DE19916921A1

DE19916921A1 - Elektrisches Sensorarray

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Publication number: DE19916921A1
Application number: DE19916921A
Authority: DE
Original assignee: Fraunhofer Gesellschaft zur Forderung der Angewandten Forschung eV
Current assignee: Fraunhofer Gesellschaft zur Forderung der Angewandten Forschung eV
Priority date: 1999-04-14
Filing date: 1999-04-14
Publication date: 2000-10-19
Also published as: WO2000062047A1; ATE364838T1; WO2000062048A2; WO2000062048A3; US7208077B1

Abstract

Für die Anwendung in der analytischen Biochemie, der Diagnostik und der Umweltüberwachung werden elektrische Sensorarrays basierend auf voltametrischen und/oder impedimetrischen Detektionsprinzipien mit serieller oder paralleler Auslesung benutzt. Das elektrische Sensorarray mit Ultramikroelektroden in sub-mum-Dimensionen wird zur elektrochemischen Detektion biomolekularer Assays benutzt. Die gleiche Elektrodenanordnung erlaubt erfindungsgemäß sowohl elektrochemische Meßvorgänge als auch die Applikation elektrischer Felder zur Handhabung geladener Moleküle. Jede Arrayposition ist individuell adressierbar, elektrochemisch kontrollierbar und für individuelle elektrische Auslesung sowie wahlweise Zwischenspeicherung geeignet. Erfindungsgemäß wird dies entweder mit direkter Kontaktierung zu separater Meß- und Steuerelektronik oder durch integrierte CMOS-Schaltungen an jeder Arrayposition realisiert. Neben den muliplen Ultramikroelektroden zur Detektion, die paarweise als Interdigitalelektroden oder als spiral- bzw. kreisförmige Bänder oder mit punktförmigen Elektroden besetzte Flächen ausgebildet sind, werden bedarfsweise unterschiedliche Hilfselektroden angeordnet. DOLLAR A Für biomolekulare Assays werden an jeder Sensorposition auf oder zwischen den Elektroden oder auf Hilfsflächen immobilisiert. Die affinitätsbindenden Moleküle können auch an feste Träger gebunden sein und an den Sensorpositionen lokalisiert werden. Nach Affinitätsbindung von Analyten aus Stoffgemischen wird an ...

Description

Gebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein elektrisches Sensorarray, das aus multiplen Ultramikroelektroden als elektrochemischen Transduktoren besteht und zum gleichzeitigen Nachweis von verschiedenen Molekülen aus Substanzgemischen in der bio chemischen Analytik der medizinischen Diagnostik und der Umweltüberwachung als Teil von Meßanordnungen verwendet wird. Außerdem betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Verbesserung des analytischen Prozesses.

Grundlagen der Erfindung

Für die analytische Untersuchung biochemischer Assays ist es erwünscht, mehrere Analyte gleichzeitig in sogenann ten Arrayanordnungen zu detektieren. Solche Arrays sind auf der Bassis optischer Detektion weit verbreitet. Es wäre von Vorteil, direkt elektrische Meßsignale ohne Umweg über optische Detektionshilfen zu erfassen und auf diese Weise partikeltolerant und volumenunabhängig zu messen. Die elektrische Detektion würde Preisvorteile und robustere Handhabung ermöglichen.

Ausgehend vom klassischen Elektrodensystem zur elektrochemischen Detektion gibt umfangreiche Bemühungen, Elektroden zu miniaturisieren. Mit dem Begriff bezeichnet man üblicherweise elektrochemisch genutzte Elektroden strukturen in Dimensionen unter 5 µm. R. M. Wightman und D. O. Dipf beschreiben Möglichkeiten der Voltametrie an Ultramikroelektroden in Electroanalytical Chemistry, Ed. A. J. Bard (Marcel Dekker, New York 1988) Vol. 15, p. 267.

Solche Ultramikroelektroden ermöglichen auch besondere Detektionsverfahren wie das Redox-Recycling [O. Niwa et al., Electroanalysis 3 (1991) 163-168], das besonders für biochemi sche Affinitätsassays mit Enzymmarkierung, wie sie bei Immuno- und DNA-Assays üblich sind, vorteilhaft eingesetzt werden kann. Elektrodenstrukturen unter 300 nm Struktur breiten ermöglichen die markerfreie Detektion der Affini tätsbindung großer Moleküle an elektrodengebundene Fänger moleküle mittels der Impedanzspektroskopie [DE 196 10 115].

Ein Paar planarer Interdigitalelektroden für kon duktometrische und voltametrische Messungen bezeichnen Sheppard et al. in Anal. Chem., 65 (1993) 1202 als Array.

Ein Paar interdigitaler Ultramikroelektroden in Siliziumtechnologie verwendeten Aoki et al. [J. Elektroanal. Chem., 79 (1997) 49] für reversible Redoxreaktionen, das sogenannte Redox-Recycling.

Wiederum ein einzelnes interdigitales Elektrodenpaar wurde von H. T. Tang et al. [Anal. Chimica Acta, 214 (1988) 187] als Detektorsystem für ein Immunoassay, bestehend aus einem Antigen und einem Antikörper genutzt.

Alle diese Anordnungen wurden aber nur zur Einzel analytbestimmung beschrieben, so daß arraytypische unter schiedliche Molekülspezies nicht einzelnen elektrisch detektiert werden konnten.

Mikroelektrodenarrays mit 16 parallelen Bandelektroden und 0,1 mm Elektrodenbreite wurden von Aoki et al. Anal. Chem. 64 (1992) 44 zur elektrochemischen Detektion beschrie ben. Dabei werden unterschiedliche Polarisationsspannungen an den einzelnen Bandelektroden angelegt und konstant gehalten. Die Elektroden werden seriell im msec-Takt aus gelesen, ohne daß den Einzelelektroden Schalter zugeordnet sind. Ein Tiefpaßfilter verhindert das Auftreten von Ladeströmen. Diese Anordnung ermöglicht nur die Detektion einzelner oder verschiedener elektrodenaktiver Spezies in Lösung.

Eine Weiterentwicklung interdigitaler Elektrodenpaare zu einem Array mit multiplen interdigitalen Elektroden wurden in DE 43 18 519 zum simultanen Betrieb an einem Multipotentiostaten angegeben. Bei diesem Verfahren werden die Potentiale an den Elektroden individuell kontrolliert und konstant gehalten. Das Array ist auch nur zur simultanen und parallelen Messung eines Analyten in Lösung geeignet. Ebenfalls mit einem Multipotentiostaten wurden 4 Felder mit punktförmigen Mikroelektroden parallel zur Bestimmung verschiedener Metalle mittels anodischem Strippingverfahren beschrieben (DE 44 24 355 C2). Das Verfahren erlaubt nur die spezielle Stripping-Voltametrie als Detektionsverfahren, wobei mit Hilfe der Square-wave-Voltametrie Spannungsrampen aufmoduliert wurden.

Das Prinzip einer voltametrischen parallelen Multi kanalmessung an Mikroelektrodenarrays ist in Elektroanalysis 8, 10 (1996) 891, aufgezeigt. Ein Elektrodenarray mit 1 bis 2 µm großen Querschnitten von eingebetteten Kohlefasern benutzten T. G. Strein und A. G. Ewing [Analytical Chemistry 65 (1993) 1203]. Beide Verfahren gestatten keine serielle elektrische Abfrage verschiedener Sensorpositionen.

Yon Hin et al. [Sensors and Actuators B1 (1990) 550] beschreiben ein Multianalyt-Elektrodenarray bestehend aus mäanderförmigen parallelen Elektrodenbändern zur parallelen Analyse von Glukose und Galaktose mittels Leitfähigkeits messung. Dazu wurden Glukoseoxidase und Galactosidase in leitfähigem Polypyrol auf den Elektrodenoberflächen ein polymerisiert, gesteuert durch die Elektropolymerisation. Da dieses Array die elektrische Leitfähigkeit als Detetektions größe nutzt, sind Schaltvorgänge im Hinblick auf Störungen bei der Voltametrie ohne Bedeutung.

Ein nanostrukturiertes Goldelektrodenarray zur Immuno detektion wird von C. R. Musiel et al. [Journal of Vacuum Science and Technology B13 (6) (1995) 2781] beschrieben. Dieses Elektrodenarray ist durch das Herauslösen von Nanopartikeln aus einer auf Gold aufgebrachten Isolations schicht stochastisch verteilt und kann nicht individuell adressiert und ausgelesen werden.

Im US Patent 5,605,662 ist ein Elektrodenarray indivi duell ansteuerbarer Einzelelektroden mit ca. 30 µm Durch messer und davon separierten größeren Gegenelektroden auf einem Siliziumchip angegeben. Dieses Array wird nicht zur elektrochemischen Detektion, sondern nur zur Adressierung und Felderzeugung zwischen gelbeschichteten Einzelelektroden und den am Rande dieses Arrays angeordneten Gegenelektroden benutzt. Mit dem erzeugten Feld werden geladene Moleküle auf individuelle Elektrodenpositionen transportiert oder durch entgegengesetzte Polarisation von diesen Feldern entfernt. Für einen konkreten Fall ist dies für das Anreichern von DNA im Gel über individuellen Elektroden zur DNA-Hybridisierung an Fängern und im umgekehrten Fall das Beseitigen von Mismatches durch Feldunterstützung der DNA-Stringenzbehand lung beschrieben [R. G. Sosnowski et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 94 (1997) 1119]. Die Anwendung dieses Systems zur molekularbiologischen Multianalytdiagnostik ist in US 5,5632,957 beschrieben, wobei der elektrische Transport mit optischer Detektion gekoppelt ist.

Ein Array zur potentiometrischen Anwendung mit mehr als tausend individuell adressierbaren Elektrodenelementen wird von T. Hermes et al. in Sensors and Actuators B 21 (1994) 33 beschrieben. Die Einzelpositionen dieses Sensorarrays werden nur zum Zeitpunkt der Auslesung aktiv angeschaltet, während im Nichtlesezustand keine Spannung anliegt und keine Reaktion stattfindet. CMOS-Schalter für dieses An- und Ausschalten der Elektroden sind an jeder Arrayposition individuell angeordnet. Ein analog aufgebautes Multielek trodenarray mit nMOS-Schaltern an jeder Sensorposition wurde von [Fiaccabriono G. C. et al. Sensors and Actuators B, 18-19 (1994) 675 beschrieben. Bei dieser Art von Arrays entstehen beträchtliche Ladeströme, die amperometrische Detektionsverfahren stark beeinträchtigen. Ein Array von 19 Iridiumelektroden mit 10 µm Durchmesser als einzeln adressierbare Elektroden beschreiben S. P. Kounaves et al. in Anal. Chem. 66 (1994) 418. Die Elektroden wurden seriell in 2-Elektrodentechnik ausgelesen und nur im Lesezustand mit einem Potential belegt.

Ein Überblick über die Elektrochemie an Ultramikro elektroden ist zu finden in Physical Electrochemistry, Ed. Rubinstein, Marcel Dekker, 1995 New York, p. 131-208.

Die Applikation eines Paares von 20-300 nm-struk turierten Interdigitalelektrodenarrays zur markerfreien Impedanzanalyse einer Molekülkonjugation auf den Elektroden oberflächen wurde im Patent DE 196 10 115 A1 beschrieben. Ein einzelnes Paar nanostrukturierter Interdigitalelektroden für die Admitanzspektroskopie gelöster Moleküle wurde in J. Vac. Sci. Technol. A 13 (3) (1995) 1755 beschrieben. Das analoge Prinzip der Impedanzmessung im Elektrodenzwischenraum immobilisierter Moleküle mittels eines interdigitalen Paars schattenartig an eine Grubenwand gedampfter Nanometerelek troden ist in der Patentanmeldung PCT/EP 96/05290 gezeigt. Bei allen beschriebenen Impedanzmessungen mit Ultramikro elektroden wurde ein interdigitales Elektrodenpaar in Zweipol-Technik an ein kommerzielles Impedanzmeßgerät angeschlossen.

Eine besondere Form individuell adressierbarer sub-µm- Bandelektrodenarrays sind von M. P. Nagale und I. Fritsch in Analytical Chemistry 70,14 (1998) 2902 als gestapelte, voneinander isolierte Dünnfilmelektroden beschrieben. Dabei sind die Querschnitte der Stapel als aktive Elektroden verwendet worden. Zur elektrochemischen Kontrolle wurde ein kommerzieller computergestützter Potentiostat mit Arbeits-, Referenz- und Gegenelektrode verwendet. Die Auslesung der 15 Elektrodenschichten erfolgte seriell durch An- und Ausschalten.

Ein Mikroelektrodenarray zur extrazellulären Aktivi tätsmessung und Stimulation lebender Zellen und neuronaler Gewebe benutzt individuell adressierbare Mikroelektroden von 14 µm im Durchmesser, die mittels eines CMOS VLSI-Chips zur Stimulation und zur Detektion eingesetzt werden, wobei jede Chipelektrode zellulär erzeugte Biopotentiale zwischen 0,9-2,1 mV und 100-400 µV individuell erfassen kann [J. J. Pancrazio et al. Biosensors & Bioelectronics 13 (1998) 971]. Zur Stimulation werden Frequenzen zwischen 0,7 und 50 kHz mit Biasspannungen von 12-16 µV appliziert. Die Elektroden werden seriell im ein- oder ausgeschalteten Zustand betrieben.

Ein Verfahren und Vorrichtung zur Anreicherung und Aufreinigung von Molekülen an großflächigen Elektroden wird im Patent PCT/DE 97/01368 beschrieben. Dabei werden nur geringe Feldstärken erzeugt und keinerlei Detektionsver fahren einbezogen.

Die Modifizierung und Belegung der Oberflächen mit Biomolekülen, wie sie für das elektrische Sensorarray benutzt werden, wird durch kovalente Bindung oder Adhäsion an die metallischen oder nichtmetallischen Oberflächen oder an die Wandungen von Kompartments erreicht. Die Moleküle werden dabei als Monolayer oder Multilayer durch kovalente Anbindung, durch Adsorption, durch Einlagerung in Polymere oder als adhäsive Filme aufgebracht [C. F. Mandenius et al., Methods in Enzymology 137 (1988) 388]. Weit verbreitet ist die Haftschichterzeugung auf Oberflächen mit funktionalisierten Silanen als Monoschichten [C. M. Fischer et al., Europhysics Letters 28 (2) (1994) 129-134] über gasförmig oder in flüssiger Phase aufgebrachte quervernetzten Schichten [R. A. Williams et al. Biosensors & Bioelectronics 9 (1994) 159]. An diese Silanderivate, die Amino-, Thiol-, Aldehyd-, Hydroxyl-, Carboxyl- oder andere funktionelle Gruppen tragen können, werden meist mit Hilfe von Crosslinking-Techniken [H. G. Bäumert and H. Fasold, Methods in Enzymology, Vol. 172, p. 584] verschiedenste andere Verbindungen mit passenden reaktiven Gruppen kovalent gebunden. Auf diese Weise sind alle als affinitätsbindende Fängermoleküle geeigneten bioaktiven Substanzen wie Oligonukleotide, Peptide, Haptene und andere auf den Elektrodenflächen zu immobilisieren.

Eine spezifisch die Metalloberflächen nutzende Immobi lisierung ist die Ausbildung von Self-assembling-Monoschich ten durch Thiol/Goldbindungen. Nach Ausbildung der Self- assembling-Monolschicht wird z. B. über Streptavidin/Biotin- Kopplungen die geordnete Anbindung von Proteinen wie Antikörpern erreicht [J. Spinke et al., Langmuir 9 (1993) 1821]. In einem anderen Ansatz werden auf Goldflächen über Chelator-thioalkane, histidinmarkierte Proteine geordnet an die Oberflächen gebunden [D. Kröger et al., Biosensors und Bioelectronics 14 (1999) 155].

