WO2007039209A1 - Verfahren und vorrichtung zur manipulation von sedimentierenden partikeln - Google Patents

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particle
separation
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Günter Bauer
Torsten Müller
Thomas Schnelle
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Evotec Technologies Gmbh
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Definitions

  • the invention relates to a method for the manipulation of suspended particles under the action of electric and / or magnetic separation fields, in particular a method for the manipulation of biological particles under the action of dielectrophoretic and / or magnetic
  • the invention further relates to a device for manipulating suspended particles with electrical and / or magnetic separation fields.
  • the device represents a manipulation device for biological particles which are separated by dielectrophoretic and / or magnetic separation forces as a function of predetermined particle properties in different particle fractions.
  • the z. B. comprises a syringe pump
  • the connection of fluid lines restricts the freedom of movement of the microsystem, which may be disadvantageous especially for laboratory applications in cell biology.
  • a further disadvantage of the conventional particle movement by means of hydrodynamic forces is that low speeds (less than 50 ⁇ m / s) can only be adjusted with inaccurate and with low reproducibility with conventional fluidic devices.
  • From EP 1 089 823 it is known to transport particles by means of a sedimentation movement in the fluidic microsystem. Sedimentation forces generated by gravity or centrifugation allow accurate and reproducible adjustment of low particle velocities.
  • the microsystem for receiving a particle suspension must be connected to a fluidic device, so that in turn results in the problem of limited freedom of movement and complicated handling of the microsystem.
  • the microsystem is formed by a fluidic chip.
  • a disadvantage of using the fluidic chip may be its limited compatibility with the rest of the art, which in a laboratory z. B. is used for chemical, biological and especially cell biology studies.
  • the fluidic chips require a complex fluidic periphery, which may represent an unacceptably high cost if only a few cells are to be manipulated and, in particular, sorted. While providing fluidic peripherals is worthwhile for high-throughput applications, laboratory equipment is flexible even with small sample quantities and under varying conditions of use not available.
  • the object of the invention is to provide an improved method for the manipulation of suspended particles, with which the disadvantages of the conventional technique are overcome and which has a wider field of application.
  • the method according to the invention should have improved compatibility with available laboratory equipment and enable flexible use under different conditions of use even with small sample quantities.
  • the object of the invention is further to provide an improved manipulation device for manipulating suspended particles, with which the disadvantages of conventional micro fluidic systems are avoided and which in particular has an extended application range and an increased freedom of movement and simplified handling compared to conventional fluidic chips.
  • the invention is based on the general technical teaching of influencing a sedimentation movement of suspended particles in a liquid lifting device by electric and / or magnetic separating fields in such a way that the particles have a characteristic sedimentation rate (in particular sedimentation rate) as a function of the specific interaction with the separating fields and / or sedimentation direction).
  • a characteristic sedimentation rate in particular sedimentation rate
  • several particle fractions are formed preferably be dispensed separately from the liquid lifting device.
  • the manipulation of the suspended particles does not take place in a fluidic chip, but rather in a liquid-lifting device which preferably has at least one siphon opening.
  • liquid lifting device (or: “lifter”) is here generally referred to as a device for receiving and / or dispensing liquids from or into open liquid reservoirs.
  • the liquid lifting device enables the uptake, temporary storage and subsequent delivery of a carrier liquid with suspended particles and thus can fulfill the transport function of the fluidics devices used in the conventional techniques.
  • An essential advantage of the invention is that by the generation of the electric and / or magnetic separation fields in the liquid lifting device additionally manipulation, in particular sorting of the particles is made possible.
  • the conventional manipulation of suspended particles in the fluidic chip in combination with the fluid device can be replaced according to the invention by the manipulation of the suspended particles in the fluid lifting device.
  • the liquid lifting device can be used independently and flexibly without additional fluidic devices for liquid transport.
  • the liquid lifting device can in particular be moved freely or brought into a rest position manually or with a mechanical actuator after receiving the suspended particles while the particles are being manipulated.
  • Another important advantage of the invention is that through the z. B. dielectrophoretic separation smallest cell levels, eg. B. two cells can be separated from each other.
  • an interaction of the particles with the electrical and / or magnetic separation fields is utilized. Influencing the sedimentation velocity of the particles as a function of their interaction with the separation fields may, in various embodiments of the invention, result in a change in the magnitude and / or direction of the sedimentation velocity.
  • separation forces are generated which, depending on the particle properties, result in an increased sedimentation velocity for some particles and in a reduced sedimentation velocity for other particles, so that the particles can collect in the separated particle fractions.
  • the sedimentation rate can be reduced to zero if necessary.
  • a particular advantage of the invention lies in the variety of interactions between the particles and the separation fields, on the basis of which the separation forces can be generated.
  • dielectrophoretic, electrophoretic, magnetic and / or electromagnetic separation forces can be generated, which accordingly have different effects on particles having different properties, which comprise dielectric properties, magnetic properties, polarization properties and / or conductivity properties of the particles.
  • different dielectrophoretic forces can be exerted on biological cells which differ from one another with regard to at least one of the properties composition, size and shape. If particles with different properties undergo different levels of negative dielectrophoresis separation forces, they can sediment at different velocities in the fluid delivery device.
  • unwanted particles can be fixed by means of positive dielectrophoresis or by electrophoresis on electrodes for generating the electric separation fields and thus form a separate particle fraction.
  • the separation is carried out by setting the separation fields so that different negative-dielectrophoretic separation forces act on different particles. Differences in the negative dielectrophoretic separation forces can, for example, cause different particles to sediment at different speeds or that different particles are moved onto different sedimentation paths depending on the interaction of the separation forces with the sedimentation forces.
  • the exercise of different strong negative dielectrophoretic separation forces has the
  • a field effect is exerted on all particles contained in the suspension and the particles are manipulated without contact in the liquid lifting device.
  • the particles positive-dielectrophoretic separation forces are exerted.
  • the affected particles are attracted to an electrode for generating the separation fields.
  • This variant has the advantage that the selective sharpness of the particle manipulation is improved by the at least temporary fixing of the particles to the electrode.
  • the separation fields have no influence, so that these uninfluenced particles exclusively perform the sedimentation movement. In this case, there are advantages in terms of the simplified setting of the separating fields.
  • the liquid lifting device generally has a reservoir for receiving the carrier liquid with the suspended particles, which comprises at least one lifting channel with a predetermined longitudinal extent. In the operating position, the liquid lifting device is oriented so that the direction of the longitudinal extent deviates from the horizontal and preferably runs vertically. Each lifting channel has at its free end to a siphon opening, through which the carrier liquid from a reservoir with a free liquid stechniksoberflache be included in the liquid lifting device. In operating position, the siphon opening is arranged at a lower end of the liquid lifting device.
  • the reservoir comprises a vessel, such as. B. a grain partiment a microtiter plate, or a free substrate surface such. B. a carrier glass for microscopy.
  • particle separation can be carried out in particular on the basis of the following considerations.
  • the sedimentation velocity is known to be determined from the following equilibrium of forces:
  • g, p, ⁇ p, ⁇ and v represent the gravitational acceleration, density, density difference, viscosity of the medium and the particle velocity.
  • an additional force can be exerted on the individual particles in the direction of sedimentation or hydrodynamic resistance to be changed.
  • the flow resistance can be changed by a reorientation and / or a deformation and / or an aggregation of the particles (larger objects of the same density and symmetry settle faster). This can be realized, for example, in homogeneous electrical or magnetic external fields.
  • F 2 may be homogeneous fields (eg electrophoresis) or gradient fields (eg dielectrophoresis or magnetophoresis), which scale with r 3 like the sedimentation force. It can also be provided that the particles are set in rotation (eg, electrorotation in rotating electric fields) so as to change their trajectory (Magnus effect).
  • homogeneous fields eg electrophoresis
  • gradient fields eg dielectrophoresis or magnetophoresis
  • the particles are set in rotation (eg, electrorotation in rotating electric fields) so as to change their trajectory (Magnus effect).
  • the suspended particles are taken up with a carrier liquid through the at least one siphon opening in the liquid lifting device, there are particular advantages for the inventive multiple function of the liquid lifting device for transporting the carrier liquid and for manipulating the suspended particles.
