DE102006033889A1

DE102006033889A1 - Mikrofluidisches System und zugehöriges Betriebsverfahren

Info

Publication number: DE102006033889A1
Application number: DE102006033889A
Authority: DE
Inventors: Torsten Dr. Müller; Thomas Dr. Schnelle
Original assignee: Evotec Technologies GmbH
Current assignee: PerkinElmer Cellular Technologies Germany GmbH
Priority date: 2006-01-18
Filing date: 2006-07-21
Publication date: 2007-09-20
Also published as: WO2007082737A1; EP1973660A1; US20110083961A1; US8128797B2

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Betriebsverfahren für ein mikrofluidisches System, mit folgenden Schritten: Zuführen eines Trägerstroms mit darin suspendierten Partikeln (5) eines ersten Partikeltyps in das mikrofluidische System; Beladen von mehreren elektrischen Feldkäfigen (1', 1'') in dem mikrofluidischen System mit den zugeführten Partikeln (5) des ersten Partikeltyps; Zuführen eines Trägerstroms mit darin suspendierten Partikeln (6) eines zweiten Partikeltyps in das mikrofluidische System sowie Beladen der Feldkäfige (1', 1'') in dem mikrofluidischen System mit den zugeführten Partikeln (6) des zweiten Partikeltyps, so dass sich in mindestens einem der Feldkäfige (1', 1'') ein Partikel (5) des ersten Partikeltyps und ein Partikel (6) des zweiten Partikeltyps befindet. Weiterhin umfasst die Erfindung ein entsprechendes mikrofluidisches System.

Description

Die Erfindung betrifft ein Betriebsverfahren für ein mikrofluidisches System und ein entsprechend ausgestaltetes mikrofluidisches System gemäß den Nebenansprüchen.

Mikrofluidische Systeme mit dielektrophoretischen Elektrodenanordnungen zur Manipulation von suspendierten Partikeln sind beispielsweise bekannt aus Müller, T. et al.: "A 3D-Microelectrode for handling and caging single cells and particles", Biosensors and Bioelectronics 14, 247–256 (1999). Bei den dielektrophoretischen Elektrodenanordnungen kann es sich beispielsweise um Feldkäfige (engl. "Cages") zur Fixierung der suspendierten Partikel handeln. Die herkömmlichen mikrofluidischen Systeme ermöglichen eine gezielte Untersuchung von suspendierten Partikeln, indem diese in das mikrofluidische System eingespült und dort in einem Feldkäfig fixiert werden. Im fixierten Zustand können die suspendierten Partikel dann beispielsweise impedanzspektroskopisch oder optisch untersucht werden.

Nachteilig an den vorstehend beschriebenen bekannten mikrofluidischen Systemen ist die Tatsache, dass die interessierenden Partikel jeweils nur einzeln untersucht werden können. Es ist dagegen oftmals wünschenswert, die chemische oder biochemische Wechselwirkung zwischen verschiedenen Partikeln zu untersuchen, was mit den herkömmlichen mikrofluidischen Systemen nur mit großem Aufwand möglich ist. Beispielsweise besteht ein Interesse an der Untersuchung der Differenzierung von Stammzellen oder Immunzellen in Abhängigkeit von einer bestimmten Zellstimulierung durch chemische oder biochemische Triggersubstanzen. Eine weiteres Beispiel ist die Untersuchung von Zell-Zell-Interaktionen.

Der Erfindung liegt deshalb die Aufgabe zugrunde, die bekannten mikrofluidischen Systeme dahingehend zu verbessern, dass auch die Wechselwirkung verschiedener Partikel untersucht werden kann. Weiterhin liegt der Erfindung die Aufgabe zugrunde, ein entsprechendes Betriebsverfahren für ein mikrofluidisches System anzugeben.

Diese Aufgabe wird durch ein erfindungsgemäßes mikrofluidisches System bzw. ein entsprechendes Betriebsverfahren gemäß den Nebenansprüchen gelöst.

Die Erfindung umfasst die allgemeine technische Lehre, die Feldkäfige in einem mikrofluidischen System nacheinander mit Partikeln verschiedener Partikeltypen zu beladen, so dass sich anschließend in mindestens einem der Feldkäfige Partikel verschiedener Partikeltypen befinden, was eine partikelspezifische Wechselwirkung der verschiedenen Partikeltypen ermöglicht.

Zum einen ermöglicht die Erfindung damit eine gezielte Untersuchung der Wechselwirkung zwischen verschiedenen Partikeln, mit denen die Feldkäfige beladen werden, was beispielsweise in der Pharmaforschung interessant ist. Auf diese Weise kann eine Vielzahl von Partikel-Partikel-Wechselwirkungen studiert werden, um beispielsweise pharmakologisch wirksame Substanzen zu ermitteln.

Zum anderen ermöglicht die Erfindung eine gezielte Stimulation von Partikeln mit bestimmten Triggersubstanzen, um eine Reaktion auszulösen, was beispielsweise in der Stammzellfor schung interessant ist. Beispielsweise können Stammzellen in den Feldkäfigen bestimmten Triggersubstanzen ausgesetzt werden, um eine bestimmte Zelldifferenzierung zu erreichen und zu beobachten.

Vorzugsweise werden die einzelnen Feldkäfige selektiv mit den Partikeln eines ersten Partikeltyps beladen, indem die einzelnen Feldkäfige beim Beladen selektiv elektrisch angesteuert werden. Die selektive elektrische Ansteuerung der einzelnen Feldkäfige kann hierbei repulsiv wirken, so dass die betroffenen Feldkäfige die eingespülten Partikel abstoßen und dadurch eine Beladung der betroffenen Feldkäfige mit dem jeweiligen Partikel verhindern. Es besteht jedoch alternativ auch die Möglichkeit, dass die selektive Ansteuerung der Feldkäfige so erfolgt, dass die betroffenen Feldkäfige die jeweiligen Partikel fixieren. Vorteilhaft ist hierbei, dass die Ansteuerung der einzelnen Feldkäfige unabhängig voneinander erfolgen kann, so dass bestimmte Feldkäfige gezielt mit den gewünschten Partikeln beladen werden können.

Nach dem Beladen der Feldkäfige mit den suspendierten Partikeln adhärieren die suspendierten Partikel vorzugsweise in den jeweiligen Feldkäfigen, d.h. die Partikel haften in dem Feldkäfig an, so dass die anhaftenden Partikel unabhängig von der elektrischen Ansteuerung des betroffenen Feldkäfigs nicht mehr ausgespült werden.

Der Begriff der Adhäsion wird hier in einem verallgemeinerten Sinn verwendet und umfasst sowohl die eigentliche Adhäsion als aktiven Prozess lebender Zellen als auch das passive Anhaften, welches sowohl bei lebenden Zellen als auch bei anderen Partikeln vorkommen kann.

Das Adhärieren der Partikel in den Feldkäfigen ist jedoch im Rahmen der Erfindung nicht zwingend erforderlich. Vielmehr reicht es u.U. auch aus, wenn die suspendierten Partikel in dem jeweiligen Feldkäfig mittels negativer Dielektrophorese kurz über der Kanalwand des Trägerstromkanals gehalten werden.

Die in den Feldkäfigen adhärierten Partikel können dann wieder abgelöst werden, indem eine oberflächenlösende Substanz in das mikrofluidische System eingeführt wird. Die oberflächenlösende Substanz zum Ablösen der adhärierten Partikel kann beispielsweise enzymatisch wirken. Beispiele derartiger oberflächenlösender Substanzen sind Trypsin, Versen, Accumax, Accutase oder Chelatbilder, insbesondere EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure). Weiterhin ist zu erwähnen, dass die oberflächenlösende Substanz vorzugsweise die Oberflächenspannung der Trägerflüssigkeit ändert und dadurch das Ablösen der adhärierten Partikel bewirkt. Die Erfindung ist jedoch hinsichtlich der oberflächenlösenden Substanz nicht auf die vorstehenden Beispiele beschränkt, sondern grundsätzlich auch mit anderen Substanzen realisierbar.

Die oberflächenlösende Substanz wird dann nach einer Einwirkzeit vorzugsweise aus dem mikrofluidischen System ausgespült, wobei die abgelösten Partikel durch eine elektrische Ansteuerung der Feldkäfige in den Feldkäfigen fixiert werden und deshalb zunächst nicht mit ausgespült werden.

Die Ablösung der adhärierten Partikel kann jedoch auch durch eine Temperaturänderung der Haftfläche (z.B. der Kanalwand des Trägerstromkanals) erreicht werden, wobei die Haftfläche aufgrund der Temperaturänderung ihre Oberflächeneigenschaft ändert, beispielsweise von hydrophil in hydrophob oder umgekehrt. Die Temperaturänderung der Haftfläche kann beispiels weise durch eine Heizung (z.B. eine Widerstandsheizung) oder eine Kühlung (z.B. mittels Peltierelementen) bewirkt werden, die in das mikrofluidisches System integriert sind.