Eine weitere Methode zur selektiven Aufbringung organischer Haft- und Kopplungsschichten ist die Elektro polymerisation, beispielsweise für die Bindung von Ferro cenen auf Platinelektroden [G. N. Kamau et al. in Anal. Chem. 66 (1994) 994].

Für die Herstellung biomolekularer Arrays in Mikro dimensionen sind eine Reihe von Verfahren gebräuchlich. Von makroskopischen Auftupfen ist das Aufsetzen miniaturisierter Ringe auf Chipoberflächen abgeleitet, auf die vorher entsprechende Moleküle durch Tauchen aufgebracht wurden [S. D. Rose, J. Ass. Lab. Autom. 3,3 (1998) 53].

Das piezoelektrische Drucken, analog den Tintenstrahl druckern, zum Aufbau von DNA-Chips gelang A. P. Blanchard [Genetic Engineering, Principles and Methods, 20 (1998) 111].

Das sogenannte Mikrokontaktdrucken, d. h. das Übertragen von Molekülen mittels Mikrostempel wurde von A. Kumar und G. M. Whitesidess [Appl. Phys. Lett. 63 (1993) 2002] beschrieben.

Eine mit photolithgraphischen Masken unterstützte Festphasensynthese auf Chip-Mikroarrealen, die Nucleotid aufbau mittels Photoaktivierung erlaubt, beschreiben G. Mcgall et al. [Proc. Natl. Acad. Sci., USA 93 (1996) 13555].

Durch elektrochemische Fokussierung werden nach US 5605662 geladene Moleküle aus der Lösung zu ihren Bindungsplätzen in Gelen über Elektroden transportiert.

Durch perforierte Membranen, die auf Chipoberflächen aufgedrückt werden, sind an den offenen Stellen Immobili sierungsreaktionen an den Oberflächen in flüssiger Phase möglich [E. Ermantraut et al., Proc. of µTAS '98, Alberta, Can., 1998, p. 217].

Die aufgezeigten Verfahren stehen für Standardmethoden, die es erlauben, DNA, Oligonukleotide, Proteine und andere Moleküle auf Arraypositionen zu immobilisieren.

Nachteil aller bisher beschriebenen elektrischen Sensorarray-Anordnungen mit Elektroden als Transducer ist es, daß sie nur zur Monoanalytbestimmung geeignet sind, oder daß die eigentliche sensorische Funktion von zusätzlichen optischen Komponenten übernommen werden muß. Die bisher als Array bezeichneten Elektrodensysteme, z. B. Interdigital elektroden, stellen keine Arrays im eigentlichen Sinn dar, die zur Multianalytmessung geeignet sind. Bisher ist zudem nicht bekannt, wie man Elektrodenarrays mit den in der Computertechnik üblichen seriellen Verfahren, d. h. nach einander, auslesen kann, ohne daß dabei die elektrische Doppelschicht, die sich durch Polarisation an den Elektroden bei voltametrischen Detektionsverfahren aufbaut, gestört wird.

Zur Verbesserung dieser Situation ist also eine Arrayanordnung zur Multianalytmessung notwendig, die eine rein elektrische Sensorfunktionen ermöglicht und die mit elektrischen Steuer- und Meßverfahren ausgeführt werden kann.

Aufgabe der Erfindung

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es insbesondere, ein Sensorarray für biochemische Affinitätsassyas zur Verfügung zu stellen, das mit den Methoden der Halbleiter technologie gefertigt werden kann und als elektrochemischer Transducer meßtechnisch einfache elektrische Signale direkt und ohne optische Komponenten erzeugt. Weiterhin soll ein Meßverfahren zur Verfügung gestellt werden, mit dem aus Stoffgemischen unterschiedliche Analyte gleichzeitig bestimmt werden. Aufgabe ist es weiterhin, ein Verfahren zur seriellen elektrischen Auslesung eines elektrischen Sen sorarrays zur Verfügung zu stellen, daß Störungen des elektrischen Meßprozesses vermeidet und technologisch kompatibel zu den Methoden der Computertechnologie ist. Es sollen Miniaturisierungs-, Fertigungs- und Handhabungs vorteile realisiert sowie die verbesserte analytische Handhabung molekularbiologischer Assays aufgezeigt werden.

Erfindungsbeschreibung

Die Erfindung bezieht sich zum einen darauf, daß als sensorisches Element multiple Ultramikroelektroden, d. h. vorzugsweise Elektroden mit typischen Strukturdimensionen unter 1 µm verwendet und als Array angeordnet werden. Die Anordnung dar Ultramikroelektroden im Array zielt neben der Miniaturisierung auf ein vorteilhaftes Diffusionsverhalten der zu detektierenden Moleküle und weiterhin auf die Nutzung voltametrischer und impedimetrischer Detektionsverfahren, wie Redox-Recycling und markerfreie Impedanzmessungen, für die derartige Ultramikroelektroden Voraussetzung sind. Die Erfindung bezieht sich ferner auf ein spezielles serielles Auslesungsverfahren der elektrochemischen Prozesse an den Ultramikroelektrodenarrays. Die erfindungsgemäße Ultramikro elektrodenanordnung bezieht sich gleichermaßen auf die Erzeugung multipler elektrischer Felder mit sehr hohen Feldstärken, die zum aktiven Transport von Molekülen individuell an allen Arraypositionen geeignet sind.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch ein elektrisches Sensorarray für die Multianalyt-Messung bio chemischer molekularer Assays, welches folgendes umfaßt:

a) ein mechanisch stabiles planares Substrat, auf dem als Array mehrere Sensorpositionen, die jeweils aus lokal separierten, mindestens paarweisen Ultramikroelektroden und wahlweise zusätzlichen Hilfselektroden bestehen,
b) isolierten Leitungen, die eine individuelle elektrische Adressierung jeder Sensorposition und Einzelelektrode gestatten,
c) zusätzlichen elektrischen Leitungen, die eine elek trochemische Kontrolle und Steuerung an jeder Position ermöglichen, und wahlweise elektrische Gleich- und/oder Wechselfelder an jeder Sensorposition ermöglichen,
d) die Immobilisierung unterschiedlicher oder gleicher affinitätsbindender Moleküle, die entweder auf allen oder ausgewählten Oberflächen der einzelnen Sensor positionen direkt oder an partikulären Trägern oder gelartigen Substanzen gebunden oder eingeschlossen sind und die individuell über den einzelnen Sensorpositionen angeordnet werden,
e) integrierte elektronische Funktionselemente, die die individuelle Kontrolle elektrochemischer Reaktionen an den einzelnen Sensorpositionen und unabhängig davon die individuelle elektrische Messung dieser Reaktionen an jeder Position gestatten, wobei die elektronischen Schaltelemente Gruppen, Reihen oder Einzelpositionen der Sensorarrays zugeordnet sind.

Die Erfindung ermöglicht durch diese aktiven Schalt elemente eine serielle, d. h. nacheinander erfolgende, elektrische Auslesung der elektrochemischen Prozesse an einzelnen Sensorpositionen. Die aktiven Schalt-, Steuer- und Auslesefunktionen an jeder Arrayposition werden so ausgeführt, daß die elektrische Doppelschicht, die sich bei elektrochemischen Prozessen an Elektroden ausbildet, nicht gestört wird. Intelligente elektronische Funktionselemente als separate Bauelemente oder direkt an den einzelnen Sensorarraypositionen ermöglichen es außerdem, elektrochemi sche Prozesse an einer Sensorposition in den Zeiten zwischen den Auslesungen aufzuzeichnen und zwischenzuspeichern.

Mit der Erfindung wird ein elektrisches Sensorarray zur Verfügung gestellt, das durch die variable Anzahl spezifischer Sensorarraypositionen für unterschiedliche Analyte erlaubt, unterschiedliche analytische Fragestel lungen zu lösen. Darüber wird erfindungsgemäß ein Verfahren aufgezeigt, das es ermöglicht, mit den zur Detektion ver wendeten Ultramikroelektroden partikeltolerant, d. h. unabhängig von optischen Eigenschaften in sub-µl-Volumina pro Arrayposition zu messen.

Von Vorteil ist weiterhin die Herstellung des Sensor elements mit waferorientierten Technologien der Halbleiter industrie, die auch kompatibel zu den Verfahren für die Immobilisierung bzw. Beladung von biochemischen affinitäts bindenden Erkennungsmoleküle auf den Arraypositionen sind.

Eine besondere erfindungsgemäße Variabilität der Anordnungen und Verfahren wird im einzelnen durch die folgenden Maßnahmen erreicht:

- Bei weniger als ca. 50 elektrische Sensorpositionen im Array werden die Ultramikroelektroden durch direkte metallische Leiterbahnen unter einer Isolationsschicht zu Kontaktflächen geleitet. Als planare Substrate finden für diese Applikation Silizium, Glas, Keramik oder Polymere vorteilhafte Verwendung.
- Sowohl geringe als auch große Zahlen von Sensorpositio nen pro Array werden durch Integration der Ableitungen mittels Si-Chip-Technologie realisiert. Silizium als planares Trägerelement wird insbesondere auch dann ver wendet, wenn eine größtmögliche dichte Anordnung von einzelnen Sensorelementen bzw. Positionen erreicht werden soll.
- Als Träger für das elektrische Sensorarray wird Sili zium auch verwendet, weil es die Anwendung einer effizienten Technologie gestattet und insbesondere dann unabdingbar ist, wenn zur individuellen Kontrolle der Positionen des Sensorarrrays Steuerung und Schaltung sowie Auslesung der einzelnen Positionen zusätzliche elektronische Elemente wie Transistoren, Dioden, Wider stände und andere übliche elektronische Komponenten positionsbezogen integriert werden.
- Sowohl bei den elektrischen Sensorelementen mit direk ter Kontaktierung als auch bei jenen mit integrierten elektronischen Elementen an den individuellen Sensor positionen wird erfindungsgemäß ein neues Verfahren zur unabhängigen Kontrolle und seriellen elektrochemischen Detektion an den Sensorpositionen benutzt. Für die elektrochemische Detektion werden dazu durch Elektro denpolarisation erzeugte elektrische Doppelschichten an den Elektrodenoberflächen kontinuierlich an alle Sensorarraypositionen appliziert. Erreicht wird dies durch besondere Umschalter, die verhindern, daß durch serielle, d. h. nacheinander erfolgende elektrische Auslesung der einzelnen Arraypositionen, diese Polari sation gestört wird und keine sogenannten Umladungs prozesse auftreten.
- Ein besonderer Nutzen entsteht dadurch, daß die zur Detektion verwendeten Ultramikroelektroden und wahl weise weitere Hilfselektroden gleichzeitig sowohl als Elemente zur Ausführung elektrophoretischer Transport vorgänge der Analytmoleküle zu den Orten affinitäts bindender Partnermoleküle als auch zur Beseitigung unerwünschter Bindungsereignisse eingesetzt werden.

Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 zeigt ein Array mit interdigitalen Ultramikro elektroden mit paarweisen Mikroelektroden und Details einzelner Sensorpositionen;

Fig. 2 zeigt Anordnungen und Kombinationen verschiedener Formen von Ultramikroelektroden und Hilfs elektroden einer einzelnen Arrayposition;

Fig. 3 zeigt ein Schema eines Arrays von Paaren inter digitaler Ultramikroelektroden mit aktiven CMOS- Schaltelementen zur Addressierung und Kontrolle der individuellen Elektrodenpolarisation sowie externen Lese- und Meßverstärkern;

Fig. 4 zeigt ein Schema eines Arrays von Paaren inter digitaler Ultramikroelektroden mit aktiven CMOS- Schaltelementen zur Addressierung und Kontrolle der individuellen Elektrodenpolarisation sowie externen Lese- und Meßverstärkern, mit Kontroll verstärker, Lese- und Steuereinrichtungen an jeder Arrayposition; und

Fig. 5 zeigt ein Schema der Anordnung von Arraylektroden und integrierten-CMOS-Elementen.

Numerierung der Abbildungen

1

planarer Träger

1

s Siliziumsubstrat

2

Kontaktflächen

3

a ringförmiges Ultramikroelektrodensystem

3

a' ringförmiges Ultramikroelektrodensystem

3

b Hilfselektrode

3

c Hilfselektrode

3

,

3

' interdigitales Ultramikroelektrodenpaar

3

d,

3

d' Interdigitalelektrodenpaar

3

e,

3

e' Hilfselektrodenpaar

3

f,

3

f' Ultramikroelektrodenarray

3

g,

3

g' Interdigitalelektrodenpaar mit Ultramikro elektrodenarray

3

h,

3

h' Elektrodenpaar mit Ultramikroelektrodenarrays

3

i,

3

i' mäanderförmige Ultramikroelektroden

3

j Hilfselektrode

4

Areale der Sensorarraypositionen

5

Abdeckung der Elektrodenzuleitungen und Steuer leitungen

6

Metallische Leitungsbahn zu den Elektroden

7

Siliziumdioxid

8

Kompartimentmaterial

9

punktförmige Ultramikroelektroden

10

elektronische Vorrichtung zur Adressierung und Decodierung

11

elektronische Vorrichtung mit Leseverstärkern

12

integrierte Schaltung im adressierten Zustand

12

a Durchkontaktierung

13

integrierte Schaltung im nicht adressierten Zustand

13

a Durchkontaktierung

14

aktive Adressleitung A

15

aktive Adressleitung A'

16

inaktive Adressleitung B

17

inaktive Adressleitung B'

18

Meßleitung C

19

Meßleitung D

20

Bias-Leitung E

21

Bias-Leitung F

22

adressierte integrierte Lese-, Verstärker- und Speicherelektronik

23

nicht adressierte integrierte Lese-, Verstärker- und Speicherelektronik

24

CMOS-Wanne

25

Source

26

Drain

27

CMOS-Aluminium

28

CMOS-Dielektrikum

29

flüssigkeitsresistente Passivierung

30

Goldelektrode

31

Polysilizium-gate

32

Kreuzung von Adressleitung und Meßleitung

In Fig. 1a ist ein Siliziumchip dargestellt, bei dem auf jeder Arrayposition 4 jeweils 1 Paar ringförmiger Mikro elektroden 3a und 3a' angeordnet sind, die durch direkte Leiterbahnen zu elektrischen Verbindungskontaktflächen 2 am Rande des Chips verlaufen. In Fig. 1b ist eine Detail vergrößerung des Chips des Arrayelementes aus Fig. 1a im Schnitt PP' dargestellt. Von jeder Arrayposition 4 werden die Ringelektroden 3a und 3a' zu jeweils einer individuellen Kontaktfläche 2 am Rande des Chips über die Leitungen 6 geführt. Die Leiterbahnen 6 sind dabei von einer flüssig keitsdichten Isolationsschicht 5 bedeckt. Ein Querschnitt detail dieser Abbildung entlang der Schnittlinie A, A' ist in Fig. 1c und 1d dargestellt. Auf dem Silizium- Substrat 1 ist eine isolierende Schicht aus Siliziumdioxid 2 aufgebracht, die die Elektrodenarrays 3a und 3a' sowie die Leiterbahnen 6 als Dünnfilmmetallstrukturen trägt. Durch die isolierende Abdeckung 5 werden die Leiterbahnen 6 bedeckt, während die aktiven Sensorelemente 3a und 3a' in den Array positionen 4 frei bleiben. Die Abdeckung 5 dient auch zur Abgrenzung zwischen den Elektroden der einzelnen Array positionen. In Fig. 1d ist der analoge Querschnitt AA' dargestellt mit einer zusätzlichen Polymerschicht 8, die zur Ausbildung von Mikrokompartments oder Distanzringen an den Arraypositionen mit den Ringelektroden 3a und 3a' dienen.