  • liquid lifting device has only one siphon opening, which is used as a fluidic input and output.
  • the inclusion of the carrier liquid with the suspended particles can be achieved by applying a negative pressure in the liquid lifting device.
  • a negative pressure in contrast to conventional fluidic devices, it is advantageously sufficient if a relatively low negative pressure is applied for a predetermined intake time and then maintained.
  • a rubber balloon or a pressure piston can be used.
  • the carrier liquid containing the suspended particles and then a buffer liquid without particles are received in the liquid lifting device, advantages for a reliable displacement of the carrier liquid with the suspended particles to a predetermined starting position relative to a manipulation region can result in which the Separation fields are exercised.
  • the inclusion of the buffer liquid has the further advantage that the carrier liquid with the suspended particles in the liquid lifting device is separated from the siphon opening. In this way, undesired environmental influences on the particles, in particular on biological cells or other biological particles during sedimentation, can be ruled out.
  • the buffer liquid may be identical to the carrier liquid, but without containing particles. Alternatively, another liquid can be used as the buffer liquid.
  • the buffer liquid comprises e.g. B. an isotonic aqueous solution.
  • the particles collect in a particle fraction, and preferably for particle sorting into at least two particle fractions.
  • the method according to the invention has great flexibility in the separate dispensing of the particle fractions from the liquid lifting device.
  • the particle fractions can be output separately in time. After sedimentation with the collection in the particle fractions, the particles having the highest sedimentation velocity can emerge first and then the particles with lower sedimentation velocities can escape from the liquid suspension device.
  • the liquid elevating device can be moved between different destination reservoirs, so that the various particles can be deposited in different compartments or on different substrates for further processing, examination or the like.
  • the particle fractions spatially separated from the liquid lifting device. For this purpose, during the sedimentation movement under the effect of the separating fields, a deflection of different particles into different lifting channels takes place.
  • This embodiment of the invention is advantageous since the particle fractions can be deposited in parallel in or on different destination reservoirs. The two variants of the temporally and spatially separated output of the particle fractions can be combined.
  • the output of the particle fractions is effected by the at least one lift opening of the liquid lifting device.
  • the siphon opening is advantageously used both for receiving and for dispensing the carrier liquid, wherein for dispensing the initially existing underpressure can be replaced by a constant overpressure in order to accelerate the dispensing of the carrier liquid with the separate particle fractions.
  • the overpressure can z. B. by an integrated syringe pump or by the exercise of a mechanical bias, z. B. by a spring on the pressure piston, be exercised.
  • the siphon opening serves as an inlet and outlet.
  • the filling of the liquid lifting device can take place through a further opening, which is arranged, for example, relative to the siphon opening at the opposite end of the liquid siphoning device.
  • a predetermined volume of the carrier liquid eg suspension of a cell sample
  • the additional, particle-free buffer liquid can be recorded.
  • the carrier liquid containing the suspended particles is transported to the start position of the sedimentation in the manipulation area or upstream of the manipulation area in which the electrical and / or magnetic separation fields are generated.
  • the liquid lifting device is inserted into a holding device. During the subsequent sedimentation movement, the separation fields are generated, so that the particles are selectively influenced in their sedimentation rate (amount and / or direction).
  • the magnetic separation fields form at least one magnetic field gradient in the liquid lifting device, there are advantages for the reliable separation of particles which experience a force effect in the magnetic field (magnetic particles) and other particles to which the magnetic field has no effect ( non-magnetic particles).
  • particles consisting of magnetic beads or connected to magnetic beads can advantageously be separated from non-magnetically marked particles.
  • the simultaneous generation of electrical and magnetic separation fields allows the simultaneous separation of the particles as a function of different particle properties (eg dielectric and magnetic properties).
  • the electrical and magnetic separation fields can be generated during the sedimentation movement with a time interval or in different partial manipulation areas in the liquid lifting device. For example, after the onset of sedimentation, the production of magnetic particles may first begin Separation fields and then the generation of dielectrophoretic separating fields are provided to first separate magnetically marked particles of non-magnetically marked particles and then perform a separation as a function of the dielectric properties. Alternatively, first the electrical separation fields and then the magnetic separation fields can be generated.
  • the separating fields form at least one separating field and / or a separating field gradient in which the particles execute an orientation movement as a function of a predetermined particle property (eg polarizability, magnetic dipole).
  • a predetermined particle property eg polarizability, magnetic dipole.
  • the sedimentation velocity and thus the separation of the particles into the particle fraction can be influenced by the orientation movement. It is particularly preferable to set an orientation of the particles as a function of the particle shape, the particle geometry, the particle structure and / or the particle composition.
  • the sedimentation forces cause a constant force effect, which is exerted in the same way on all particles.
  • the sedimentation forces comprise the gravitational force and / or centrifuging force, since for them conventional sedimentation techniques are available in the quiescent vessel or in a centrifuge.
  • a magnetic sedimentation force, a dielectrophoretic sedimentation force, an electrophoretic sedimentation force, an electromagnetic sedimentation force or a combination be used from these forces in support of the sedimentation movement.
  • the carrier liquid is subjected to ultrasound with the suspended particles in the liquid lifting device, undesired particle aggregations can advantageously be dissolved.
  • This embodiment makes it possible to avoid clogging of a lift channel.
  • the trajectory of the particles can be changed by ultrasound.
  • a transfer of the liquid-leveling device into a holding device is provided. If the sedimentation is induced substantially by the gravitational force, the liquid lifting device is positioned in the holding device so that the longitudinal extent of the at least one lifting channel is vertical.
  • the positioning of the fluid lifting device may include insertion or suspension in a customized frame.
  • the operation of the liquid lifting device can be simplified if, at the same time as the positioning of the liquid lifting device in the holding device, the separating device is electrically connected to a power supply device.
  • the holding device can be designed to exercise further sedimentation forces, and include, for example, a centrifuge and / or a switchable sedimentation magnet.
  • the suspended particles preferably comprise biological cells, cell constituents, cell groups, cell organelles, viruses, biological macromolecules or combinations thereof.
  • the implementation of the invention is not limited to biological applications, but also possible with non-biological particles, which are made for example of plastic, glass, minerals or ceramics.
  • the suspended particles in a sample can comprise particles of biological origin and non-biological particles which are separated from one another, for example, by the manipulation according to the invention.
  • the particles preferably have a characteristic dimension in the range of 500 ⁇ m to 50 nm.
  • the carrier liquid may be selected depending on the application of the invention and comprise a single-phase or a multi-phase liquid.
  • Another preferred application of the invention is the separation of particles for the purification of cell suspensions, e.g. for the patch clamp technique.
  • living biological cells can be separated from dead or damaged cells or cell debris using the method of the invention.
  • This blockage of the suction of a patch device is avoided by unwanted sample components or target cells or aggregates of larger or smaller objects are separated. This works better with the technique according to the invention than in horizontal flow systems in which the larger objects sediment easily into flow-calmed zones and blockages can occur there.
  • an electric field treatment of the suspended particles in the liquid is stechniksheber worn provided, which alternatively or in parallel to the separation into different particle fractions also includes a change of the particles.
  • a cell or cell fusion can be performed in the liquid lifting device.
  • the liquid-lifting device described here is equipped with a poration and / or fusion electrode arrangement, as is known, for example, from micromachining technology, and can be constructed as described here with reference to the separating device is.
  • the reception of the carrier liquid in the liquid lifting device comprises a simultaneous suction into a plurality of lifting channels.
  • This variant allows the parallel recording of samples z. B. from the compartments of a microtiter plate.
  • a pipetting device or a part thereof is used as the liquid lifting device.
  • the treatment of the suspended particles with electrical and / or magnetic fields can be provided, for example, in at least one pipette tip or at least one pipette reservoir of a single or multiple pipette.
  • the separation and / or efficiency of the separation is monitored by optical and / or electrical measuring methods.
  • the liquid lifting device is z. B. equipped with a camera device.
  • the electrical monitoring may be based on an impedance measurement in the fluid lift device.
