de tratamiento para tratar la afección ocular en el individuo, en base a la primera y segunda lectura de muestra. En algunos métodos, el método comprende además recolectar el volumen de muestra de película lagrimal. En algunos métodos, la afección ocular es queratoconjuntivitis sicca. En algunos métodos, la afección ocular es una alergia. En algunos métodos, la afección ocular es diabetes. En algunos métodos, la afección ocular es la retinopatía diabética. En algunos métodos, la afección ocular es la degeneración macular relacionada con la edad. En algunos métodos, la afección ocular es glaucoma. En algunos métodos, la afección ocular es una o más que degeneración macular relacionada con la edad, alergia, blefaritis, cataratas, conjuntivitis, celulitis, retinopatía serosa central, chalazión, daño relacionado con lentes de contacto, abrasiones corneales/conjuntivales, distrofias, erosiones, laceraciones, úlceras, rechazo de trasplante de córnea, retinitis por citomegalovirus, retinopatía diabética, cánceres oculares, distrofia de Fuch, enfermedad de Grave, histoplasmosis, glaucoma, infección, queratitis, queratocono, enfermedad macular, neovascularización, hipertensión ocular, neuritis óptica, pinguécula, pterioblastoma, retinitis, escleritis, tracoma, triquiasis o uveítis.
A medida que la muestra de fluido interactúa con el sustrato microporoso, existe una cierta velocidad de unión inespecífica que elimina progresivamente la señal a lo largo de la longitud de trayectoria a través de la membrana microporosa. Por lo tanto, ciertos métodos minimizan la interacción del fluido de muestra con el sustrato microporoso limpio antes de que fluya sobre el transductor, para eliminar pérdidas inespecíficas y reducción de precisión. En algunos métodos, la geometría del sustrato microporoso usa una protuberancia en forma de cuña corta o triangular que sirve como interfaz inicial entre las regiones de muestra, que minimiza de esta manera la cantidad de membrana limpia con la que interactúa el fluido de muestra. En algunas modalidades, las moléculas de detección se colocan dentro y se dejan incubar con el fluido de muestra dentro del canal de recolección para evitar que el fluido de muestra interactúe por completo con la membrana limpia.
En la presente descripción se describen dispositivos para analizar una muestra de fluido, el dispositivo que comprende: (a) una entrada de fluido; (b) una región de muestra dispuesta dentro del dispositivo en comunicación fluídica con la entrada de fluido y configurada para recibir un volumen de la muestra de fluido, la región de muestra que comprende un sustrato de detección configurado para permitir la detección de uno o más analitos en el volumen para generar una primera lectura de la muestra; y (c) un depósito de fluido dispuesto dentro del dispositivo y en comunicación fluídica con la región de muestra, el depósito de fluido que contiene un fluido de transferencia, que cuando se transfiere a la región de muestra es capaz de hidratar un reactivo dispuesto dentro de la región de la muestra, que lava el sustrato de detección durante la operación del dispositivo, o ambos.
Algunos dispositivos comprenden además un mecanismo de medición que controla el flujo de fluido entre la entrada de fluido y la región de muestra. En algunos dispositivos, el mecanismo de medición puede comprender una válvula pasiva, una válvula activa o una combinación de las mismas. En algunos dispositivos, la válvula pasiva puede comprender una o más características geométricas que restringen el flujo del volumen en la región de muestra. En algunos dispositivos, la válvula activa comprende un electrodo que tiene un recubrimiento hidrófobo y la aplicación de un voltaje al electrodo provoca la disolución del recubrimiento hidrófobo, que permite de esta manera el flujo de al menos una porción del volumen a la región de muestra. En algunos dispositivos, el recubrimiento hidrófobo comprende una monocapa autoensamblada de alcanotiol. En algunos dispositivos, el dispositivo comprende además una segunda región de muestra dispuesta entre, y en comunicación fluídica con, la entrada y la primera región de muestra, en donde la segunda región de muestra comprende al menos un transductor configurado para detectar una propiedad energética de la muestra de fluido. En algunos dispositivos, la segunda región de muestra comprende un canal capilar. En algunos dispositivos, al menos un transductor se sitúa en una pared del canal capilar. En algunos dispositivos, la muestra de fluido comprende fluido lagrimal. En algunos dispositivos, la primera lectura de la muestra es indicativa de la presencia o concentración de uno o más analitos en la muestra de fluido. En algunos dispositivos, la segunda lectura de la muestra es indicativa de la osmolaridad de la muestra de fluido. En algunos dispositivos, el volumen está dentro de un intervalo de aproximadamente 10 nL a aproximadamente 10 pL. En algunos dispositivos, el volumen está dentro de un intervalo de aproximadamente 50 nL a aproximadamente 250 nL. En algunos dispositivos, el volumen no supera los 10 nL, 20 nL, 30 nL, 40 nL, 50 nL, 60 nL, 70 nL, 80 nL, 90 nL, 100 nL, 150 nL, 200 nL, 250 nL, 300 nL, 400 nL, 500 nL, 600 nL, 700 nL, 800 nL, 900 nL, 1 pL, 2 pL, 3 pL, 4 pL, 5 pL, 6 pL, 7 pL, 8 pL, 9 pL o 10 pL. En algunos dispositivos, el sustrato de detección comprende un sustrato microporoso y, durante la operación, al menos una porción del volumen atraviesa el sustrato microporoso. En algunos dispositivos, el sustrato microporoso tiene una geometría configurada para facilitar un frente de fluido sustancialmente uniforme ya que al menos una porción del volumen atraviesa el sustrato microporoso en la dirección del flujo. En algunos dispositivos, el sustrato microporoso tiene una geometría en forma de reloj de arena. En algunos dispositivos, el sustrato microporoso comprende una pluralidad de aberturas para facilitar el frente de fluido sustancialmente uniforme. En algunos dispositivos, el sustrato de detección comprende además un primer aglutinante inmovilizado capaz de unirse, directa o indirectamente, al uno o más analitos si están presentes en el volumen. En algunos dispositivos, el primer aglutinante se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo, un miembro de un par de unión avidina-biotina y un miembro de un par de unión estreptavidinabiotina. En algunos dispositivos, el sustrato de detección comprende además un segundo aglutinante capaz de unir uno o más analitos si están presentes en el volumen, en donde el segundo aglutinante está opcionalmente conjugado con una molécula detectable. En algunos dispositivos, la molécula detectable es una nanopartícula, un marcador detectable visualmente, un marcador fluorescente o un marcador bioluminiscente.
En la presente descripción se describen métodos para analizar una muestra de fluido, el método que comprende: (a) introducir un volumen de la muestra de fluido en la región de muestra del dispositivo de un dispositivo proporcionado en la presente descripción; y (b) detectar la presencia y/o concentración de uno o más analitos en el volumen, si están presentes en la muestra de fluido. En algunos métodos, la muestra de fluido comprende fluido lagrimal. En algunos métodos, el volumen está dentro de un intervalo de aproximadamente 10 nL a aproximadamente 10 pL. En algunos métodos, el volumen está dentro de un intervalo de aproximadamente 50 nL a aproximadamente 250 nL. En algunos métodos, el volumen no supera los 10 nL, 20 nL, 30 nL, 40 nL, 50 nL, 60 nL, 70 nL, 80 nL, 90 nL, 100 nL, 150 nL, 200 nL, 250 nL, 300 nL, 400 nL, 500 nL, 600 nL, 700 nL, 800 nL, 900 nL, 1 pL, 2 pL, 3 pL, 4 pL, 5 pL, 6 pL, 7 pL, 8 pL, 9 pL o 10 pL.
En la presente descripción se describen métodos para tratar o controlar una afección ocular en un individuo, el método que comprende: (a) introducir un volumen de una muestra de película lagrimal del individuo en la región de muestra de un dispositivo proporcionado en la presente descripción; (b) detectar la presencia y/o concentración de uno o más analitos en el volumen; y (c) ajustar un plan de tratamiento para tratar la afección ocular en el individuo, en base a la presencia y/o concentración de uno o más analitos en el volumen. En algunos métodos, la afección ocular es queratoconjuntivitis sicca. En algunos métodos, la afección ocular es una alergia. En algunos métodos, la afección ocular es diabetes. En algunos métodos, la afección ocular es la retinopatía diabética. En algunos métodos, la afección ocular es la degeneración macular relacionada con la edad. En algunos métodos, la afección ocular es glaucoma. En algunos métodos, la afección ocular es una o más que degeneración macular relacionada con la edad, alergia, blefaritis, cataratas, conjuntivitis, celulitis, retinopatía serosa central, chalazión, daño relacionado con lentes de contacto, abrasiones corneales/conjuntivales, distrofias, erosiones, laceraciones, úlceras, rechazo de trasplante de córnea, retinitis por citomegalovirus, retinopatía diabética, cánceres oculares, distrofia de Fuch, enfermedad de Grave, histoplasmosis, glaucoma, infección, queratitis, queratocono, enfermedad macular, neovascularización, hipertensión ocular, neuritis óptica, pinguécula, pterigosis pigmentaria, retinitis, escleritis, tracoma, triquiasis y uveítis.
Otros objetos y características de la presente invención resultarán evidentes mediante una revisión de la descripción, las reivindicaciones y las figuras adjuntas.
Breve descripción de los dibujos
Las características novedosas de la invención se exponen con particularidad en las reivindicaciones adjuntas. Un mejor entendimiento de las características y ventajas de la presente invención se obtendrá como referencia a la siguiente descripción detallada que expone las modalidades ilustrativas, en la que se utilizan los principios de la invención, y los dibujos acompañantes de los cuales:
La Figura 1 ilustra una vista en sección transversal de un dispositivo microfluídico ilustrativo no limitativo con una válvula pasiva para medir el flujo de fluido, de acuerdo con algunas modalidades;
La Figura 2 ilustra una vista en sección transversal de un dispositivo microfluídico ilustrativo no limitativo con una válvula activa para medir el flujo de fluido, de acuerdo con algunas modalidades;
La Figura 3A ilustra una vista en sección transversal de un dispositivo microfluídico ilustrativo no limitativo para la detección integrada de osmolaridad y uno o más analitos de interés que utiliza interacciones de energía superficial para retrasar el flujo de fluido, de acuerdo con algunas modalidades;
Las Figuras 3B y 3C ilustran resultados de flujo ilustrativos no limitativos obtenidos mediante el uso de un dispositivo microfluídico que implementa un mecanismo de retraso de flujo basado en energía superficial, de acuerdo con algunas modalidades;
La Figura 4A ilustra una vista despiezada de un dispositivo microfluídico ilustrativo no limitativo para la detección integrada de osmolaridad y detección de uno o más analitos que tienen una válvula pasiva, de acuerdo con algunas modalidades; La Figura 4B ilustra una vista en sección transversal del dispositivo microfluídico ensamblado de la Figura 4A;
La Figura 5A y la Figura 5B ilustran vistas superiores e inferiores de dispositivos microfluídicos ilustrativos no limitativos ensamblados para la detección integrada de osmolaridad y uno o más analitos de interés, de acuerdo con algunas modalidades;
Las Figuras de la 6A a la 6G ilustran sustratos de detección ilustrativos no limitativos con geometrías para lograr la homogeneización del flujo, de acuerdo con algunas modalidades; y
La Figura 7 ilustra sustratos de detección ilustrativos no limitativos configurados para efectuar retrasos del fluido de precisión, de acuerdo con algunas modalidades.
La Figura 8 muestra una ilustración no limitativa de una osmolaridad medida en serie y 250 ng/ml de IgE mediante el uso de aproximadamente 100 nL de fluido lagrimal humano.
La Figura 9 muestra una ilustración no limitativa de un ensayo multiplexado dentro de una estructura de rehidratación que contiene canales de rehidratación segregados.
Descripción detallada
La presente descripción proporciona sistemas, métodos y dispositivos para recolectar y analizar pequeños volúmenes (como ejemplo no limitativo, menos de aproximadamente 20 microlitros) de muestras de fluido. Los sistemas, métodos y dispositivos que se describen en la presente descripción se usan, en algunos ejemplos fuera del alcance de la presente invención, para detectar y/o medir una o más características de la muestra de fluido de interés. Como ejemplo no limitativo, los sistemas, métodos y dispositivos se usan para medir una primera característica (como ejemplo no limitativo, la osmolalidad de un fluido de interés) y una segunda característica de interés (como ejemplo no limitativo, la presencia y/o concentración de uno o más analitos en el fluido de interés). En algunos ejemplos fuera del alcance de la presente invención, los sistemas, métodos y dispositivos se usan para medir la presencia y/o concentración de uno o más analitos en un fluido de interés. En algunos ejemplos fuera del alcance de la presente invención, los sistemas, métodos y dispositivos se usan para medir una primera característica (como ejemplo no limitativo, la osmolalidad de un fluido de interés) o una segunda característica de interés (como ejemplo no limitativo, la presencia y/o concentración de uno o más analitos en el fluido de interés).