Die bereits vorstehend erwähnte Beladung der Feldkäfige mit den Partikeln des zweiten Partikeltyps erfolgt vorzugsweise, indem die einzelnen Feldkäfige beim Beladen selektiv elektrisch angesteuert werden, um die Partikel entweder abzustoßen oder anzuziehen.

Nach der Beladung der einzelnen Feldkäfige mit den Partikeln der beiden Partikeltypen erfolgt dann vorzugsweise eine Untersuchung einer Reaktion zwischen den gemeinsam in den Feldkäfigen befindlichen Partikeln. Diese Untersuchung kann beispielsweise impedanzspektroskopisch oder optisch erfolgen, jedoch sind im Rahmen der Erfindung grundsätzlich auch andere Untersuchungsverfahren einsetzbar.

In Abhängigkeit von dem Ergebnis dieser Untersuchung können dann bestimmte Partikel in den zugehörigen Feldkäfigen selektiert werden. Bei den selektierten Partikeln handelt es sich vorzugsweise um die Partikel, mit denen die Feldkäfige zuerst beladen wurden. Es ist jedoch alternativ auch möglich, dass es sich bei den selektierten Partikeln um die Partikel handelt, mit denen die Feldkäfige zuletzt beladen wurden.

Hierbei ist zu erwähnen, dass die Partikel der verschiedenen Partikeltypen eine Reaktion eingehen können, was beispielsweise zu einer dauerhaften Verbindung der Partikel führen kann. Wenn es sich bei dem einen Partikel um eine Stammzelle handelt, so kann diese Stammzelle aufgrund der Wechselwirkung mit dem anderen Partikel eine bestimmte Zelldifferenzierung erfahren. Bei einer solchen Stammzelldifferenzierung ermöglicht die Erfindung eine Echtzeit-Beobachtung bzw. eine Echt zeit-Untersuchung des Prozesses der Zelldifferenzierung. Die Selektion kann dann in Abhängigkeit davon erfolgen, ob und ggf. wie die Zelldifferenzierung stattfindet.

Die auf diese Weise selektierten Partikel können dann aus dem mikrofluidischen System entfernt werden, beispielsweise durch Ausspülen der Partikel.

Vorzugsweise wird zur selektiven Beladung der Feldkäfige negative Dielektrophorese verwendet. So wirkt negative Dielektrophorese je nach Abstand vom Feldkäfig generell auf die Partikel abstoßend. Allerdings gelangen Partikel, die nah genug sind, bevorzugt nur ein Partikel, in das Potentialminimum des Feldkäfigs, wobei die anderen Partikel nur die abstoßenden Kräfte erfahren. Werden die Partikel, Zellen nun dicht genug an die Kanal-/Gefäßwand herangeführt, adhärieren sie. Eine einmal adhärierte Zelle ist unabhängig vom Feld stabil gebunden und kann nur durch "Lösemittel" abgelößt werden. Ein zweites Partikel gelangt bevorzugt unter Abschalten des Feldes zu dem ersten Partikel. Bleibt das Feld angeschaltet, so überwiegen die abstoßenden Kräfte und der zweite Partikel gelangt nicht in den Feldkäfig.

Im Rahmen der vorstehend erwähnten selektiven Beladung der Feldkäfige mit den Partikeln können die Feldkäfige also so angesteuert werden, dass die Partikel mittels negativer Dielektrophorese von den Feldkäfigen aufgenommen werden. Die zu beladenden Feldkäfige werden dann beim Beladen angeschaltet, während die anderen Feldkäfige abgeschaltet werden können.

Alternativ besteht auch die Möglichkeit, dass die Partikel mittels positiver Dielektrophorese von den Feldkäfigen angezogen werden. Bei den im Rahmen der Erfindung bevorzugten planaren Ringstrukturen werden die Partikel hierbei jedoch am Rand der Ringelektroden abgelegt. Bei einem Fixieren der suspendierten Partikel mittels positiver Dielektrophorese ist es deshalb vorteilhaft, wenn innerhalb der Ringelektroden, z.B. in der Mitte der Ringstruktur, eine punktförmige Elektrode angeordnet ist.

Es besteht jedoch auch die Möglichkeit, dass die Feldkäfige zur selektiven Beladung so angesteuert werden, dass die suspendierten Partikel mittels Dielektrophorese selektiv von den Feldkäfigen abgestoßen werden. Die zu beladenden Feldkäfige können dann beim Beladen abgeschaltet werden, während die anderen Feldkäfige angeschaltet werden und dann repulsiv wirken.

Ferner besteht die Möglichkeit, dass beim Beladen der Feldkäfige sowohl die zu beladenden Feldkäfige elektrisch angesteuert werden als auch die Feldkäfige, die nicht beladen werden sollen. Die zu beladenden Feldkäfig werden dann so angesteuert, dass die Partikel angezogen werden. Die anderen Feldkäfige werden dagegen repulsiv angesteuert, so dass die Partikel abgestoßen werden.

Darüber hinaus besteht im Rahmen der Erfindung die Möglichkeit, dass die einzelnen Feldkäfige bei der Beladung mit den Partikeln des zweiten Partikeltyps unterschiedlich lang und/oder unterschiedlich stark angesteuert werden, so dass sich zwischen den Feldkäfigen ein Gradient der Partikel des zweiten Partikeltyps ausbildet. Bei einer räumlich verteilten Anordnung einer Vielzahl von Feldkäfigen lassen sich so innerhalb des mikrofluidischen Systems nahezu beliebige räumliche Konzentrationsverteilungen der Partikel des zweiten Partikeltyps erreichen.

Darüber hinaus ist die Erfindung nicht auf eine Beladung der einzelnen Feldkäfige mit Partikeln von zwei verschiedenen Partikeltypen beschränkt. Es besteht im Rahmen der Erfindung vielmehr auch die Möglichkeit, dass die einzelnen Feldkäfige mit mehr als zwei Partikeln oder mit Partikeln von mehr als zwei Partikeltypen beladen werden. So ermöglicht die Beladung der Feldkäfige mit drei verschiedenen Partikeln eine Untersuchung der Wechselwirkung zwischen diesen drei Partikeln.

Ferner besteht im Rahmen der Erfindung die Möglichkeit, die suspendierten Partikel zu markieren, beispielsweise durch eine Fluoreszenzmarkierung oder durch eine radioaktive Markierung. Dies erleichtert vorteilhaft die Verfolgung der Partikelreaktionen oder der Partikel selbst.

Weiterhin ist zu erwähnen, dass es sich sowohl bei den Partikeln des ersten Partikeltyps als auch bei den Partikeln des zweiten Partikeltyps um verschiedenste Partikel handeln kann. Beispielhaft sind biologische Zellen, Stammzellen und Immunzellen zu nennen. Es besteht jedoch auch die Möglichkeit, dass es sich bei den Partikeln um magnetische oder magnetisierbare Partikel, insbesondere Partikel mit einem magnetischen oder magnetisierbaren Kern handelt. Ferner kommen als Partikel auch Antigene, Antikörper, Hormone, Viren oder gentechnisch modifizierte Viren in Frage. Darüber hinaus ist es auch möglich, Bakterien, sogenannte Latex beads, Vesikel oder Antigen-präsentierende Zellen als Partikel zu untersuchen. Allgemein kann es sich bei den zu untersuchenden Partikeln im Rahmen der Erfindung auch um biologische Zellen, Makromoleküle, insbesondere Immunglobulin, Partikel mit einer umhüllten Zielsubstanz im Partikelinneren, z.B. RNA, siRNA, DNA, oder um Partikel handeln, die an ihrer Partikeloberfläche eine Zielstruktur aufweisen, insbesondere in Form von Molekülen, wie beispielsweise biologischen Zellen, Stammzellen oder Na nostrukturen. Die Erfindung ist jedoch hinsichtlich der zu verwendenden Partikel nicht auf die vorstehend genannten Partikeltypen beschränkt, sondern grundsätzlich auch mit anderen Partikeltypen realisierbar. Darüber hinaus ist zu erwähnen, dass die Erfindung die Untersuchung einer Wechselwirkung beliebiger Kombinationen der vorstehend genannten Partikeltypen ermöglicht.

In einer Variante der Erfindung sind die zuerst eingespülten Partikel des ersten Partikeltyps größer als die anschließend eingespülten Partikel des zweiten Partikeltyps. Es ist jedoch im Rahmen der Erfindung auch möglich, dass die zuerst eingespülten Partikel des ersten Partikeltyps kleiner sind als die anschließend eingespülten Partikel des zweiten Partikeltyps. Darüber hinaus besteht auch die Möglichkeit, dass die Partikel der verschiedenen Partikeltypen gleich groß sind.