  • the above-mentioned object is achieved by equipping a liquid lifting device for receiving a suspension sample with a separating device (eg electrode device or magnetic field device) for generating electric and / or magnetic separating fields in the liquid lifting device.
  • a separating device eg electrode device or magnetic field device
  • this provides a multifunctional manipulation device which is compatible with laboratory technology used in practice.
  • the liquid lifting device has one or more lifting channels.
  • the lifting channels preferably run straight with a predetermined longitudinal extent.
  • the plurality of lift channels are arranged parallel to each other in a plane (one-dimensional lift) or as a matrix (two-dimensional lift).
  • the separating device is arranged in at least one of the lifting channels.
  • This variant is preferred because of the direct field effect of the separator.
  • the coupling of the electrical see and / or magnetic separation fields in the carrier liquid is simplified.
  • the separating device may be arranged on an outer side of the liquid lifting device in the vicinity of at least one of the lifting channels.
  • possible desired effects of a substance (eg the carrier liquid) in the liquid lifting device on the separating device avoided.
  • the structure and manufacture of the liquid lifting device is simplified.
  • the separation device can, for. B. be releasably secured on the outside of the liquid lifting device.
  • conventional liquid lifting devices such. As pipettes or pipette tips with a separating device to provide on the invention manipulation device.
  • the separating device preferably comprises an electrode device with at least two strip-shaped or annular electrodes.
  • the electrode device can be designed as known from the conventional technique of fluidic microsystems.
  • the separating device preferably comprises a magnetic field device.
  • the magnetic field device has at least one coil, the magnetic separation effect can be advantageously adjusted depending on the specific application of the invention. If the magnetic field device has at least one permanent magnet, advantages result from a simplified construction of the manipulation device.
  • the at least one lifting channel of the liquid lifting device is provided with at least one subchannel whose characteristic cross-sectional dimension is less than is the cross-sectional dimension of the lifting channel and in which the electrodes of the separator are arranged.
  • the liquid lifting device or at least the wall of the siphon channels there is a large variety of available materials from which the liquid lifting device or at least the wall of the siphon channels is made.
  • materials from which the liquid lifting device or at least the walls of the siphon channels is constructed dielectrically from the carrier liquid, for. B. different from a saline solution.
  • the liquid lifting device comprises a pipetting device or a part thereof.
  • the pipetting device e.g.
  • B. Laborhubpipette which may be constructed substantially as conventional laboratory equipment is equipped with the separator for generating the separation fields in the pipette reservoir and / or in the pipette tip. It is particularly advantageous for a high degree of flexibility in the application of the invention if the manipulation device has a pipette tip which is connected to the separating device. In this case, a conventional pipetting device can be equipped with the inventively functionalized pipette tip.
  • FIG. 3 shows embodiments of electrode devices according to various embodiments of the manipulation device according to the invention
  • FIG. 4 shows a further embodiment of the manipulation device according to the invention with a plurality of lifting channels
  • FIG. 5 shows a further embodiment of the manipulation of suspended particles according to the invention
  • FIGS. 6 and 7 illustrations of the separation fields generated in a manipulation device according to the invention
  • Figures 8 and 9 Illustrations of sedimentation and orientation steps in a manipulation device according to the invention.
  • FIG. 10 shows embodiments of the manipulation device according to the invention, in which a pipette tip is equipped with a magnetic field device.
  • the invention will be described below by way of example with reference to the use of pipette tips for the electrical or magnetic manipulation of suspended particles. It is emphasized that the invention can be implemented accordingly by providing the separating device at the reservoir of a liquid pipette or another liquid lifter (eg suction pipette, lifting pipette, capillary tube, fluidic hollow line).
  • a liquid pipette or another liquid lifter eg suction pipette, lifting pipette, capillary tube, fluidic hollow line.
  • FIG. 1A illustrates, in a schematic, enlarged sectional view, the manipulation device 100 in which a pipette tip 10 is provided as the liquid lifting device.
  • the siphon opening and the siphon channel are correspondingly formed by the pipette opening 11 and the pipette channel 12.
  • an electrode device 20 with strip-shaped electrodes 21.1, 21.2 is arranged as the separating device.
  • the pipette tip 10 has dimensions such as conventional, commercially available pipette tips from manufacturers such. Gilson or Eppendorf.
  • the inner volume of the pipette channel 12 is, for example, 5 .mu.l to 200 .mu.l.
  • the pipette tip 10 can be made of known materials such as glass, plastics, ceramics or silicon, which can be easily provided with electrodes. It is also possible to use composite materials such as plastics provided with conductive nanoparticles, which can be inexpensively formed by means of injection-molding processes and, for example, can be optically provided with conductor tracks. It may be particularly advantageous to integrate in the pipette channel a plurality of subchannels. This can be, for example, cost-effective on the WO 2004/076060 realize known technology.
  • the manipulation range of the pipette can be shaped differently (for example, circular or rectangular cross-section) and with constant dimensions or conical.
  • a dielectric to the medium (conductivity / dielectric constant) different material can be introduced, for.
  • a porous plug that produces field inhomogeneities for particle separation see Lapizco-Encinas et al., "Dielectrophoretic Concentration and Separation of Live and Dead Bacteria in an Array of Insulators” in Analytical Chemistry, Vol. 76, 2004, p. 1571-1579).
  • the electrodes 21.1, 21.2 comprise at least two electrically conductive conductor tracks which are connected to a power supply device (not shown) for generating electrical separation fields.
  • the electrodes 21.1, 21.2 are electrically isolated from one another, preferably on the inside of the pipette tip 10, or alternatively arranged in the wall or on its outer surface.
  • the figures show the electrodes on the outside of the pipette tip for improved visibility.
  • the electric fields generated by the electrodes (separating fields) act in accordance with their extent in a certain area of space, which is referred to here as a manipulation area.
  • the pipette tip 10 has a cross-sectional dimension, preferably in the range of 100 ⁇ m to 1 mm.
  • the pipette channel 12 can, for example, starting from the pipette opening 11 with a narrow section step-shaped into a section with a larger Expand internal dimension, the electrode means 20 is provided in this case at the upper end of the narrow portion in front of the stepped extension.
  • FIG. 1A further shows in a sample reservoir 70 a suspension sample with different types of particles 1, 2 in a carrier liquid 3.
  • the sample reservoir 70 is, for example, a compartment of a microtiter plate.
  • the different types of particles 1, 2 include z. B. different cell populations, which differ in their passive dielectric properties and / or their shape, geometry or size.
  • the separation of the cell populations with the method according to the invention is illustrated in FIGS. IB to IF and comprises the following steps.
  • the pipette tip 10 is attached to a laboratory pipette (not shown) and subjected to a negative pressure with a pressure piston.
  • the recording of the carrier liquid takes place first in the lower portion of the pipette tip 10 below the electrode device 20 ( Figure IB).
  • the dotted line 3.1 denotes the meniscus of the carrier liquid 3.
  • a further buffer liquid 4 is received from a buffer reservoir 71, so that the carrier liquid with the particles is displaced into the manipulation region between the electrodes 21.1, 21.2.
  • the interface between the carrier liquid 3 and the buffer liquid 4 is marked with dots (3.2).
  • the buffer liquid 4 may have different physical properties than the sample.
  • the density or viscosity may be changed or it may differ in the conductivity or dielectric constant.
  • the particles in the buffer liquid can first be compacted.
  • the narrower band can then be accelerated by applying additional forces (centrifugation, magnetic field).
  • Changed dielectric properties of the buffer liquid can serve to set more favorable conditions for dielectrophoresis.
  • the holding device 30 comprises a frame with an electrical connection 31 for connecting the electrodes 21.1, 21.2 to a power supply device.
  • the separation of the particles 1, 2 into different particle fractions takes place in three stages, which are illustrated in the figures ID to IF.
  • the pipette tip in the holding device 30 is set up vertically for a predetermined separation time T z .
  • the lower pipette tip can rest in a vessel or on a substrate (not shown).
  • high-frequency electric fields are generated with the electrodes 21.1, 21.2 in the manipulation area.