La presente invención aborda los problemas que pueden surgir al intentar recolectar y analizar muestras de fluido en nanolitros (nL) en un dispositivo integrado para su uso en el punto de atención. Los volúmenes pequeños de muestra tienen menos moléculas para detectar que los volúmenes más grandes a la misma concentración, por lo que requiere una sensibilidad muy alta. Por lo general, los ensayos intentan resolver este problema mediante largos tiempos de incubación de más de una hora hasta toda la noche para permitir que la difusión ayude a acumular analitos de interés en la superficie del detector, acompañada de un lavado riguroso repetido para eliminar el fondo no específico. Ninguna de estas técnicas está disponible en el punto de atención, lo que requiere pruebas rápidas (como ejemplo no limitativo, menos de unos pocos minutos) con sistemas simples operables por usuarios completamente inexpertos. Adicionalmente, al implementar un análisis en serie tanto de una osmolaridad lagrimal basada en impedancia como de un ensayo sándwich de tipo cromatográfico (o flujo lateral), pueden surgir una variedad de cuestiones, como: medición precisa del fluido recolectado, rehidratación del anticuerpo de detección (o como ejemplos no limitativos incluyen complejo de nanopartículas, aptámero, scFv o similares), eficiencia de la transferencia de muestra, que logra la rehidratación del anticuerpo de captura antes de que la muestra de lágrima haya pasado por completo sobre la región de la muestra, que evita el desbordamiento del tampón de ejecución sobre la membrana de flujo lateral microporosa, flujo de homogeneización (que crea un patrón de flujo sustancialmente isotrópico y uniforme en el borde delantero del anticuerpo de detección, o alternativamente, en la mayoría de la muestra de lágrima reaccionada y el frente del complejo de detección que fluye a través de la región de captura en lugar de a su alrededor) y evitar inestabilidades del flujo que cambian aleatoriamente el flujo hacia un lado u otro del sistema cromatográfico.
Para abordar estos asuntos, la presente descripción proporciona, en algún ejemplo fuera del alcance de la presente invención, dispositivos integrados de recolección microfluídica que comprenden (a) un sustrato que recibe un volumen alícuota de un fluido de muestra, en donde el sustrato se conforma operativamente para recibir el volumen alícuota del fluido de muestra a través de acción capilar; y al menos una de (b) una región del sustrato del fluido de muestra, dimensionada de manera que el volumen del fluido de muestra sea suficiente para recubrir operativamente una porción de la región de muestra, con lo cual las propiedades energéticas del fluido de muestra son trasducidas para producir una lectura del fluido de muestra que indica la osmolaridad de la muestra, y (c) una segunda región de muestra que analiza una porción del fluido de muestra en busca de analitos de interés. En ciertos ejemplos fuera del alcance de la presente invención, el dispositivo y sistema como se describe en la presente descripción también contiene una serie de una o más válvulas pasivas balanceadas para medir el fluido de muestra, en donde el fluido presurizado a través del sistema atravesará las válvulas en una secuencia predeterminada. En ciertos ejemplos fuera del alcance de la presente invención, el dispositivo y sistema como se describe en la presente descripción también contiene al menos un depósito integrado. En algún ejemplo fuera del alcance de la presente invención, el depósito contiene un tampón, fluido de lavado, fluido de transferencia, fluido de muestra, gas, aire o cualquier otro volumen de fluido dentro del mismo. En algunos ejemplos fuera del alcance de la presente invención, el depósito se divide para contener más de un tampón de transferencia, fluido de lavado, fluido de transferencia, fluido de muestra, gas, aire o cualquier otro volumen de fluido dentro del mismo. Algunos ejemplos fuera del alcance de la presente invención, cuentan con una segunda región de muestra que comprende un sustrato microporoso, conformado operativamente para optimizar la eficiencia de la transferencia de la muestra, dinámica de rehidratación, protección contra desbordamiento y equilibrio de resistencia fluídica para evitar inestabilidades del flujo. En ciertos ejemplos fuera del alcance de la presente invención, la eficiencia de la transferencia de la muestra se optimiza mediante la colocación de una pequeña protuberancia del sustrato microporoso en la interfaz entre las dos regiones de muestra. En otros ejemplos fuera del alcance de la presente invención, la dinámica de rehidratación del complejo de detección se logra mediante la colocación del complejo de detección del inmunoensayo en el lado medido de una válvula pasiva, o dentro del canal de recolección, o ambos. En otros ejemplos fuera del alcance de la presente invención, la rehidratación del complejo de detección se logra dentro del sustrato microporoso después de la transferencia de la muestra. En otros ejemplos fuera del alcance de la presente invención, la dinámica de rehidratación de la región de captura se logra mediante la colocación de constricciones fluídicas aguas abajo de manera que la trayectoria fluídica de menor resistencia pase a través de la región de captura en lugar de alrededor de ella. En otros ejemplos fuera del alcance de la presente invención, la rehidratación de la región de captura se logra aguas abajo de una rápida expansión en la trayectoria de la sección transversal fluídica. En otro ejemplo fuera del alcance de la presente invención, la rehidratación de la región de captura se logra mediante el modelado de uno o más canales en forma de serpentina dentro del sustrato microporoso que actúa como un retraso fluídico y una trayectoria preferencial para la transferencia de muestras mientras que los canales de rehidratación más pequeños y de menor longitud de trayectoria llevan el tampón de transferencia a la región de captura aguas abajo antes de la llegada de la muestra retrasada, momento en el que se fusionan las trayectorias de rehidratación y muestra. En otros ejemplos fuera del alcance de la presente invención, los canales de rehidratación de longitud de trayectoria más corta que rodean una trayectoria de muestra central enfocan el flujo desarrollado del detector en un área más predecible después de que los canales de rehidratación y los canales de muestra se fusionan en una sola trayectoria. En otros ejemplos fuera del alcance de la presente invención, se añaden uno o más canales de fluido para ayudar a mitigar la posibilidad de un desbordamiento impulsado por presión desde el depósito. En otros ejemplos fuera del alcance de la presente invención, los canales de rehidratación y de protección de desbordamiento se combinan en una estructura. En un ejemplo adicional fuera del alcance de la presente invención, las resistencias de flujo de muestra aguas abajo están equilibradas para evitar que el flujo elija aleatoriamente una trayectoria asimétrica a través del sustrato microporoso que crea una inestabilidad del flujo e imprevisibilidad dentro del sistema. En otros ejemplos fuera del alcance de la presente invención, se permiten inestabilidades del flujo asimétrico en el sistema y se compensan mediante la colocación de regiones de captura redundantes a cada lado de una trayectoria simétrica y sus intensidades promediadas en software. En conjunto, estas características abordan los problemas del análisis paralelo de uno o más analitos de interés en muestras medidas en nanolitro.
En algunos ejemplos fuera del alcance de la presente invención, un volumen de una muestra de fluido de interés fluye de forma secuencial y controlada a través de una pluralidad de regiones de muestra en un único dispositivo microfluídico. En algunos ejemplos fuera del alcance de la presente invención, cada región de muestra incluye varios componentes de detección para analizar y detectar varias propiedades del volumen de muestra, tales como presión osmótica, concentración total, osmolalidad y/o osmolaridad, así como también detección de uno o más analitos de interés. Algunos ejemplos fuera del alcance de la presente invención, de la presente descripción, se configuran para ser relativamente rápidos, no invasivos, económicos y/o fáciles de usar, con un riesgo mínimo de lesión para el paciente. Se proporcionan mediciones precisas con volúmenes tan pequeños como microlitros de un fluido de muestra, en algunos ejemplos fuera del alcance de la presente invención. Como ejemplo no limitativo, un dispositivo de medición se configura para permitir la medición de la osmolaridad con no más de 20 microlitros de fluido de muestra. Los volúmenes más pequeños, como ejemplos no limitativos, los volúmenes de nanolitros, a veces tan pequeños como 20 nanolitros, se miden eficazmente. El rendimiento de la medición no se compromete por las variaciones en el volumen del fluido de muestra recolectado, de modo que las mediciones de osmolaridad y uno o más analitos de interés son sustancialmente independientes del volumen recolectado. En un ejemplo fuera del alcance de la presente invención, esto se logra a través de la interrogación de un subconjunto bien definido del volumen alícuota del fluido de muestra. En algunos ejemplos fuera del alcance de la presente invención, los enfoques descritos en la presente descripción permiten el análisis rápido de pequeños volúmenes de muestra dentro de un solo dispositivo integrado, que mejora de esta manera la velocidad, flexibilidad, conveniencia para el usuario y rentabilidad de las pruebas diagnóstico de muestras de fluido.
En algunos ejemplos fuera del alcance de la presente invención, los dispositivos descritos en la presente descripción se usan para analizar una variedad de diferentes tipos de fluidos, que incluyen la película lagrimal, el sudor, la sangre, la orina, la saliva u otros fluidos corporales, o sus combinaciones. En algunos ejemplos fuera del alcance de la presente invención, los dispositivos descritos en la presente descripción se usan para analizar otros fluidos de muestra, como la leche u otras bebidas, así como también varios tampones, soluciones, reactivos o productos químicos, o sus combinaciones.
En algunos ejemplos fuera del alcance de la presente invención, los dispositivos descritos en la presente descripción se usan para analizar el fluido lagrimal de un paciente. En algunos ejemplos fuera del alcance de la presente invención, el análisis del fluido lagrimal es beneficioso para diagnosticar, controlar y/o tratar varias afecciones oculares en las que se manifiestan anomalías en la película lagrimal del paciente. Por ejemplo, la queratoconjuntivitis sicca (KCS), u "ojo seco", es una afección en la que uno o más de los componentes de la estructura de la película lagrimal (como ejemplo no limitativo, base de mucina subyacente, componente acuoso medio, capa lipídica sobrepuesta) está presente en un volumen insuficiente o de cualquier otra manera están desequilibrados con los otros componentes. Se sabe que la tonicidad de los fluidos o la osmolaridad de las lágrimas aumenta en pacientes con KCS. El KCS se asocia con afecciones que afectan la salud general del cuerpo, como el síndrome de Sjogren, el envejecimiento y la deficiencia de andrógenos. Por lo tanto, la osmolaridad de una película lagrimal es un indicador sensible y específico para el diagnóstico de KCS y otras afecciones.
Además, evidencia reciente ha demostrado que la hiperosmolaridad lagrimal se relaciona directamente con la inestabilidad de la película lagrimal, la afección en la que la película lagrimal pasa de un sistema homeostático en equilibrio con la osmolaridad sanguínea a una forma estructurada progresivamente más caótica e impredecible. En las primeras etapas de la enfermedad del ojo seco, la película lagrimal puede ser metaestable, donde las variaciones de parpadeo en resistencia, el contacto del párpado, etc., retraen una película delgada de capacidad variable en dependencia de las variables antes mencionadas. En la enfermedad avanzada del ojo seco, o en cualquier otra afección de la superficie ocular que promueva la inestabilidad, la película lagrimal se compromete hasta el punto en que las fuerzas cohesivas son insuficientes para mantener cualquier apariencia de una película y se produce una rápida evaporación sobre la córnea y la conjuntiva. Esta inestabilidad es relevante cuando se intentan medir analitos como biomarcadores de proteínas dentro de una muestra de película lagrimal. Por ejemplo, muestras puntuales de biomarcadores de lágrimas (como ejemplo no limitativo, para pruebas diagnósticas desechables in vitro que proporcionan datos sobre la concentración de un biomarcador en el momento único de la recolección de la muestra) son susceptibles a variaciones inaceptables al tomar decisiones clínicas a menos que la osmolaridad de la muestra se tenga en cuenta debido a la variación de primer orden en la concentración debido a la inestabilidad lagrimal y la hiperosmolaridad resultante debido a la pérdida de agua por evaporación.