In Fig. 2 sind einzelne Arraypositionen 4 mit ver schiedenen Anordnungen der Ultramikroelektroden und Hilfs elektroden dargestellt. Fig. 2a zeigt im Detail ein Paar ringförmige Ultramikroelektroden 3a und 3a' mit den Ablei tungen 6 auf einer Arrayposition 4. In Fig. 2b sind ring förmige Bandelektroden 3a und 3a' sowie 3c angeordnet und zusätzlich eine zentrale kreisförmige Hilfselektrode 3b im Zentrum dieser Bandelektroden. Fig. 2c zeigt im Detail ein Paar Ultramikroelektroden 3 und 3' mit den Ableitungen 6 auf der Arrayposition. Fig. 2d zeigt 2 Paare interdigitaler Ultramikroelektroden unterschiedlicher Geometrie mit schmalen Elektrodenstrukturen 3 und 3' und vergrößerten Strukturen 3d und 3d' mit individuellen Ableitungen 6. In Fig. 2e ist ein interdigitales Ultramikroelektrodenpaar 3 und 3' mit 2 metallischen Hilfselektroden 3e und 3e' ange ordnet. Fig. 2f zeigt ein Paar interdigitaler Ultramikro elektroden 3 und 3' und zwei flächige Hilfselektroden 3f und 3f', die von der isolierenden Schicht 5 bedeckt sind. In dieser Abdeckung 5 sind punktförmig aktive Elektroden flächen 9 freigelegt, die parallel geschaltet sind. In Fig. 2g ist ein interdigitales Elektrodenpaar 3g und 3g' mit analogem Aufbau wie die Elektroden 3f und 3f' darge stellt. Die punktförmigen Elektroden 9 sind entsprechend der Fingerstruktur elektrisch miteinander verbunden. Fig. 2h ist ein Paar flächiger Elektroden 3h und 3h' angeordnet, die ebenfalls von einer Abdeckschicht 5 belegt sind, und Öffnungen mit aktiven punktförmigen Elektroden 9 aufweisen. In Fig. 2i ist ein mäanderförmiges Elektrodenpaar 3i und 3i' mit einer flächigen Hilfselektrode 3j kombiniert.

In Fig. 3 ist ein Array mit Paaren von interdigitalen Ultramikroelektroden gezeigt, wo Adressierung und Steuerung der Elektrodenpolarisation durch CMOS-Schalter 12, 13 im Siliziumchip 1 an jedem einzelnen Interdigitalsystem 3 und 3' angeordnet sind. Die flüssigkeitsdichte Abdeckung 7 liegt über dieser Schalterebene. Die Ableitungen 6 in der Ebene der Ultramikroelektroden führen an den Stellen 12a und 13a durch Öffnungen in der isolierenden Abdeckschicht 7 (Fig. 1) zu der Ebene der CMOS-Schalter. Von einer auf dem Silizium-Chip angeordneten elektronischen Adressier einheit 10 werden die Adressleitungen 14 und 15 bzw. 16 und 17 angesteuert. Die Schalter 12 zeigen die aktivierte Stellung beim Auslesen einer Spalte von Ultramikroelek troden-Paaren. Die adressierten Ultramikroelektroden sind mit den Meßleitungen 18, 19 verbunden. Die Leitungen 18, 19 führen zu einem Leseverstärker 11. Die Schalter 13 sind in Ruhestellung, die nicht adressierten Ultramikroelektroden sind mit den Bias-Leitungen 20, 21 verbunden.

In Fig. 4 ist ein Sensor-Array mit Paaren von inter digitalen Ultramikroelektroden gezeigt, das der Anordnung nach Fig. 3 entspricht. Die oval umrandeten Bereiche 22, 23 sind elektronische Schaltungen mit Integratoren als Meßwert speichern, welche die Stromwerte der benachbarten Ultra mikroelektroden 3, 3' speichern. In den Gebieten 23 wird über die Adressleitungen 16, 17 das Signal zur Durchführung der Integration angelegt und die Ultramikroelektroden mit den Bias-Leitungen 20, 21 verbunden. In den Bereichen 22 ist durch die Signale der Adressleitungen 14, 15 die Ausgangs spannung des Integrators an die Meßleitungen 18, 19 gelegt.

In Fig. 5 ist in Silizium 1s als planarem Träger eine CMOS-Wanne 24 mit Source 25 und Drain 26 integriert. Ein Gate und Leiterbahnen aus Polysilizium 31 verbinden zusamm men mit CMOS-Aluminium 27 im CMOS-Dielektrikum 28 die chip internen Elemente. Ebenfalls mittels Aluminium ist die Source 25 mit der Goldelektrode 30 durch eine flüssigkeits dichte Siliziumnitrid-Passivierung 29 hindurch elektrisch verbunden. Im Kreuzungsbereich 32 kreuzen sich z. B. Leiter bahnen wie die Adressleitungen 15 mit Meßleitung 18 gemäß Fig. 4.

Ausführliche Erfindungsbeschreibung/bevorzugte Anordnungen

Für die Konstruktion des elektrischen Sensorarrays werden planare Träger bzw. Substrate aus verschiedenen Materialien verwendet. Ein besonders günstiges Material ist Silizium, weil mit den eingeführten technologischen Methoden der Halbleiterfertigung die erfindungsgemäßen Ultramikro elektrodenarrays in Dünnfilmtechnologie und in Waferprozes sen hergestellt werden können. Diese Methode ist variabel und preisgünstig, wenn Arraypositionen mit geringer Dichte, d. h. ca. 10-30 Arraypositionen pro elektrisches Sensor array hergestellt werden sollen, so daß wie in Fig. 1 dar gestellt, die Ultramikroelektroden durch isolierte direkte Kontaktierung mit Kontaktflächen am Rand der Chips verbunden werden.

Wenn zur Ansteuerung der individuellen Positionen des Sensorarrays Steuerung und Schaltung sowie Auslesung der einzelnen Positionen zusätzliche elektronische Elemente wie Transistoren, Dioden, Widerstände und Kondensatoren inte griert werden, wie in Fig. 3 und 4 dargestellt, ist die Siliziumtechnologie unerläßlich. Silizium als planares Trägerelement wird insbesondere auch dann verwendet, wenn mehr als ca. 60 Arraypositionen pro Sensorelement oder eine sehr dichte Anordnung dieser Positionen erreicht werden soll.

Im Falle direkter elektrischer Kontaktierung ist die Verwendung von Glas und glasähnlichen Substanzen sowie Keramik und auch den besonders verschiedenen Arten von Polymeren als planare Träger möglich. Alle Substrate müssen dabei die Eigenschaft aufweisen, daß metallische Leiter bahnen und die strukturierten Ultramikroelektroden auf ihnen haftfest aufgebracht werden können. Das halbleitende Silizium wird durch dünne Schichten aus Siliziumdioxid oder Siliziumnitrid oder deren Gemische isoliert. Auf den Einzelpositionen des elektrischen Sensorelements werden die Ultramikroelektroden und bedarfsweise Hilfselektroden oder Hilfsflächen aus Metallen durch Aufdampfen oder Aufsputtern von Edelmetallfilmen wie Gold, Platin oder Iridium aufge bracht und üblicherweise durch photolithographische Prozesse und/oder Naß- bzw. Trockenätzen strukturiert. Mit Hilfe dünner Haftschichten aus Chrom oder Titan oder Tantal oder anderen ähnlichen Metallen wird die Haftung dieser Edel metalle zum planaren Substrat verbessert. In besonderen Ausführungsformen werden nm-strukturierte Ultramikroelek troden in die Isolatorschichten eingelegt und damit zum Zwecke hoher Chipausbeuten und Kurzschlußfestigkeit plana risiert.

Die für die Detektion verwendeten Ultramikroelektroden, gemäß Fig. 2 sind mindestens paarweise angeordnet und können als interdigitale Ringstrukturen 3a, 3a', 3b, 3c, als interdigitale Strukturen verschiedener Geometrien 3, 3', 3d, 3d', 3g, 3g' in einfacher oder mehrfacher Ausführung oder auch als Mäander 3i, 3i' angeordnet sein. Sie können zusammen mit Flächen diskförmiger Ultramikroelektroden sowie auch zusammen mit Hilfselektroden in verschiedensten Kombinationen benutzt werden.

Die bandförmigen Elektrodenstrukturen, die paarweise als kreis- oder spiralförmige oder interdigitale oder mäandrische Anodnungen ausgeführt sind, werden bevorzugt für das Redox-Recycling als Detektionsverfahren benutzt und photolithografisch in Dimensionen zwischen 200 nm und 800 nm gefertigt, sind aber prinzipiell auch sowohl in größeren als auch in kleineren Dimensionen geeignet.

Analoge Elektrodenstrukturen unter 500 nm Struktur breiten, bevorzugt zwischen 100 und 300 nm, werden zur markerfreien Detektion der Affinitätsbindung großer Moleküle an die elektrodengebundenen Fängermoleküle mittels Impedanz spektroskopie gefertigt.

Eine besondere Eigenschaft der bandförmigen paarweisen Ultramikroelektroden-Strukturen und auch der in großer Nähe angeordneten zusätzlichen Elektroden ist die Erzeugung hoher elektrischer Felder mit Feldstärken bis zu mehreren Megavolt pro m mit relativ geringen Spannungen von typischerweise 0,5 bis 20 V. Die elektrischen Felder zwischen sub-µm-Elektroden verlaufen nur in allernächster Nähe der Elektroden und durchdringen damit bevorzugt die aufliegenden Molekül schichten, erfassen aber vergleichsweise wenig von der umgebenden Elektrolytlösung.

Dies wiederum gestattet, einen elektrophoretischen Transport von Molekülen schon mit Spannungen von wenigen Volt und damit einem erheblich niedrigeren Spannungsbedarf als bei den sog. Makroelektroden mit Abmessungen typischer weise über 10 µm zu realisieren. Auch durch höhere Spannun gen hervorgerufene störende Vorgänge wie Elektrolyse, pH-Gradientenerzeugung u. a. werden auf diese Weise reduziert oder verhindert.

Bei mehrfacher Anordnung paarweiser Ultramikroelek troden, wie in Fig. 2b gezeigt, ist eine wahlweise Feld erzeugung zwischen den verschiedenen Elektroden möglich. Auch die Möglichkeit von Differenz- oder Brückenschaltungen bei der elektrochemischen Detektion ergibt meßtechnische Vorteile zur Kompensation von Störungen. So sind die in Fig. 2d dargestellten zwei Paare interdigitaler Ultramikro elektroden mit unterschiedlichen Geometrien für Differenz schaltungen auf Grund unterschiedlicher Detektionseigen schaften, wie die Amplifikationsrate beim Redox-Recyling, geeignet.

Auch unterschiedliche organische Beladungen erfüllen diesen Zweck einer Differenzmessung. Mittels Abdeckung eines Paares durch galvanische Abscheidung von nicht Self-asssem bling-Monoschichten ausbildenden Metallen, wie z. B. Nickel o. a., wird eine Immobilisierung verhindert. Auch nach trägliche individuelle Entfernung der Immobilisierungs schicht auf einer Elektrode z. B. durch Desorption einer Self-assembling-Schicht mittels elektrischer Oxidation auf einem dieser Elektrodenpaare kann für solche Differenz messungen genutzt werden.

Die Erzeugung 1-2 µm großer punktförmiger Ultramikro elektroden 9 auf den in der übrigen Fläche isolierten Arrays, wie in Fig. 2f, 2g und 2h dargestellt, dient optimaler hemisphärischer Diffusion von elektrodenaktiven Partikeln zu den Elektrodenflächen. Diese hemisphärische Diffusion bewirkt an den punktförmigen Elektroden eine mehr als zehnfach höhere Stromdichte pro Fläche sowohl bei der Detektion als auch bei der Applikation von elektrischen Feldern verglichen mit Makroelektroden.

In einer besonderen Ausführungsform können diese punktförmigen Elektroden wie auch die bandförmigen Elek troden gemäß Fig. 2a, 2b, 2c, 2d, 2e, 2f, 2h und 2i von einer dünnen Isolatorschicht auf einer oder beiden Elek troden eines Paares bedeckt sein und damit ein besonderes Meßelement zur Kapazitätsmessung immobilisierter oder an die Oberfläche anbindender Moleküle darstellen. Gleichermaßen ist durch solche Isolierung eines von zwei Paaren von Ultramikroelektroden eine Differenzmessung möglich.

Die Kombination eines Ultramikroelektrodenpaares mit flächenförmigen Hilfselektroden wie in Fig. 2e dargestellt, wird verwendet zur Vergrößerung metallischer Bindungsflächen zur Immobilisierung von Molekülen. Gleichzeitig können diese Flächen wie 3e und 3e', aber auch zur Applikation von elektrischen Zusatzfeldern benutzt werden, um beispielsweise Moleküle in die Nähe der Detektionselektroden 3 und 3' zu transportieren oder bei der Beseitigung von unerwünschten Molekülen Feldunterstützung zu ermöglichen. In Fig. 2f ist die Kombination eines interdigitalen Ultramikroelektroden paares mit Hilfselektroden 3f, 3f' gezeigt, die mit den beschriebenen punktförmigen Elektroden besetzt sind. Dabei werden die für band- und punktförmige Elektroden vorstehend beschriebenen unterschiedlichen Eigenschaften der Ultra mikroelektroden kombiniert.

In einer besonderen Ausführungsform, wie in Fig. 2h dargestellt, werden flächenförmige Elektroden mit ultra mikroelektrodenförmigen Punkten 9 besonders zur Anwendung für die Impedanzspektroskopie benutzt. Dabei können immobi lisierte Moleküle sowohl über den gesamten Elektrodenflächen oder in den Zwischenräumen oder auf den aktiven Elektroden oberflächen spezifisch gebunden sein. In einer anderen Ausführungsvariante werden die Moleküle auf den vorgenannten dünnen Isolatorschichten über den Elektroden immobilisiert.

Weitere Kombination von Elektrodenformen und damit deren Eigenschaften wie z. B. die Doppelanordnung der Elektrodenpaare 3, 3' oder die Kombination von 3a, 3a' mit 3e, 3e' oder 3e, 3e' mit 3g, 3g' und andere sind dabei möglich.

Eine besondere Ausführungsform sind die ringförmigen Ultramikroelektroden 3a, 3a' in Fig. 1, 2a und 2b, die im Prinzip analoge Eigenschaften wie die Paare interdigitaler Mikroelektroden 3 und 3' zeigen, aber effektiver die Aus nutzung der Sensorarrayfläche gestatten und die Applikation zentraler 3b und äußerer Hilfselektroden 3c ermöglichen, die für Feldverteilung und Felderzeugung von Bedeutung sind. Mit letzterer Anordnung läßt sich ein käfigähnliches Feld über z. B. zeitweise inaktiven Elektroden 3a, 3a' erzeugen und gezielt Moleküle in diesen Bereich hereinziehen oder abstoßen.

Die in Fig. 2i dargestellten mäanderförmigen Elek troden 3i und 3i' entsprechen in ihren Eigenschaften den ringförmigen- und den interdigitalen Bandelektroden und können ebenso mit den Hilselektroden 3j für Differenzmes sungen oder zur Felderzeugung kombiniert werden.

Eine spezielle, nicht in den Abbildungen dargestellte Form bandförmiger Elektroden ist die spiralförmige Anordnung der Ultramikroelektroden, bei denen parallele Elektroden bänder von außen nach innen oder von innen nach außen laufen und zu getrennten Kontaktleitungen führen. Auch die spiral förmigen Ultramikroelektroden können wieder mehrfach als Paare mit unterschiedlichen Geometrien kombiniert werden, gegebenenfalls auch mit zusätzlichen Hilfselektroden, entweder flächenförmig oder entsprechend 3b und 3c.

Sowohl die ringförmigen als auch die kreis- und spiralförmigen Ultramikroelektroden können in Analogie zur Fig. 2g mit punktförmigen Ultramikroelektroden zusätzlich strukturiert sein und weisen dann auch analoge Eigenschaften auf.