  • the fields typically have frequencies in the range of 1 kHz to 100 MHz and voltages in the range of 1 V to 20 V, depending on the specific separation task.
  • the fields are generated with alternating voltages or with pulsed voltages.
  • the high frequency electric separation fields are generated so that the type of the first cell population (white circles) forms a first particle fraction 5 and the sedimentation following movement in the pipette tip 10, while the type of the other cell population (black circles) forms a second particle fraction 6 and is held in the manipulation area by positive dielectrophoresis.
  • the separation time is determined by the difference between the mass densities of the cells (eg 1.05 g / cm 3 ) and the carrier liquid (eg 0.9 g / cm 3 ). For cell sizes in the range of 5 microns to 30 microns results in a separation time of up to about 60 min.
  • the sedimented particle fraction 5 is discharged via a predetermined volume from the pipette tip 10 into a target reservoir 72 (for example, a comparator of a microtiter plate).
  • a target reservoir 72 for example, a comparator of a microtiter plate.
  • the particle fraction 6 can still be held in the manipulation area or flushed out of it as illustrated.
  • the volume for delivering the particle fraction 5 into the target reservoir is dimensioned such that the particle fraction 6 does not likewise reach the target reservoir 72.
  • the particle fraction 6 is transferred to a further destination reservoir 73 or a waste container (FIG. IF).
  • the particle separation is accelerated in a centrifuge. After successful Separation, the particles / cells can be rinsed out of the pipette in one or more fractions.
  • the pipette tip can also be placed directly in a vessel, with a particle fraction sedimenting directly into this vessel. If, during the separation of two particle types, one is completely retained in the manipulation region and the manipulation region begins immediately at the pipette tip, then it is possible to dispense with the step of drawing up the separation medium. This results in fluidically easy-to-handle systems compatible with laboratory diagnostics with integrated cell preparation (cell fractionation, cell cleaning, etc.), which are also easy to automate (pipetting autodata).
  • the pipette tip 10 or the laboratory pipette may be provided with a scaling.
  • the electrode strips extending perpendicular to the longitudinal extent of the pipette channel 12 can be used as scaling.
  • the force acting in the earth field in the pipette tip 10 corresponds to about 1 pN. In aqueous solutions, this results in an unaffected sinking rate of approximately 7.4 ⁇ m / s. This requires approx. 135 s per 1 mm separation distance. Dielectrophoretic forces can easily be adjusted in the range of nN up to several tens of pN via appropriate voltages or frequency settings. If a sample of the height h in the pipette to be completely separated and the dielectrophoretic forces are, for example.
  • the subchannels have the characteristic dimensions of z. B. 300 microns.
  • the particles may be exposed to further forces, e.g. magnetic fields (e.g., to accelerate sedimentation) or ultrasound (to avoid particle clumping).
  • Magnetic forces can be applied from the outside (see Figure 2D) or internally with microelectrodes, as shown for example in DE 103 55 460 Al. In the latter case and when using magnetic or magnetizable particles (eg., Dynabeads) may possibly be dispensed with an electrical separation entirely.
  • the liquid lifting device consists of a pipette tip 10 and an electrode device 20 with electrodes 21.1, 21.2 (FIG 2A), as described above (see Figure IA).
  • FIG 2A the difference to the method described above is provided according to Figure 2, however, that the two-stage recording of the suspension sample (carrier liquid with particles) results in a stronger displacement of the suspension sample.
  • the particles are taken up with the carrier liquid in the lower portion of the pipette tip 10.
  • buffer fluid 71 is taken up from a buffer reservoir 71 in such a way that the particles are transported into an area above the manipulation area (FIG. 2C).
  • the pipette tip 10 (with the laboratory pipette) is inserted into the holding device 30 (FIG. 2D).
  • the particles sediment through the manipulation region between the electrodes 20, whereby different strong separation forces are exerted opposite to the direction of sedimentation by means of negative dielectrophoresis on the different particles.
  • the particle fraction 5 initially reaches the target reservoir 72.
  • the activation of the electrodes 21.1, 21.2 can be switched to an operating mode in which positive dielectrophoresis is generated and the particle fraction 6 is retained in the manipulation region. As a result, the selectivity of the method according to the invention is increased.
  • FIG. 2D schematically illustrates further details of the holding device 30 with the electrical connection 31, the power supply device (generator) 32, a switching and contact electronics 33 and a magnetic control 34.
  • Magnetic control 34 an electrically switchable magnet 35 below the pipette opening 11 of the pipette tip 10 is turned on ⁇ to an additional magnetic sedimentation to generate onskraft and to increase the sinking rate of magnetic particles.
  • the holding device 30 can be equipped with further modules, for. B. with a drive module for the pressure piston of the laboratory pipette. With the drive module, a slight volume flow could be generated by the pipette channel 12 corresponding to the function of a syringe pump, whereby the separation of the particles is advantageously accelerated.
  • the holding device 30 may also be part of a centrifuge.
  • FIG. 3 illustrates three variants of the design of an electrode device 20, which can be arranged on the inner wall of a pipette tip 10.
  • the electrode device 20 comprises two comb-shaped intermeshing electrodes 21.1, 21.2 with radially extending electrode strips, which are driven by two signals which have a mutual phase shift of 180 ° (+/- represent the phase shift 180 °).
  • FIG. 3B a more complex electrode geometry is provided, in which four comb-shaped electrodes are arranged to intermesh, wherein in each case two pairs of electrodes have a relative phase shift of 90 °.
  • the designs shown in FIGS. 3A and 3B are preferably realized with a pipette tip having a cylindrical pipette channel 12 (top view in the lower parts of FIGS. 3A, 3B).
  • FIG. 3C shows a modification in which the electrodes are arranged as axially extending strips on the inner wall of a tapered pipette channel 12.
  • the electrodes are arranged as axially extending strips on the inner wall of a tapered pipette channel 12.
  • four opposing electrodes are provided (top view in the lower part of FIG. 3C), which are subjected to signals of a relative phase shift of 90 ° in each case.
  • three electrodes can also be arranged offset by 120 ° and applied with signals which have a mutual phase shift of 120 °.
  • FIG. 4 illustrates an embodiment of the manipulator device 100 according to the invention, in which a multipipette 10 having a plurality of pipette tips 10.1, 10.2, 10.3 and 10.4 is provided as the liquid lifting device.
  • the schematically illustrated pipette 10 is constructed like conventional pipettes.
  • the separating device 20 comprises a plurality of electrode devices 20.1, 20.2, 20.3 and 20.4, which are each arranged on the pipette tips 10.1, 10.2, 10.3 and 10.4.
  • FIG. 5 shows a further exemplary embodiment of the manipulation device 100 according to the invention, in which the liquid-lifting device comprises a two-channel pipette 10.
  • the separator 20 is provided in the pipette reservoir above the pipette tips.
  • the two-channel pipette 10 has two tubular pipette channels 12. 1, 12. 2 for the sample intake and a pipette reservoir 13.
  • the electrode device 20 is arranged in the pipette reservoir 13. Only via one of the pipette channels (12.2), the electrode device 20 is electrically insulated in the upper region of the pipette 10 with at least two electrical conductors 21.1, which allow an application of alternating electric fields.
  • the pipette 10 has an asymmetrical pipette reservoir 13. The volume of the pipette reservoir 13 is greater above the electrodes 21.1 and the pipette channel 12.2 than the corresponding volume above the pipette channel 12.1.
  • the carrier liquid 3 in the sample reservoir 70 contains two different cell populations 1, 2, which differ in their passive dielectric properties, shape, geometry, and / or size.
  • both pipette channels are filled with the mixed population of the particles 1, 2.
  • buffer liquid is additionally taken up from a buffer reservoir 71 (FIG. 5B).
  • the mixed population of the particles 1, 2 reaches the common space above the electrodes 21.1 (FIG. 5C).
  • the particle fractions 5, 6 are not staggered in time as in the above-described processes, but are generated spatially separated in the pipette channels.
  • the pipette 10 can be used in a holding device (not shown, similar to Figure 2).