En algunos ejemplos fuera del alcance de la presente invención, se ensayan y usan una pluralidad de analitos de interés para ayudar en el diagnóstico y tratamiento de una o más enfermedades oculares. Los ejemplos no limitativos de enfermedades oculares incluyen: degeneración macular relacionada con la edad, alergia, blefaritis, cataratas, conjuntivitis, celulitis, retinopatía serosa central, chalazión, daño relacionado con lentes de contacto, abrasiones corneales/conjuntivales, distrofias, erosiones, laceraciones, úlceras, rechazo de trasplante corneal, retinitis por citomegalovirus, retinopatía diabética, cánceres oculares, distrofia de Fuch, enfermedad de Grave, histoplasmosis, glaucoma, infección, queratitis, queratocono, enfermedad macular, neovascularización, hipertensión ocular, neuritis óptica, pinguécula, pterigión, retinitis pigmentosa, retinoblastoma, escleritis, tracoma, triquiasis y uveítis. En algunas modalidades, se usa una interpretación paralela (como ejemplo no limitativo, un OR lógico, donde si alguno de la pluralidad de analitos es positivo, retorna un diagnóstico positivo) de analitos específicos (y/o propiedades de fluidos como la osmolaridad) se usan para aumentar la sensibilidad general de una prueba de enfermedades oculares sin sacrificar mucha especificidad. Como ejemplo no limitativo, en un ejemplo, se usa la interpretación paralela de osmolaridad, lactoferrina, albúmina y lipocalina para diagnosticar la enfermedad del ojo seco. En otro ejemplo fuera del alcance de la presente invención, la interpretación paralela de osmolaridad, lipocalina, proteína 4 rica en prolina (PRR4) y zinc-alfa-2-glicoproteína 2 (ZAG2) (u otras proteínas lagrimales importantes) se usan para diagnosticar la enfermedad del ojo seco cuando los niveles de proteína son más bajos que su intervalo normal. En otro ejemplo más fuera del alcance de la presente invención, se usa la interpretación paralela de osmolaridad, lipocalina, p RR4 y ZAG2 (u otras proteínas lagrimales importantes) para diagnosticar glaucoma sin tratamiento previo si los niveles son más altos que el intervalo normal. En otro ejemplo más fuera del alcance de la presente invención, se usa la interpretación paralela de osmolaridad, lipocalina, PRR4 y z AG2 (u otras proteínas lagrimales importantes) para diagnosticar tanto el ojo seco como el glaucoma en el mismo dispositivo. En algunos ejemplos fuera del alcance de la presente invención, la interpretación paralela de la osmolaridad y la albúmina glucosilada permite una mayor precisión en la diferenciación entre pacientes sanos, pacientes diabéticos y pacientes diabéticos con retinopatía, al compensar la variación de parpadeo la concentración de la lágrima que normaliza la concentración de albúmina glucosilada frente a la osmolaridad medida. En otros ejemplos más fuera del alcance de la presente invención, la interpretación paralela de la osmolaridad y el factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF) permite una precisión mejorada en la determinación del glaucoma de baja tensión que normaliza el nivel de BDNF frente a la osmolaridad lagrimal medida. En otro ejemplo fuera del alcance de la presente invención, la interpretación paralela de la osmolaridad, IL-1Ra, MMP-9 y S100A8 ayuda a diagnosticar tanto la enfermedad del ojo seco como los subconjuntos causantes del trastorno, ya sea por deficiencia inflamatoria o acuosa. En otros ejemplos fuera del alcance de la presente invención, se miden en paralelo múltiples analitos de interés de diferentes enfermedades con síntomas coincidentes y presentación clínica. Como ejemplo no limitativo, en un ejemplo, la osmolaridad más una pluralidad de marcadores de alergia como IgE, ECP y/o EDN se miden para interrogar la alergia tanto en etapa temprana como en la tardía mientras se diferencia entre ojo seco y alergia a pesar de la presentación clínica y los síntomas similares. En otros ejemplos fuera del alcance de la presente invención, no se mide la osmolaridad, mientras que los analitos de interés sí. Estos ejemplos no pretenden ser limitativos, pero proporcionan ejemplos de cómo aplicar los dispositivos descritos en el punto de atención.
En consecuencia, la presente descripción proporciona, en algunos ejemplos fuera del alcance de la presente invención, sistemas, métodos y dispositivos para medir la osmolaridad de un volumen alícuota (como ejemplo no limitativo, de una película lagrimal u otra muestra de fluido) junto con la medición de uno o más analitos de interés en el volumen (como ejemplo no limitativo, la presencia y/o concentración de uno o más analitos). En algunos ejemplos fuera del alcance de la presente invención, las mediciones de osmolaridad y analito se realizan de forma simultánea o secuencial. En algunos ejemplos fuera del alcance de la presente invención, la medición de la osmolaridad se realiza primero, seguida de un ensayo para detectar la presencia y/o concentración de uno o más analitos en el volumen de la muestra. En algunos ejemplos fuera del alcance de la presente invención, la medición de la osmolaridad se realiza en segundo lugar, seguida de un ensayo para detectar la presencia y/o concentración de uno o más analitos en el volumen de muestra. En otros ejemplos fuera del alcance de la presente invención, la osmolaridad de la muestra es relativamente constante y solo se analizan los analitos de interés.
En algunos ejemplos fuera del alcance de la presente invención, se usa cualquier técnica adecuada para medir la osmolaridad de una muestra de fluido. En algunos ejemplos fuera del alcance de la presente invención, la osmolaridad se mide cuando se detectan las propiedades energéticas de la muestra (como un ejemplo no limitativo, propiedades térmicas, ópticas y/o eléctricas), como al transferir la energía a la muestra, detectar la energía impartida y usar el resultado de la detección para determinar la osmolaridad. En algunos ejemplos fuera del alcance de la presente invención, se usan uno o más transductores o electrodos para medir la conductividad eléctrica del fluido, como ejemplo no limitativo, cuando se aplica una señal eléctrica adecuada. Dado que la conductividad eléctrica se relaciona con la concentración de iones del fluido, la osmolaridad del fluido se puede determinar si se aplican funciones de corrección de temperatura y calibración apropiada.
Los analitos que pueden medirse en una muestra de fluido mediante el uso de las técnicas, sistemas y dispositivos presentados en la presente descripción incluyen, pero no se limitan a, proteínas, péptidos, metabolitos, electrolitos, moléculas pequeñas, lípidos, azúcares, ácidos nucleicos y proteoglicanos, entre otros partes biológicas y conjuntos de orden superior, así como también sus combinaciones. En algunos ejemplos fuera del alcance de la presente invención, los analitos incluyen biomarcadores de proteínas. En algunos ejemplos fuera del alcance de la presente invención, los analitos incluyen, pero no se limitan a: inmunoglobulinas (como ejemplo no limitativo, Inmunoglobulina E (IgE), Inmunoglobulina M (IgM), Inmunoglobulina A (IgA), Inmunoglobulina G (IgG)), citocinas (como ejemplo no limitativo, factor de crecimiento transformante -p(TGF-p), factores de necrosis tumoral (TNF-a), interleucina 1-A), proteínas (S100, lactoferrina, lipocalina, catepsina, BDNF, enolasa, Proteína Catiónica Eosinófila (ECP), Neurotoxina Derivada de Eosinófilos (EDN), PRR4, ZAG2, cistatina, albúmina o similares) o mucinas y otras glicoproteínas (como ejemplo no limitativo, mucina 5 asociada a la superficie celular (MUC- 5), proteoglicano 4 (PRG4), mucina 16 asociada a la superficie celular (MUC16)). En algunos ejemplos fuera del alcance de la presente invención, el procedimiento de detección y/o medición de analitos comprende hacer fluir la muestra de fluido a través de un sustrato de detección. El sustrato de detección ilustrativo no limitativo incluye un sustrato microporoso o una membrana microporosa. En otros ejemplos fuera del alcance de la presente invención, el sustrato de detección es uno o más seleccionados de nitrocelulosa, almohadillas conjugadas de fibra de vidrio, Fusion 5, materiales POREX®, papel, PVDF o similares. En algunos ejemplos fuera del alcance de la presente invención, el sustrato microporoso y la membrana microporosa son equivalentes e intercambiables en el mismo. En algunos ejemplos fuera del alcance de la presente invención, el canal de recolección, el canal capilar y el canal microfluídico son términos equivalentes e intercambiables en el mismo. En algunos ejemplos fuera del alcance de la presente invención, el sustrato de detección se configura para análisis cromatográfico, de flujo continuo o de flujo lateral de uno o más analitos de interés. Otras técnicas ilustrativas no limitativas incluyen impedancia, espectroscopía de impedancia, espectroscopía Raman mejorada en superficie (SERS), transductores electroquímicos, transductores sin marcadores tales como resonancia de plasmón de superficie, interferometría o similares. Los expertos en la técnica conocen los ensayos para detectar analitos en un volumen de fluido y se describen con más detalle a continuación.
En algún ejemplo fuera del alcance de la presente invención, los sistemas, métodos y dispositivos proporcionados en la presente descripción se aplican al análisis de osmolaridad y concentración de analito en volúmenes relativamente pequeños de muestras de fluido, como un volumen dentro de un intervalo de aproximadamente 10 nL a aproximadamente 10 |jl, o dentro de un intervalo de aproximadamente 50 nl a 250 nl. En algunos ejemplos fuera del alcance de la presente invención, el volumen está dentro de un intervalo entre dos de los siguientes: aproximadamente 10 nL, aproximadamente 20 nL, aproximadamente 30 nL, aproximadamente 40 nL, aproximadamente 50 nL, aproximadamente 60 nL, aproximadamente 70 nL, aproximadamente 80 nL, aproximadamente 90 nL, aproximadamente 100 nL, aproximadamente 150 nL, aproximadamente 200 nL, aproximadamente 250 nL, aproximadamente 300 nL, aproximadamente 400 nL, aproximadamente 500 nL, aproximadamente 600 nL, aproximadamente 700 nL, aproximadamente 800 nL, aproximadamente 900 nL, aproximadamente 1 pL, aproximadamente 2 pL, aproximadamente 3 pL, aproximadamente 4 |jL, aproximadamente 5 pL, aproximadamente 6 pL, aproximadamente 7 pL, aproximadamente 8 pL, aproximadamente 9 pL o aproximadamente 10 pL. En algunos ejemplos fuera del alcance de la presente invención, el volumen no es más de aproximadamente 20 pL, aproximadamente 250 nL, aproximadamente 200 nL o aproximadamente 50 nL. En algunos ejemplos fuera del alcance de la presente invención, el volumen no es más de aproximadamente 10 nL, aproximadamente 20 nL, aproximadamente 30 nL, aproximadamente 40 nL, aproximadamente 50 nL, aproximadamente 60 nL, aproximadamente 70 nL, aproximadamente 80 nL, aproximadamente 90 nL, aproximadamente 100 nL, aproximadamente 150 nL, aproximadamente 200 nL, aproximadamente 250 nL, aproximadamente 300 nL, aproximadamente 400 nL, aproximadamente 500 nL, aproximadamente 600 nL, aproximadamente 700 nL, aproximadamente 800 nL, aproximadamente 900 nL, aproximadamente 1 pL, aproximadamente 2 pL, aproximadamente 3 pL, aproximadamente 4 pL, aproximadamente 5 pL, aproximadamente 6 pL, aproximadamente 7 pL, aproximadamente 8 pL, aproximadamente 9 pL o aproximadamente 10 pL.
En algunos ejemplos fuera del alcance de la presente invención, las mediciones de osmolaridad y analito se realizan en un único dispositivo microfluídico, tal como un chip microfluídico. En algunos ejemplos fuera del alcance de la presente invención, el dispositivo microfluídico incluye una pluralidad de regiones de muestra conformadas para recibir un volumen de la muestra de fluido, como ejemplo no limitativo, canales microfluídicos, cámaras y similares. En algunos ejemplos fuera del alcance de la presente invención, las dimensiones de las estructuras microfluídicas varían según se desee. En algunos ejemplos fuera del alcance de la presente invención, los canales microfluídicos, los canales de ensayo o los canales de desbordamiento como se describen en la presente descripción tienen un ancho de canal de aproximadamente 10 pm, aproximadamente 20 pm, aproximadamente 30 pm, aproximadamente 40 pm, aproximadamente 50 pm, aproximadamente 60 pm, aproximadamente 70 pm, aproximadamente 80 pm, aproximadamente 90 pm, aproximadamente 100 pm, aproximadamente 200 pm, aproximadamente 300 pm, aproximadamente 400 pm, aproximadamente 500 pm, aproximadamente 600 pm, aproximadamente 700 pm, aproximadamente 800 pm, aproximadamente 900 pm, o aproximadamente 1 mm. En algunos ejemplos fuera del alcance de la presente invención, la profundidad o altura del canal es de aproximadamente 5 pm, aproximadamente 10 pm, aproximadamente 20 pm, aproximadamente 30 pm, aproximadamente 40 pm, aproximadamente 50 pm, aproximadamente 60 pm, aproximadamente 70 pm, aproximadamente 80 pm, aproximadamente 90 pm, aproximadamente 100 pm, aproximadamente 1500 pm, aproximadamente 200 pm, aproximadamente 250 pm, aproximadamente 300 pm o aproximadamente 400 pm. En algunos ejemplos fuera del alcance de la presente invención, los dispositivos descritos en la presente descripción incluyen un canal capilar para realizar la detección de osmolaridad en un volumen de muestra que tiene un ancho de canal de aproximadamente 300 pm y una profundidad de canal de aproximadamente 75 pm. En algunos ejemplos fuera del alcance de la presente invención, el ancho del canal es la distancia más grande que conecta dos puntos espaciales de un contorno de sección transversal del canal.