Eine besondere Ausführungsform der Ultramikroelek trodenarrays entsteht nach Anspruch 7 dadurch, daß auf den einzelnen Positionen bandförmige Elektroden, wie in Fig. 2a, 2b, 2c, 2d oder 2i, oder flächenförmige Elektroden analog Fig. 2e, mehrfach übereinander gestapelt werden und die dann von isolierenden Zwischenschichten wie Silizium dioxid, Siliziumnitrit, Siliziumoxinitrit voneinander isoliert sind. Dazu wird das Aufdampfen von Metallen und die PECVD-Abscheidung der Isolatorschichten kombiniert. Diese gestapelten Elektroden sind typischerweise 10-200 nm dick und bewirken an den Schnittkanten eines solchen Stapels, der von einem Isolationsmaterial bedeckt ist, ein Ultramikro elektrodenverhalten, wo allerhöchste Annäherung der Elek troden und die Erzeugung ultrahoher Feldstärken erreicht werden. Die einzelnen Schichten werden bei dieser Anordnung unter einer isolierenden Bedeckung seitlich zu Kontakt flächen einzeln und individuell herausgeführt.

Prinzipiell ist es auch möglich, die in Fig. 2 gezeig ten und vorstehend beschriebenen Ultramikroelektroden und Hilfselektrodenstrukturen mit metallischen Flächen zu kombinieren, die keinen elektrischen Anschluß tragen. Sie dienen dann z. B. als Areale zur Immobilisierung von affini tätsbindenden Molekülen.

Die Ultramikroelektroden einer einzelnen Arrayposition werden mit metallischen Gesamtflächen von typischerweise 100-30 000 µm² ausgeführt und gestatten es daher, Array positionen mit sehr kleinen Abmessungen zu konstruieren, wobei die Abstände der Arraypositionen typischerweise den Abmessungen der aktiven Elektrodenflächen von 30 µm bis 300 µm entsprechen, aber auch wesentlich größer oder kleiner sein können, wenn Applikationen dies erfordern.

Wie in Fig. 1d dargestellt, werden für spezielle Anwendungen, dies sind insbesondere quantitative volta metrische Meßverfahren wie das Redox-Recyling, die Array positionen durch volumenseparierende Mikrokompartments voneinander abgetrennt. Im Falle qualitativer Detektion, wie lokale Impedanzspektroskopie an sensorgebundenen Fänger molekülen ist die Volumenseparierung in der Regel nicht erforderlich.

Volumenkompartimentierte Mikroareale werden auch dann benutzt, wenn Reaktionen und Molekülimmobilisierungen auf individuellen Arraypositionen ausgeführt werden sollen. Falls die Detektion dies erfordert, können diese Kompart ments wahlweise nach ausgeführten Immobilisierungsreaktionen wieder entfernt werden. Damit ensteht ein ideal planares Sensorarray, das homogen sowohl für Analyt- als auch Reagenzlösungen zugänglich ist.

Mittels Stempel-, Piezo- oder Tintenstrahltechnik oder anderen Spottingverfahren, wie Mikrokapillardosierung können die zu immobilisierenden Moleküle ebenfalls auf den Sensor arrayflächen ohne Kompartimentierung lokal positioniert werden.

Die zu immobilisierenden Fängermoleküle selbst werden nach bekannten Verfahren über bifunktionelle Reagenzien z. B. Alkyloxisilane mit verschiedenen funktionellen Gruppen wie Halogen-, Amino-, Thioester- und Aldehydgruppen, Succinimid-, Carbodiimid- und andere gebräuchliche Kopp lungsgruppen [H. G. Bäumert and H. Fasold, Methods in Enzymology, Vol. 172, p. 584] an die Oberflächen der planaren Trägerelemente wie z. B. Siliziumdioxid, Glas, Keramik oder Polymere oder auch an die Wandungen der Si- oder polymeren Mikrokompartments gebunden.

Eine bevorzugte Immobilisierungsform ist die Nutzung der Gold- und Platinoberfläche als Immobilisierungsareal für Thiolderivate von Fängermolekülen, die sog. selbstorganisie rende molekulare Monolayer auf diesen gut definierten Elektrodenoberflächen ausbilden [S. D. Evans et al., J. Amer. Chem. Soc. 113 (1991) 5866].

In einer anderen Ausführungsform werden die im ganzen mit Self-assembling-Schichten auf den Elektroden belegten Arraypositionen teilweise wieder gereinigt. Moleküle, die sowohl auf Detektions- als auch Hilfsflächen gemeinsam auf den Metalloberflächen immobilisiert wurden, können durch Applikation elektrischer Felder gezielt von den Detektor elektroden wieder desorbiert werden. Durch elektrische Potentiale wird die Desorption von Thiolen erreicht, so daß die Detektionselektroden frei von Beschichtungen werden. Sie können dann Produkte detektieren, die z. B. auf anderen Flächen der Sensorarrayposition, wie den metallischen Hilfsflächen gebildet werden.

Alternativ zu den vorstehend beschriebenen Thimobilisie rungen von affinitätsbindenden Molekülen auf den Elektroden oder Hilfselektroden oder metallischen Hilfsflächen bzw. den Wandungen oder anorganischen Teilflächen der einzelnen Sensorareale können diese affinitätsbindenden Moleküle wahlweise auch über den Sensorpositionen angeordnet und dazu an partikulären oder gelartigen Trägern gebunden werden. In dieser Form ist es möglich, die Produkte der Enzymmarker von biochemischen Assays, die an kugelförmigen oder partikel förmigen Polymeren oder metallischen oder mineralischen Partikeln gebunden sind, in den o. g. Mikrokompartments anzuordnen oder mechanisch, beispielsweise durch Einschluß zu fixieren. Auch die Fixierung magnetischer Trägerpartikel in den Mikrokompartments durch Magnete unterhalb der Chips ist geeignet, unterschiedliche Sensorarraypositionen zu beladen.

Auch das Einbringen von Gelen mit inkorporierten affinitätsbindenden Molekülen oder Molekülkomplexen in den Mikrokompartments oder über die gesamte Sensorfläche ist möglich. Solche Gele können üblicherweise durch Diffusion oder elektrisch unterstützte Diffusion wie bei der Gelelek trophorese mit biochemischen Assays oder Assaykomponenten beladen werden. Durch die Anordnung mehrerer Ultramikroelek troden an jeder Arrayposition ist dies im Gegensatz zu anderen beschriebenen Verfahren an jeder einzelnen Sensor arrayposition unabhängig möglich.

In einer besonderen Ausführungsform werden die an der Arrayoberfläche immobilisierten Moleküle partiell in den Kompartments oder homogen über die gesamte Sensorarrayfläche mit einem diffusiblen Hydrogel bedeckt. Das Gel wirkt als Schutzschicht oder erleichtert den Molekültransort durch Elektrophorese.

Die Anordnung immobilisierter biochemischer Assays an Partikeln oder in Gelen über den Elektroden wird dadurch möglich, daß Detektionsverfahren wie das Redox-Recycling, die niedermolekularen von den Assays produzierten und an die Elektroden diffundierenden Enzymprodukte messen, solange die Wassereinlagerung in den Gelen oder Zwischenräumen zwischen Partikeln eine Diffusion gestatten. Das Redox-Recycling selbst ist durch die geringen Distanzen zwischen den Ultramikroelektroden dadurch ausgezeichnet, daß aufliegende Partikel oder Gele solche Detektionen nicht stören, da sie vorzugsweise in oder nahe der molekularen Doppelschicht, die durch Polarisation an den Elektrodenoberflächen entsteht, verlaufen. In gleicher Weise ist auch eine impedimetrische Detektion an den Ultramikroelektroden im Gegensatz zu üb lichen Verfahren, die weit voneinander entfernte Elektroden nutzen [V. M. Mirsky et al. Biosensors & Bioelectronics 12,9-10 (1997) 977] weitgehend partikelunabhängig. Bei Ultramikroelektroden mit einem Elektrodenabstand von 200 nm und ca. 1 µm langen DNA-Molekülen, die an deren Oberfläche in größter Nähe zueinander affinitätsgebunden sind, verläuft das elektrische Feld zwischen 2 Bandelektroden im wesent lichen durch die Moleküle selbst, wobei weiter entfernte Partikel ebenso wie der Grundelektrolyt in der Lösung wenig Einfluß haben.

Ein besonderes Merkmal der Erfindung ist die individu elle Kontrolle elektrochemischer Prozesse zur Detektion an jeder einzelnen Arrayposition unabhängig in der Weise, daß durch elektrisches Auslesen und damit verbundenes Schalten diese Prozesse nicht gestört werden. Erfindungsgemäß wird dies dadurch erreicht, daß die Elektrodenpolarisation wie sie beispielsweise für das voltametrische Redox-Recycling benötigt wird, an allen Arraypositionen individuell erzeugt werden muß. Dies ist problemlos durch Multipotentiostaten mit direkten Leiterbahnen zu jeder Chiparrayposition und jeder Einzelelektrode simultan und parallel möglich [R. Hintsche et al. Biosensors & Bioelectronics 9 (1994) 697]. Da auf diese Weise die Zahl der möglichen Arraypositionen sehr durch den elektronischen Aufwand beim Meßgerät begrenzt ist und auch durch die Zahl der Leiterbahnen limitiert ist, werden erfindungsgemäß die einzelnen Detektorelektroden seriell, d. h. nacheinander vermessen. Vorbedingung ist dabei, daß die elektrischen Potentiale zur Polarisation für Anode und Kathode beim Redox-Recycling auch dann erhalten bleibt, wenn die Elektroden einzeln nacheinander oder in Gruppen mittels individueller Schalter an das Meßgerät angeschlossen werden.

In der einfachsten Ausführungsform mit direkter Kontaktierung der Elektrodenarraypositionen nach Fig. 1 wird dazu ein ASIC benutzt. Bezüglich der Messung hat er die Funktionalität eines Multiplexers, d. h. die individuell mit dem ASIC verbundenen Sensorpositionen werden seriell adressiert und auf einen einzigen Bipotentiostaten zur Auslesung geschaltet. Abweichend von einer einfachen Ausführung sind jedoch die einzelnen Schalter des Multi plexers nicht als Ein-Aus-Schalter sondern als Umschalter ausgelegt. Im nicht adressierten Zustand verbinden sie die Sensorpositionen mit einer Biasspannung, die der Aufrechter haltung der Elektrodenpolarisation während des Nichtlese zustands dient.

In einer komplexeren Ausführungsvariante wird die störungsfreie Umschaltung eines größeren Arrays von Sensor elektroden erfindungsgemäß, wie in Fig. 3 dargestellt, dadurch erreicht, daß neben üblichen Adress- und Meßleitun gen, wie sie für elektronische Speicher seit langem verwen det werden, zusätzliche potentialführende Leitungen, soge nannte Biasleitungen angeordnet werden. Die Adressierung wird dabei von einem Adressierelement, das außerhalb des eigentlichen elektrischen Sensorarrays entsprechend Detail 10 in Fig. 3 angeordnet sein kann, über die Adressleitun gen 14/15 und 16/17 ausgeführt werden. Die Meßleitungen 18 und 19 in Fig. 3 und die Biasleitungen 20 und 21 werden dabei von speziellen Leseverstärkern 11 ausgelesen, die ebenfalls außerhalb des eigentlichen elektrischen Sensor arrays angeordnet sind. Durch die Meßleitungen 18 werden dabei alle Elektroden 3 auf den unterschiedlichen Sensor arraypositionen erfaßt und gemessen, während die Meßleitung 19 alle Interdigitalelektroden 3' in Fig. 3 messen kann. In analoger Weise können alle Elektroden 3 von der Biasleitung 21 mit der gleichen Polarisationsspannung, die z. B. für die Oxidation einer zu detektierenden Molekülart erforderlich ist, versorgt werden. In gleicher Weise können alle Elek troden 3' durch die Biasleitung 20 mit dem Potential für die Elektrodenpolarisierung, das für eine Reduktion notwendig ist, versorgt werden. Die an jeder Sensorposition integrier ten Umschalteinrichtungen 12 und 13 bewirken dabei die Umschaltung zwischen Lese- und Nichtlesezustand. Beim Lesezustand wird die ablaufende elektrochemische Reaktion meßtechnisch über die Meßleitungen erfaßt und gleichzeitig mittels des Multipotentiostaten gesteuert. Im Nichtlese zustand werden die elektrochemischen Vorgänge, z. B. Oxida tion oder Reduktion, durch die Biasleitungen 21 für 3 und 20 für 3' kontinuierlich mit den Polarisationsspannungen versorgt und kontrolliert. Die Schaltelemente 12 und 13 werden z. B. mit konventioneller CMOS-Technologie mit üblicher Halbleitertechnologie in Siliziumwafern an jeder Arrayposition lokal angeordnet. Über diesen integrierten CMOS-Schaltern, an die Meß-, Bias- und Adressleitungen geführt werden, befindet sich eine flüssigkeitsresistente Isolationsschicht, z. B. aus Siliziumoxinitrit, wahlweise in Kombination mit Siliziumdioxid. Der Kontakt zwischen den Schaltelementen 12 und 13 und den individuellen Elektroden 3 und 3', die in der beschriebenen Dünnfilmtechnologie auf dieser Isolationsschicht durch Elektronenstrahlverdampfen oder Sputtern und ähnliche Prozesse aufgebracht werden, wird durch eine senkrechte Durchkontaktierung zur CMOS-Element ebene im Silizium erzeugt. Alle Strukturen oberhalb dieser flüssigkeitsresistenten Isolationsschicht entsprechen den in Fig. 1 und 2 dargestellten Details mit dem Unterschied, daß die in Fig. 1 gezeigte direkte Kontaktierung durch Leiterbahnen entfällt. Die besondere Konstruktion der integrierten CMOS-Schalteinrichtungen 12 und 13 ermöglicht es, das Umschalten vom Lese- in den Nichtleseprozeß für die interdigitalen Ultramikroelektroden ohne Einfluß zu reali sieren. Dies ist notwendige Voraussetzung für den gesamten meßtechnischen Prozeß, da sich durch die Elektrodenpolari sation an der Elektrodenoberfläche eine elektrochemische Doppelschicht ausbildet, die als eine Art chemisches Gedächtnis während des Schaltprozesses erhalten bleiben muß.

Der Umschaltprozess dauert nur Mikrosekunden, so daß während dieser Zeit die Elektrodenkapazitäten als Spannungs speicher wirken. Danach ist die Versorgung der Elektroden mit Polarisationsspannung von den Meßleitungen 18 und 19 auf die Biasleitungen 20 und 21 umgeschaltet.

In Fig. 3 stellen die schwarzen Vollkreise 12 die jenigen Schaltelemente dar, die im Lesezustand von den Meßleitungen 18 und 19 mit der Polarisationsspannung versorgt werden und durch diese Leitungen auch mit den Leseverstärkern zur Detektion des elektrochemischen volta metrischen oder impedimetrischen Ereignisses verbunden sind. Die Adressierung vom elektronischen Element 10 erfolgt dabei reihenweise, so daß sich, wie schematisch dargestellt, mehrere Sensorarraypositionen im Lesezustand befinden. Sie können durch das meßtechnische Element mit Leseverstärkern 11 nacheinander, mit einem Leseverstärker oder parallel mit zwei Leseverstärkern ausgelesen werden bzw. der elektroche mische Vorgang verfolgt werden. Die reihenweise Adressierung durch die Adressleitungen 14 und 15 erlaubt eine beliebige Verlängerung dieser Reihe adressierter Arraypositionen und beliebig viele Elemente, die jeweils wieder durch die Meßleitungen nacheinander oder parallel durch Leseverstärker ausgemessen werden können. Nach Beendigung des Meßereignis ses an dieser senkrechten mit schwarzen Schaltelementen dargestellten Reihe von Sensorarraypositionen kann die benachbarte senkrechte Reihe mit den bisher inaktiven Schaltelementen 13 durch die beiden Adressleitungen 16 und 17, die jeweils die Elektroden 3 oder 3' ansteuern, in die Meßposition wie vorstehend beschrieben umgeschaltet werden. Dies geschieht, nachdem die vorher in Lesezustand befind liche Reihe auf den Nichtlesezustand umgeschaltet wurde. So fortschreitend kann einzeln oder in Reihen jede Sensorarray position wie in der Speichertechnik üblich, adressiert und ausgelesen werden. Diese Meß-, Bias- und Adressleitungen können in der Siliziumebene durch eine sog. Mehrlagenver drahtung realisiert werden, wie sie in der Siliziumtechnolo gie für elektronische Bauelemente üblich ist.