  • the electrode device 20 is activated. Be ⁇ vorzugt by sedimentation or via a manual or mechanical feed enter the cells 1, 2, 20, in the area of the electrode device a result of the dielectric differences, the first type of particle which Elektrodeneinrich- Device 20 pass unhindered and get into the pipette channel 12.2, while the second particle type is deflected by the electrode device 20 and transferred to the pipette channel 12.1. Thereafter, the various fractions 5, 6 can be collected in separate vessels.
  • a particular advantage of the sorting process described here is that after the separation in the region of the electrode device for removal, the particles do not have to sediment to the lower end of the pipette channels, but instead can be flushed out separately after they have entered the pipette channel.
  • FIG. 6 illustrates the dielectrophoretic potential (mean E 2 ) for a 2-ring electrode structure.
  • Electrodes 21 a conical channel (as in Figure 1) in the central section parallel to the longitudinal extension of the pipette tip.
  • two different types of particles are shown, with the particles shown darker than the bright particles are retained by negative dielectrophoresis and therefore not sediment so quickly.
  • FIG. 7 illustrates the dielectrophoretic potential (average E 2 ) for the electrodes 21 shown in FIG. 3C (drawn in black) in the case of an activation with an alternating field ("ac", 2-phases, left) and with a rotation field (“red”). , 4-phase, right).
  • FIGS. 6 and 7 show that while particles can also be influenced in the vicinity of a single electrode, a two-electrode arrangement allows the setting of more precisely defined conditions, in the simplest case consisting of 2 rings (FIG.
  • the particles are dielectrophoretically centered in the field and sediment towards the tip 11 (see Figure IA) of the pipette 10.
  • Figure 7 In ac control, the electric field in the axis of symmetry disappears and the particles experience a force which is proportional to the 5th power of the particle radius. Thus, smaller particles sediment faster than larger ones under conditions of negative dielectrophoresis. In red field control, the dielectrophoresis dipole forces, which are proportional to the particle volume, dominate.
  • cells can be fractionated particularly effectively according to their size if the cells are manipulated by suitable electrode geometry and control in regions with vanishing dipole force fraction and, for example, a separation according to quadrupole force fractions.
  • the reorientation represents a general separation possibility, since the flow resistance depends on the orientation of the particles. While pure particle aggregation into spherical objects is usable only in special field distributions with, for example, disappearing dipole moment in the symmetry axis (FIG. 7, ac), the field-induced particle aggregation to non-spherical objects (eg bead chains in homogeneous fields) is outstandingly suitable. resistance depends on the orientation. Should z.
  • non-spherical particles are separated from one another or from spherical particles, at least one particle type is oriented in parallel with the larger "semiaxis" parallel or antiparallel to the electrical (magnetic, optical) field by suitable choice of the frequency and possibly the buffer liquid.
  • the second type of particle can be oriented perpendicular to the first
  • One important technical application is the separation of conducting and semiconducting CNTs that occur accidentally during production.
  • non-spherical objects such as non-spherical biological cells, e.g. B. red blood cells, or artificial objects, such. B. carbon nanotubes tube
  • the aggregation of the objects in electric and / or magnetic fields and the concomitant altered sedimentation velocity are used for particle manipulation and in particular separation.
  • This embodiment of the invention is based, in particular, on the knowledge that, when particles accumulate, the flow resistance i.sub.A increases less than the sedimentation force. For two touching balls with the same radius, for example, with doubled mass (sedimentation force) depending on the orientation only an approx.
  • the field-induced particle aggregation can be achieved according to a first variant in homogeneous fields. It is known there, for example, as pearl chain formation (see TB Jones “Electromechanics of Particles", Chapter 6 “Theory of pearl chains", p. 139 ff.).
  • FIG. 8A shows the formation of particle aggregates (in particular particle chains or particle carpet) in the homogeneous or nearly homogeneous electric field.
  • the manipulation device 100 (top side view, bottom plan view) has, on opposite walls of the lift channel 12 formed with a rectangular cross section, electrodes 21.4, which are alternately acted upon with a positive or negative voltage to form a homogeneous electric field.
  • aggregates can also be generated in inhomogeneous fields by dielectrophoresis or magnetophoresis and used for separation.
  • magnetophoresis coils are correspondingly used (see for example DE 10355460.2).
  • the filling of the manipulation device 100 according to FIGS. 8A or 8B with a particle suspension can take place from the below-provided siphon opening 11 or at the opposite, upper end of the siphon channel 12.
  • a particularly sharp separation into fractions can be achieved if the particles are initially above the electrodes and the field frequency and voltage or phase pattern are set so that the particles can not initially penetrate into the separation area with the electrodes.
  • advantageously defined initial conditions are set.
  • unwanted random or field-mediated particle aggregation can be minimized or inhibited by coupled vibrations (e.g., ultrasound) in this phase.
  • coupled vibrations e.g., ultrasound
  • two electrode regions may be provided, wherein the particles are arranged in an upper electrode initially filled and exposed to a first aggregation field, which retains the objects simultaneously, and sediment in a lower electrode area. If the particles tend to contact for active aggregation (eg biological cells), the lower electrode area may be omitted.
  • active aggregation eg biological cells
  • the orientation of aggregates is explained below with reference to FIG. 9, which illustrates by way of example two force-induced orientation effects which can lead to a different sample separation.
  • the orientation electrode 21.6 is z. B. a dielectrophoretic funnel ("Funnel"), as it is known from the fluidic microsystem technology.
  • the orientation electrode 21.6 is arranged in the lifting channel 12 extending axially.
  • at least one holding electrode 21.7 is provided.
  • the holding electrode 21.7 includes z. B. parallel, annular partial electrodes in the form of strips or so-called ZigZag elements, as they are known from the dielectrophoretic manipulation.
  • the holding electrode 21.7 is arranged in the lifting channel 12 radially encircling.
  • a separation cascade can be formed, which is a combination of at least one orientation electrode 21.6 and at least one holding electrode 21.7, z. B. at least two holding electrodes 21.7 and / or at least two orientation electrodes 21.6 includes, z. B. be driven with two different frequencies.
  • a suspension to be separated in the manipulation device 100 contains e.g. B. spherical particles 7 and two types of ellipsoidal particles 8, 9.
  • the suspension arrives at the with an AC voltage acted upon orientation electrode 21.6, the particles are rotated in response to the frequency of the AC voltage in the range of the orientation electrode 21.6 (reoriented).
  • predetermined preferred frequencies are set for ellipsoids in which an orientation occurs transversely or longitudinally to the field vector of the orientation electrode 21.6. This rotation (orientation) then affects the sedimentation behavior of the particles.
  • electric fields with different frequencies are applied to the orientation electrode 21.6, which are adapted to the respective particle types. The different frequencies can be superimposed simultaneously or generated alternately.
  • the suspension arrives at the holding electrode 21.7 charged with an alternating voltage and the frequency of the alternating voltage is selected at a subelectrode so that all ellipsoidal particles or a certain subset of them lie transversely to the flow, then the corresponding holding force is increased and the particles are retarded significantly longer than spheres or other ellipsoids that align in the flow direction.
  • the suspensions to be separated contains z.
  • Carbon fibers each of which may consist of spherical and elongated ellipsoidal objects.
  • the invention can be used with suspensions containing blood cells. It is known from rheology that blood cells arrange differently in different currents (so-called "money roll” phenomenon). This changes their fluidic behavior. In addition, blood cells can change their rheological behavior to certain diseases or pathological changes getting closed. Furthermore, the rate of separation of serum and plasma components in classical blood sedimentation can be used to assess pathological changes in the blood.
  • FIG. 10 shows embodiments of a manipulation device 100 according to the invention with a magnetic separation in a pipette tip 10.
  • a conical pipette tip 10 is provided with a magnetic field device 20, which comprises a coil wrapping 21.3 on the outer surface of the pipette tip 10.
  • a magnetic field device 20 which comprises a coil wrapping 21.3 on the outer surface of the pipette tip 10.
  • the coil winding 21.3 is subjected to an electrical current, an inhomogeneous magnetic field is generated in the pipette tip 10.
  • the pipette tip 10 according to FIG. 10B is inserted into a corresponding coil insert 22, which has the particular advantage that no electrode has to be integrated into the pipette tip 10.