En algunos ejemplos fuera del alcance de la presente invención, cada una de las regiones de muestra del dispositivo microfluídico se usan para realizar una función analítica diferente. En algunos ejemplos fuera del alcance de la presente invención, el dispositivo incluye una primera región de muestra que incluye al menos un transductor para medir la osmolaridad y una segunda región de muestra que incluye un sustrato de detección para realizar la detección de analitos. En ejemplos fuera del alcance de la presente invención donde la osmolaridad y la medición del analito se realizan de forma secuencial (como ejemplo no limitativo, la detección de la osmolaridad se realiza antes de la detección del analito), las regiones de muestra están en comunicación fluídica entre sí (como ejemplo no limitativo, conectado por conductos, orificios pasantes u otros elementos fluídicos) para permitir el flujo del volumen de muestra desde la primera región de muestra hacia la segunda región de muestra. En algunos ejemplos fuera del alcance de la presente invención, el flujo se activa mediante varios métodos, que incluyen, pero no se limitan a flujo convectivo, flujo impulsado por presión, absorción, acción capilar, evaporación, disolución o sus combinaciones adecuadas. En algunos ejemplos fuera del alcance de la presente invención, se introduce un segundo fluido, como un fluido de lavado, en el dispositivo microfluídico para desplazar el volumen de muestra y activar el flujo a través del sistema. En algunos ejemplos fuera del alcance de la presente invención, el flujo fluídico de una muestra viaja desde una de la primera y segunda regiones de muestra y luego a la otra región de muestra de la primera y la segunda regiones de muestra.
En algunos ejemplos fuera del alcance de la presente invención, es beneficioso controlar el tiempo y/o la velocidad de flujo entre las diferentes regiones de muestra del dispositivo microfluídico, como ejemplo no limitativo, para asegurar el tiempo suficiente para realizar las mediciones y para facilitar el procesamiento de muestras. En algunos ejemplos fuera del alcance de la presente invención, una medición de osmolaridad requiere de aproximadamente 1-2 segundos para realizarse. En otros ejemplos fuera del alcance de la presente invención, el dispositivo, una medición de osmolaridad requiere aproximadamente de 3 a 10 segundos para realizarse después de que el sistema espera a que se estabilicen las dinámicas de flujo transitorias. En consecuencia, algunos ejemplos fuera del alcance de la presente invención de los dispositivos microfluídicos descritos en la presente descripción incorporan uno o más mecanismos de medición u otros elementos de control de flujo para asegurar que el volumen de muestra se retenga en la región de muestra durante un período de tiempo apropiado y para evitar el flujo prematuro del volumen de muestra a otras regiones.
En una modalidad particular, la Figura 1 ilustra una vista en sección transversal de un dispositivo microfluídico 10 para la detección integrada de osmolaridad y analitos de interés que tiene una válvula pasiva como mecanismo de medición, de acuerdo con algunas modalidades. En la modalidad de la Figura 1, el chip capilar microfluídico 100 se integra en el interior de una cápsula microfluídica 101 que proporciona una forma conveniente de proteger el contenido en el interior durante la manipulación. La cápsula 101 incluye una superficie interior (indicada por la línea discontinua 102) que define una cavidad que recibe uno o más sustratos de detección 103 (como ejemplo no limitativo, sustratos microporosos como nitrocelulosa, almohadillas de conjugado de fibra de vidrio, Fusion 5, materiales Porex, papel, PVDF o similares) y permite que los sustratos se estratifiquen en capas verticalmente durante el ensamble. En algunas modalidades, el interior de la cápsula contiene características elevadas 104 que permiten que un depósito de fluido de transferencia 105 (como ejemplo no limitativo, un blíster) reviente cuando se presiona, como se describe con más detalle a continuación. El adhesivo sensible a la presión 106 se coloca encima de la superficie interior 102 de la cápsula y une el sustrato microporoso tanto a la cápsula 101 como al chip capilar microfluídico 100, que está sellado por un adhesivo hidrófilo sensible a la presión 107. En algunas modalidades, se define un canal capilar 112 entre el adhesivo sensible a la presión 107 y la superficie superior del chip microfluídico 100, de manera que el adhesivo 107 sirve como una pared del canal 112 y la superficie superior del chip 100 sirve como una segunda pared.
En algunas modalidades, el canal capilar 112 sirve como una primera región de muestra en la que se realizan las mediciones de osmolaridad y la cavidad que contiene el sustrato de detección 103 sirve como la segunda región de muestra en la que se realizan las mediciones de analitos. En algunas modalidades, la primera y segunda regiones de muestra del dispositivo 10 se conectan entre sí mediante un conducto continuo o un orificio pasante 114. En algunas modalidades, el conducto 114 incluye una válvula pasiva 108 que sirve como mecanismo de medición para controlar el flujo entre las dos regiones de muestra. Por ejemplo, la válvula pasiva 108 incluye uno o más características geométricas usadas para restringir el flujo de fluido. En algunas modalidades, la válvula pasiva comprende un cambio brusco en el ángulo de la pared lateral a lo largo de una trayectoria fluídica, o una modulación de la hidrofilicidad tal como una franja o región de material sustancialmente hidrófobo encima de una capa generalmente hidrófila. En una modalidad particular como la de la FIG. 1, un ángulo de transición agudo en la geometría de la válvula proporciona una función de medición para los volúmenes de muestra.
Cuando se introduce un volumen de muestra de fluido en el dispositivo 10 a través de la entrada 113 del chip microfluídico 100, fluirá a través del canal 112 hasta que sea detenido por la válvula pasiva 108. En algunas modalidades, la osmolaridad del volumen se determina entonces en el canal 112 mediante el uso de uno o más transductores situados en el canal 112. En algunas modalidades, los electrodos (no mostrados) se incrustan dentro del canal 112 (como ejemplo no limitativo, en la pared del canal definida por el chip 100). En algunas modalidades, los electrodos se estampan sobre la superficie del chip 100, por ejemplo, mediante evaporación del metal y posterior ablación láser, y se usan para determinar cuándo se ha recolectado suficiente fluido de muestra en el canal 112. Adicionalmente, en algunas modalidades, los electrodos en el canal capilar 112 crean un transductor basado en impedancia, de manera que las propiedades energéticas del volumen de muestra se detectan desde dentro del canal capilar 112 para producir una lectura de muestra indicativa de la osmolaridad del fluido de muestra.
En algunas modalidades, una vez que se ha medido la osmolaridad de la muestra, el volumen de la muestra se desplaza desde la primera región de muestra (el canal 112) hacia la segunda región de la muestra para realizar mediciones de analito. Se usa cualquier técnica adecuada para lograr este desplazamiento del volumen de fluido. En algunas modalidades, el depósito 105 se presiona externamente mediante una fuerza de activación (como ejemplo no limitativo, con un pulgar u otro dedo, un tornillo, un elemento fijo que sobresale en una ranura del sistema lector u otro elemento de activación). Esta fuerza permite que el fluido de transferencia fluya a través de los microfluídicos de la cápsula 109 y hacia una entrada vertical (que, en algunas modalidades, se compone por una válvula pasiva adicional) 110 en el chip 100, como ejemplo no limitativo, por flujo impulsado por presión y/o absorción. En algunas modalidades, la introducción del fluido de lavado (como ejemplo no limitativo, aproximadamente 1 pL a aproximadamente 50 pL de volumen) en la primera región de muestra hace que el volumen de muestra pase a través de la válvula pasiva 108 y sobre la región de muestra que contiene el sustrato de detección microporoso 103. En algunas modalidades, la entrada 113 o la entrada vertical 110 incluye una o más válvulas unidireccionales. En algunas modalidades, una o más válvulas son impulsadas por presión fluídica.
En algunas modalidades, a medida que la muestra fluye hacia el extremo distal del sustrato de detección 103 (como ejemplo no limitativo, el lado derecho del sustrato de detección 103 como se muestra en la Figura 1), la muestra interactúa con los reactivos de ensayo dispuestos en o en el sustrato de detección 103 para generar una lectura de muestra indicativa de la concentración de uno o más analitos en el fluido de muestra. En algunas modalidades, al menos una porción del sustrato de detección 103 se expone a través de una ventana 111 en la cápsula 101, que permite de esta manera, la interrogación óptica de los resultados del ensayo de analito. En otras modalidades, el chip 100 y el depósito 105 se ensamblan en un portador separado que luego se encaja o se une de cualquier otra manera a la cápsula. En esta modalidad, el portador separado proporciona canales microfluídicos que permiten que la comunicación fluídica fluya desde el depósito 105, a la entrada vertical 110, a través del canal 112, a través del conducto 114 y la válvula pasiva 108, y al sustrato de detección 103 en lugar de los plásticos de la cápsula.
En una modalidad particular, la Figura 2 ilustra una vista en sección transversal de un dispositivo microfluídico 20 para la detección integrada de osmolaridad y analitos de interés que tiene una válvula activa como mecanismo de medición, de acuerdo con algunas modalidades. Los componentes del dispositivo 20 son generalmente similares a los del dispositivo 10, excepto que el dispositivo 20 incluye una válvula activa como mecanismo de medición para controlar el flujo de fluido, en lugar de una válvula pasiva. En la modalidad de la Figura 2, el chip capilar microfluídico 200 incluye una válvula activa compuesta de elementos activos 202 que restringen y/o detienen el flujo de fluido entre la primera región de muestra (canal capilar 203) y la segunda región de muestra (sustrato de detección 204). En algunas modalidades, los elementos activos 202 se ubican dentro del orificio pasante 201 o dentro del canal capilar 203.
Se usa cualquier tipo adecuado de válvula activa para controlar el flujo de fluido dentro del dispositivo 20. Como ejemplo no limitativo, la válvula activa incluye elementos que obstruyen físicamente el flujo entre la primera y la segunda regiones de muestra, pero se desplaza después de la aplicación de un estímulo o señal para permitir el flujo. Como otro ejemplo, la válvula activa incluye características de modulación de energía superficial que interactúan con el fluido de muestra para reducir o evitar un flujo de fluido sustancial. Como ejemplo no limitativo, los elementos activos 202 incluyen uno o más electrodos que tienen un recubrimiento hidrófobo que impide el flujo de fluido, tal como una monocapa de alcanetiol ensamblada en la superficie (SAM). Por ejemplo, se aplica un campo eléctrico a los electrodos para provocar la electrodisolución de la monocapa superficial de grupos alcanotiol, que hace de esta manera la transición de la energía superficial y que permite que el fluido pase en el momento seleccionado. El voltaje aplicado está dentro de un intervalo de aproximadamente 1 V a aproximadamente 100 V, como dentro de un intervalo de aproximadamente 1 V a aproximadamente 10 V. Otros tipos de elementos activos 202 que son capaces de experimentar una transición de hidrófobo a hidrófilo en respuesta a un estímulo que se usa en otras modalidades.
En algunas modalidades, los elementos de modulación de energía superficial se diseñan para disolverse después de la exposición al fluido de muestra, que permite de esta manera el paso a través de la válvula una vez que ha transcurrido el tiempo suficiente para la disolución. Como ejemplo no limitativo, los elementos activos 202 detienen el flujo durante aproximadamente 1 a 30 segundos antes de disolverse y permitir que el fluido fluya libremente a la segunda región de muestra aguas abajo. Opcionalmente, el dispositivo 20 incluye microcanales adicionales que actúan como respiraderos para permitir que el aire escape mientras fluye el fluido. Estos respiraderos de microcanales se fabrican a partir de materiales hidrófobos o incluyen revestimientos superficiales hidrófobos para evitar que el fluido entre en los respiraderos.