Ferner besteht im Rahmen der Erfindung die Möglichkeit, dass die Partikel der verschiedenen Partikeltypen durch magnetische Kräfte relativ zueinander bewegt werden. Beispielsweise können die Partikel der verschiedenen Partikeltypen von den magnetischen Kräften beim Beladen der Feldkäfige aufeinander zu bewegt werden, damit die Feldkäfige mit Partikeln unterschiedlicher Partikeltypen beladen werden. Weiterhin besteht die Möglichkeit, dass die Partikel der verschiedenen Partikeltypen von den magnetischen Kräften beim Ausspülen der Partikel aus dem mikrofluidischen System voneinander weg bewegt werden.

Hierbei besteht im Rahmen der Erfindung die Möglichkeit, dass die magnetischen Kräfte beim Beladen der Feldkäfige geringer eingestellt werden als die dielektrophoretischen Kräfte der Feldkäfige, so dass die von den Feldkäfigen erzeugten di elektrophoretischen Kräfte über die externen magnetischen Kräfte dominieren.

Darüber hinaus besteht im Rahmen der Erfindung die Möglichkeit, dass die magnetischen Kräfte beim Ausspülen der Partikel aus dem mikrofluidischen System geringer eingestellt werden als die Bindungskräfte zwischen den Partikeln der verschienen Partikeltypen.

Es wurde bereits vorstehend erwähnt, dass vorzugsweise die Wechselwirkung der verschiedenen Partikeltypen in den Feldkäfigen untersucht wird. Beispielsweise kann diese Untersuchung mittels Messelektroden erfolgen, die beispielsweise eine impedanzspektroskopische Untersuchung durchführen.

Die suspendierten Partikel können hierbei direkt auf den Messelektroden abgesetzt werden, was insbesondere bei der sogenannten Patch-Clamp-Technik vorteilhaft ist. Hierzu werden die Messelektroden vorzugsweise bei der Frequenz des Fangfeldes auf ein Potenzialniveau eingestellt, das dem Potenzialniveau entspricht, das auch ohne die Messelektroden an deren Ort herrschen würde. Das Absetzen der zu untersuchenden Partikel direkt auf den Messelektroden bietet den Vorteil, dass elektrische Messungen wesentlich empfindlicher ausgeführt werden können.

Die Messelektroden können im Rahmen der Erfindung auch als Manipulationselektroden eingesetzt werden, beispielsweise zur Partikelfusion, Zelle-Zelle-Fusion oder zur Partikelporation.

Darüber hinaus besteht im Rahmen der Erfindung die Möglichkeit, dass die Feldkäfige während der Untersuchung elektrisch nicht angesteuert werden, um eine Verfälschung der elektrischen Untersuchung durch die Ansteuerung der Feldkäfige zu vermeiden. Hierbei ist also das Fangfeld abgeschaltet, während das Messfeld angeschaltet ist.

Es besteht jedoch auch die Möglichkeit, dass das Fangfeld während der Messung angeschaltet bleibt. Der störende Einfluss des Fangfeldes muss dann durch geeignete signalverarbeitungstechnische Maßnahmen unterdrückt werden, wie beispielsweise Filter oder Chopper.

Darüber hinaus besteht im Rahmen der Erfindung auch die Möglichkeit, durch die Elektroden Strömungswirbel zu erzeugen, welche die Strömung der Partikel zu den Elektroden wesentlich beschleunigen. Diese Technik ist in der Patentanmeldung WO 2005/110605 A1 beschrieben, so dass der Inhalt dieser Patentanmeldung der vorliegenden Beschreibung in vollem Umfang zuzurechnen ist. Die Anwendung dieser Technik ermöglicht es, dass Partikel aus einem größeren Einzugsbereich in den Feldkäfig gelangen können.

Darüber hinaus ist zu erwähnen, dass die Erfindung nicht nur das vorstehend beschriebene Betriebsverfahren für ein mikrofluidisches System betrifft, sondern auch ein entsprechend gestaltetes mikrofluidisches System selbst.

Der im Rahmen der Erfindung verwendete Begriff eines mikrofluidischen Systems ist jedoch allgemein zu verstehen und nicht auf mikrofluidische Systeme beschränkt, die auf einem Chip integriert sind, einen geschlossenen Trägerstromkanal sowie Zuleitungen und Ausgangsleitungen aufweisen. Vielmehr umfasst der Begriff eines mikrofluidischen Systems auch eine ebene oder gebogene Platte, auf der mindestens ein Feldkäfig angeordnet ist. Ein weiteres Beispiel für ein mikrofluidisches System in dem erfindungsgemäßen Sinne ist eine (Mikro-)Titerplatte. Die Beladung der einzelnen Feldkäfige kann hierbei auch durch Pipetieren erfolgen, so dass die Trägerstromzuführung durch eine Pipetierungseinrichtung gebildet wird.

Vorzugsweise sieht das erfindungsgemäße mikrofluidische System als Trägerstromzuführung jedoch einen Trägerstromkanal vor, über den ein Trägerstrom mit darin suspendierten Partikeln zugeführt werden kann. Der im Rahmen der Erfindung verwendete Begriff eines Trägerstromkanals ist allgemein zu verstehen und nicht auf schmale Kanäle mit einem eckigen Querschnitt beschränkt. Vielmehr kann der Trägerstromkanal auch eine flächige Erstreckung aufweisen, damit in dem Trägerstromkanal in einer gemeinsamen Ebene eine Vielzahl von Feldkäfigen angeordnet werden kann.

Darüber hinaus weist das mikrofluidische System mehrere dielektrische Feldkäfige auf, die in dem Trägerstromkanal räumlich getrennt voneinander angeordnet sind und in Abhängigkeit von ihrer elektrischen Ansteuerung die suspendierten Partikel entweder fixieren oder abstoßen. Durch eine entsprechende elektrische Ansteuerung der Feldkäfige können diese dann selektiv mit den Partikel der verschiedenen Partikeltypen beladen werden.

Die einzelnen Feldkäfige können beispielsweise dreidimensional sein, wie in der bereits eingangs zitierten Veröffentlichung von Müller T. et al.: "A 3D-microelectrode for handling and caging single cells and particles" beschrieben ist, so dass der Inhalt dieser Veröffentlichung der vorliegenden Beschreibung hinsichtlich der konstruktiven Ausgestaltung und der Funktionsweise der Feldkäfige in vollem Umfang zuzurechnen ist. Die einzelnen Feldkäfige können jedoch auch planar sein, wie in der deutschen Patentanmeldung 10 2006 002 462 beschrieben ist, so dass der Inhalt dieser Patentanmeldung der vorliegenden Beschreibung ebenfalls in vollem Umfang zuzurechnen ist.

Darüber hinaus kann das erfindungsgemäße mikrofluidische System mindestens eine Hilfselektrodenanordnung aufweisen, die in dem Trägerstromkanal stromaufwärts vor oder stromabwärts hinter zumindest einem der Feldkäfige für die Fixierung bzw. Abstoßung der Partikel angeordnet ist. Bei derartigen Hilfselektroden kann es sich beispielsweise um trichterförmige Zentrierelektroden (engl. "Funnel"), Ablenkelektroden, Halteelektroden (engl. "Hook") oder Partikelweichen (engl. "Switch") handeln, wie sie in der eingangs beschriebenen Veröffentlichung von Müller, T. et al.: "A 3D-microelectrode for handling and caging single cells and particles" beschrieben sind. Der Inhalt dieser Veröffentlichung ist deshalb hinsichtlich der konstruktiven Gestaltung und der Funktionsweise der Hilfselektrodenanordnung der vorliegenden Beschreibung in vollem Umfang zuzurechnen.

In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel der Erfindung sind die einzelnen Feldkäfige auf einem Träger angeordnet, der beispielsweise plattenförmig ist. Vorzugweise besteht der Träger im wesentlichen aus Glas, Keramik, einem Halbleiter, insbesondere Silizium, oder aus Kunststoff. Die Erfindung ist jedoch hinsichtlich des Materials für den Träger der Feldkäfige nicht auf die vorstehend genannten Materialien beschränkt, sondern auch mit anderen Materialien realisierbar.

Vorzugsweise bildet der Träger für die Feldkäfige hierbei Begrenzungsflächen für den Trägerstromkanal. Beispielsweise können die Elektroden der einzelnen Feldkäfige an der oberen bzw. unteren Kanalwand des Trägerstromkanals angebracht sein. Es besteht jedoch alternativ auch die Möglichkeit, dass die Elektroden der Feldkäfige an den gegenüber liegenden seitli chen Kanalwänden des Trägerstromkanals angebracht sind, wobei sich die räumlichen Orientierungsangaben auf das Schwerefeld der Erde beziehen.