  • Conventional pipette materials such as glass ceramic or plastic are advantageously well penetrated by the magnetic field.
  • the separation of particles is analogous to the methods described above.
  • the embodiments may also be modified such that the magnetic separation is limited only to an upper region of the pipette tip 10. This will separate unmagnetized Zones first.
  • a switchable and adjustable in the magnetic field strength design allows even a continuous separation of the objects.
  • the electrical isolation may be provided as described above.

Abstract

Ein Verfahren zur Manipulation von Partikeln (1, 2), die in einer Trägerflüssigkeit (3) suspendiert sind, umfasst die Schritte Aufnahme der Trägerflüssigkeit (3) mit den Partikeln (1, 2) in eine Flüssigkeitshebereinrichtung (10) mit mindestens einer Heberöffnung (11) , Erzeugung von elektrischen und/oder magnetischen Trennfeldern in der Flüssigkeitshebereinrichtung (10) , Sedimentationsbewegung der Partikel (1, 2) in der Flüssigkeit, wobei jedes Partikels eine Sedimentationsgeschwindigkeit aufweist, die von der Wirkung der Trennfelder auf dieses Partikel (1, 2) abhängt, und die Partikel (1, 2) in Abhängigkeit von ihren Sedimentationsgeschwindigkeiten mehrere Partikelfraktionen (5, 6) bilden, und getrennte Ausgabe der Partikelfraktionen (5, 6) aus der Flüssigkeitshebereinrichtung (10) . Es wird auch eine Manipulationsvorrichtung (100) zur Manipulation von suspendierten Partikeln (1, 2) beschrieben.

Description

Verfahren und Vorrichtung zur Manipulation von sedimentierenden Partikeln
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Manipulation von suspendierten Partikeln unter der Wirkung von elektrischen und/oder magnetischen Trennfeldern, insbesondere ein Verfahren zur Manipulation von biologischen Partikeln unter der Wirkung von dielektrophoretischen und/oder magnetischen
Trennkräften. Die Erfindung betrifft des Weiteren eine Vorrichtung zur Manipulation von suspendierten Partikeln mit elektrischen und/oder magnetischen Trennfeldern. Die Vorrichtung stellt insbesondere eine Manipulationsvorrichtung für biologische Partikel dar, die durch dielektrophoretische und/oder magnetische Trennkräfte in Abhängigkeit von vorbestimmten Partikeleigenschaften in verschiedenen Partikelfraktionen getrennt werden.
Es ist bekannt, suspendierte Partikel unter der Wirkung nega- tiv-dielektrophoretisch wirkender Feldkräfte zu manipulieren. Beispielsweise wird von T. Müller et al . in "Biosensors and Bioelectronics, Band 14, 1999, S. 247-256 beschrieben, einzelne biologische Zellen unter der Wirkung negativer Die- lektrophorese in Feldkäfigen zu halten und zu untersuchen oder mit Feldbarrieren zu sortieren. Die Feldkäfige oder Feldbarrieren werden mit hochfrequenten elektrischen Feldern gebildet, die mit Elektroden in Kompartimenten des Mikrosys- tejns erzeugt werden. Die Bewegung der Zellen zu einem Feldkä- fig oder zu einer Feldbarriere erfolgt durch hydrodynamische Kräfte. Die Zellen werden mit einer Strömung der Trägerflüssigkeit, in der die Zellen suspendiert sind, durch die Kom- partimente bewegt. Zur Erzeugung der hydrodynamischen Kräfte ist das herkömmliche Mikrosystem an eine Fluidikeinrichtung angeschlossen, mit der eine kontinuierliche Strömung der Trägerflüssigkeit aufrechterhalten wird. Die Ankopplung des Mik- rosystems an die Fluidikeinrichtung, die z. B. eine Spritzenpumpe umfasst, kann die Beweglichkeit des Mikrosystems ein- schränken. Durch den Anschluss von Flüssigkeitsleitungen wird die Bewegungsfreiheit des Mikrosystems eingeschränkt, was insbesondere für Laboranwendungen in der Zellbiologie von Nachteil sein kann. Ein weiterer Nachteil der herkömmlichen Partikelbewegung mittels hydrodynamischer Kräfte besteht dar- in, dass geringe Geschwindigkeiten (kleiner als 50 μm/s) mit herkömmlichen Fluidikeinrichtungen nur ungenau und mit geringer Reproduzierbarkeit einstellbar sind. Aus EP 1 089 823 ist bekannt, Partikel mittels einer Sedimentationsbewegung im fluidischen Mikrosystem zu transportieren. Sedimentations- kräfte, die durch Gravitation oder Zentrifugation erzeugt werden, ermöglichen eine genaue und reproduzierbare Einstellung von geringen Partikelgeschwindigkeiten. Allerdings muss auch in diesem Fall das Mikrosystem zur Aufnahme einer Partikelsuspension mit einer Fluidikeinrichtung verbunden werden, so dass sich wiederum das Problem der eingeschränkten Bewegungsfreiheit und aufwändigen Handhabung des Mikrosystems ergibt.
Bei den herkömmlichen Techniken wird das Mikrosystem durch einen Fluidikchip gebildet. Ein Nachteil bei der Verwendung des Fluidikchips kann in dessen beschränkter Kompatibilität mit der übrigen Technik bestehen, die in einem Labor z. B. für chemische, biologische und insbesondere zellbiologische Untersuchungen verwendet wird. Die Fluidikchips erfordern ei- ne komplexe fluidische Peripherie, was ggf. einen unakzeptabel hohen Aufwand darstellt, wenn nur wenige Zellen manipuliert und insbesondere sortiert werden sollen. Während sich die Bereitstellung der fluidischen Peripherie für Hochdurchsatzanwendungen lohnt, sind Laborgeräte zum flexiblen Einsatz auch bei kleinen Probenmengen und unter variierenden Anwendungsbedingungen bisher nicht verfügbar.
Die Aufgabe der Erfindung ist es, ein verbessertes Verfahren zur Manipulation von suspendierten Partikeln bereitzustellen, mit dem die Nachteile der herkömmlichen Technik überwunden werden und das einen erweiterten Anwendungsbereich aufweist. Das erfindungsgemäße Verfahren soll insbesondere eine verbesserte Kompatibilität mit verfügbaren Laborgeräten aufweisen und einen flexiblen Einsatz unter verschiedenen Anwendungsbedingungen selbst bei geringen Probenmengen ermöglichen. Die Aufgabe der Erfindung besteht ferner darin, eine verbesserte Manipulationsvorrichtung zur Manipulation von suspendierten Partikeln bereitzustellen, mit der die Nachteile der herkömm- liehen fluidischen Mikrosysteme vermieden werden und die insbesondere einen erweiterten Anwendungsbereich und eine im Vergleich zu herkömmlichen Fluidikchips vergrößerte Bewegungsfreiheit und vereinfachte Handhabbarkeit aufweist.
Diese Aufgaben werden durch ein Verfahren oder eine Manipulationsvorrichtung mit den Merkmalen der unabhängigen Ansprüche gelöst. Vorteilhafte Ausführungsformen und Anwendungen der Erfindung ergeben sich aus den abhängigen Ansprüchen.
Verfahrensbezogen basiert die Erfindung auf der allgemeinen technischen Lehre, eine Sedimentationsbewegung suspendierter Partikel in einer Flüssigkeitshebereinrichtung durch elektrische und/oder magnetische Trennfelder derart zu beeinflussen, dass die Partikel in Abhängigkeit von der spezifischen Wech- selwirkung mit den Trennfeldern eine charakteristische Sedimentationsgeschwindigkeit (insbesondere Sedimentationsge- schwindigkeitsbetrag und/oder Sedimentationsrichtung) erhalten. In Abhängigkeit von den Sedimentationsgeschwindigkeiten der Partikel werden mehrere Partikelfraktionen gebildet, die vorzugsweise getrennt aus der Flüssigkeitshebereinrichtung ausgegeben werden. Im Unterschied zur herkömmlichen Mikrosys- temtechnik erfolgt die Manipulation der suspendierten Partikel nicht in einem Fluidikchip, sondern in einer Flüssig- keitshebereinrichtung, die vorzugsweise mindestens eine Heberöffnung aufweist.