In einer anderen spezifischen Ausführungsform, die in Fig. 4 schematisch dargestellt ist, werden die elektrischen Sensorarrays zusätzlich neben den CMOS-Schalteinrichtungen 12 und 13 zusätzlich mit weiteren integrierten Elementen zur Auslesung, Verstärkung und gegebenenfalls zur Zwischen speicherung ausgerüstet. Dabei wird der Lesezustand, wie vorstehend zu Fig. 3 beschrieben, in gleicher Weise durch die Adressierleitungen 14 und 15 bestimmt und die übrigen Arraypositionen mit den Adressleitungen 16 und 17 über die Biasleitungen 20 und 21 kontrolliert und durch die Meß leitungen 18 und 19 ausgelesen. In den elektronischen Elementen 22 und 23 in Fig. 4 sind an jeder Arrayposition und an jeder individuellen Elektrode 3 und 3' elektronische Verstärker angeordnet. Dabei wird an der Arrayposition direkt das elektrochemische Meßsignal, was durch die Elektrodenprozesse generiert wird, über Vorverstärker verstärkt und kann dann entsprechend Fig. 3 über die Meß leitungen 18 und 19 im adressierten Zustand ausgelesen werden. Bei dieser Verfahrensweise sind die nichtadressier ten Leseverstärker in den elektronischen Elementen 23 ohne Funktion.

In einer besonderen Ausführungsform werden in die elektronischen Elemente 22 und 23 zusätzlich elektronische Speicher integriert. Da der elektrochemische Prozeß durch die konstant erhaltene Elektrodenpolarisation auch in den Zeiten abläuft, in denen sich Elektrodenarraypositionen im Nichtlesezustand befinden, wird diese Zeit genutzt, um über die Leseverstärker das in den Ultramikroelektroden generier te Signal in einem elektronischen Zwischenspeicher zu akku mulieren und abzuspeichern. Bei dieser Ausführungsform wird das an den Elektroden generierte Signal über Leseverstärker in einen Zwischenspeicher gegeben, der beim Lesevorgang über die Meßleitungen ausgelesen wird. Danach wird beim Lesevor gang das während der gesamten Zeit im Nichtlesezustand im Speicher akkumulierte elektrochemische Ergebnis sehr rasch ausgelesen. Es ist bei dieser Anordnung nicht notwendig, längere Meßzeiten während eines Auslesevorganges in Kauf zu nehmen. Die besondere Konstruktion mit den zusätzlichen Biasleitungen macht diese Art der Meßwertgewinnung und Zwischenspeicherung möglich. Man erreicht auf diese Weise eine erhebliche Beschleunigung des Ausleseprozesses und eine wesentliche Verbesserung des Nutzsignals verglichen mit der Ausführungsvariante in Fig. 3. In der Ausführungsvariante gemäß Fig. 4 lassen sich durch die Integration elektroni scher Komponenten an den einzelnen Arraypositionen auch elektrische Sensorarrays mit höherer Dichte der Array positionen (1000 und mehr) anordnen.

Typisch für die integrierten CMOS-Schalter und elek tronischen Zusatzelemente unterhalb der Arraypositionen im Silizium werden Standardtransistoren wie in Fig. 5 schematisch gezeigt als CMOS-Wanne 24 mit Source 25 und Drain 26 angeordnet. Gates und Leiterbahnen aus Polysilizium 31 verbinden wie auch CMOS-Aluminium 27 im CMOS-Dielektrikum 28 die chipinternen Elemente. Ebenfalls mittels Aluminium oder auch Wolfram wird die Kontaktierung der chip-inter nernen Elemente mit den Elektroden an den Sensorarrayposi tionen durch eine flüssigkeitsdichte Siliziumnitrid-Passi vierung 29 hindurch errreicht. Der Kreuzungsbereich 32 zeigt exemplarisch, wie sich Leiterbahnen kreuzen, z. B. die Adressleitung 15 mit Meßleitung 18 gemäß Fig. 4.

Die vorstehend beschriebenen mit verschiedenen elek tronischen Elementen ausgerüsteten elektrischen Sensorarrays eignen sich alle in gleicher Weise für eine Multianalytmes sung. Wie vorstehend beschrieben, wird die Immobilisierung unterschiedlicher affinitätsbindender Moleküle auf einzelnen Sensorarraypositionen, z. B. in den Mikrokompartments, ausgeführt, indem durch Mikrodosierung beispielsweise tintenstrahlanaloge Dosiertechnik (z. B. Piezodosierer) oder Mikrokapillardosierung die Reaktionslösungen zugeführt werden. Es ist ebenso möglich, durch Stempeltechniken individuell auf einzelne Positionen Moleküle aufzubringen, die dann reagieren oder haften. Beispielsweise werden Selfassembling-Schichten durch sog. Kontaktstempelung vom Stempel auf die Elektrodenoberfläche übertragen und damit individuell über eine Thiol-Goldbindung belegt.

Bei einer anderen Ausführungsform wird die Immobilisie rung durch aufgesetzte Mikrodurchflußsysteme bzw. Stempel für die Applizierung von Flüssigkeiten durch Ein- und Aus flußöffnungen über einzelnen Arraypositionen oder in Gruppen oder in Reihen erreicht. Die so mit unterschiedlichen affinitätsbindenden Molekülen ausgestatteten Arraypositionen aller Ausführungsformen werden dann mit einem Multianalyt gemisch in ihrer Gesamtheit in Kontakt gebracht. Dies kann durch Tauchen des Sensorarrays in die Analytlösung oder durch Einbau in eine Durchflußzelle oder durch Befüllen von Kompartments an den Einzelpositionen erfolgen. Die unter schiedlichen affinitätsbindenden Moleküle auf oder über den Arraypositionen binden durch ihre hohe Spezifität aus schließlich ihr Zielmolekül, sofern es im Analytgemisch vorhanden ist. Dieser Bindungsprozeß ebenso wie ein analoger Bindungsprozeß an immobilisierten Molekülen in Gelen oder auf Partikeln ist Voraussetzung für den folgenden elektro chemischen Detektionsprozeß. Die Verwendung von träger gebundenen Fängermolekülen erzielt hohe Beladungsdichten in einer Sensorarrayposition, da nicht nur die Flächen, sondern das Volumen genutzt werden.

Für das Redox-Recycling werden Enzymmarker verwendet, die entweder mit dem Zielmolekül an die Sensorarrayposition eingeführt werden oder nach der erfolgten spezifischen Bindung durch sekundäre Bindungsprozesse wie Antikörper bindung, Interkalation, kovalente Anheftung und andere gebräuchliche Markierungsreaktionen gebunden werden. Die Markerenzyme, die sich nur an Arraypositionen befinden, an denen die molekulare Erkennungsreaktion stattgefunden hat, werden mit einem elektrochemisch inaktiven Substrat z. B. p-Aminophenylphosphat versetzt, das dann durch die Enzym reaktion in ein elektrodenaktives Produkt das p-Aminophenol umgewandelt wird. Im zyklischen Prozess einer an Anode und Kathode der bandförmigen Ultramikroelektroden ablaufenden Oxidation und Reduktion wird ein Summenstrom ermittelt, der mit der Menge der an dieser Arrayposition gebundenen Moleküle streng korreliert. Bezogen auf gebundene Analyt moleküle muß die Menge eingeführten Markerenzyme quantitativ und stöchiometrisch sein. Nutzt man die zur Immobilisierung hergestellten Mikrokompartments auch zur Volumentrennung bei dieser Art Detektion aus, ist die in jedem Mikrokompartment entstehende Konzentration an elektroaktiven Spezies ein quantitatives Maß für die Zahl der an dieser Arrayposition individuell stattgefundenen Erkennungsreaktionen. Auf diese Weise bedeutet das Fehlen einer elektrochemischen Reaktion auch das Ausbleiben des Erkennungsereignisses und damit die Abwesenheit des gesuchten Analyten an der jeweiligen Arrayposition.

Die von den Enzymmarkern für das Redox-Recycling erzeugten elektrodenaktiven Moleküle können problemlos in wasserhaltigen Gelen an die Elektrodenoberfläche diffundie ren. Auch aus einer Partikelpackung über dem Elektrodenarray diffundieren sie über die Flüssigkeit zwischen den festen Partikeln, wobei im geringen Restvolumen besonders rasch eine Konzentrationserhöhung herbeigeführt wird.

Da sich der Detektionsprozeß durch das Ultramikroelek trodenverhalten nur unmittelbar an der Elektrodenoberfläche abspielt, ist die bestimmende Zone die Elektrodendoppel schicht und wenige Moleküllagen darüber. Dadurch ist die Methode unabhängig von Konvektion und allein durch die Braun'sche Molekularbewegung bestimmt, so daß jegliches aktives Rühren unterbleiben kann und zum Beispiel mit Stop- Flow-Verfahren oder geschlossenen Kammern und Mikrokompart ments gearbeitet werden kann.

In einer anderen Ausführungsform, wenn die Mikrokom partments nach erfolgter Immobilisierung wieder entfernt wurden, erhält man nur qualitative Aussagen für die An- oder Abwesenheit von Analyten unter der Bedingung, daß die Konvektion sich bildender Markerenzymprodukte genügend unterdrückt wird, z. B. durch ausreichenden Abstand der Positionen und stopped flow Analytik.

In einer weiteren Ausführungsform werden die planaren Sensorarrays zur Redox-Recycling-Detektion wieder mit volumentrennenden Elementen für die Arraypositionen ver sehen. Dies kann beispielsweise auch durch das Aufsetzen der vorstehend zur Immobilisierung beschriebenen Stempel erfolgen. Es lassen sich damit Einzelsensorarraypositionen, Gruppen von Arraypositionen oder Reihen von Arraypositionen separat erfassen und messen.

Bei einer anderen Ausführungsform, die die elektroche mische Impedanzspektroskopie als Detektionsmethode verwendet, werden ebenfalls die in Fig. 1, 3 und 4 beschriebenen Anordnungen der elektronischen Schalt- und Zusatzelemente Wechselstrom verwendet. Die Spezifität dieser Meßmethode und der Abstand der Elektroden in den nm-Dimensionen machen es möglich, eine solche Reaktion markerfrei zu vermessen.

Zur Messung werden Wechselströme mit bestimmter Frequenz oder Frequenzgemische von 0,1 Hz-1 MHz auf eine Biasspannung von vorzugsweise 10-200 mV aufgeprägt, die in der gleichen Weise wie die Elektrodenpolarisation für die voltametrischen Methoden an die Arraypositionen angelegt wird. Bei dieser Detektionsmethode werden Elektrodenabstände < 500 nm, bevorzugt 20-200 nm, verwendet. Wie bei den Ausführungsvarianten für das Redox-Recycling werden die auf oder zwischen den Elektrodenoberflächen in der Sensorarray position immobilisierten, affinitätsbindenden Moleküle mit dem Gemisch verschiedener Analyte zusammengebracht und die molekulare Erkennungsreaktion läuft wie voranstehend beschrieben ab. Mit den durch die geringen Elektroden abständen erzielbaren starken elektrischen Feldern von einigen MV/m kann auf jeder Position individuell vermessen werden, wie die affinitätsbindenden Moleküle die Elektroden oberfläche bedecken. Dies zeigt sich entsprechend der Bedeckung der Oberflächen durch die Abnahme der Kapazität der Ultramikroelektroden. Erfolg der Immobilisierung und Bedeckungsgrad lassen sich auf diese Weise quantitativ verfolgen. Die mit affinitätsbindenden Fängerelektroden versehenen einzelnen Sensorarraypositionen werden individu ell mittels Impedanzspektroskopie vermessen, wobei Kapazi tät, Leitfähigkeit und Dielektrizitätskonstante sowie der Phasenwinkel durch die Messung und ihrer Auswertung sepa riert werden können. Nach erfolgter Erkennungsreaktion an einer einzelnen Arrayposition, die üblicherweise mit einem größeren Biomakromolekül erfolgt, bildet sich ein großer Molekülkomplex, der typischerweise größer ist als der Abstand zwischen zwei Elektroden. Das elektrische Feld reicht dabei nicht erheblich über diese Molekülkomplexe hinaus und erfaßt so nur die elektrodennahen Bereiche, so daß schwebende Partikel nicht stören. Eine neue Impedanz messung nach erfolgten Erkennungsreaktionen mit den gleichen Parametern wird zur Differenzbildung benutzt. Eine sichtbare Veränderung gibt Auskunft darüber, an welchen Positionen Komplexbindungen stattgefunden haben. Die Impedanzänderung wird durch die Verdrängung des Elektrolyten und Beeinflußung des elektrischen Feldes z. B. durch geladene DNA-Moleküle hervorgerufen.

Im Unterschied zum quantitativen Redox-Recycling ist die impedanzspektroskopische Detektionsmethode semiquanti tativ und gestattet eine Aussage über stattgefundene oder nicht stattgefundene molekulare Erkennungsreaktionen. Die Parameter, die bei der Impedanzspektroskopie ausgewertet werden, erlauben Aussagen über die Größe der Moleküle, die an der Elektrodenoberfläche bei der Erkennungsreaktion gebunden haben sowie über den Ladungszustand dieses Mole küle. Auch die Dichte der Molekülbelegung hat Einfluß auf das Meßergebnis. Alle Parameter können zur näheren Analyse des molekularen Erkennungsvorgangs und der beteiligten Partner herangezogen werden.

In einer speziellen Ausführungsform wird das elek trische Sensorarray nach Immobilisierung der affinitäts bindenden Moleküle oder nach stattgefundener molekularer Erkennungsreaktion und entsprechender Waschvorgänge mit einem Hydrogel belegt. Diese Belegung mit Hydrogel kann für verschiedene Verfahren zur Anwendung der elektrischen Sensorarrays vorteilhaft sein. Bei der Bedeckung der oberflächengebundenen affinitätsbindenden Moleküle mit Hydrogel können z. B. die Analyte aktiv durch Dosierung oder elektrophoretisch durch Applikation elektrischer Felder mittels Hilfselektroden in das Gel und an die Affinitäts partner herangebracht oder durch Diffusionsprozesse zugeführt werden. Die Beschichtung mit Hydrogelen nach stattgefundener molekularer Erkennungsreaktion an den Oberflächen kann auch dazu verwendet werden, zusätzliche Marker oder Reagenzien durch elektrophoretische Prozesse oder Direktdosierung an die Molekülkomplexe heranzuführen und zu detektieren.

Alternativ werden Hydrogele benutzt, um partikelgebun dene immobilisierte Fängermoleküle oder nach stattgefundener molekularer Erkennungsreaktion immobilisierte Zielanalyte in den Mikrokompartments einzuschließen. Die Methode ist bevorzugt geeignet für die Anwendung des Redox-Recycling, da die diffundierenden Enzymprodukte durch das Gel wenig gehindert werden, an die Elektrodenoberfläche zu gelangen. Zu beobachten ist dabei lediglich eine Verlangsamung der Diffusion.