In einem Ausführungsbeispiel der Erfindung sind die einzelnen Feldkäfige jeweils ringförmig und/oder geschlossen, wobei die Feldkäfige stromabwärts eine Schwächung aufweisen können, die beispielsweise aus einer Passivierungsschicht bestehen kann, was an sich bekannt ist. Die Passivierungsschicht erlaubt dann das Auskoppeln des Fangfeldes für die Fixierung der suspendierten Partikel, wohingegen die Passivierungsschicht für Messsignale (z.B. Gleichstrom-Messsignale oder niederfrequente Messsignale wie bei Patch-Clamp-Messungen oder Membranimpedanzmessungen) abschirmend wirkt.

Weiterhin besteht im Rahmen der Erfindung die Möglichkeit, dass die Feldkäfige Elektroden aufweisen, die entgegen der Strömungsrichtung gekrümmt sind. Beispielsweise können die Elektroden der Feldkäfige jeweils halbkreisförmig oder bogenförmig sein, wobei die Elektrodenenden gegen die Strömungsrichtung weisen.

Vorzugsweise sind die einzelnen Feldkäfige matrixförmig in Zeilen und Spalten angeordnet, wobei die einzelnen Feldkäfige vorzugsweise durch Zeilen-Steuerleitungen und Spalten-Steuerleitungen selektiv angesteuert werden können. Eine derartige matrixförmige Anordnung einer Vielzahl von Feldkäfigen ist beispielsweise in der deutschen Patentanmeldung 10 2006 002 462 beschrieben, so dass der Inhalt dieser Patentanmeldung der vorliegenden Beschreibung hinsichtlich der matrixförmigen Anordnung der Feldkäfige in vollem Umfang hinzuzurechnen ist.

Weiterhin ist in einem bevorzugten Ausführungsbeispiel der Erfindung vorgesehen, dass das mikrofluidische System An schlusskontakte aufweist, die eine lösbare elektrische Verbindung der Feldkäfige mit einer separaten Treiberschaltung (Generator) ermöglichen. Beispielsweise kann eine solche lösbare elektrische Kontaktierung durch Federkontakte realisiert werden.

In einer Variante der Erfindung weisen die Feldkäfige eine äußere Ringelektrode und eine innere Ringelektrode auf, wobei die äußere Ringelektrode die innere Ringelektrode vorzugsweise konzentrisch umgibt.

Die beiden Ringelektroden können jeweils planar sein. Hierbei besteht die Möglichkeit, dass die planaren Ringelektroden in einer gemeinsamen Elektrodenebene angeordnet sind. Es besteht jedoch alternativ auch die Möglichkeit, dass die planaren Ringelektroden in parallelen, aber zueinander versetzten Elektrodenebenen angeordnet sind.

Weiterhin besteht im Rahmen der Erfindung die Möglichkeit, dass innerhalb der inneren Ringelektrode mindestens eine Messelektrode angeordnet ist, um die in dem Feldkäfig fixierten Partikel zu vermessen. Vorzugsweise sind jedoch hierbei innerhalb der inneren Ringelektrode 2, 3 oder sogar 4 Messelektroden und/oder Manipulationselektroden angeordnet, wobei die einzelnen Messelektroden wahlweise rund, insbesondere oval, oder eckig, insbesondere rechteckig, sein können.

Die Anordnung der Messelektroden innerhalb der Ringelektroden bietet den Vorteil, dass sich die dielektrophoretische Barriere nach oben verringert und damit das Einfangen von Partikeln aus dem Trägerstrom erleichtert, insbesondere wenn die Partikel schwerer als die Trägerflüssigkeit sind, was bei biologischen Zellen typisch ist. Außerdem ermöglicht die Verwendung von mindestens einer inneren Elektrode den Prozess des Fangens und Beladens in nicht-adhäriertem Zustand, was für Suspensionszellen wie Blutzellen von Vorteil ist. Das ganze funktioniert auch mit nur einer inneren Elektrode (Ring-Ring-Dot-Struktur). Falls das Absetzen auf das Substrat erforderlich oder wünschenswert ist, so wird diese vorzugsweise auf das Potential gelegt, auf welchem sich der Elektrodenbereich im Mittel auch ohne innere Elektrode bei geschalteten Ringelektroden befinden würde. Messungen bzw. Manipulationen können dann zwischen der Zentralelektrode und der inneren Ringelektrode erfolgen. Ein weiterer Vorteil der inneren Elektrode besteht darin, dass sowohl positive als auch negative Dielektrophorese verwendet werden kann. Zur pDEP-Positionierung wird etwa ein Feld entsprechender Frequenz zwischen der Zentralelektrode und dem inneren und oder dem äußeren Ring geschaltet.

Darüber hinaus können die Ringelektroden eine Passivierungsschicht aufweisen, wobei die Passivierungsschicht vorzugsweise so stark ausgebildet ist, dass die Passivierungsschicht ein Auskoppeln eines elektrischen Feldes zur Partikelfixierung erlaubt, wohingegen die Passivierungsschicht für Gleichstromsignale und niederfrequente Signale abschirmend wirkt.

Die Fixierung der einzelnen Partikel in den Feldkäfigen kann zusätzlich durch Unterdruck unterstützt werden. In einem Ausführungsbeispiel der Erfindung weist das mikrofluidische System deshalb einen Unterdruckanschluss auf, der in einem Feldkäfig ausmündet, um die dort befindlichen Partikel zusätzlich zu fixieren.

Bei einer Anordnung von Messelektroden kann der Unterdruckanschluss auch zwischen den beiden Messelektroden ausmünden, um die Partikel dort für eine Messung zu fixieren.

Weiterhin ist zu erwähnen, dass die Messelektroden in dem Feldkäfig entweder symmetrisch oder unsymmetrisch angeordnet sein können.