En una modalidad particular, la Figura 3A ilustra una vista en sección transversal de un dispositivo microfluídico 30 para la detección integrada de osmolaridad y analitos de interés que utiliza interacciones de energía superficial para retrasar el flujo de fluido, de acuerdo con algunas modalidades. Los componentes del dispositivo microfluídico 30 son generalmente similares a los de los dispositivos 10 y 20 excepto como se especifica a continuación. De forma similar a los dispositivos 10 y 20, el dispositivo 30 incluye un chip capilar microfluídico 300 y un sustrato de detección 301 dentro de una cápsula microfluídica 302. En algunas modalidades, el chip 300 y el sustrato 301 están sellados y unidos entre sí por una capa de adhesivo sensible a la presión 303. En particular, el sustrato de detección 301 se coloca encima del chip microfluídico 300, en lugar de abajo como en los dispositivos 10 y 20. Un canal capilar 304 se define por la superficie superior del chip 300 y la capa de adhesivo sensible a la presión 303. En algunas modalidades, el chip y el depósito se ensamblan en un portador separado que luego se encaja o se une de cualquier otra manera a la cápsula. En tal modalidad, el portador separado proporciona canales microfluídicos que permiten que la comunicación fluídica fluya desde el depósito, a la entrada vertical, a través del canal, a través del conducto y la válvula pasiva, y sobre el sustrato de detección en lugar de los plásticos de la cápsula. En ciertas modalidades, el portador contiene un depósito microfluídico para retrasar el flujo o proporcionar capacitancia fluídica para atrapar burbujas después del estallido inicial del depósito principal.
En algunas modalidades, el canal 304 sirve como una primera región de muestra para realizar mediciones de osmolaridad del volumen de muestra, mientras que el sustrato de detección 301 sirve como la segunda región de muestra para la detección de analitos, similar a las otras modalidades descritas en la presente descripción. Las regiones de muestra primera y segunda se acoplan de forma fluida a través de un orificio pasante o conducto 305 formado en la capa de adhesivo sensible a la presión 303 por encima de una abertura 306 en el sustrato chip. En algunas modalidades, el conducto 305 y el canal capilar 304 no incluyen válvulas u otros mecanismos de medición para restringir el flujo de fluido. En cambio, el dispositivo 30 usa interacciones de energía superficial del volumen de muestra de fluido con la capa adhesiva 303 para controlar el flujo de fluido entre la primera y la segunda regiones de muestra. En algunas modalidades, la hidrofilicidad y/o hidrofobicidad de la capa adhesiva 303 se ajusta según se desee para lograr el control sobre el flujo de fluido. Como ejemplo no limitativo, la capa adhesiva 303 incluye una capa interior hidrófoba (como ejemplo no limitativo, una capa de PET de 75 pm) situada entre dos capas exteriores hidrófilas (como ejemplo no limitativo, capas de 25 pm). En algunas modalidades, este material adhesivo multicapa ralentiza el flujo del volumen de muestra a través del canal 304 para permitir tiempo suficiente para medir la osmolaridad en el canal 304 y retrasar la entrada de la muestra al sustrato de detección 301 en la segunda región de muestra. Como otras modalidades en la Figura 1 y la Figura 2, los componentes de reacción para la mitad de un ELISA tipo sándwich se secan, se marcan y de cualquier otra manera se inmovilizan (adsorbidos covalentemente, iónicamente, hidrofóbicamente, no específicamente) en el canal 304, en algunas modalidades. En otras modalidades, los componentes de reacción para la mitad de un ELISA tipo sándwich se secan, se marcan o se inmovilizan de cualquier otra manera (adsorbidos covalentemente, iónicamente, hidrofóbicamente, no específicamente) en la abertura 306. En otras modalidades más, los componentes de reacción para la mitad de un ELISA tipo sándwich se secan, se marcan o se inmovilizan de cualquier otra manera (adsorbidos covalentemente, iónicamente, hidrofóbicamente, no específicamente) sobre el sustrato 301. En algunas modalidades, tales componentes de reacción comprenden anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, sitios de unión de anticuerpos biosintéticos, aptámeros, variables de fragmentos de cadena corta y similares. En ciertas modalidades, la segunda mitad de un ELISA tipo sándwich se seca, se marca o se inmoviliza de cualquier otra manera (covalentemente, iónicamente, hidrofóbicamente, no específicamente) dentro del canal 304, la abertura 306 o el sustrato 301. Los marcadores apropiados como colorantes fluorescentes, nanopartículas, enzimas, electroquimioluminiscentes, quimioluminiscentes, HCR, nanoesferas luminiscentes, nanopartículas reflectantes, marcadores redox, estreptavidina, avidina, neutravidina, biotina, colorantes quelatados de europio, fósforos de conversión ascendente, sistemas FRET, marcadores plasimónicas, etc. acompañan la mitad de detección del ELISA tipo sándwich, en algunas modalidades.
Reactivos, configuraciones de sustrato y métodos ilustrativos no limitativos para fabricar y usar sustratos para detectar la presencia y/o concentración de analitos de interés se encuentran, por ejemplo, en las patentes de Estados Unidos Núms.
6,319,676; 5,141,850; 5,602,040; 5,656,503; 5,714,389; 5,591,645; 5,989,921; 6,319,676; 6,485,982; 7,763,454; y la solicitud de patente de Estados Unidos publicada Núm. US2015/0017068. Las patentes de Estados Unidos Núms.
5,714,389; 5,989,921 y 6,485,982 describen sustratos de ensayo en los que un analito de interés se captura directamente en una región de prueba mediante un aglutinante inmovilizado por el analito (como ejemplo no limitativo, un anticuerpo anti-analito) inmovilizado en la región de prueba. En este enfoque, el analito unido a un segundo aglutinante marcado por el analito (como ejemplo no limitativo, un segundo anticuerpo anti-analito) en forma de "medio sándwich" se une en la región de prueba. Las patentes de Estados Unidos Núms. 6,319,676 y 5,141,850 describen sustratos de ensayo en los que un analito de interés se captura indirectamente en la región de prueba a través de un aglutinante inmovilizado (como ejemplo no limitativo, avidina o estrepatavidina) que se une a un aglutinante asociado (biotina) acoplado covalentemente a un aglutinante por el analito de interés (como ejemplo no limitativo, un anticuerpo anti-analito). En este enfoque, un "sándwich completo" que comprende un complejo de una molécula aglutinante capturable (como ejemplo no limitativo, un anticuerpo anti-analito biotinilado) molécula aglutinante detectable por analito (como ejemplo no limitativo, un anticuerpo anti-analito marcado) se forma cuando el fluido atraviesa el sustrato y luego se captura en la región de prueba a través de una molécula aglutinante (como ejemplo no limitativo, avidina o estreptavidina) que se une a la molécula aglutinante capturable.
En varios ejemplos fuera del alcance de la presente invención, el dispositivo 10, 20 o 30 en las Figuras 1, 2 y 3A omite la primera región de muestra y solo contiene la segunda región de muestra, como ejemplo no limitativo, cuando se desea la detección de un analito y/o la medición de la concentración de uno o más analitos. En estas modalidades, la segunda región de muestra se denomina región de procesamiento de muestra. En algunos ejemplos fuera del alcance de la presente invención, el dispositivo que se describe en la presente descripción incluye solo la segunda región de muestra. En otros ejemplos fuera del alcance de la presente invención, el volumen de muestra a examinar se impulsa directamente desde una entrada y/o una entrada vertical a la segunda región de muestra antes de viajar a la primera región de muestra. En ejemplos alternativos fuera del alcance de la presente invención, el volumen de muestra viaja a la primera región de muestra y luego a la segunda región de muestra.
En una modalidad particular, las Figuras 3B y 3C ilustran resultados de flujo ilustrativos obtenidos mediante el uso de un dispositivo microfluídico que implementa un mecanismo de retraso de flujo basado en energía superficial, similar al dispositivo 30 de la Figura 3A. La Figura 3B ilustra el flujo retrasado de un fluido de muestra que contiene colorante alimentario rojo en una membrana microporosa (una membrana de nitrocelulosa modelada) que actúa como la segunda región de muestra. Dicha estructura permite que el flujo capilar impulse la reacción aguas abajo, ya que el flujo impulsado por presión es absorbido por la gran área de papel, absorbido por el canal lateral de la membrana y luego gira para ejecutar un ensayo cromatográfico. La Figura 3C es un gráfico que ilustra la relación entre el diámetro del orificio pasante y el tiempo de retraso antes de humedecer el sustrato microporoso. Cuando el diámetro del orificio es de 200 pm, se observa una gran variabilidad en el tiempo de retraso, que varía desde aproximadamente 0 segundos hasta aproximadamente 60 segundos. Sin embargo, la variabilidad es menor para dispositivos con diámetros de orificio de 300 pm y 400 pm, que presentan tiempos de retraso de aproximadamente 10 segundos. En la modalidad de la Figura 3B, la abertura del sustrato chip tiene aproximadamente 300 pm de diámetro, lo que sugiere que la relación ideal entre el diámetro del orificio pasante del adhesivo sensible a la presión y el diámetro de la abertura del sustrato chip está en un intervalo de aproximadamente 0,5:1 a aproximadamente 2:1.
En una modalidad particular, las Figuras 4A y 4B ilustran un dispositivo microfluídico 40 para la detección integrada de osmolaridad y analitos de interés que tiene una válvula pasiva, de acuerdo con algunas modalidades. En la modalidad de la Figura 4A, que ilustra una vista despiezada del dispositivo 40, el chip capilar microfluídico 400 se ensambla en capas con un adhesivo hidrófilo sensible a la presión 401 que forma una superficie del canal capilar inferior, una capa adhesiva sensible a la presión de doble cara 403 que sella los microfluidos 404 en la superficie superior del chip 400. La capa 403 de doble cara se extiende hasta los orificios de entrada de fluido y salida de aire 405, que aceptan fluido de lavado y permiten que escape el aire, respectivamente. Un sustrato de detección 406 (como ejemplo no limitativo, una membrana o sustrato microporoso), que actúa como la segunda región de muestra, se sella a presión contra el adhesivo sensible a la presión de doble cara 403. La Figura 4B muestra una vista en sección transversal del dispositivo microfluídico 40 ensamblado, en la que son visibles detalles de la válvula pasiva 407, la entrada de fluido 408 y el canal capilar 409. En algunas modalidades, el canal capilar 409 sirve como la primera región de muestra para analizar la osmolaridad, y el sustrato de detección 406 sirve como la segunda región de muestra para detectar uno o más analitos de interés. En algunas modalidades, se recolecta un volumen de muestra en el canal capilar 409 de la primera región de muestra y la válvula pasiva 407 impide que fluya hacia la segunda región de muestra mediante los mecanismos descritos anteriormente. En algunas modalidades, después de la introducción de fluido de lavado en el canal 409 a través de la entrada de lavado 408, el volumen de muestra se desplaza desde el canal 409 hacia el sustrato de detección 406 de la segunda región de muestra.
En una modalidad particular, la Figura 5A ilustra una vista superior (izquierda) y una vista inferior (derecha) de un dispositivo microfluídico 50 ensamblado para la detección integrada de osmolaridad y analitos de interés, de acuerdo con algunas modalidades. De manera similar a las otras modalidades proporcionadas en la presente descripción, el dispositivo 50 incluye una cápsula microfluídica 500 y un chip microfluídico 501. La cápsula 500 incluye una ventana 502 a través de la cual es visible una porción del sustrato de detección 503 (como ejemplo no limitativo, un sustrato microporoso). En algunas modalidades, el sustrato 503 se dispone de manera que la lectura de un ensayo de flujo lateral u otro ensayo de detección de analitos se observe a través de la ventana 502 (como ejemplo no limitativo, por un usuario o un dispositivo de detección como un sistema lector). En algunas modalidades, el dispositivo 50 también incluye un depósito de fluido 504 (como ejemplo no limitativo, un blister que contiene un volumen de fluido que se usa, como ejemplos no limitativos, como fluido de transferencia, fluido de lavado y/o un fluido de hidratación) que se activa mecánicamente para liberar un volumen de fluido para desplazar la muestra de fluido que se prueba desde los canales capilares del chip microfluídico 501 al sustrato de detección 503, como se describió previamente. En la modalidad de la Figura 5A, la superficie exterior del blíster está expuesta. En algunas modalidades, el blíster está sustancialmente cubierto excepto por un pequeño orificio para permitir su activación. En algunas modalidades, se usa una configuración del blíster para evitar que un usuario acceda al blíster para minimizar el potencial de activación accidental y rotura. La Figura 5B muestra una modalidad de un dispositivo microfluídico ensamblado para la detección combinada de osmolaridad y analitos de interés, o la detección separada de osmolaridad y analitos de interés. En esta modalidad particular, la funda integrada 505 protege la punta del chip microfluídico, la ventana y el sustrato de detección, y la funda integrada 505 se retira una vez que el dispositivo se coloca en un dispositivo tipo bolígrafo y está listo para la prueba. El depósito 506 del blíster está protegido de la interacción del usuario por la cápsula (carcasa), pero el orificio 507 de la cápsula/carcasa permite que un émbolo (no mostrado, como ejemplo no limitativo, un émbolo del tamaño adecuado externo al dispositivo microfluídico 50) reviente el blíster y proporciona un flujo impulsado por presión a través de la red de microfluidos dentro del portador 508, que se acopla al chip de osmolaridad microfluídico 509 a través del adhesivo sensible a la presión 510. En algunas modalidades, las alas de la cápsula 511 y las pestañas 512 proporcionan elementos de acoplamiento mecánico para el bolígrafo opuesto, mientras que los elementos de agarre 513 permiten al usuario agarrar y manipular fácilmente el dispositivo como un todo.