In einer anderen Ausführungsform werden die Hydrogele über das gesamte elektrische Sensorarray gleichmäßig auf gebracht und bewirken durch ihre Diffusionshemmung eine verbesserte Zuordnung der Bindungsvorgänge zu einzelnen Arraypositionen, ohne daß Mikrokompartments hergestellt wurden.

Die an den einzelnen Arraypositionen angeordneten Ultramikrodetektionselektroden und flächenförmigen oder mit Punktelektroden besetzten Hilfselektroden sowie die spiral- oder kreisförmig angeordneten Bandelektroden nach Fig. 2 können neben ihrer Verwendung für die Detektionsprozesse selbst auch zur Applikation elektrischer Felder im Sinne einer Freifeld- oder Gelelektrophorese eingesetzt werden. Für die Heranführung geladener Analytmoleküle oder Reagen zien an die Elektrodenoberflächen, z. B. an den Ort der molekularen Erkennungsreaktionen, können besonders vor teilhaft parallel angeordnete interdigitale Ultramikroelek troden nach Fig. 2b, 2c, 2d oder 2g verwendet werden. Dabei werden in einer Ausführungsform des Verfahrens die beiden Ultramikroelektrodenpaare in Fig. 2b, 2c und 2d beispielsweise in der Weise zu einem elektrophoretischen System geschaltet, daß immer zwei zusammengehörige inter digitalen Fingerpaare oder Paare von bandförmigen Ultra mikroelektroden einen Pol des elektrischen Feldes bilden. Je nach Polarisation und Ladung der Moleküle werden elek trophoretische Transportvorgänge eingeleitet. Verwendet man Felder mit niedriger Frequenz im unteren Hz- und mHz-Bereich, werden wechselseitig Moleküle an die Elektroden herange führt. Üblicherweise werden die elektrischen Felder in Sequenzen mit erzeugt. In den stromlosen Pausen können durch Elektrolyse gebildete Gase abdiffundieren und auch pH-Gradienten sich ausgleichen.

In einer anderen Ausführungsform werden die Hilfs elektroden wie in Fig. 2e und 2f zur Applikation der vorstehend beschriebenen elektrischen Felder benutzt. Sie können dabei die gleiche Polarisation aufweisen und gegen einen interdigitales Elektrodenpaar 3, 3' geschaltet werden, oder es wird das Feld zwischen den Hilfselektroden 3e und 3e' bzw. 3f und 3f' erzeugt, so daß die Moleküle in die Nähe der Detektionselektroden 3, 3' gezogen werden. Im Gegensatz zu den flächenhaften Hilfselektroden 3e und 3e' erlauben die Hilfselektroden 3f und 3f' durch die punktförmigen aktiven Elektrodenflächen mit Ultramikroelektrodencharakter eine wesentlich höhere Stromdichte pro Fläche durch die ver besserte Diffusion. Auch durch die Elektrodenkonstruktion 3g und 3g' kann eine wesentlich höhere Stromdichte pro Fläche als für 3 und 3' erreicht werden. Im Ergebnis dieser punkt förmigen Strukturierung gibt sich durch hemisphärische Diffusion der Vorteil, daß eine wesentlich höhere Strom dichte pro Fläche erreicht werden kann, trotzdem die aktive Elektrodenfläche verkleinert ist.

Diese Ausführungsform zur Heranführung von Analyt oder Reagenzmolekülen an die Elektrodenoberfläche wird ergänzt durch die gleichzeitige Verwendung der Detektions- und Hilfselektroden zur Erzeugung elektrischer Felder nach stattgefundener Erkennungsreaktion. Bei dieser Verfahrens weise werden die schon bei niedriger Spannung unter 1 V entstehenden erheblichen Feldstärken zwischen den Elektroden dazu genutzt, daß schwach gebundene Moleküle von ihrem Affinitätspartner im Unterschied zu stärker gebundenen Molekülen von den Detektionselektroden wieder entfernt werden können. Schon das einfache Ultramikroelektrodeninter digitalpaar in 3, 3' in Fig. 2c gestattet die Beseitigung schwächer und damit falsch gebundener Molekülkomplexe. Dazu wird das applizierte Feld zwischen Elektrode 3 und 3' als Wechselfeld mit niedriger Frequenz (wenige Hz oder mHz) benutzt, von beiden Elektroden unerwünschte Spezies zu entfernen. Das Wechselfeld mit niedriger Frequenz bewirkt dabei, daß immer die Elektrode, die gleich zur Ladung des unerwünschten Moleküls geladen ist, durch ihr hohes Feld die Abstoßung dieses Moleküls bewirkt. Durch die Wechselfelder werden beide Elektroden nacheinander in diesen abstoßenden Zustand versetzt und die Reaktion findet im Summenergebnis auf beiden Interdigitalsystemen statt. Die Feldapplikation wird nach kurzer Zeit, d. h. wenige zehntel bis Sekunden durch Pausen unterbrochen, in denen Gase und pH-verändernde Spezies abdiffundieren können. Die Reaktion kann durch biochemische Waschvorgänge oder durch Temperaturveränderung unterstützt werden. Eine Temperaturkontrolle kann sowohl extern als mit auf den Chips aufgebrachte Heizer aus Dünnfilmmetallbändern wie Platin realisiert werden.

Mit multiplen Ultramikroelektrodenanordnungen, wie in 2b, 2d, 2e, 2f und 2i, ist die Anwendung des Prozesses, wie für 2a beschrieben, für jedes Paar interdigitaler oder bandförmiger Ultramikroelektroden möglich. Prinzipiell kann dieser Prozeß durch Kombination beliebiger Detektor- und/oder Hilfselektroden mit dem gleichen Verfahren der niedrigfrequenten Feldumpolung und der Beseitigung schwach bindender bzw. unerwünschter Moleküle von den Elektroden oberflächen benutzt werden.

Als besondere Ausführung werden die in Fig. 2b, 2e, 2f und 2i außen liegenden Elektroden zur Felderzeugung ver wendet, während die dazwischen liegenden Elektroden stromlos sind. Diese Art der Applikation kann auch zur Heranführung von Molekülen an die zwischenliegenden Elektrodenpaare benutzt werden, da sich diese in einer Art Feldkäfig befinden. Mit den gleichen multiplen Anordnungen sind überdies auch kombinierte Gleich- und Wechselstromapplika tionen, Umpolungen sowie wahlweise Adressierung der Einzel elektroden möglich und damit gezielte Effekte der Molekül heranführung und der Molekülbeseitigung an beliebigen Elektroden zu erzielen.

In den Ausführungsformen gemäß Fig. 2e und 2f lassen sich die flächenförmigen oder mit Punkten besetzten Hilfs elektroden so einsetzen, daß jeweils zu einer oder beiden Ultramikroelektroden die gewünschte Polung der Elektroden zur Beseitigung von Molekülen vorliegt. Hier ist die Gleichstrom oder die niedrigfrequente Wechselstromappli kation über Kreuz, z. B. in Fig. 2e zwischen 3e und 3', bzw. zwischen 3e' und 3 möglich. Damit lassen sich die Einzel elektroden selektiv behandeln. Die unterschiedliche Behand lung der Elektrodensysteme in 2b, 2d, 2e und 2f läßt sich in einer anderen Ausführung auch dazu verwenden, daß an einzelnen Elektroden unerwünschte Bindungen beseitigt werden und an anderen bestehen bleiben, so daß aus der Differenz messung auf die Differenzmenge geschlossen werden kann.

An den kreisförmigen Elektroden gemäß Fig. 2b oder spiralförmigen analogen Strukturen sind die vorstehend beschriebenen Verfahren zur Verwendung der elektrischen Felder dadurch besonders geeignet, daß durch eine zentrale Elektrode eine Art Feldkäfig über die dazwischen liegenden Elektroden gelegt werden kann, so daß diese auch im strom losen Zustand von diesem Feld in gewünschter Weise zur Entfernung oder Heranführung von Molekülen genutzt werden können.

Die punktförmigen Ultramikroelektrodenanordnungen in Fig. 2h können in einer anderen Ausführungsform vorteilhaft zur Erzeugung elektrischer Felder sowohl zur Anreicherung von Molekülen als auch zur Entfernung von Molekülen einge setzt werden. Dazu werden diese Elektroden an verschiedenen Stellen eines Sensorarrays z. B. als außen liegender Ring oder konzentriert in Innenposition oder durch Kombination von beiden ausgewählten Positionen eines Sensorarrays angeordnet. Sie dienen zur Erzeugung starker Felder an anderen Arraypositionen über den Raum des Sensorarrays hinweg durch besonders hohe Stromdichten. Die erzielbare hohe Stromdichte bei vergleichsweise niedrigen Spannungen erzeugt Feldkäfige, die den Transport von geladenen Mole külen nach elektrophoretischen Prinzipien besonders ver bessern.

Ausführungsbeispiele Beispiel 1 Herstellung eines elektrischen Sensorarrays mit direkter Kontaktableitung in Siliziumtechnologie

Mikroelektrodenstrukturen entsprechend Fig. 1 und 2a werden in Standardsilizium-technologie hergestellt. [K. Reimer et al. Sensors and actuators, A 46/47 (1995) 66]. Dazu wird 500 nm dickes thermisches Oxid auf 4"-Silizium wafern erzeugt. Auf dem Oxid wird Fotolack photolitho grafisch so strukturiert, daß die Konturen der Elektroden für die Elektrodenstrukturen freiliegen. Das Ultramikro elektrodensystem konzentrischer Ringe gemäß Details in Fig. 2a besteht aus ringförmigen Elektrodenbändern mit 1,5 µm Breite im Ringabstand von 800 nm. Die Ringe sind abwechselnd über die Leiterbahnen 6 mit den Kontakten gemäß Fig. 2a verbunden. Es sind 16 Sensorarraypositionen in einer 4 × 4 Matrix mit Arraypositionen von 300 µm Durch messer auf dem Sensorarray angeordnet. Die 2 × 16 Ableit kontakte befinden sich auf zwei benachbarten Seiten des 1 × 1 cm großen Siliziumchips. Die Abstände der Sensorarray positionen betragen 400 µm, so daß ein aktives Sensorarray gebiet von ca. 2,5 mm × 2,5 mm entsteht.

Durch 15 sec Tauchen in 10%ige Flußsäure wird das Oxid ca. 150 µm tief angeätzt. Eine 20 nm dicke Titanhaftschicht und eine 150 nm dicke Goldschicht werden auf die gesamte Oberfläche mittels Elektronenstrahl aufgedampft. Durch einen Lift off-Prozeß wird alles Material zwischen den Elektroden, Leiterbahnen und Kontakten beseitigt. Der Wafer wird anschließend mit einer 400 nm dicken Silizium-Oxinitrid schicht bedeckt, die im Plasma durch chemische Abscheidung (PECVD-SiN_x:H) erzeugt wird. Im folgenden werden die Array positionen und den außenliegenden Kontaktflächen durch reaktives chemisches Trockenätzen bis auf die Goldflächen freigelegt. Nach Aufschleudern eines Schutzlackes wird der Wafer von der Rückseite entsprechend der vorgesehenen Einzelchipkanten ca. 250 µm tief von der Rückseite ein gesägt.

Beispiel 2 Herstellung eines elektrischen Sensorarrays mit direkter Kontaktierung auf Glas

Auf 4"-Pyrexglaswafern werden mit einer dem Beispiel 1 entsprechenden Photolithographie Interdigitalelektroden arrays entsprechend Fig. 2e mit 9 Sensorpositionen im Raster 3 × 3 strukturiert. Dazu wird abweichend von Bei spiel 1 auf das Glas eine 20 nm dicke Chromhaftschicht gefolgt von einer 150 nm dicken Platinschicht aufgedampft und wie im Ausführungsbeispiel 1 durch Liftoff-Technik fertig strukturiert. Als Haftvermittler für die folgende Isolationsschicht wird eine 3%ige Lösung von Alkyloxysilan in Aceton mit der Oberfläche in Kontakt gebracht. Die 400 µm großen Sensorarraypositionen im Abstand von 500 µm werden nach Aufschleudern einer 10 µm dicken Polyimidschicht mit Standard-Photolithographie so strukturiert, daß die Kontakt flächen und die Sensorpositionen freigelegt werden. Das Interdigital-Elektroden-System mit Hilfselektroden ent sprechend Fig. 2e besteht an jedem Elektrodenfingersystem aus 90 je 200 µm langen und 1 µm breiten Fingern, wobei die Interdigitalabstände 0,9 µm betragen. Die Hilfselektroden 3e und 3e' sind wie in der Fig. 2e dargestellt, bis 50 µm vom Rand der Sensorarrayposition flächig ausgeführt. Wie im Beispiel 1 wird der Wafer geschützt und eingesägt.

Beispiel 3 Herstellung eines elektrischen Sensorarray-Systems mit CMOS- Schaltern

Die Schalterebene wird mit einem CMOS-Standardprozess [D. Widmann, H. Mader, H. Friedrich, Technologie hoch integrierter Schaltungen, Springer Berlin 1996] in einem Prozeß mit 1 µm Minimalstrukturen hergestellt. Die nach Fig. 3 erforderlichen Kreuzungen von Leiterbahnen werden durch Überkreuzungen von Polysilizium- und Aluminium-Bahnen realisiert. Der größere elektrische Widerstand spielt wegen der kleinen Sensorströme keine Rolle. Im verwendeten CMOS- Prozess werden die Schalter 12 und 13 vorteilhaft als Transmission-Gates ausführen. Jeweils ein Transmission-Gate verbindet die Punkte 12a mit der Leitung 18 bzw. den Punkt 13a mit der Bias-Leitung 21. Die Adress-Leitungen bestehen aus einem parallel laufenden Paar von Leiterbahnen, an denen Signale komplementärer Polarität zu den Gates der beiden Transistoren eines Transmission-Gates geführt werden. Bei der einen Polung ist das Transmission-Gate 12a-18 leitend und das Transmission-Gate 13a-21 sperrend. Bei der umgekehr ten Polung ist 12a-18 sperrend und 13a-21 leitend. Die Transmission-Gates schalten sowohl positive als auch negative Ströme. Zusätzlich zu den üblichen Anschlußpads einer CMOS-Schaltung an den Rändern des Chips enthält die Schaltung nach Fig. 3 an den Stellen 12a und 13a Aluminium pads, mit denen die Verbindung zu den Elektroden-Ar 19358 00070 552 001000280000000200012000285911924700040 0002019916921 00004 19239rays hergestellt wird. Standardmäßig wird der CMOS-Prozeß mit der Aufbringung einer PECVD-Nitridschicht und Öffnung der Anschluß-Pads in dieser passivierenden Schicht abge schlossen. Auf diese Isolationsschicht werden mit gleicher Lift off-Technik, wie in Ausführungsbeispiel 1 dargestellt, Haftschicht und Goldelektroden direkt aufgedampft und wie oben beschrieben photolithographisch strukturiert. Eine weitere Passivierung ist nicht vorgesehen, da die Kontakte von den Interdigital- und Hilfselektroden direkt senkrecht in die darunterliegende Schalterebene geführt werden.

Beispiel 4 Herstellung eines elektrischen Sensorarrays mit Schaltern, Verstärkern und Integrator in CMOS-Technologie

Für die Herstellung des Ausführungsbeispiels nach Fig. 4 wird der gleiche CMOS-Standard-Prozess, sowie die gleiche Elektroden und Leitungsanordnung benutzt, wie unter Beispiel 3 beschrieben wurde. In der 1 µm-Technologie werden diese Bauteile auf einer Fläche von 300 µm × 400 µm angeord net. Zwischen den Elektroden und den Transmission-Gates, die zu den Meßleitungen 18, 19 führen, liegt jetzt ein Operationsverstärker und eine integrierte Kapazität von 1 pF, die den Ausgang mit dem Eingang des Operationsver stärker verbindet. Weiterhin liegt ein Schalter parallel zu dieser Kapazität. Von der Adressiereinheit 10 führen zusätzliche Steuerleitungen zu diesem Schalter, die ihn außerhalb der Meßzeiten geschlossen halten. In der beschriebenen Ausführung erzeugt ein Strom von 1 nA an den Elektroden am Ausgang des Operationsverstärkers nach 1 msec eine Spannung von 1 V. Diese Spannung wird wie in Beispiel 3 beschrieben mit Transmission-Gates auf die Meßleitungen 18, 19 geschaltet und mit dem Leseverstärker 11 gemessen.