Mit dem Begriff "Flüssigkeitshebereinrichtung" (oder: "Heber") wird hier allgemein eine Vorrichtung zur Aufnahme und/oder Abgabe von Flüssigkeiten aus oder in offene Flüssigkeitsreservoire bezeichnet. Die Flüssigkeitshebereinrichtung ermöglicht die Aufnahme, die zeitweilige Speicherung und die spätere Abgabe einer Trägerflüssigkeit mit suspendierten Partikeln und kann damit die Transportfunktion der bei den her- kömmlichen Techniken verwendeten Fluidikeinrichtungen erfüllen. Ein wesentlicher Vorteil der Erfindung besteht darin, dass durch die Erzeugung der elektrischen und/oder magnetischen Trennfelder in der Flüssigkeitshebereinrichtung zusätzlich eine Manipulation, insbesondere Sortierung der Partikel ermöglicht wird. Die herkömmliche Manipulation von suspendierten Partikeln im Fluidikchip in Kombination mit der Flui- dikeinrichtung kann erfindungsgemäß durch die Manipulation der suspendierten Partikel in der Flüssigkeitshebereinrichtung ersetzt werden.
Vorteilhafterweise kann die Flüssigkeitshebereinrichtung ohne zusätzliche Fluidikeinrichtungen zum Flüssigkeitstransport eigenständig und flexibel verwendet werden. Die Flüssigkeitshebereinrichtung kann insbesondere manuell oder mit einem me- chanischen Stellantrieb nach Aufnahme der suspendierten Partikel frei bewegt oder in eine Ruheposition gebracht werden, während die Manipulation der Partikel erfolgt. Ein weiterer wichtiger Vorteil der Erfindung besteht darin, dass durch die z. B. dielektrophoretische Trennung kleinste Zellmengen, z. B. zwei Zellen voneinander getrennt werden können.
Zur Manipulation der Partikel wird eine Wechselwirkung der Partikel mit den elektrischen und/oder magnetischen Trennfeldern ausgenutzt. Die Beeinflussung der Sedimentationsgeschwindigkeit der Partikel in Abhängigkeit von ihrer Wechselwirkung mit den Trennfeldern kann sich bei verschiedenen Ausführungsformen der Erfindung in einer Änderung des Betrages und/oder der Richtung der Sedimentationsgeschwindigkeit auswirken.
Zur Änderung des Betrages der Sedimentationsgeschwindigkeit werden Trennkräfte erzeugt, welche in Abhängigkeit von den - Partikeleigenschaften bei einigen Partikeln in einer erhöhten Sedimentationsgeschwindigkeit und bei anderen Partikeln in einer verminderten Sedimentationsgeschwindigkeit resultieren, so dass sich die Partikel in den getrennten Partikelfraktionen sammeln können. Die Sedimentationsgeschwindigkeit kann ggf- bis auf Null vermindert werden.
Im Ergebnis einer Änderung der Richtung der Sedimentationsgeschwindigkeit sammeln sich Partikel mit verschiedenen Eigenschaften auf verschiedenen Sedimentationspfaden in der Flüs- sigkeitshebereinrichtung, so dass eine getrennte Ausgabe der Partikelfraktionen ermöglicht wird.
Ein besonderer Vorteil der Erfindung besteht in der Vielfalt von Wechselwirkungen zwischen den Partikeln und den Trennfel- dern, auf deren Grundlage die Trennkräfte erzeugt werden können. Es können beispielsweise dielektrophoretische, elektro- phoretische, magnetische und/oder elektromagnetische Trennkräfte erzeugt werden, die entsprechend verschiedene Wirkungen auf Partikel mit verschiedenen Eigenschaften aufweisen, die dielektrische Eigenschaften, magnetische Eigenschaften, Polarisationseigenschaften und/oder Leitfähigkeitseigenschaften der Partikel umfassen. Es wird beispielsweise ausgenutzt, dass durch die geeignete Wahl der Frequenz des elektrischen Trennfeldes unterschiedliche dielektrophoretische Kräfte auf biologische Zellen ausgeübt werden können, die sich in Bezug auf wenigstens eine der Eigenschaften Zusammensetzung, Größe und Form voneinander unterscheiden. Wenn Partikel mit verschiedenen Eigenschaften entsprechend verschieden starke ne- gative Dielektrophorese-Trennkräfte erfahren, können sie in der Flüssigkeitshebereinrichtung mit verschiedenen Geschwindigkeiten sedimentieren. Alternativ können unerwünschte Partikel mittels positiver Dielektrophorese oder mittels Elektrophorese an Elektroden zur Erzeugung der elektrischen Trennfelder fixiert werden und somit eine eigene Partikelfraktion bilden.
Wenn auf die suspendierten Partikel dielektrophoretische Trennkräfte ausgeübt werden, ergeben sich besondere Vorteile für die Genauigkeit und Selektivität der Trennung. Gemäß einer ersten Variante erfolgt die Trennung, indem die Trennfelder so eingestellt werden, dass auf verschiedene Partikel verschieden starke negativ-dielektrophoretische Trennkräfte wirken. Unterschiede der negativ-dielektrophoretischen Trenn- kräfte können beispielsweise bewirken, dass verschiedene Partikel verschieden schnell sedimentieren oder dass verschiedene Partikel in Abhängigkeit von der Zusammenwirkung der Trennkräfte mit den Sedimentationskräften auf verschiedene Sedimentationspfade bewegt werden. Die Ausübung verschieden starker negativ-dielektrophoretischer Trennkräfte hat den
Vorteil, dass auf alle in der Suspension enthaltenen Partikel eine Feldwirkung ausgeübt wird und die Partikel berührungslos in der Flüssigkeitshebereinrichtung manipuliert werden. Gemäß einer zweiten Variante ist vorgesehen, dass für einen Teil der Partikel positiv-dielektrophoretische Trennkräfte ausgeübt werden. In diesem Fall erfolgt eine Anziehung der betroffenen Partikel hin zu einer Elektrode zur Erzeugung der Trennfelder. Diese Variante hat den Vorteil, dass durch die zumindest zeitweilige Fixierung der Partikel an der Elektrode die Trennschärfe der Partikelmanipulation verbessert wird. Schließlich ist gemäß einer dritten Variante möglich, dass für einen Teil der Partikel die Trennfelder keinen Einfluss haben, so dass diese unbeeinflussten Partikel ausschließlich die Sedimentationsbewegung ausführen. In diesem Fall ergeben sich Vorteile in Bezug auf die vereinfachte Einstellung der Trennfelder.
Insbesondere bei der Ausübung positiv-dielektrophoretischer Trennkräfte, bei der ein Teil der Partikel in der Flüssigkeitshebereinrichtung zurückgehalten wird, kann auf die Aufnahme der Pufferflüssigkeit verzichtet werden. Die Erzeugung der Trennfelder kann in diesem Fall im Heberkanal unmittelbar nach der Heberöffnung erfolgen.