Las modalidades mencionadas anteriormente permiten, en algunas modalidades, cuantificar tanto la osmolaridad como otros analitos de interés en la misma plataforma con un mínimo de interacción del usuario. En algunas modalidades, los dispositivos microfluídicos descritos en la presente descripción se proporcionan en varios formatos diferentes para facilitar la recolección de muestras y la lectura de los resultados de las mediciones. Como ejemplo no limitativo fuera del alcance de la presente invención, el dispositivo microfluídico se proporciona como una unidad desechable que se usa junto con un dispositivo tipo bolígrafo. En algunos ejemplos fuera del alcance de la presente invención, el dispositivo tipo bolígrafo se configura para recibir y acoplar un dispositivo microfluídico. En algunos ejemplos fuera del alcance de la presente invención, el dispositivo tipo bolígrafo valida el dispositivo microfluídico y le indica al usuario que el dispositivo microfluídico no se ha utilizado y está listo para tomar muestras. En algunos ejemplos fuera del alcance de la presente invención, el usuario quita una funda protectora que mantiene limpia la punta de muestreo y usa la punta de muestreo para recolectar lágrimas de un paciente (como ejemplo no limitativo, de un solo ojo o de ambos ojos).
En algunos ejemplos fuera del alcance de la presente invención, los sistemas, dispositivos y métodos como se describen en la presente descripción incluyen una unidad base. En algunas modalidades, la unidad base se une de forma reversible al dispositivo microfluídico. En otros ejemplos fuera del alcance de la presente invención, la unión reversible es una o más seleccionadas de: una unión mecánica, una comunicación fluídica y una comunicación eléctrica o electrónica. En algunas modalidades, una vez que se completa la recolección de la muestra, el dispositivo tipo bolígrafo y el dispositivo microfluídico acoplado se acoplan luego a una unidad base (como ejemplo no limitativo, un dispositivo lector) que activa automáticamente cualquier válvula activa para permitir la liberación y el flujo del fluido de lavado, y luego realiza el ensayo de detección de analitos y/o genera una lectura de las lecturas de muestra registradas. En otras modalidades, una vez que se completa la recolección de la muestra, el dispositivo tipo bolígrafo y el dispositivo microfluídico acoplado se acoplan a una unidad base (como ejemplo no limitativo, un dispositivo lector) que baja automáticamente un émbolo para finalmente reventar un blíster, lo que permite la liberación y el flujo de un fluido de transferencia a través del circuito microfluídico, y luego realiza el ensayo de detección de analito y/o genera una lectura de las lecturas de muestra registradas. En algunos ejemplos fuera del alcance de la presente invención, el usuario retira el dispositivo microfluídico del dispositivo tipo bolígrafo después de la recolección de lágrimas y coloca el dispositivo microfluídico en la unidad base, que luego realiza automáticamente la activación y muestra los resultados de la lectura de la muestra. En estas modalidades, el dispositivo tipo bolígrafo comunica la lectura de osmolaridad registrada a la unidad base (como un ejemplo no limitativo, mediante el uso de métodos de comunicación inalámbrica) mientras que la unidad base lleva a cabo el ensayo de analitos de interés. Dado el gran número de analitos que pueden ser interrogados por este sistema, en algunas modalidades, el dispositivo microfluídico desechable contiene marcas, como un código de barras o un código de barras bidimensional, que permiten que la unidad base reconozca los parámetros relevantes del ensayo (como un ejemplo no limitativo, tiempo, intensidad, longitudes de onda de excitación, longitudes de onda de emisión o número de analitos) y realizar los procedimientos de ensayo apropiados. En ejemplos alternativos fuera del alcance de la presente invención, el propio dispositivo microfluídico proporciona una lectura óptica semicuantitativa o cualitativa de los analitos de interés que el usuario lee directamente.
En algunos ejemplos fuera del alcance de la presente invención, los dispositivos tipo bolígrafo incluyen mecanismos para detectar y enviar una señal al usuario una vez que se ha recolectado un volumen suficiente de fluido lagrimal (como ejemplo no limitativo, señales audibles que incluyen pitidos o similares, señales visuales que incluyen luces o similares, señales hápticas que incluyen vibraciones o similares). En algunas modalidades, el usuario luego retira el dispositivo microfluídico desechable, presiona manualmente el blíster para liberar el fluido del blíster y luego acopla el dispositivo microfluídico en la unidad base para su análisis.
Los sistemas, dispositivos y métodos como se describen en la presente descripción son compatibles con una amplia variedad de formatos de ensayo. El ejemplo no limitativo de ensayo incluye uno o más seleccionados de: un ensayo basado en un ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA), un ELISA tipo sándwich, un ELISA competitivo, una detección basada en nanopartículas, una detección basada en resonancia de plasmón de superficie (SPR), una detección electroquímica, una detección cromatográfica, ensayos de un flujo continuo, un flujo lateral y similares. En algunos ejemplos fuera del alcance de la presente invención, el sustrato microporoso sirve para capturar el fluido de lavado mientras se realiza la reacción de ensayo dentro del canal capilar. Como ejemplo no limitativo, en ciertas modalidades, tanto la impedancia indicativa de osmolaridad como una medición de impedancia diferencial se realizan a medida que las nanopartículas se acumulan en una matriz de electrodos interdigitados dentro del canal capilar, en comparación con una matriz de electrodos interdigitados aguas arriba con anticuerpos no específicos unidos. En otros ejemplos fuera del alcance de la presente invención, tanto la impedancia (osmolaridad) como una medición electroquímica se realizan dentro del canal capilar. En modalidades alternativas, se realiza una medición de impedancia indicativa de osmolaridad dentro del canal capilar y el sustrato microporoso actúa como sustrato de flujo lateral para permitir la detección fluorescente.
En algunos ejemplos fuera del alcance de la presente invención, los sustratos proporcionados en la presente descripción tienen formas geométricas para aumentar la homogeneización del flujo sobre la región de muestra para minimizar los efectos de la falta de homogeneidad del sustrato (como un ejemplo no limitativo, de la variación de fabricación, anisotropías locales en la densidad del sustrato), obstrucción (como ejemplo no limitativo, debido a materia de partículas y reticulación biológica que se acumula dentro de los poros del sustrato) y/u otras fuentes de anisotropía fluídica. En algunas modalidades, las geometrías se diseñan para generar regiones predeterminadas de mayor resistencia al flujo en el sustrato de detección. Al aprovechar la resistencia al flujo de esta manera, los retrasos cronometrados, la expansión del flujo predecible y/o la contracción del flujo se pueden usar para asegurar que cualquier nanopartícula o reticulación biológica que de cualquier otra manera pueda causar obstrucción y humedecimiento no uniforme de las regiones de muestra, se reduzcan o se eliminen. En algunos ejemplos fuera del alcance de la presente invención, de manera similar, los sustratos tienen una forma operativa para fomentar la transferencia de fluido desde el canal capilar a al menos una región específica de una membrana, mientras que simultáneamente se fomenta que el desbordamiento impulsado por presión se absorba en lugar de ingresar a la segunda región de muestra. En algunos ejemplos fuera del alcance de la presente invención, al menos una región específica es la primera o la segunda región de muestra. En otros ejemplos fuera del alcance de la presente invención, los sustratos tienen una forma operativa para permitir que el fluido de transferencia fluya preferentemente aguas abajo antes de los componentes de reacción de un ELISA para hidratar los anticuerpos de captura incrustados, ya que pequeños volúmenes de fluido lagrimal pueden ser insuficientes para rehidratar los componentes de alta resistencia de anticuerpo dentro de una membrana de nitrocelulosa en el momento en que el bolo de lágrima ha pasado por la primera región de muestra.
Las Figuras de la 6A a la 6E ilustran sustratos de detección ilustrativos con geometrías para lograr un frente de fluido sustancialmente isótropo (uniforme) cuando el fluido atraviesa la segunda región de muestra en la dirección del flujo, de acuerdo con muchas modalidades. Las Figuras de la 6F a la 6G muestran ejemplos no limitativos de distribuciones aguas abajo de nanopartículas anisotrópicas no homogéneas como resultado directo de las condiciones iniciales de la distribución de nanopartículas aguas arriba y el flujo no modificado resultante. Específicamente, la Figura 6F muestra cómo las nanopartículas marcadas en la línea central (en la parte inferior de la figura) fluyen verticalmente aguas arriba mientras se enfocan en un camino central por el fluido que se mueve más rápido que evita que las nanopartículas alcancen los bordes de la región de captura rayada. La Figura 6G muestra el ejemplo opuesto, donde las nanopartículas marcadas a lo ancho de la franja se empujan hacia los bordes, lo que genera una señal solo en los bordes exteriores de la región de captura rayada. En consecuencia, la Figura 6A muestra un patrón que enfoca el flujo hacia el medio ya que hay menos resistencia que en los bordes largos del patrón, lo cual es útil cuando se detectan nanopartículas en franjas a lo largo de todo el ancho de la membrana: dado que las nanopartículas agregan resistencia a la trayectoria del fluido, una franja aguas arriba de nanopartículas horizontales tiende a hacer que el fluido fluya preferentemente por el medio y deposite las nanopartículas en los bordes lejanos de la franja, por lo tanto, enfocar el flujo hacia el medio ayuda a crear un perfil de flujo más uniforme. La Figura 6b muestra una modalidad particular de un diseño útil para empujar el fluido hacia los bordes, para compensar cuando las nanopartículas se marcan (o se transfieren a la membrana) por la mitad. Las Figuras de la 6C a la 6D muestran ejemplos no limitativos de diferentes tipos de estructuras de control de flujo, incluidas constricciones, expansiones y resistencias aguas abajo que hacen que el flujo sea más uniforme al cambiar la resistencia de la sección transversal. Además, estas estructuras de las Figuras 6C-D cuenta con resistencia aguas abajo que ayuda a equilibrar y evitar que inestabilidades aleatorias cambien el flujo de un lado de la membrana al otro. Estos enfoques son bastante importantes al analizar pequeños volúmenes de muestra, ya que el frente de flujo de la muestra puede no permitir el transporte uniforme de moléculas detectables a través del canal de fluido o una zona de detección sin guía, ya que muchas veces las moléculas detectables introducen una resistencia que cambia con el tiempo y el espacio a medida que la muestra fluye a través de la membrana, especialmente si las moléculas detectables usan nanopartículas como marcadores.
Con respecto a las Figuras de la 6A a la 6E, en algunos ejemplos fuera del alcance de la presente invención, los sustratos de detección son membranas microporosas o sustratos microporosos, como se discutió anteriormente. En algunos ejemplos fuera del alcance de la presente invención, los sustratos incluyen una o más geometrías diseñadas para producir restricciones de flujo. Dichas geometrías se fabrican mediante varios métodos, como ejemplos no limitativos, perforación, calentamiento, marcado, deposición de cera, deposición de anticuerpos u otras proteínas, unión covalente de polímeros de alta resistencia o compuestos inorgánicos, o modelado por láser. En la representación de las Figuras de la 6A a la 6E, el flujo de fluido se diseña para hacer que el volumen de muestra migre a través del sustrato (de abajo hacia arriba) para aprovechar los efectos de la región de entrada y las expansiones del flujo después de una restricción para aumentar la homogeneización del flujo. Por ejemplo, el sustrato de la Figura 6A incluye una serie de aberturas alargadas paralelas cerca de la mitad del sustrato. Las longitudes de las aberturas disminuyen cuando se mueven desde los bordes del sustrato hacia el centro. El sustrato de la Figura 6B es similar al de la Figura 6A, excepto que las longitudes de las aberturas aumentan cuando se mueven desde los bordes del sustrato hacia el centro. El sustrato de la Figura 6C incluye una pluralidad de pequeñas aberturas dispuestas en un patrón de rejilla. El sustrato de la Figura 6D tiene forma de reloj de arena, de manera que la porción central del sustrato es significativamente más estrecha que los extremos. El sustrato de la Figura 6E incluye una abertura de forma ovalada en la porción del centro, de manera que el extremo superior del sustrato está unido al extremo inferior del sustrato por dos franjas de material relativamente estrechas.
Ciertos fuera del alcance de la presente invención, en la presente descripción también se prestan al enfoque de flujo para permitir regiones de muestra paralelas dentro de cada membrana. Fuera del alcance de la presente invención de las Figuras 6D y 6E incluyen una serie de canales paralelos en la porción superior del sustrato que son susceptibles de procesamiento de muestras en paralelo. En algunos fuera del alcance de la presente invención, estos canales se diseñan para aprovechar la mayor homogeneización del flujo que se produce después de que el volumen de muestra pasa de las regiones restringidas a las regiones expandidas del sustrato.