Beispiel 5 Aufbau von Mikrokompartments mit vorgefertigten Polymeren

Elektrische Sensorarrays, wie sie nach Beispiel 1 bis 4 hergestellt worden sind, werden mit Aceton im Ultraschall bad von Schutzlack befreit und mehrmals mit Alkohol und Reinstwasser gewaschen. Im folgenden Schritt werden sie durch das Auflaminieren einer vorher perforierten 400 µm dicken Polypropylen-Folie mit Mikrokompartments versehen. Die Perforation entspricht dabei den Größen der Sensorarray positionen und den Kontaktflächen an den Außenrändern. Das Auflaminieren geschieht mittels Heißsiegel-Technologie durch induktive Erwärmung. Die Justage der mittels eines Vakuum stempels in Wafergröße aufgebrachten Folie wird mittels Justiermarken auf der Waferoberfläche durch optische Kontrolle vorgenommen. Der auf -10°C gekühlte Wafer wird entlang der vorgesägten Chipkanten gebrochen, so daß die einzelnen Chips erhalten werden.

Beispiel 6 Aufbau von Mikrokompartments mit photolithographisch strukturierten Polymeren

Elektrische Sensorarrays, wie sie nach Beispiel 1-4 aufgebaut wurden, werden mit Aceton im Ultraschallbad von Schutzlack befreit und mehrmals mit Alkohol und Reinstwasser gewaschen. Anschließend werden sie im Spin coat-Verfahren mit Teflon AF (DuPont) mit einem 15 µm dicken Film beschich tet. Zuvor wird der gesamte Wafer mit dem zugehörigen Haftmittel (DuPont) benetzt. Nach Ausbacken der Teflon schicht bei 150°C für 20 Minuten werden mittels reaktivem Trockenätzen die Gebiete der Sensorpositionen und der Kontaktpads bis zu den metallischen Oberflächen freigelegt. Der Wafer wird entlang der vorgesägten Chipkanten gebrochen, so daß die einzelnen Chips erhalten werden.

Beispiel 7 Immobilisierung von Oligonukleotiden auf elektrischen Sensorarrays

Ein nach Beispiel 5 hergestellter Chip mit 400 µm hohen polymeren Mikrokompartments wird auf einen Keramikträger mit üblichen Leiterbahnen montiert und drahtgebondet. Durch Aufkleben eines polymeren Formteils aus Polysiloxan entlang der Chipkanten, das die aktiven Elektrodengebiete eingrenzt, wird ein Reaktionsgefäß von ca. 5 mm Durchmesser auf dem Chip befestigt. In dieses Reaktionsgefäß wird eine 5 mM Lösung von 11-Merkapto-undecanyl-amin in Cyclohexanon, eingefüllt, abgedeckt und bei Raumtemperatur für 5 Stunden belassen. Die Belegung der Elektroden durch Self-assembling wird kontrolliert durch eine online-Impedanz-Messung (EG Model 398). Die abnehmende Kapazität durch die Belegung mit der monomolekularen Molekülschicht und ist ein Maß für die Bedeckung. Die Belegung wird abgebrochen, wenn die ursprüng liche Kapazität der Chipelektroden um 70% abgesunken ist.

Diese Belegung der Metalloberflächen kann alternativ auch vor dem Brechen und Vereinzeln der Chips durch Tauchen des gesamten vorher entlackten Wafers in die analogen Lösungen vorgenommen werden.

Die mit Aminofunktionen derivatisierte Oberfläche des Chips wird anschließend mit einem Tropfen (0,1-10 µl) 20 mM Tolylen-2,4-diisocyanat (TDI) in Essigsäureethylester (EEE) bei RT während 10-60 min inkubiert. Es wird mit EEE gewaschen und getrocknet.

Nach Waschen eines so aktivierten Chips mit neu tralerPhosphatpufferlösung werden mittels Mikrokapillar dosierung nacheinander in jede Sensorarrayposition je 5 nl 24mer-Oligonukleotid eingebracht, die am 5'-Terminus eine Jodoacetyl-Gruppe tragen.

Die Nucleotidsequenz ist an jeder Arrayposition unter schiedlich entsprechend der zu analysierenden verschiedenen Ziel-DNA-Moleküle. Dabei sind die Volumina der Reaktions flüssigkeiten kleiner als das Kompartimentvolumen. Die Kopplungsreaktion erfolgt spontan während einer Stunde bei Zimmertemperatur. Nach erfolgter kovalenter Anbindung wird das elektrische Sensorarray mit SSPE-Puffer (0,9 M NaCl, 50 mM NaH₂PO₄, 5 mM Na₂EDTA, pH 7,5) gewaschen.

Beispiel 8 Affinitätsbindung von DNA auf elektrischen Sensorarrays mit trägergebundenen Oligonucleotiden

Auf ein nach Beispiel 7 mit unterschiedlichen Fänger oligonukleotiden beladenes elektrisches Sensorarray wird der Analyt als DNA-Gemisch aufgegeben. Es wird Analyt-DNA verwendet, in welche bei der konventionellen Vervielfälti gung der DNA mittels PCR biotinylierte Primer Biotin-Reste eingeführt wurden. Die Analyt-DNA in SSPE-Puffer wird mit Denhardt's Lösung (0,5 g Ficoll, 0,5 g Polyvinylpyrrolidon, 0,5 g RSA in 0,5 l H₂O) in eine Konzentration von 1 µg/ml überführt und auf das Sensorarray aufgegeben und bei Raumtemperatur 2 Stunden inkubiert. Zur Entfernung über schüssiger Analyt-DNA wird bei 40°C mit SSC-Puffer (52,6 g NaCl, 26,5 g Na-Citrat in 0,8 l H₂O) gewaschen.

Beispiel 9 Immobilisierung von partikelgebundenen affinitätsbindenden Molekülen auf elektrischen Sensorarrays

Ein elektrisches Sensorarray, das nach Beispiel 1 hergestellt und nach Beispiel 5 mit Mikrokompartments versehen wurde, wird über einem üblichen Magneten zur Handhabung magnetischer Carrier plaziert. In jedes Mikro kompartment werden durch Mikrokapillardosierung 10 nl Flüssigsuspensionen magnetischer Polymerkügelchen mit unterschiedlichen Oligonukleotiden in appliziert und durch die Magneten am Boden der Mikrokompartments über den Elektroden fixiert. Die Beladung der magnetischen Träger erfolgte zuvor separat für alle Positionen nach einem Standardverfahren (Boehringer) durch Streptavidin/Biotin- Kopplung. Die Träger sind dabei oberflächlich mit Strepta vidin beschichtet und binden die 5'-biotin-modifizierten 24mer-Nukleotide. Über die Streptavidin/Biotin-Bindung wurden unterschiedliche Oligonukleotide fest auf den magnetischen Trägern immobilisiert.

Beispiel 10 Detektion der Affinitätsbindung an Oberflächen von elek trischen Sensorarrays

Elektrische Sensorarrays mit immobilisierten Oligonu kleotiden nach Beispiel 7 werden nach Hybridisierung analog Beispiel 8 zur Auslesung mittels Redox-Recycling vorberei tet. Dazu wird das gesamte elektrische Sensorarray mit 1,5 µl einer neutralen Phosphatpufferlösung des Markerenzyms alkalische Phosphatase, die als Streptavidinkonjugat vorliegt, befüllt. Die Biotin/Strepavidin-Bindung erfolgt während einer Stunde. Danach werden alle nicht gebundenen Enzymkonjugate mittels 2 mM p-Aminophenylphosphat in Phosphatpuffer pH 9,5 von der Sensoroberfläche weggespült. Nach Absaugen aller über die Mikrokompartments überstehenden Flüssigkeit wird die in jedem Mikrokompartment durch die Enzymreaktion entstehende p-Aminophenolkonzentration, die der Menge doppelstranggebundener DNS adäquat ist, individuell mit einem 16-Kanal-Multipotentiostaten (Eigenbau) gemessen. Für das Redox-Recycling werden die Ultramikroelektroden paarweise mit 2 verschiedenen Potentialen beaufschlagt. Die Anode mit +350 mv und die Kathode mit -100 mv gegen eine Silber/Silberchlorid-Referenzelektrode. Der anodische und der kathodische Strom jeder Arrayposition wird als Strom anstieg dI/dT an der jeweiligen Sensorposition ausgewertet. Man erhält einen Stromanstieg von 0,5 bis 2 nA pro Minute je nach Beladungsdichte. Die Summe beider Ströme ist ein quantitatives Maß für die Anzahl gebundener Ziel-DNA an jeder Arrayposition.

Die Menge gebundener DNA pro Arrayposition wird dadurch bestimmt, daß eine Arrayposition des Sensorarray als interner Standard benutzt wird. Dazu wird dem Analyten ein 35mer-Oligonucleotid, welches 20 komplementäre Basen zu dem Fängeroligonucleotid an einer Arrayposition aufweist in bekannter Konzentration beigemischt.

Beispiel 11 Detektion der Affinitätsbindung auf Oberflächen von elek trischen Sensorarrays mittels Impedanzspektroskopie

Elektrische Sensorarrays, die nach Beispiel 6 aufgebaut werden, werden an jeder Sensorarrayposition mit 10 nl Oligonukleotidlösung in einer Konzentration von 10 µg pro ml Phosphatpuffer pH 7 befüllt. Die 24-mer-Oligonukleotide besitzen einheitlich 6 Thymidin-Reste am 5'-Kettenende, deren letzte 3 mit Thiolat-Gruppen modifiziert sind. Nach 12 Stunden ist die Schwefel/Gold-Bindung der Thiolatgruppen beendet.

Bei Raumtemperatur wird jede Arrayposition mittels Impedanzspektroskopie (EG Model 392) in einem Frequenz bereich zwischen 10 mHz und 1 MHz vermessen und die komplexe Impedanz analysiert.

Das Sensorarrays wird mit SSPE-Puffer (0,9 M NaCl, 50 mM NaH₂PO₄, 5 mM Na₂EDTA, pH 7,5) gewaschen. Die Analyt-DNA in SSPE-Puffer wird mit Denhardt's Lösung (0,5 g Ficoll, 0,5 g Polyvinylpyrrolidon, 0,5 g RSA in 0,5 l H₂O) in eine Konzen tration von 1 µg/ml überführt und auf das Sensorarray aufgegeben und bei Raumtemperatur 2 Stunden inkubiert. Zur Entfernung überschüssiger Analyt-DNA wird bei 40°C mit SSC-Puffer (52,6 g NaCl, 26,5 g Na-Citrat in 0,8 l H₂O) gewaschen.

Bei Raumtemperatur wird jede Arrayposition mittels Impedanzspektroskopie in einem Frequenbereich zwischen 10 mHz und 1 MHz erneut vermessen und die komplexe Impedanz analysiert.

Die Differenz der Messungen an jeder Sensorarray- Position vor und nach DNA-Bindung zeigt im Falle der Erniedrigung des elektrischen Leitfähigkeitstherms der komplexen Impedanz die Position mit erfolgter DNA-Bindung an.

Beispiel 12 Transport geladener Moleküle zu Detektorelektroden des elektrischen Sensorarrays

Die Analyt-DNA in 200 mmol/l Bernsteinsäurepuffer- Puffer pH 5,1 wird mit einer Konzentration von ca. 1 µg/ml auf das Sensorarray aufgegeben.

Mit Hilfe einer externer Präzisionsstromquelle (Eigen bau) wird auf alle Elektroden 3e' und 3 ein Strom von 20 nA für 80 msec aufgeprägt. Danach wird für 80 msec auf die Elektroden 3e und 3' umgeschaltet. Die Elektroden 3 und 3' sind dabei positiv gepolt. Die gesamte Schaltsequenz wird 100 mal wiederholt. Zur Entfernung überschüssiger Analyt-DNA wird dann bei 40°C mit SSC-Puffer (52,6 g NaCl, 26,5 g Na-Citrat in 0,8 l H₂O) gewaschen.

Beispiel 13 Elektrische Stringenzbehandlung von hybridisierter DNA auf elektrischen Sensorarrays

Ein elektrisches Sensorarray mit hybridisierter DNA, wie im Beispiel 12 verwendet, wird mit einer 200 mmol/l Bernsteinsäurepuffer-Puffer pH 5,1 beaufschlagt.

Mittels einer externen Stromquelle (Eigenbau) wird 10 nA Wechselstrom von 50 Hz Strom für 0,2 sec auf alle Elektroden paare 3, 3' aufgeprägt. Nach einer Pause von 0,2 sec wird die gesamte Schaltsequenz 100 mal wiederholt. Abdiffundierte schwächer gebundene Moleküle werden dann bei 40°C mit SSC-Puffer (52,6 g NaCl, 26,5 g Na-Citrat in 0,8 l H₂O) weg gewaschen.

Beispiel 14 Selektive Desorption von oberflächengebundenen Molekülen auf elektrischen Sensorarraychips

Ein elektrisches Sensorarray wird nach Beispiel 1 hergestellt und nach Beispiel 7 mit Oligonukleotiden beladen. Dazu werden Elektrodengeometrien an den Sensor arraypositionen gemäß Fig. 2e verwendet. In den Probenring wird pH 5,1 eingefüllt.

Alle Elektroden 3 und 3' auf dem Sensorarray werden an eine Stromquelle (Eigenbau) angeschlossen. Nun wird Wechsel strom mit 20 Hz und einer Spannung von 2 V für eine Sekunde angelegt und nach einer Pause von 0,5 Sekunden erneut eingeschaltet. Diese Sequenz wird 50 mal wiederholt. Anschließend wird das elektrische Sensorarray mit SSPE- Puffer (0,9 M NaCl, 50 mM NaH₂PO₄, 5 mM Na₂EDTA, pH 7,5) gewaschen.

Die folgende Hybridisierung von Analyt-DNA erfolgt nur noch auf fängerbeladenen Elektroden 3e, 3e' und wird analog Beispiel 8 ausgeführt.

Wie in Beispiel 10 wird mit alkalischer Phosphatase markiert. Mittels Redox-Recycling messen die Elektroden 3 und 3' die p-Aminophenolkonzentration die auf den Flächen 3e, 3e' produziert wird. Dabei wird der Stromanstieg dI/dT an der jeweiligen Sensorposition ausgewertet. Man erhält einen Stromanstieg von 0.2 bis 2 nA pro Minute je nach Beladungsdichte.

Beispiel 15 Kontrolle und Meßwerterfassung eines elektrischen Sensor arrays mittels eines ASIC

Ein elektrisches Sensorarray wird analog Beispiel 15 hergestellt, mit Oligonukleotidfängern beladen und zur Affinitätsbindung von Ziel-DNA sowie folgender Enzymmarkie rung verwendet. An die 32 Leitungen 6 des Sensorarrays wird ein selbstentwickelter ASIC zur seriellen Elektrodensteue rung mit 32 Schaltausgängen angeschlossen und mit einem Bipotentiostaten verbunden. Die Vorbereitung und Realisie rung des Redox-Recycling werden wie nach Beispiel 10 ausgeführt. Die anodischen Potentiale von +350 mV und die kathodischen Potentiale von -100 mV werden vom Bipotentio staten an den ASIC angelegt und über die direkten Leiterbah nen zu den einzelnen Sensorarraypositionen geleitet. Dabei ist jede Sensorarrayposition einem Schaltersystem auf dem ASIC zugeordnet. Prozessorkontrolliert wird nun nacheinander durch den Bipotentiostaten jede Sensorarrayposition für 0,1 sec ausgelesen. Beim Umschalten einer Arrayposition von Lese- in Nichtlesezustand wird mittels ASIC das anodische und das kathodische Potential auf die jeweilige Kontaktlei tung geschaltet. Alle 16 Arraypositionen arbeiten dadurch kontinuierlich im Redox-Recycling. Dieser serielle Aus lesezyklus wird 5 min ausgeführt. Der Anstieg des Summen stroms pro Zeit je Arrayposition wird gemessen und wie in Beispiel 10 interpretiert.