Andere vorteilhafte Weiterbildungen der Erfindung sind in den Unteransprüchen gekennzeichnet oder werden nachstehend zusammen mit der Beschreibung der bevorzugten Ausführungsbeispiele der Erfindung anhand der Zeichnungen näher erläutert. Es zeigen:
1A eine Aufsicht auf einen Feldkäfig eines erfindungsgemäßen mikrofluidischen Systems,
1B eine Querschnittsansicht durch den Feldkäfig gemäß 1A entlang der Linie A-A,
2A ein erfindungsgemäßes mikrofluidisches System mit mehreren Feldkäfigen während einer selektiven Beladung mit Partikeln, wobei der eine Feldkäfig mit Partikeln beladen wird, während der andere Feldkäfig die eingespülten Partikel abstößt,
2B das mikrofluidische System gemäß 2A nach dem Beladen der Feldkäfige,
3A ein alternatives Ausführungsbeispiel eines erfindungsgemäßen mikrofluidischen Systems, bei dem die Beladung der Feldkäfige von oben erfolgt,
3B das mikrofluidische System gemäß 3B nach der Beladung,
4A ein alternatives Ausführungsbeispiel eines Feldkäfigs zur Verwendung in einem erfindungsgemäßen mikrofluidischen System,
4B eine Querschnittsansicht des Feldkäfigs gemäß 4A entlang der Linie A-A,
5 eine matrixförmige Anordnung einer Vielzahl von Feldkäfigen in einem erfindungsgemäßen mikrofluidischen System,
6A eine Aufsicht auf eine alternative Ausführungsform eines Feldkäfigs zur Verwendung in einem erfindungsgemäßen mikrofluidischen System,
6B eine Querschnittsansicht des Feldkäfigs gemäß 6A entlang der Linie A-A,
7A, 7B das erfindungsgemäße Betriebsverfahren für ein mikrofluidisches System in Form eines Flussdiagramms,
8 ein alternatives Ausführungsbeispiel eines erfindungsgemäßen Feldkäfigs mit koplanaren Ringelektroden und zwei Messelektroden innerhalb der inneren Ringelektrode,
9A die Feldverteilung E² in dem Feldkäfig gemäß 8 in der Schnittebene A-A, wobei die innere Ringelektrode und die äußere Ringelektrode mit der gleichen Spannung gegenphasig angesteuert werden, während die Messelektroden auf Masse liegen,
9B die Feldverteilung E² in dem Feldkäfig gemäß 8 in der Schnittebene A-A, wobei die innere Ringelektrode und die äußere Ringelektrode gegenphasig mit der gleichen Spannung angesteuert werden, während die Messelektroden gleichphasig zu der inneren Ringelektrode angesteuert werden.
Die 1A und 1B zeigen ein Ausführungsbeispiel eines dielektrophoretischen Feldkäfigs 1, der in einem erfindungsgemäßen mikrofluidischen System eingesetzt werden kann, wie es beispielsweise in den 2A und 2B bzw. 3A und 3B dargestellt ist.
Der Feldkäfig 1 weist in diesem Ausführungsbeispiel zwei planare Ringelektroden 2, 3 auf, die in einer gemeinsamen Elektrodenebene koplanar angeordnet sind, wie aus der Querschnittsansicht in 1B ersichtlich ist. Die beiden Ringelektroden 2, 3 sind hierbei konzentrisch auf einem plattenförmigen Träger 4 aus Glas angeordnet und elektrisch unabhängig voneinander ansteuerbar.
Durch eine geeignete elektrische Ansteuerung der beiden Ringelektroden 2, 3 kann ein hier nur schematisch dargestellter Partikel 5 mittels negativer Dielektrophorese in den Feldkäfig 1 gelangen und in dem Feldkäfig 1 fixiert werden, wobei der Partikel 5 im fixierten Zustand an dem Träger 4 adhärieren kann und dann auch nach einem Abschalten des Feldkäfigs 1 an dem Träger 4 haften bleibt.
Der Feldkäfig 1 kann jedoch elektrisch auch so angesteuert werden, dass der Partikel 5 von dem Feldkäfig 1 mittels Dielektrophorese abgestoßen wird, wodurch eine Beladung des Feldkäfigs 1 mit dem Partikel 5 und dadurch auch ein Adhärie ren des Partikels 5 innerhalb der inneren Ringelektrode 3 verhindert wird. Eine selektive Ansteuerung des Feldkäfigs 1 ermöglicht also innerhalb des nachstehend beschriebenen erfindungsgemäßen mikrofluidischen Systems wahlweise eine Beladung des Feldkäfigs 1 mit dem Partikel 5 oder ein Abstoßen des Partikels 5, um eine Beladung des Feldkäfigs 1 mit dem Partikel 5 zu verhindern.
Die 2A und 2B zeigen Ausschnittsweise ein erfindungsgemäßes mikrofluidisches System mit einer Vielzahl von Feldkäfigen 1', 1'' entsprechend den 1A und 1B, wobei in den Zeichnungen zur Vereinfachung nur zwei der Feldkäfige 1', 1'' dargestellt sind.
Oberhalb des Trägers 4 verläuft hierbei ein Trägerstromkanal, durch den in Pfeilrichtung ein Trägerstrom mit darin suspendierten Partikeln 6 strömt.
2A zeigt hierbei einen Zustand des mikrofluidischen Systems, in dem in den beiden Feldkäfigen 1'. und 1'' bereits die Partikel 5 fixiert sind und dort an dem Träger 4 adhärieren.
In diesem Zustand wird der Feldkäfig 1' abgeschaltet, so dass sich die Partikel 6 an den Partikeln 5 anlagern.
Der rechte Feldkäfig 1'' wird dagegen in diesem Zustand elektrisch so angesteuert, dass er die Partikel 6 mittels Dielektrophorese abstößt, um eine Anlagerung der Partikel 6 an den Partikeln 5 zu verhindern.
Die beiden Partikel 5, 6 gehören hierbei verschiedenen Partikeltypen an. So handelt es sich bei dem Partikel 5 in diesem Ausführungsbeispiel um eine biologische Zelle, während die Partikel 6 Viren sind, die auf die Partikel 5 wirken.
2B zeigt dann einen Zustand, in dem die beiden Feldkäfige 1', 1'' abgeschaltet sind. Die Partikel 5 bleiben dann an dem Träger 4 adhäriert und können später mit einer oberflächenlösenden Substanz wie beispielsweise Trypsin gelöst und aus dem mikrofluidischen System ausgespült werden.
In dem Zustand gemäß 2B erfolgt dann eine Untersuchung der Partikel 5 mit den dort angelagerten Partikeln 6, um die Wechselwirkung zwischen den Partikeln 5, 6 zu untersuchen.
In Abhängigkeit von dem Untersuchungsergebnis können dann bestimmte Partikel 5 selektiv ausgespült und weiter verwendet werden.
Die 3A und 3B zeigen ein alternatives Ausführungsbeispiel eines erfindungsgemäßen mikrofluidischen Systems, das weitgehend mit dem vorstehend beschriebenen und in den 2A und 2B dargestellten Ausführungsbeispiel übereinstimmt, so dass zur Vermeidung von Wiederholungen auf die vorstehende Beschreibung Bezug genommen wird, wobei für entsprechende Teile dieselben Bezugszeichen verwendet werden.
Eine Besonderheit dieses Ausführungsbeispiels besteht darin, dass die Beladung der Feldkäfige 1' und 1'' hierbei nicht parallel zur Elektrodenebene, d.h. parallel zu dem Träger 4, erfolgt, sondern rechtwinklig hierzu parallel zur Schwerkraft, wie durch die eingezeichnete Schwerkraftrichtung g verdeutlicht wird.
In dem Zustand gemäß 3A ist der Feldkäfig 1' abgeschaltet, wohingegen der Feldkäfig 1'' angeschaltet ist und die Partikel 6 mittels negativer Dielektrophorese abstößt, wodurch eine Anlagerung der Partikel 6 in dem Feldkäfig 1'' verhindert wird, wohingegen sich die Partikel 6 in dem linken Feldkäfig 1' ohne weiteres ablagern.
3B zeigt einen Zustand des erfindungsgemäßen mikrofluidischen Systems nach der Beladung, wenn die beiden Feldkäfige 1' und 1'' abgeschaltet sind. Im Bereich des zuvor abgeschalteten Feldkäfigs 1' hat sich dann eine Vielzahl der Partikeln 6 abgelagert, was insbesondere auch für das Innere des Feldkäfigs 1' gilt, wo die Partikel 5, 6 unmittelbar aneinander angrenzen, so dass deren Wechselwirkung untersucht werden kann.
In dem zuvor angeschalteten Feldkäfig 1'' haben sich dagegen aufgrund der abstoßenden Wirkung des Feldkäfigs 1'' keine der Partikel 6 auf dem Partikel 5 abgelagert.
Durch eine selektive Ansteuerung der einzelnen Feldkäfige 1' und 1'' können die einzelnen Partikel 5 also gezielt mit bestimmten Partikeln 6 zusammengebracht werden, um deren Wechselwirkung zu untersuchen.
Die 4A und 4B zeigen ein alternatives Ausführungsbeispiel eines Feldkäfigs zur Verwendung in dem erfindungsgemäßen mikrofluidischen System. Dieses Ausführungsbeispiel stimmt teilweise mit dem vorstehend beschriebenen und in den 1A und 1B gezeigten Ausführungsbeispielen eines Feldkäfigs überein, so dass zur Vermeidung von Wiederholungen auf die vorstehende Beschreibung Bezug genommen wird, wobei für entsprechende Bauteile dieselben Bezugszeichen verwendet werden.
Eine Besonderheit dieses Ausführungsbeispiels besteht darin, dass die Ringelektroden 2, 3 nicht ringförmig geschlossen, sondern nur halbkreisförmig sind, wobei die beiden halbkreisförmigen Ringelektroden 2, 3 entgegen der Strömungsrichtung gekrümmt sind.
5 zeigt eine matrixförmige Anordnung einer Vielzahl der Feldkäfige 1 gemäß den 4A und 4B, wobei die einzelnen Feldkäfige 1 durch eine Vielzahl von Spalten-Steuerleitungen 7 und eine Vielzahl von Zeilen-Steuerleitungen 8 selektiv angesteuert werden können. Die Spalten-Steuerleitungen 7 sind hierbei jeweils mit der inneren Ringelektrode 3 der Feldkäfige 1 der betreffenden Spalte verbunden, während die Zeilen-Steuerleitungen 8 jeweils mit der äußeren Ringelektrode 2 der Feldkäfige 1 der betreffenden Zeile verbunden sind. Durch eine geeignete Ansteuerung der einzelnen Feldkäfige 1 können diese selektiv mit den Partikeln 5, 6 beladen werden, indem die einzelnen Feldkäfige 1 jeweils repulsiv oder fixierend angesteuert bzw. abgeschaltet werden.