En algunos fuera del alcance de la presente invención, los volúmenes de fluido usados son extremadamente pequeños, como se discutió anteriormente. En otras modalidades, los volúmenes de fluido incluyen uno o más seleccionados de: un volumen de fluido de muestra, un volumen de fluido de lavado y un volumen de fluido de transferencia. En consecuencia, en varias modalidades, se integran una o más características adicionales en el canal capilar y/o el sustrato de detección para controlar el flujo y medir con precisión la muestra. Un ejemplo no limitativo de tal característica son los cambios de alta frecuencia espacial en la energía de la superficie dentro del canal capilar, que se sabe que actúan como reductores de velocidad que cambian la forma del menisco que retrocede durante la evaporación y ralentizan efectivamente el movimiento del volumen de fluido. De manera similar, en algunos fuera del alcance de la presente invención, los canales en forma de serpentina u otros retrasos se modelan en el sustrato de detección para modular la sincronización del ensayo y mejorar la sensibilidad del ensayo (como ejemplo no limitativo, un flujo más lento da como resultado tiempos de reacción más largos en las regiones de muestra).
En un ejemplo particular fuera del alcance de la presente invención, la Figura 7 ilustra fuera del alcance de la presente invención patrones de sustrato de detección que efectúan retrasos de sincronización del fluido, de acuerdo con muchos fuera del alcance de la presente invención. En algunos fuera del alcance de la presente invención, los sustratos de detección son membranas microporosas o sustratos microporosos, como se discutió anteriormente. En algunas modalidades, las geometrías de los sustratos de detección se diseñan para influir en la duración del retraso de tiempo, que proporciona de esta manera control sobre varios parámetros de ensayo. Por ejemplo, los sustratos 700, 701, 702 y 703 exhiben cantidades decrecientes de estructuras de canales en forma de serpentina, con el sustrato 700 que tiene la mayoría de las estructuras en forma de serpentina y el sustrato 703 que no tiene estructuras en forma de serpentina. La cantidad de estructuras en forma de serpentina en el sustrato influye en la cantidad en la que se retrasa el flujo de fluido a través del sustrato, como lo demuestran las diferentes extensiones en las que los frentes de colorante 704, 705, 706, 707 han progresado a través de sus respectivos sustratos 700, 701, 702 y 703. En particular, el sustrato 700 altamente en forma de serpentina exhibe el mayor retraso de tiempo del flujo de fluido, mientras que el sustrato lineal 703 exhibe el menor retraso del flujo de fluido.
En un ejemplo particular fuera del alcance de la presente invención, la Figura 8 ilustra un ejemplo preferido fuera del alcance de la presente invención de un polímero de nitrocelulosa microporoso 800 (línea discontinua) unido a un chip microfluídico de policarbonato con electrodos de impedancia integrados. En esta modalidad, después de la recolección de nanolitros de fluido lagrimal en la punta, se analiza primero del fluido lagrimal la osmolaridad lagrimal como se muestra en la Figura 8A. En el mismo ejemplo fuera del alcance de la presente invención, la activación posterior de un depósito de blíster a través de un émbolo impulsado por un motor paso a paso controlado por un ordenador (no mostrado) crea un pulso de aire que empuja la lágrima del canal de recolección 801 más allá de la válvula pasiva 802 (válvula de ventilación), sobre la membrana de nitrocelulosa microporosa, que está modelada con una estructura de lengüeta 803 (que desciende sustancialmente en la parte superior de la válvula pasiva 802) como se muestra en la Figura 8B. La Figura 8C muestra la muestra de lágrima 804 completamente adsorbida por la membrana microporosa después de la activación inicial del depósito de blíster, pero antes de reventar. En esta modalidad particular, mientras se espera el estallido del blister y el flujo de tampón en funcionamiento para impulsar el ensayo en la Figura 8D, la muestra de lágrima se incuba con el complejo detector que comprende nanopartículas de quelato de Europio fluorescentes funcionalizadas con anticuerpo (mostradas bajo iluminación ultravioleta (UV) con un filtro rojo de paso largo). Después de la ruptura del blíster, el tampón viaja a través del microcanal 805, baja a través de la válvula de punta 806, regresa a través del canal 801, sube a través de la válvula de ventilación 802, hacia la lengüeta 803, lo que desencadena de esta manera el flujo del complejo de nanopartículas/lágrimas reaccionado sobre la segunda región de muestra 807, como se muestra en la Figura 8E. En este ejemplo fuera del alcance de la presente invención, el tampón se acumula encima de la válvula de ventilación y la lengüeta mientras suministra la reacción de flujo lateral, que crea una cúpula de fluido 808, ilustrada por el reflejo en el lente de las cuatro luces de iluminación. En este ejemplo fuera del alcance de la presente invención, el sustrato microporoso está modelado con canales de desbordamiento 809, adyacentes a la válvula 802. En algunas modalidades, los canales de desbordamiento 809 ayudan a mitigar el riesgo de que la cúpula de fluido se acumule y supere el ensayo de flujo lateral, que proporciona una trayectoria de cortocircuito para que el fluido se mueva sobre la membrana en lugar de a través de la membrana. La Figura 8F muestra el resultado del ensayo completo en el que el bolo inicial del complejo 810 de nanopartículas/lágrimas reaccionadas se ha extendido para coincidir con el contorno de la estructura de la membrana microporosa. En algunas modalidades, el grosor del bolo 810 se controla por la concentración inicial, distribución, densidad de carga, estado de reticulación y volumen de las nanopartículas marcadas sobre la membrana microporosa. En algunos ejemplos fuera del alcance de la presente invención, al configurar la segunda región de muestra para interrogar sólo un subconjunto del volumen total disponible, el ensayo hace que la intensidad de la marca 811 sea relativamente independiente del volumen. En algunas modalidades, dentro de los límites de linealidad del ensayo, cuanto mayor es la concentración de analito en la lágrima, mayor es la intensidad de la marca 811, y cuanto menor es la concentración, menor es la intensidad.
La Figura 9 ilustra un polímero de nitrocelulosa 900 (línea discontinua) unido a un chip microfluídico de policarbonato 901 con electrodos de impedancia integrados como se muestra en la Figura 9A. Después de la recolección de nanolitros de fluido lagrimal en la punta 902 más a la izquierda, el fluido lagrimal se analiza primero para determinar la osmolaridad lagrimal en el canal 903 de la Figura 9B. La activación posterior de un depósito de blíster a través de un émbolo impulsado por un motor paso a paso controlado por ordenador (no mostrado) crea un pulso de aire que viaja por el canal 904, a través de la válvula de punta 905, empuja la lágrima desde más allá de la válvula de ventilación pasiva 906, y hacia la membrana microporosa, que está modelada con una estructura de lengüeta 907 (que se presiona sustancialmente en la parte superior de la válvula de ventilación por una protuberancia de dedo de policarbonato que emana hacia abajo desde la parte superior de la carcasa de plástico del portador no se muestra), lo que da como resultado la transferencia de muestra inicial como se muestra en la Figura 9C. En este ejemplo particular fuera del alcance de la presente invención mostrado en la Figura 9, las nanopartículas queladas con Eu funcionalizadas con anticuerpo se incluyen en la válvula de ventilación 906 antes de ejecutar el ensayo, en lugar de en la membrana de nitrocelulosa, que permiten que la lágrima y las nanopartículas se incuben mientras están en el canal de recolección. Como se evidencia en la Figura 9C, Los anticuerpos 908 de captura marcados, multiplexados, crean una resistencia fluídica que evita que pequeños volúmenes de nanolitros de fluido rehidraten eficazmente la región de muestra. Esto también se ve en la Figura 9D bajo iluminación ultravioleta con filtro rojo, donde el brillo de las nanopartículas 909 se excluye efectivamente de las marcas de anticuerpos de captura. Dado que la totalidad de la señal del analito de interés se contiene dentro del bolo inicial de fluido, la constricción fluídica aguas abajo 910 crea un aumento en la resistencia aguas abajo que hace que la muestra de líquido fluya preferentemente a través de las marcas de captura en lugar de alrededor de las marcas de captura, como las marcas de captura tienen ahora una resistencia menor que a través del centro del canal, lo que facilita el ensayo cromatográfico donde las nanopartículas fluyen sobre el anticuerpo de captura, como se muestra en la Figura 9E. Un resultado multiplexado 911 se ve en la Figura 9F, como resultado del inmunoensayo en sándwich que capturó una serie de analitos de interés unidos al complejo de detección dentro del fluido de muestra a medida que pasaba. Además, los canales de desbordamiento 912 que rodean el canal de ensayo absorben el exceso de fluido para evitar que una cúpula de tampón fluya sobre la parte superior del sustrato microporoso y proporcione al tampón en funcionamiento una trayectoria de menor resistencia que no sea a través de la segunda región de muestra.
En algunos ejemplos fuera del alcance de la presente invención, dos elementos seleccionados de los siguientes están en comunicación fluida entre sí: un canal capilar, un sustrato de detección, un sustrato microporoso, una cápsula, un chip capilar, una cavidad definida por una pared interior de una cápsula, un depósito, un conducto conectado de forma fluida al sustrato de detección, una válvula, una entrada vertical y una entrada.
En algunos ejemplos fuera del alcance de la presente invención, los sistemas, dispositivos y métodos que se describen en la presente descripción incluyen un blíster o el uso del mismo. En algunos ejemplos fuera del alcance de la presente invención, el blíster incluye al menos un volumen cerrado y sellado configurado para contener un volumen de fluido en su interior. En algunos ejemplos fuera del alcance de la presente invención, el volumen de fluido cerrado dentro del blíster se libera de una manera predeterminada cuando se aplica un elemento de activación del blíster. En algunos ejemplos fuera del alcance de la presente invención, el elemento de activación es externo o dentro de los dispositivos, sistemas como se describe en la presente descripción. En algunos ejemplos fuera del alcance de la presente invención, el volumen de fluido dentro del blíster es suficiente para lavar la primera región de muestra, la segunda región de muestra o uno o más de los elementos dentro del dispositivo o sistema como se describe en la presente descripción. En algunos ejemplos fuera del alcance de la presente invención, el volumen de fluido dentro del blíster es suficiente para transferir el fluido de muestra a la primera región de muestra, la segunda región de muestra o uno o más de los elementos dentro del dispositivo o sistema como se describe en la presente descripción de modo que el sistema o dispositivo genera una primera lectura de muestra válida o una segunda lectura de muestra válida basada en la muestra de fluido transferida de esta manera. En algunos ejemplos fuera del alcance de la presente invención, el volumen de fluido dentro del blíster está dentro de un intervalo de aproximadamente 10 nL a aproximadamente 50 pL, o dentro de un intervalo de aproximadamente 50 nL a 500 nL. En algunos ejemplos fuera del alcance de la presente invención, el volumen de fluido está dentro de un intervalo entre dos de los siguientes: aproximadamente 10 nL, aproximadamente 20 nL, aproximadamente 30 nL, aproximadamente 40 nL, aproximadamente 50 nL, aproximadamente 60 nL, aproximadamente 70 nL, aproximadamente 80 nL, aproximadamente 90 nL, aproximadamente 100 nL, aproximadamente 150 nL, aproximadamente 200 nL, aproximadamente 250 nL, aproximadamente 300 nL, aproximadamente 400 nL, aproximadamente 500 nL, aproximadamente 600 nL, aproximadamente 700 nL, aproximadamente 800 nL, aproximadamente 900 nL, aproximadamente 1 jiL, aproximadamente 2 jiL, aproximadamente 3 jiL, aproximadamente 4 jiL, aproximadamente 5 jiL, aproximadamente 6 jiL, aproximadamente 7 jiL, aproximadamente 8 jiL, aproximadamente 9 jiL, aproximadamente 10 jiL, aproximadamente 11 jiL, aproximadamente 12 jiL, aproximadamente 13 jiL, aproximadamente 14 jiL, aproximadamente 15 jiL, aproximadamente 16 jiL, aproximadamente 17 jiL, aproximadamente 18 jiL, aproximadamente 19 jiL, aproximadamente 20 jiL, aproximadamente 21 jiL, aproximadamente 22 jiL, aproximadamente 23 jiL, aproximadamente 24 jiL, aproximadamente 25 jiL, aproximadamente 26 jiL, aproximadamente 27 jiL, aproximadamente 28 jiL, aproximadamente 29 jiL, aproximadamente 30 jiL, aproximadamente 31 jiL, aproximadamente 32 jiL, aproximadamente 33 jiL, aproximadamente 34 jiL, aproximadamente 35 jiL, aproximadamente 36 jiL, aproximadamente 37 jiL, aproximadamente 38 jiL, aproximadamente 39 jiL, aproximadamente 40 jiL, aproximadamente 41 jiL, aproximadamente 42 jiL, aproximadamente 43 jiL, aproximadamente 44 jiL, aproximadamente 45 jiL, aproximadamente 46 jiL, aproximadamente 47 jiL, aproximadamente 48 jiL, aproximadamente 49 jiL o aproximadamente 50 jiL. En algunas modalidades, el volumen de fluido no es más de aproximadamente 20 jiL, aproximadamente 250 nL, aproximadamente 200 nL o aproximadamente 50 nL. El volumen de fluido no es más de aproximadamente 10 nL, aproximadamente 20 nL, aproximadamente 30 nL, aproximadamente 40 nL, aproximadamente 50 nL, aproximadamente 60 nL, aproximadamente 70 nL, aproximadamente 80 nL, aproximadamente 90 nL, aproximadamente 100 nL, aproximadamente 150 nL, aproximadamente 200 nL, aproximadamente 250 nL, aproximadamente 300 nL, aproximadamente 400 nL, aproximadamente 500 nL, aproximadamente 600 nL, aproximadamente 700 nL, aproximadamente 800 nL, aproximadamente 900 nL, aproximadamente 1 jiL, aproximadamente 2 jiL, aproximadamente 3 jiL, aproximadamente 4 jiL, aproximadamente 5 jiL, aproximadamente 6 jiL, aproximadamente 7 jiL, aproximadamente 8 jiL, aproximadamente 9 jiL, aproximadamente 10 jiL, aproximadamente 11 jiL, aproximadamente 12 jiL, aproximadamente 13 jiL, aproximadamente 14 jiL, aproximadamente 15 jiL, aproximadamente 16 jiL, aproximadamente 17 jiL, aproximadamente 18 jiL, aproximadamente 19 jiL, aproximadamente 20 jiL, aproximadamente 21 jiL, aproximadamente 22 jiL, aproximadamente 23 jiL, aproximadamente 24 jiL, aproximadamente 25 jiL, aproximadamente 26 jiL, aproximadamente 27 jiL, aproximadamente 28 jiL, aproximadamente 29 jiL, aproximadamente 30 jiL, aproximadamente 31 jiL, aproximadamente 32 jiL, aproximadamente 33 jiL, aproximadamente 34 jiL, aproximadamente 35 jiL, aproximadamente 36 jiL, aproximadamente 37 jiL, aproximadamente 38 jiL, aproximadamente 39 jiL, aproximadamente 40 jiL, aproximadamente 41 jiL, aproximadamente 42 jiL, aproximadamente 43 jiL, aproximadamente 44 jiL, aproximadamente 45 jiL, aproximadamente 46 jiL, aproximadamente 47 jiL, aproximadamente 48 jiL, aproximadamente 49 jiL o aproximadamente 50 jiL.