Beispiel 16 Kontrolle und Meßerfassung eines elektrischen Sensorarrays mit teilintegrierter Elektronik

Die Adressleitungen 14, 15, 16, 17 des Sensorarrays wie in Fig. 3 gezeigt werden mit einem PC-gesteuerten Decoder (Eigenbau) verbunden. An je eine der Leseleitungen 18, 19 wird ein Kanal eines 8-kanaliger Multipotentiostaten angeschlossen. Die Biasleitungen 20, 21 werden mit analogem anodischen (+350 mV) und dem kathodischen Potential (-100 mV) wie in Beispiel 15 versorgt.

Die Vorbereitung und Realisierung des Redox-Recycling werden wie nach Beispiel 10 ausgeführt.

Im Lesezustand werden alle Arraypositionen entlang der Adressleitung 14 bzw. 15 aktiviert und durch die integrier ten Schalter 12 an die jeweiligen Meßkanäle des Multipotien tiostaten geschaltet. Alle anderen Arraypositionen sind im Nichtlesezustand und durch die integrierten Schalter 13 mit den Biasleitungen 20 bzw. 21 verbunden, so daß auch hier die entsprechenden Potentiale an 3 bzw. 3' anliegen und die Redoxreaktion kontinuierlich abläuft.

Prozessorkontrolliert wird nun parallel durch den Multipotentiostaten jede aktive Sensorarrayposition für 0,1 sec ausgelesen. Danach wird durch den Decoder diese Reihe mit Schalter 12 in den Nichtlesezustand versetzt und sofort die nächste Reihe mittels der nächstliegenden Adressleitun gen über 13 aktiviert.

Dieser Auslesezyklus wird ca. 5 Minuten ausgeführt. Der Anstieg des Stroms pro Zeit wird für jede Sensorarray position separat gemessen und im PC gespeichert. Die Auswertung entspricht Beispiel 15.

Beispiel 17 Kontrolle und Meßwerterfassung eines elektrischen Sensor arrays mit integriertem Zwischenspeicher

Ein elektrisches Sensorarray wird gemäß Beispiel 4 und 5 hergestellt mit Elektrodengeometrien, die der Fig. 2c entsprechen. Die Vorbereitung des elektrischen Sensorarrays mit chemischen Komponenten erfolgt analog Beispiel 15.

Die Adressleitungen 14, 15, 16, 17 des Sensorarrays wie in Fig. 4 gezeigt werden mit einem PC-gesteuerten Decoder (Eigenbau) verbunden analog Beispiel 15. An jede der Leseleitungen 18, 19 wird ein hochempfindlicher Verstärker mit dem Ausgang an einen ADC angeschlossen. Die Biasleitun gen 20, 21 werden mit analogem anodischen (+350 mV) und dem kathodischen Potential (-100 mV) aus einem Bipotentiostaten versorgt. Die Adressierung erfolgt wie im Beispiel 16.

Abweichend von diesem Beispiel wird nur der im Nicht lesezustand an den Elektroden 3 und 3' durch Redox-Recycling generierte Strom durch einen integrierten Vorverstärker mit internem Integrator 22, 23 für jede Elektrode einzeln gespeichert. Beim Lesevorgang wird bei Adressierung nur der Inhalt dieses Integrators abgefragt.

Das dort ablaufende Redox Recycling generiert Strom, der über den internen Verstärker in 23 zum internen posi tionsspezifischen Integrator in 23 geleitet und dort aufsummiert wird. Die Aufsummation geschieht während des gesamten Nichtlesezustandes.

Claims

1. Elektrisches Sensorarray zur elektrochemischen Detek tion molekularer Assays und zum Transport geladener Moleküle, gekennzeichnet durch die folgenden Merkmale:

- Anordnung von mehr als 2 Sensorpositionen auf planaren Trägern bestehend aus lokal separierten mindestens paarweise angeordneten Arrays von Ultramikroelektroden und wahlweise angeordneten Hilfselektroden;
- individuelle elektrische Adressierung jeder Sensorposition;
- kontinuierliche elektrochemische Kontrolle an jeder Sensorposition;
- wahlweise Erzeugung elektrischer Gleich- und/oder Wechselfelder auf jeder Sensorposition;
- individuelle Detektion unterschiedlicher elektro chemischer Reaktionen oder Eigenschaften bzw. elektrische Auslesung solcher vorangegangenen Ereignisse an jeder Sensorposition;
- Immobilisierung unterschiedlicher oder gleicher affinitätsbindender Moleküle wahlweise auf den Sensorpositionen oder an partikulären Trägern oder in Gelen über den Sensorpositionen unabhängig von optischen Eigenschaften.

2. Elektrisches Sensorarray zur elektrochemischen Detek tion molekularer Assays und zum Transport geladener Moleküle nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der planare Träger aus Silizium, Glas, Keramik oder Kunststoff besteht.

3. Elektrisches Sensorarray zur elektrochemischen Detek tion molekularer Assays und zum Transport geladener Moleküle nach einem der Ansprüche 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet, daß Ultramikro- und Hilfselektroden oberflächen aus Edelmetallfilmen wie Gold oder Platin oder Iridium oder aus Kohlenstoff bestehen.

4. Elektrisches Sensorarray zur elektrochemischen Detek tion molekularer Assays und zum Transport geladener Moleküle nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß Ultramikro- und Hilfselektroden oberflächen aus unterschiedlichen Materialien bestehen können.

5. Elektrisches Sensorarray zur elektrochemischen Detek tion molekularer Assays und zum Transport geladener Moleküle nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß jede einzelne Sensorposition auch mit einem oder mehreren Ultramikroelektrodenpaaren gleicher oder verschiedener Geometrie bestückt ist.

6. Elektrisches Sensorarray zur elektrochemischen Detek tion molekularer Assays und zum Transport geladener Moleküle nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die paarweise angeordneten Ultra mikroelektroden als interdigitale Fingerelektroden oder als mit punktförmigen Ultramikroelektroden bedeckte Flächen oder Interdigitalanordnungen oder spiral- oder kreisförmig angeordnete Bandstrukturen angeordnet sind.

7. Elektrisches Sensorarray zur elektrochemischen Detek tion molekularer Assays und zum Transport geladener Moleküle nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die paarweise angeordneten Ultra mikroelektroden nach Anspruch 6 wahlweise auch mehr schichtig als von Isolatorschichten getrennte band förmige Metallfilme vertikal gestapelt werden.

8. Elektrisches Sensorarray zur elektrochemischen Detek tion molekularer Assays und zum Transport geladener Moleküle nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß an jeder einzelnen Sensorposition neben den Ultramikroelektroden wahlweise zusätzlich weitere flächige oder strukturierte Elektroden, die kein Ultramikroelektrodenverhalten aufweisen müssen und/oder unkontaktierte metallische Flächen angeordnet werden.

9. Elektrisches Sensorarray zur elektrochemischen Detek tion molekularer Assays und zum Transport geladener Moleküle nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Sensorpositionen von Flüssig keiten bedeckt sind und Reagenzien, Analyte oder Analytgemische jeder einzelnen Sensorposition oder allen Sensorpositionen gleichzeitig zugeführt werden.

10. Elektrisches Sensorarray zur elektrochemischen Detek tion molekularer Assays und zum Transport geladener Moleküle nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß an den einzelnen Sensorpositionen affinitätsbindende Moleküle auch mit unterschiedlicher Spezifität auf den einzelnen Elektroden und/oder auf metallischen Hilfsflächen und/oder auf Flächen des Trägers und/oder Kompartmentwandungen so immobilisiert sind, daß voltametrische oder impedimetrische Meßver fahren mit den Ultramikroelektroden ausgeführt werden.

11. Elektrisches Sensorarray zur elektrochemischen Detek tion molekularer Assays und zum Transport geladener Moleküle nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß an den einzelnen Sensorpositionen affinitätsbindende Moleküle, die auf den Ultramikro elektroden gebunden wurden, durch Desorption oder elektrochemische Oxidation wieder entfernt werden.

12. Elektrisches Sensorarray zur elektrochemischen Detek tion molekularer Assays und zum Transport geladener Moleküle nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß eine voltametrische Detektion in flüssigen Analyten unabhängig von partikulären Bestand teilen und/oder aufliegenden Gelen und/oder anhaftenden Substanzen vorgenommen wird.

13. Elektrisches Sensorarray zur elektrochemischen Detek tion molekularer Assays und zum Transport geladener Moleküle nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß eine impedimetrische Detektion in flüssigen Analyten unabhängig von schwebenden parti kulären Bestandteilen vorgenommen werden kann.

14. Elektrisches Sensorarray zur elektrochemischen Detek tion molekularer Assays und zum Transport geladener Moleküle nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß an jeder Sensorposition indivi duelle molekulare Bindungsereignisse elektrochemisch detektiert werden, nachdem Analyte aus Stoffgemischen an die auf oder über den Sensorpositionen immobilisier ten affinitätsbindenden Moleküle spezifisch gebunden worden sind.

15. Elektrisches Sensorarray zur elektrochemischen Detek tion molekularer Assays und zum Transport geladener Moleküle nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß an jeder Sensorposition individuell das Ausbleiben molekularer Bindungsereignisse detek tiert wird, nachdem Analyte aus Stoffgemischen mit den auf oder über den Sensorpositionen immobilisierten affinitätsbindenden Molekülen keine spezifische Bindung eingegangen sind.

16. Elektrisches Sensorarray zur elektrochemischen Detek tion molekularer Assays und zum Transport geladener Moleküle nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß an jeder Sensorposition indivi duelle molekulare Bindungsereignisse nach Bindung von Analyten aus Stoffgemischen an die auf oder über den Sensorpositionen immobilisierten affinitätsbindenden Moleküle dadurch mit den Ultramikroelektroden detek tiert werden, daß redoxaktive Reaktionsprodukte bin dungsspezifisch eingebrachter Enzymmarker qualitativ und/oder quantitativ erfaßt werden.

17. Elektrisches Sensorarray zur elektrochemischen Detek tion molekularer Assays und zum Transport geladener Moleküle nach einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß die Ultramikroelektroden und gegebenenfalls zusätzliche Elektroden an jeder einzel nen Sensorposition mittels elektronischer Schaltungen so adressiert und elektrochemische Ereignisse so ausgelesen werden, daß Potentiale zur Polarisation der Elektroden ohne Unterbrechung bestehen bleiben und eine elektrische Doppelschicht an den flüssigkeitsbenetzten Elektroden nicht beeinflußt wird.

18. Elektrisches Sensorarray zur elektrochemischen Detek tion molekularer Assays gleichzeitig geeignet zum Transport geladener Moleküle nach einem der Ansprüche 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß integrierte Schaltungen für das Analyseverfahren im aus Silizium bestehenden planaren Träger hergestellt werden.

19. Elektrisches Sensorarray zur elektrochemischen Detek tion molekularer Assays und zum Transport geladener Moleküle nach einem der Ansprüche 1 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß bei serieller Auslesung des Arrays elektrochemische Vorgänge, die an den Ultramikro elektroden und gegebenenfalls zusätzlichen Elektroden an jeder einzelnen Sensorposition in der Zeit zwischen individuellen Auslesevorgängen ablaufen, individuell erfaßt und gespeichert und/oder aufsummiert werden.

20. Elektrisches Sensorarray zur elektrochemischen Detek tion molekularer Assays und zum Transport geladener Moleküle nach einem der Ansprüche 1 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß die einzelnen Sensorpositionen durch volumenseparierende Kompartments so abgetrennt sind oder mechanisch abgetrennt werden können, daß eine positionsspezifische quantitative elektrochemische Detektion möglich ist.

21. Elektrisches Sensorarray zur elektrochemischen Detek tion molekularer Assays und zum Transport geladener Moleküle nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß Ultramikroelektroden aus Edelmetall und wahlweise weitere flächige oder strukturierte Elektroden und/oder unkontaktierte metallische Flächen gleichzeitig als Immobilisierungsflächen für Self- assembling-Monoschichten unterschiedlicher thiol modifizierter affinitätsbindender Moleküle auf den verschiedenen Sensorpositionen genutzt werden.

22. Elektrisches Sensorarray zur elektrochemischen Detek tion molekularer Assays und zum Transport geladener Moleküle nach einem der Ansprüche 1 bis 21, dadurch gekennzeichnet, daß die Ausbildung von Selfassembling- Monoschichten so ausgeführt wird, daß auf allen Sensor positionen eine gleichartige Beschichtung mit bifunk tionellen thiolmodifizierten Molekülen vorgenommen wird, die in einem zweiten Reaktionsschritt zur Bindung gleicher oder unterschiedlicher affinitätsbindender Moleküle auf jeder einzelnen Sensorposition genutzt werden.

23. Elektrisches Sensorarray zur elektrochemischen Detek tion molekularer Assays und zum Transport geladener Moleküle nach einem der Ansprüche 1 bis 22, dadurch gekennzeichnet, daß die nach Anspruch 20 und 21 an den einzelnen Sensorpositionen immobilisierten affinitäts bindenden Moleküle mit einer Schicht aus Hydrogelen belegt werden, die wahlweise auch das gesamte elek trische Sensorarray bedecken kann.

24. Elektrisches Sensorarray zur elektrochemischen Detek tion molekularer Assays und zum Transport geladener Moleküle nach einem der Ansprüche 1 bis 23, dadurch gekennzeichnet, daß in die Kompartments an den ein zelnen Sensorpositionen unterschiedliche affinitäts bindende Moleküle, die an Polymere oder an Nanopartikel aus Metallen oder mineralischen Stoffen oder in gel artigen Substanzen trägergebunden sind, eingebracht und fixiert werden.

25. Elektrisches Sensorarray zur elektrochemischen Detek tion molekularer Assays und zum Transport geladener Moleküle nach einem der Ansprüche 1 bis 24, dadurch gekennzeichnet, daß die an einzelnen Sensorpositionen eingebrachten und an partikulären Trägern ixnmobilisier ten affinitätsbindender Moleküle zusätzlich in einer Schicht aus Hydrogelen fixiert werden, die wahlweise auch das gesamte elektrische Sensorarray bedecken kann.

26. Elektrisches Sensorarray zur elektrochemischen Detek tion molekularer Assays und zum Transport geladener Moleküle nach einem der Ansprüche 1 bis 25, dadurch gekennzeichnet, daß zwischen den Ultramikroelektroden paaren der verschiedenen Positionen des elektrischen Sensorarrays, wahlweise unter Einbeziehung der Hilfs elektroden des Sensorarrays, solche elektrischen Felder erzeugt werden, daß geladene Moleküle nach elektro phoretischen Prinzipien bewegt werden.

27. Elektrisches Sensorarray zur elektrochemischen Detek tion molekularer Assays und zum Transport geladener Moleküle nach einem der Ansprüche 1 bis 26, dadurch gekennzeichnet, daß zwischen den Ultramikroelektroden paaren der verschiedenen Positionen des elektrischen Sensorarrays, wahlweise unter Einbeziehung der Hilfs elektroden des Sensorarrays, solche elektrischen Wechselfelder erzeugt werden, daß gebundene Analyt moleküle abhängig von Bindungsstärke und Ladung von den einzelnen Sensorpositionen entfernt werden.