Zum initialen Beladen des Arrays gemäß 5 mit Zellen geht man beispielsweise folgendermaßen vor. Zellen werden von links mittels einer Strömung eingespült. Zunächst sind die Spalten-Steuerleitung 7 und die Zeilen-Steuerleitungen 8 auf Masse bis auf die Spalten-Steuerleitungen 6 mit den Indizes imax und imax-1. Nach Füllung der Feldkäfige 1 der Spalten (imax) und (imax-1) (entweder unter Beobachtung oder nach hinreichend langer Zeit) werden nachfolgend die nächsten beiden Spalten (imax-2) und (imax-3) durch zusätzlichen Aktivierung der Spalten-Steuerleitungen 7 mit den Indizes (imax-2) und (imax-3) gefüllt. Dieser Prozess kann bis zur vollständige Füllung des Arrays spaltenweise fortgesetzt werden und hat den Vorteil, dass die stromaufwärtsgelegenen Strukturen nicht die Beladung der abwärtsgelegenen behindert. Das Beladen mit den zweiten Partikeln erfolgt mittels Strömung von rechts, wobei alle Spalten- und Zeilensteuerleitungen 7, 8 (bspw. gegenphasig) bis auf die mit zu beladenen Zellen (1, M) aktiviert werden, Die Spalten- und Zeilensteuerleitungen 6, 7 (1, M) befinden sich auf Masse. Das optionale Ablösen von Zielzellen erfolgt durch eine analoge Ansteuerung mittels einer Strömung über einen Querkanal. Besonders vorteilhaft ist es, wenn die Basiselektrodenstruktur wie in 1 erzeugt wurde, jedoch halbseitig mit einer Passivierungsschicht versehen wurde, die bei einer hinreichend niedrigen Frequenz dielektrophoretisch der Struktur gemäß 4 entspricht. Dann würde man das initiale Beladen mit Zellen beispielsweise mit der niedrigeren Frequenz ausführen, das gezielte Beladen mit Triggern sowie das Entladen der Zielzellen mit der höheren, wobei die Zellen dann auch in Kanalrichtung entlassen werden können (nach oder von links).
Die 6A und 6B zeigen ein alternatives Ausführungsbeispiel eines Feldkäfigs 1 zur Verwendung in einem erfindungsgemäßen mikrofluidischen System. Dieses Ausführungsbeispiel stimmt teilweise mit dem vorstehend beschriebenen und in den 1A und 1B dargestellten Ausführungsbeispiel überein, so dass zur Vermeidung von Wiederholungen auf die vorstehende Beschreibung Bezug genommen wird, wobei für entsprechende Teile dieselben Bezugszeichen verwendet werden.
Eine Besonderheit dieses Ausführungsbeispiels besteht darin, dass der Feldkäfig 1 nicht die äußere Ringelektrode 2 aufweist, wie dies bei dem Ausführungsbeispiel gemäß den 1A und 1B der Fall ist.
Stattdessen weist der Feldkäfig 1 in diesem Ausführungsbeispiel stromaufwärts vor dem Feldkäfig 1 eine trichterförmige Elektrodenanordnung 9 (engl. "Funnel") auf, durch welche die Partikel 5 gezielt in den Feldkäfig 1 geleitet werden.
Eine weitere Besonderheit dieses Ausführungsbeispiels besteht darin, dass die innere Ringelektrode 3 nicht geschlossen, sondern auf ihrer stromaufwärts gelegenen Seite geöffnet ist und in die trichterförmige Elektrodenanordnung 9 übergeht.
Im Folgenden wird anhand des Flussdiagramms gemäß den 7A und 7B der Ablauf des erfindungsgemäßen Betriebsverfahrens beschrieben.
In einem ersten Schritt S1 wird zunächst ein Trägerstrom mit darin suspendierten biologischen Zellen in das mikrofluidische System eingespült.
In einem weiteren Schritt S2 werden dann die einzelnen Feldkäfige in dem mikrofluidischen System mit den eingespülten Zellen beladen, indem die einzelnen Feldkäfige selektiv angesteuert werden. Die Feldkäfige, die mit den eingespülten Zellen beladen werden sollen, werden hierzu so angesteuert, dass die eingespülten Zellen mittels negativer Dielektrophorese fixiert werden. Die anderen Feldkäfige, die mit den eingespülten biologischen Zellen nicht beladen werden sollen, werden dagegen elektrisch so angesteuert, dass die eingespülten biologischen Zellen mittels negativer Dielektrophorese abgestoßen werden.
Es ist jedoch alternativ auch möglich, dass zur Partikelbeladung nur diejenigen Feldkäfige eingeschaltet und mittels negativer Dielektrophorese angesteuert werden, die Partikel fixieren sollen, während die anderen Feldkäfige ausgeschaltet bleiben.
In einem weiteren Schritt S3 adhärieren die biologischen Zellen dann in den zuvor selektiv beladenen Feldkäfigen, so dass sich die adhärierten Zellen auch nach einem anschließenden Abschalten der einzelnen Feldkäfige nicht lösen, sondern in den beladenen Feldkäfigen verbleiben.
In einem weiteren Schritt S4 werden dann Triggerpartikel (z.B. Antigene) in den Trägerstromkanal des mikrofluidischen Systems eingespült.
Die Feldkäfige werden dann in einem weiteren Schritt S5 selektiv mit den Triggerpartikeln beladen, was durch eine entsprechend selektive elektrische Ansteuerung der Feldkäfige mittels positiver bzw. negativer Dielektrophorese bewirkt wird. Auf diese Weise werden die einzelnen Feldkäfige sowohl mit biologischen Zellen als auch mit Triggerpartikeln beladen, wobei die Wechselwirkung zwischen den zuerst zugeführten Zellen und den anschließend zugeführten Triggerpartikeln in einem weiteren Schritt S6 untersucht wird, was beispielsweise optisch oder impedanzspektroskopisch geschehen kann. Die Untersuchung kann jedoch auch durch eine Patch-Clamp-Messung bzw. durch einen Gleichstrommessung erfolgen.
In einem weiteren Schritt S7 werden dann in Abhängigkeit von der Untersuchung der Wechselwirkung zwischen den biologischen Zellen und den zugegebenen Triggerpartikeln bestimmte Zellen selektiert.
Anschließend können dann in einem weiteren Schritt S8 die in den Feldkäfigen geladenen Zellen durch Applikation einer oberflächenlösenden Substanz (z.B. Trypsin) gelöst werden, wobei in einem Schritt S9 eine ausreichende Einwirkzeit der oberflächenlösenden Substanz abgewartet wird.
Anschließend werden die in den Feldkäfigen geladenen Zellen dann in einem Schritt S10 wieder in den Feldkäfigen fixiert, um ein Ausspülen der Zellen durch den Trägerstrom zu verhindern. Hierzu werden die Feldkäfige in geeigneter Weise elektrisch angesteuert.
In einem weiteren Schritt S11 wird dann die zuvor zugegebene oberflächenlösende Substanz bei gleichzeitiger Fixierung der Zellen in den Feldkäfigen aus dem mikrofluidischen System ausgespült.
Nach dem Ausspülen der oberflächenlösenden Substanz aus dem mikrofluidischen System werden dann in einem Schritt S12 selektiv bestimmte Feldkäfige abgeschaltet, welche die zuvor selektierten Zellen enthalten. Diese selektive Abschaltung der Feldkäfige bewirkt, dass die darin enthaltenen Zellen in einem weiteren Schritt S13 von dem Trägerstrom aus dem mikrofluidischen System ausgespült werden, während die anderen Zellen in den weiterhin angeschalteten anderen Feldkäfigen fixiert bleiben.
Auf diese Weise werden selektiv die Zellen aus dem mikrofluidischen System ausgespült, die zuvor eine bestimmte Wechselwirkung mit der Trägersubstanz gezeigt haben.
In einem letzten Schritt S14 werden dann die auf diese Weise selektierten und ausgespülten Zellen außerhalb des mikrofluidischen Systems für eine weitere Verwendung aufgefangen.
Hierbei ist es möglich, dass das mikrofluidische System noch weitere Kanäle aufweist und die Partikel zunächst einer Manipulation (z.B. einer Sortierung) unterzogen werden, bevor die Partikel dann aufgefangen werden.
8 zeigt ein weiteres Ausführungsbeispiel eines Feldkäfigs zur Verwendung in dem erfindungsgemäßen mikrofluidischen System. Dieses Ausführungsbeispiel stimmt weitgehend mit dem vorstehend beschriebenen und in den 1A und 1B dargestellten Ausführungsbeispiel überein, so dass zur Vermeidung von Wiederholungen auf die vorstehende Beschreibung verwiesen wird, wobei für entsprechend die Teile dieselben Bezugszeichen Bezugszeichen verwendet werden.
Eine Besonderheit dieses Ausführungsbeispiels besteht darin, dass innerhalb der inneren Ringelektrode 3 zwei Messelektroden bzw. Manipulationselektroden 10, 11 angeordnet sind, die eine impedanzspektroskopische Untersuchung der innerhalb der inneren Ringelektrode 3 adhärierten Partikel 5 bzw. 6 ermöglichen.
Darüber hinaus ermöglichen die Manipulationselektroden 10, 11 eine Zellfusion. Hierzu wird beispielsweise eine der beiden Manipulationselektroden 10, 11 auf Masse gehalten, während die anderen Manipulationselektrode 10 bzw. 11 mit kurzen Gleichstrom- oder Wechselstromimpulsen beaufschlagt wird.
Die beiden Messelektroden 10, 11 sind hierbei in dem Feldkäfig 1 symmetrisch auf gegenüberliegenden Seiten des Mittelpunkts angeordnet.
Darüber hinaus weist der Feldkäfig 1 in diesem Ausführungsbeispiel eine Ansaugöffnung 12 auf, über die in dem Feldkäfig 1 ein Unterdruck erzeugt werden kann, der die Partikel 5 bzw. 6 ansaugt und dadurch die Beladung des Feldkäfigs 1 mit den Partikeln 5 bzw. 6 unterstützt. Die Ansaugöffnung 12 ist hierbei zwischen den beiden Messelektroden 10, 11 angeordnet, so dass die Partikel 5, 6 bei der Beladung des Feldkäfigs 1 auch zwischen den beiden Messelektroden 11, 12 fixiert werden, was für eine anschließende Messung vorteilhaft ist.
9A zeigt die Feldverteilung E² innerhalb des Feldkäfigs 1 gemäß 8, wobei die innere Ringelektrode 3 und die äußere Ringelektrode 2 mit gegenphasigen elektrischen Signalen der gleichen Spannung U angesteuert werden, während die beiden Messelektroden 10, 11 auf Masse liegen.
9B zeigt die Feldverteilung E² in dem Feldkäfig 1 gemäß 8, wobei die innere Ringelektrode 3 und die äußere Ringelektrode 2 gegenphasig mit der gleichen Spannung U angesteuert werden, während die beiden Messelektroden 10, 11 gleichphasig mit der inneren Ringelektrode 3 mit einer Spannung von 0,26·U angesteuert werden.
Die Erfindung ist nicht auf die vorstehend beschriebenen bevorzugten Ausführungsbeispiele beschränkt. Vielmehr ist eine Vielzahl von Varianten und Abwandlungen möglich, die ebenfalls von den Erfindungsgedanken gebrauch machen und deshalb in den Schutzbereich fallen.