En algunos ejemplos fuera del alcance de la presente invención, el sistema, los dispositivos y los métodos como se describen en la presente descripción incluyen una interfaz. En otros ejemplos fuera del alcance de la presente invención, la interfaz se ubica entre la primera y la segunda regiones de muestra. Incluso en otros ejemplos fuera del alcance de la presente invención, la interfaz se configura para minimizar la cantidad de membrana limpia con la que interactúa el fluido de muestra. En algunos ejemplos fuera del alcance de la presente invención, la interfaz se forma y se ubica para minimizar la cantidad de membrana limpia con la que interactúa el fluido de muestra.
En consecuencia, en algunos ejemplos fuera del alcance de la presente invención, la presente descripción proporciona sistemas, métodos y dispositivos que facilitan la integración de la recolección microfluídica de lágrimas y los ensayos biológicos de analitos de interés en un solo dispositivo receptor. Varios ejemplos fuera del alcance de la presente invención del dispositivo integrado descrito en la presente descripción permiten la recolección de lágrimas a escala de nanolitros, la medición precisa del fluido lagrimal, un retraso del movimiento fluídi
la incubación de lágrimas con conjugados de detección, la transferencia cronometrada de nanolitros de fluido a la región de muestra, y/o características para permitir un lavado al activar el blíster y una cuantificación óptica de una pluralidad de analitos de interés. En algunos ejemplos fuera del alcance de la presente invención, los resultados de dichos análisis se aplican al tratamiento y seguimiento de una amplia variedad de afecciones oculares, como la enfermedad del ojo seco, glaucoma, retinopatía diabética, alergia, queratocono, degeneración macular u otras enfermedades oculares. Como ejemplo no limitativo, las lecturas de muestra generadas mediante el uso de los enfoques descritos en la presente descripción se usan como base para ajustar la planificación del tratamiento para varias afecciones oculares.
Como se usa en la presente descripción, A y/o B abarca uno o más de A o B, y sus combinaciones como A y B.
Donde se proporciona un intervalo de valores, se entiende que cada valor intermedio, hasta la décima de la unidad del límite inferior a menos que el contexto dicte claramente de cualquier otra manera, entre los límites superior e inferior de ese intervalo y cualquier otro valor establecido o intermedio en ese intervalo establecido, se abarca dentro de la descripción proporcionada en la presente descripción. En algunos ejemplos; los límites superior e inferior de estos intervalos más pequeños se incluyen independientemente en los intervalos más pequeños y se incluyen también dentro de la descripción, sujeto a cualquier límite específicamente excluido en el intervalo establecido. Donde el intervalo establecido incluye uno o ambos límites, los intervalos que excluyen cualquiera o ambos de estos límites incluidos se incluyen también en la descripción proporcionada en la presente descripción.
En la presente descripción los intervalos pueden expresarse como de "aproximadamente" un valor particular, y/o a "aproximadamente" otro valor particular. Cuando este intervalo se expresa, otro ejemplo incluye desde un valor particular y/o hasta otro valor particular. De manera similar, cuando los valores se expresan como aproximaciones, mediante el uso del antecedente "aproximadamente", se debe entender que el valor particular forma otro ejemplo. Se entenderá más aún que los puntos finales de cada uno de los intervalos son significativos tanto en relación con el otro punto final, e independientemente del otro punto final. El término "aproximadamente" como se usa en la presente descripción se refiere a un intervalo que es 10% más o menos de un valor numérico establecido dentro del contexto del uso particular.
Ejemplo 1
Este ejemplo describe la operación de un dispositivo capaz de medir tanto la osmolaridad como la cantidad de un analito de interés en un pequeño volumen de una muestra de fluido.
El dispositivo se construyó y se operó como se discutió anteriormente en relación con las Figuras 8 y 9. Como se ejemplifica en la Figura 8, se aplicaron aproximadamente 150 nL de lágrima humana enriquecida con 250 ng/ml de IgE a la entrada de fluido de un dispositivo ensamblado. El dispositivo ensamblado introdujo fluido en el tubo capilar mientras interrogaba la impedancia y temperatura de la muestra. La introducción de la muestra provocó una brusca reducción de la impedancia que provocó que un programa informático comenzara a bajar un émbolo para reventar el depósito del blíster dispuesto dentro de la cápsula/carcasa del dispositivo ensamblado. Una vez que el blíster estalló y el fluido de transferencia viajó a través del sistema, apareció una marca de 36 píxeles de diámetro con una intensidad media de 8 bits de 52,74, mientras que la media de fondo aguas arriba de una marca idéntica mostró 28,14 y aguas abajo 20,23, lo que resultó en una señal final de 52,74-((28,14 20,23)/2)=28,56 del canal rojo. Una configuración equivalente con 100 ng/ml enriquecida con IgE dio como resultado una intensidad de la marca de 34,12, una media de fondo aguas arriba de 28,88 y una intensidad aguas abajo de 21,71, lo que da como resultado una señal final de 34,12-((28,88 21,71)/2)=8,83, mientras que una muestra de lágrima de control sana y sin picos resultó en una intensidad de marca de 21,91, un fondo aguas arriba de 23,46 y un fondo aguas abajo de 19,03, lo que resultó en una señal final de 21,91-((23,46+19,03)/2)=0,67. La relación señal/ruido de 250 ng/mL fue 42,3, mientras que la relación señal/ruido de la muestra de 100 ng/mL fue 13,2. Este experimento demostró la detección y cuantificación de analitos de interés en volúmenes de muestra muy pequeños. Aunque el dispositivo también era capaz de medir la osmolaridad, se contempla que los dispositivos se puedan configurar para medir la presencia y/o cantidad de uno o más analitos de interés en una muestra de prueba.

Claims (11)

REIVINDICACIONES
1. Un dispositivo microfluídico para analizar una muestra de fluido, el dispositivo que comprende:
(a) una punta con forma para recibir un volumen de la muestra de fluido;
(b) una entrada vertical (110) que comprende una primera válvula (806) y adyacente a un flujo horizontal de la muestra de fluido desde la punta de muestra y se ubica después de la punta;
(c) una primera región de muestra (112, 203, 304, 409) ubicada después de la primera válvula (806), en donde la primera región de muestra (112, 203, 304, 409) está en comunicación fluídica con la punta y comprende al menos un transductor configurado para detectar una propiedad energética de la muestra de fluido con el fin de generar una primera lectura de muestra, en donde la primera lectura de muestra es indicativa de la osmolaridad de la muestra de fluido;
(d) un depósito de fluido (105, 504) conectado de forma fluida a la entrada vertical (110), en donde el depósito de fluido (105, 504) contiene un fluido de transferencia;
(e) una segunda válvula (108, 202, 306, 407, 802) que evita el flujo prematuro de fluido desde la primera región de muestra a una segunda región de muestra (103, 204, 301, 406, 807); y
(f) la segunda región de muestra (103, 204, 301, 406, 807) está en comunicación fluídica con la primera región de muestra (112, 203, 304, 409) y se conforma para recibir al menos una porción de la muestra de fluido, en donde la segunda región de muestra (103, 204, 301, 406, 807) comprende un sustrato de detección (103, 204, 301, 406) configurado para detectar uno o más analitos en la muestra de fluido para generar una segunda lectura de muestra, en donde la introducción del fluido de transferencia desde el depósito (105, 504) a la primera región de muestra (112, 203, 304, 409) mueve al menos una porción de la muestra de fluido desde la primera región de muestra (112, 203,304, 409) a la segunda región de muestra (103, 204,301, 406).
2. Un dispositivo microfluídico como se reivindicó en la reivindicación 1, en donde la primera válvula y/o la segunda válvula es una válvula pasiva (108).
3. Un dispositivo microfluídico como se reivindicó en la reivindicación 1, en donde la segunda válvula es una válvula activa (201, 202).
4. Un dispositivo microfluídico como se reivindicó en la reivindicación 1, en donde la segunda válvula es
a) una válvula pasiva (108) que comprende una o más características geométricas que restringen el flujo de la muestra de fluido hacia la segunda región de muestra (103, 204, 301, 406), o
b) una válvula activa (201, 202) que comprende un electrodo que tiene un recubrimiento hidrófobo en el que la aplicación de un voltaje al electrodo provoca la disolución del revestimiento hidrofóbico, que permite de esta manera el flujo de al menos una porción de la muestra de fluido a la segunda región de muestra (103, 204, 301, 406).
5. Un dispositivo microfluídico como se reivindicó en la reivindicación 4, en donde el recubrimiento hidrófobo comprende una monocapa autoensamblada de alcanotiol.
6. Un dispositivo microfluídico como se reivindicó en la reivindicación 1, en donde la primera región de muestra (112, 203, 304, 409) comprende un canal capilar (113, 203, 304) en comunicación fluídica con la segunda región de muestra (103, 204, 301, 406).
7. Un dispositivo microfluídico como se reivindicó en la reivindicación 6, en donde al menos una pared del canal capilar comprende una capa de adhesivo sensible a la presión (107, 303, 403).
8. Un dispositivo microfluídico como se reivindicó en la reivindicación 7, en donde la capa de adhesivo sensible a la presión interactúa con una porción de la muestra de fluido para retrasar el flujo de la porción de la muestra de fluido a través del canal capilar (112, 203, 304).
9. Un dispositivo microfluídico como se reivindicó en cualquiera de las reivindicaciones de la 6 a la 8, en donde al menos un transductor se sitúa en una pared del canal capilar.
10. Un dispositivo microfluídico como se reivindicó en cualquier reivindicación anterior, en donde la segunda lectura de la muestra es indicativa de la presencia o concentración de uno o más analitos en la muestra de fluido.
11. Un dispositivo microfluídico como se reivindicó en cualquier reivindicación anterior, en donde el volumen está dentro de un intervalo de aproximadamente 10 nL a aproximadamente 10 pL.
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