1: Feldkäfig
2: Ringelektrode
3: Ringelektrode
4: Träger
5: Partikel
6: Partikel
7: Spalten-Steuerleitungen
8: Zeilen-Steuerleitungen
9: Trichterförmige Elektrodenanordnung
10: Messelektrode
11: Messelektrode
12: Ansaugöffnung

Claims

Betriebsverfahren für ein mikrofluidisches System, mit folgenden Schritten (S1–S2): a) Zuführen (S1) eines Trägerstroms mit darin suspendierten Partikeln (5) eines ersten Partikeltyps in das mikrofluidische System, b) Beladen (S2) von mindestens einem elektrischen Feldkäfig (1) in dem mikrofluidischen System mit den zugeführten Partikeln (5) des ersten Partikeltyps, gekennzeichnet durch folgende Schritte (S4–S5): c) Zuführen (S4) eines Trägerstroms mit darin suspendierten Partikeln (6) eines zweiten Partikeltyps in das mikrofluidische System, d) Beladen (S5) des Feldkäfigs (1) in dem mikrofluidischen System mit den zugeführten Partikeln (6) des zweiten Partikeltyps, so dass sich in dem Feldkäfig (1) mindestens ein Partikel (5) des ersten Partikeltyps und mindestens ein Partikel (6) des zweiten Partikeltyps befindet.
Betriebsverfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Feldkäfige (1, 1', 1'') selektiv mit den Partikeln (5) des ersten Partikeltyps beladen werden, indem die einzelnen Feldkäfige (1', 1'') beim Beladen selektiv elektrisch angesteuert werden.
Betriebsverfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, gekennzeichnet durch folgenden Schritt (S3): Adhärieren der Partikel (5) des ersten Partikeltyps in den Feldkäfigen (1', 1'') nach dem Beladen und vor dem Zuführen der Partikel (6) des zweiten Partikeltyps.
Betriebsverfahren nach Anspruch 3, gekennzeichnet durch folgenden Schritt (S8): Ablösen der adhärierten Partikel (5) des ersten Partikeltyps aus den Feldkäfigen (1', 1'').
Betriebsverfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die adhärierten Partikel (5) aus den Feldkäfigen (1', 1'') abgelöst werden, indem eine oberflächenlösende Substanz in das mikrofluidische System eingeführt wird.
Betriebsverfahren nach Anspruch 5, gekennzeichnet durch folgenden Schritt (S11): Ausspülen der oberflächenlösenden Substanz aus dem mikrofluidischen System, wobei die beladenen Partikel (5, 6) durch eine elektrische Ansteuerung der Feldkäfige (1', 1'') in den Feldkäfigen (1', 1'') fixiert werden.
Betriebsverfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die oberflächenlösende Substanz enzymatisch wirkt.
Betriebsverfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die oberflächenlösende Substanz aus einer Gruppe ausgewählt ist, die folgende Substanzen enthält: a) Trypsin, b) Versen, c) Accumax, d) Accutase, e) Chelatbilder, insbesondere Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA).
Betriebsverfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die oberflächenlösende Substanz die Oberflächenspannung ändert.
Betriebsverfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die adhärierten Partikel (5) in den Feldkäfigen (1', 1'') von Haftflächen abgelöst werden, indem die Temperatur der Haftflächen geändert wird, so dass sich die Oberflächeneigenschaften der Haftfläche ändern.
Betriebsverfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass sich die Oberflächeneigenschaften der Haftfläche durch die Temperaturänderung von hydrophil in hydrophob ändern oder umgekehrt.
Betriebsverfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Feldkäfige (1', 1'') selektiv mit den Partikeln (6) des zweiten Partikeltyps beladen werden, indem die einzelnen Feldkäfige (1', 1'') beim Beladen selektiv elektrisch angesteuert werden.
Betriebsverfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, gekennzeichnet durch folgenden Schritt (S6): Untersuchung einer Reaktion zwischen den gemeinsam in den Feldkäfigen (1') befindlichen Partikeln (5, 6) der beiden Partikeltypen.
Betriebsverfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Untersuchung durch eines der folgenden Untersuchungsverfahren erfolgt: a) Impedanzspektroskopie, b) Gleichstrommessung, c) Patch-Clamp-Messung, d) Mikroskopie.
Betriebsverfahren nach Anspruch 13 oder 14, gekennzeichnet durch folgenden Schritt (S7): Selektion bestimmter Partikel (5) des ersten Partikeltyps in Abhängigkeit von der Untersuchung.
Betriebsverfahren nach Anspruch 15, gekennzeichnet durch folgenden Schritt (S12): Selektive Fixierung oder Abstoßung der selektierten Partikel (5) des ersten Partikeltyps in den Feldkäfigen (1', 1''), indem die Feldkäfige (1', 1'') selektiv elektrisch angesteuert werden.
Betriebsverfahren nach Anspruch 16, gekennzeichnet durch folgenden Schritt (S13): Entfernen der abgelösten und nicht fixierten Partikel (5) des ersten Partikeltyps aus dem mikrofluidischen System, insbesondere durch Ausspülen der Partikel (5).
Betriebsverfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Feldkäfige (1', 1'') zur selektiven Beladung mit den Partikeln (5) des ersten Partikeltyps und/oder mit den Partikeln (6) des zweiten Partikeltyps elektrisch selektiv so angesteuert werden, dass die Partikel (5, 6) mittels negativer Dielektrophorese selektiv von den Feldkäfigen (1', 1'') abgestoßen und/oder mittels negativer oder positiver Dielektrophorese selektiv von den Feldkäfigen (1', 1'') angezogen werden.
Betriebsverfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die einzelnen Feldkäfige (1', 1'') bei der Beladung mit den Partikeln (5) des zweiten Partikeltyps unterschiedlich lang und/oder unterschiedlich stark angesteuert werden, so dass sich zwischen den Feldkäfi gen (1, 1', 1'') ein Gradient der Partikel (6) des zweiten Partikeltyps ausbildet.
Betriebsverfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass sequentiell unterschiedliche Partikel (6) des zweiten Partikeltyps zugeführt werden, mit denen selektiv verschiedene Feldkäfige (1', 1'') beladen werden.
Betriebsverfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Partikel (5) des ersten Partikeltyps und die Partikel (6) des zweiten Partikeltyps aus folgender Gruppe ausgewählt sind: a) Biologische Zellen, b) Stammzellen, c) Immunzellen, d) Magnetische oder magnetisierbare Partikel, insbesondere Partikel mit einem magnetischen oder magnetisierbaren Kern, e) Antigene, f) Antikörper, g) Hormone, h) Viren, i) Bakterien, j) Latex beads, k) Vesikel, l) Antigen-präsentierende Zellen, m) biologische Zellen, n) Makromoleküle, insbesondere Immunglobuline, o) Partikel mit einer umhüllten Zielsubstanz im Partikelinneren, p) Partikel mit einer Zielstruktur an der Partikeloberfläche, insbesondere in Form von Molekülen, insbeson dere biologischen Zellen oder Stammzellen, oder Nanostrukturen, q) Magnetische oder magnetisierbare Partikel, insbesondere Partikel mit einem magnetischen oder magnetisierbaren Kern.
Betriebsverfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Partikel (6) des zweiten Partikeltyps kleiner als die Partikel (5) des ersten Partikeltyps sind.
Betriebsverfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, gekennzeichnet durch folgenden Schritt: Bewegen der Partikel (5, 6) der verschiedenen Partikeltypen relativ zueinander durch magnetische Kräfte.
Betriebsverfahren nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, dass die Partikel (5, 6) der verschiedenen Partikeltypen von den magnetischen Kräften a) beim Beladen der Feldkäfige (1, 1', 1'') aufeinander zu bewegt werden und/oder b) beim Ausspülen der Partikel (5, 6) voneinander weg bewegt werden.
Betriebsverfahren nach Anspruch 23 oder 24, dadurch gekennzeichnet, dass a) dass die magnetischen Kräfte beim Beladen der Feldkäfige (1, 1', 1'') geringer eingestellt werden als die dielektrophoretischen Kräfte der Feldkäfige (1, 1', 1'') und/oder b) dass die magnetischen Kräfte beim Ausspülen der Partikel (5, 6) geringer eingestellt werden als die Bin dungskräfte zwischen den Partikeln (5, 6) der verschiedenen Partikeltypen.
Betriebsverfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 25, dadurch gekennzeichnet, dass die Untersuchung durch Messelektroden (10, 11) erfolgt, wobei die Messelektroden (10, 11) auf ein Potentialniveau eingestellt werden, das dem Potentialniveau entspricht, das auch ohne die Messelektroden (10, 11) an deren Ort herrschen würde.
Betriebsverfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, a) dass die Feldkäfige (1, 1', 1'') während der Untersuchung elektrisch nicht angesteuert werden, um eine Verfälschung der Untersuchung zu vermeiden, und/oder b) dass die Feldkäfige (1, 1', 1'') abgeschirmt sind, insbesondere durch eine Passivierungsschicht.
Betriebsverfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, gekennzeichnet durch folgenden Schritt: Manipulation der Partikel (5, 6) in dem Feldkäfig (1, 1', 1'') durch Manipulationselektroden (10, 11).
Betriebsverfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, a) dass die Partikel der beiden Partikeltypen Stammzellen und Triggersubstanzen sind, um eine bestimmte Zelldifferenzierung anzutriggern, und b) dass die Zelldifferenzierung der Stammzellen im fixierten Zustand in den Feldkäfigen erfolgt.
Mikrofluidisches System mit a) einer Trägerstromzuführung zur Zuführung eines Trägerstroms mit darin suspendierten Partikeln (5, 6), gekennzeichnet durch b) mindestens einen Feldkäfig (1, 1', 1''), der in Abhängigkeit von seiner elektrischen Ansteuerung die suspendierten Partikel (5, 6) fixiert oder abstößt.
Mikrofluidisches System nach Anspruch 30, gekennzeichnet durch mehrere Feldkäfige (1, 1', 1''), die in dem mikrofluidischen System räumlich getrennt voneinander angeordnet sind.
Mikrofluidisches System nach einem der Ansprüche 30 bis 31, dadurch gekennzeichnet, dass die Trägerstromzuführung ein Trägerstromkanal ist.
Mikrofluidisches System nach einem der Ansprüche 30 bis 32, dadurch gekennzeichnet, dass die Elektroden der einzelnen Feldkäfige (1, 1', 1'') jeweils dreidimensional oder planar angeordnet sind.
Mikrofluidisches System nach einem der Ansprüche 30 bis 33, dadurch gekennzeichnet, dass die einzelnen Feldkäfige (1, 1', 1'') jeweils dielektrophoretische Feldkäfige sind.
Mikrofluidisches System nach einem der Ansprüche 30 bis 34, gekennzeichnet durch mindestens eine Hilfselektrodenanordnung (9), die in dem Trägerstromkanal stromaufwärts vor oder stromabwärts hinter einem der Feldkäfige (1) für die Fixierung bzw. Abstoßung der Partikel (5, 6) angeordnet ist.
Mikrofluidisches System nach Anspruch 35, dadurch gekennzeichnet, dass die Hilfselektrodenanordnung (9) als Trichter oder als Deflektor wirkt.
Mikrofluidisches System nach einem der Ansprüche 30 bis 36, gekennzeichnet durch einen Träger (4), auf dem die Feldkäfige (1, 1', 1'') angebracht sind.
Mikrofluidisches System nach Anspruch 37, dadurch gekennzeichnet, dass der Träger (4) im Wesentlichen aus Glas, Keramik, einem Halbleiter, insbesondere Silizium, oder Kunststoff besteht.
Mikrofluidisches System nach einem der Ansprüche 30 bis 38, dadurch gekennzeichnet, dass die einzelnen Feldkäfige (1, 1', 1'') jeweils ringförmig und/oder geschlossen sind und/oder stromabwärts eine Schwächung aufweisen.
Mikrofluidisches System nach Anspruch 39, dadurch gekennzeichnet, dass die Schwächung aus einer Passivierungsschicht besteht.
Mikrofluidisches System nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die einzelnen Feldkäfige (1) entgegen der Strömungsrichtung gekrümmt sind.
Mikrofluidisches System nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die einzelnen Feldkäfige matrixförmig in Zeilen und Spalten angeordnet sind.
Mikrofluidisches System nach Anspruch 42, dadurch gekennzeichnet, dass die Feldkäfige (1) durch Zeilen-Steuerleitungen (8) und Spalten-Steuerleitungen (7) selektiv ansteuerbar sind.
Mikrofluidisches System nach einem der Ansprüche 30 bis 43, gekennzeichnet durch Anschlusskontakte, die eine lösbare elektrische Verbindung der Feldkäfige (1, 1', 1'') mit einem separaten Generator ermöglichen.
Mikrofluidisches System einem der Ansprüche 30 bis 44, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens einer der Feldkäfige (1, 1', 1'') eine äußere Ringelektrode (2) und eine innere Ringelektrode (3) aufweist.
Mikrofluidisches System nach Anspruch 45, dadurch gekennzeichnet, dass die Ringelektroden (2, 3) planar und/oder in einer gemeinsamen Elektrodenebene angeordnet sind.
Mikrofluidisches System nach Anspruch 45 oder 46, dadurch gekennzeichnet, dass innerhalb der inneren Ringelektrode (3) mindestens eine Messelektrode (10, 11) angeordnet sind, um die in dem Feldkäfig (1) fixierten Partikel (5, 6) zu vermessen.
Mikrofluidisches System nach Anspruch 45 oder 46, dadurch gekennzeichnet, dass innerhalb der inneren Ringelektrode (3) mindestens eine weitere Manipulationselektrode (10, 11) angeordnet sind, um die in dem Feldkäfig (1) fixierten Partikel (5, 6) zu verändern, insbesondere elektrisch zu porieren oder zu fusionieren.
Mikrofluidisches System nach Anspruch 48, dadurch gekennzeichnet, dass innerhalb der inneren Ringelektrode (3) eine, zwei, drei oder vier Messelektroden (10, 11) angeordnet sind.
Mikrofluidisches System nach Anspruch 48 oder 49, dadurch gekennzeichnet, dass die Messelektroden (10, 11) a) rund, insbesondere oval, oder b) eckig, insbesondere rechteckig, sind.
Mikrofluidisches System nach einem der Ansprüche 30 bis 50, dadurch gekennzeichnet, dass die Ringelektroden (2, 3) eine Passivierungsschicht aufweisen, wobei die Passivierungsschicht ein Auskoppeln eines elektrischen Feldes zur Partikelfixierung erlaubt, wohingegen die Passivierungsschicht für Gleichstromsignale und niederfrequente Signale abschirmend wirkt.
Mikrofluidisches Systems nach einem der Ansprüche 30 bis 51, dadurch gekennzeichnet, dass in mindestens einen der Feldkäfige (1, 1', 1'') ein Unterdruckanschluss (12) mündet, um die Partikel zusätzlich durch Unterdruck zu fixieren.
Mikrofluidisches System nach Anspruch 52, dadurch gekennzeichnet, dass der Unterdruckanschluss (12) zwischen den beiden Messelektroden (10, 11) ausmündet.
Mikrofluidisches Systems nach einem der Ansprüche 30 bis 53, dadurch gekennzeichnet, dass die Messelektroden (10, 11) in dem Feldkäfig (1) entweder symmetrisch oder unsymmetrisch angeordnet sind.
Mikrofluidisches System nach einem der Ansprüche 30 bis 54, gekennzeichnet durch eine Platte, auf der die Feldkäfige angeordnet sind.