Die Flüssigkeitshebereinrichtung weist allgemein ein Reservoir zur Aufnahme der Trägerflüssigkeit mit den suspendierten Partikeln auf, das mindestens einen Heberkanal mit einer vorbestimmten Längsausdehnung umfasst. In Betriebsposition ist die Flüssigkeitshebereinrichtung so ausgerichtet, dass die Richtung der Längsausdehnung von der Horizontalen abweicht und vorzugsweise vertikal verläuft. Jeder Hebekanal weist an seinem freien Ende eine Heberöffnung auf, durch welche die Trägerflüssigkeit von einem Reservoir mit einer freien Flüs- sigkeitsoberflache in die Flüssigkeitshebereinrichtung aufgenommen werden kann. In Betriebsposition ist die Heberöffnung an einem unteren Ende der Flüssigkeitshebereinrichtung angeordnet. Das Reservoir umfasst ein Gefäß, wie z. B. ein Korn- partiment einer Mikrotiterplatte, oder eine freie Substratoberfläche, wie z. B. ein Trägerglas für die Mikroskopie.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren kann eine Partikeltren- nung insbesondere auf der Grundlage der folgenden Überlegungen erfolgen. Für den vereinfachten Fall der Partikeltrennung ohne eine Änderung der Sedimentationsrichtung bestimmt sich die Sedimentationsgeschwindigkeit bekannterweise aus folgendem Kräftegleichgewicht:
Fhyd=Fg+Fz (1)
wobei sich die Gravitationskraft und hydrodynamische Kraft für ein sphärisches Partikel mit dem Radius r zu
Fg = 4 / 3 Ttr 3 g(ppartide - Pmedium ) = * / ϊπr3 gδp und Fhyd = 6πηrv ( 2 )
ergibt. Hierbei stellen g, p, δp, η und v die Erdbeschleunigung, Dichte, Dichtedifferenz, Viskosität des Mediums und die Partikelgeschwindigkeit dar. Um die Sedimentationsgeschwindigkeit zu verändern, kann entweder eine zusätzliche Kraft auf die einzelnen Partikel in Sedimentationsrichtung ausgeübt werden und oder der hydrodynamische Widerstand verändert werden. Der Strömungswiderstand kann durch eine Umorientierung und/oder eine Deformation und/oder eine Aggregation der Partikel (größere Objekte gleicher Dichte und Symmetrie sedimen- tieren schneller) verändert werden. Dies lässt sich bspw. in homogenen elektrischen oder magnetischen externen Feldern realisieren. Bei F2 kann es sich um homogene Felder (bspw. Elektrophorese) oder Gradientenfelder (bspw. Dielektrophorese oder Magnetophorese) , die wie die Sedimentationskraft mit r3 skalieren, handeln. Es kann auch vorgesehen sein, dass die Partikel in Rotation versetzt werden (z.B. Elektrorotation in rotierenden elektrischen Felder) um so ihre Bewegungsbahn zu verändern (Magnuseffekt) .
Wenn gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung die suspendierten Partikel mit einer Trägerflüssigkeit durch die mindestens eine Heberöffnung in die Flüssigkeitshebereinrichtung aufgenommen werden, ergeben sich besondere Vorteile für die erfindungsgemäße Mehrfachfunktion der Flüssigkeitshebereinrichtung zum Transport der Trägerflüssigkeit und zur Manipulation der suspendierten Partikel.
Besonders bevorzugt ist eine Ausführungsform der Erfindung, bei der die Flüssigkeitshebereinrichtung nur eine Heberöffnung aufweist, die als fluidischer Ein- und Ausgang verwendet wird.
Die Aufnahme der Trägerflüssigkeit mit den suspendierten Partikeln kann durch die Ausübung eines Unterdrucks in der Flüssigkeitshebereinrichtung erreicht werden. Im Unterschied zu herkömmlichen Fluidikeinrichtungen ist es vorteilhafterweise ausreichend, wenn ein relativ geringer Unterdruck für eine vorbestimmte Ansaugzeit ausgeübt und dann aufrechterhalten wird. Hierzu kann beispielsweise wie bei herkömmlichen Flüssigkeitshebereinrichtungen ein Gummiballon oder ein Druckkol- ben verwendet werden.
Wenn gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Manipulationsverfahrens zunächst die Trägerflüssigkeit mit den suspendierten Partikeln und anschließend eine Pufferflüssigkeit ohne Partikel in die Flüssigkeitshebereinrichtung aufgenommen wird, können sich Vorteile für eine zuverlässige Verschiebung der Trägerflüssigkeit mit den suspendierten Partikeln zu einer vorbestimmten Startposition relativ zu einem Manipulationsbereich ergeben, in dem die Trennfelder ausgeübt werden. Die Aufnahme der Pufferflüssigkeit hat den weiteren Vorteil, dass die Trägerflüssigkeit mit den suspendierten Partikeln in der Flüssigkeitshebereinrichtung von der Heberöffnung getrennt wird. Damit können uner- wünschte Umwelteinflüsse auf die Partikel, insbesondere auf biologische Zellen oder andere biologische Partikel während der Sedimentation ausgeschlossen werden. Die Pufferflüssigkeit kann mit der Trägerflüssigkeit identisch sein, ohne jedoch Partikel zu enthalten. Alternativ kann als Pufferflüs- sigkeit eine andere Flüssigkeit verwendet werden. Bei biologischen Anwendungen der Erfindung umfasst die Pufferflüssigkeit z. B. eine isotonische wässrige Lösung.
Durch die Ausbildung einer von der jeweiligen Trennkraft ab- hängigen Sedimentationsgeschwindigkeit sammeln sich die Partikel, falls nur ein Partikeltyp in der Probe enthalten ist, in einer Partikelfraktion, und vorzugsweise für die Partikelsortierung in mindestens zwei Partikelfraktionen. Vorteilhafterweise weist das erfindungsgemäße Verfahren eine große Flexibilität bei der getrennten Ausgabe der Partikelfraktionen aus der Flüssigkeitshebereinrichtung auf. Gemäß einer ersten Alternative können die Partikelfraktionen zeitlich getrennt ausgegeben werden. Nach der Sedimentation mit der Sammlung in den Partikelfraktionen können die Partikel mit der höchsten Sedimentationsgeschwindigkeit zuerst und anschließend die Partikel mit geringeren Sedimentationsgeschwindigkeiten aus der Flüssigkeitshebereinrichtung austreten. Vorteilhafterweise kann dabei zwischen den Phasen der Ausgabe einer bestimmten Partikelfraktion die Flüssigkeitshe- bereinrichtung zwischen verschiedenen Zielreservoiren bewegt werden, so dass die verschiedenen Partikel in verschiedenen Kompartimenten oder auf verschiedenen Substraten zur weiteren Bearbeitung, Untersuchung oder dergleichen abgelegt werden können. Gemäß einer zweiten Alternative können die Partikel- fraktionen räumlich getrennt aus der Flüssigkeitshebereinrichtung ausgegeben werden. Hierzu erfolgt während der Sedimentationsbewegung unter der Wirkung der Trennfelder eine Ablenkung von verschiedenen Partikeln in verschiedene Heberka- näle. Diese Ausführungsform der Erfindung ist von Vorteil, da die Partikelfraktionen parallel in oder auf verschiedenen Zielreservoiren abgelegt werden können. Die beiden Varianten der zeitlich und räumlich getrennten Ausgabe der Partikelfraktionen können kombiniert werden.
Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung erfolgt die Ausgabe der Partikelfraktionen durch die mindestens eine Heberöffnung der Flüssigkeitshebereinrichtung. Die Heberöffnung wird vorteilhafterweise sowohl zur Aufnahme als auch zur Ausgabe der Trägerflüssigkeit verwendet, wobei zur Ausgabe der zunächst vorhandene Unterdruck durch einen konstanten Überdruck ersetzt werden kann, um die Ausgabe der Trägerflüssigkeit mit den getrennten Partikelfraktionen zu beschleunigen. Der Überdruck kann z. B. durch eine integrierte Spritzenpumpe oder durch die Ausübung einer mechanischen Vorspannung, z. B. durch eine Feder am Druckkolben, ausgeübt werden. Es ist jedoch nicht zwingend erforderlich, dass die Heberöffnung als Ein- und Auslass dient. Alternativ kann die Befüllung der Flüssigkeitshebereinrichtung durch eine weitere Öffnung erfolgen, die zum Beispiel relativ zur Heberöffnung am entgegengesetzten Ende der Flüssigkeitshebereinrichtung angeordnet ist.
Zur erfindungsgemäßen Manipulation von suspendierten Parti- kein wird zunächst ein vorbestimmtes Volumen der Trägerflüssigkeit (z. B. Suspension einer Zellprobe) mit der Flüssigkeitshebereinrichtung aufgenommen. Anschließend kann die weitere, partikelfreie Pufferflüssigkeit (Separationsmedium) aufgenommen werden. Gleichzeitig zur Aufnahme der Pufferflüs- sigkeit wird die Trägerflüssigkeit mit den suspendierten Partikeln in die Startposition der Sedimentation im Manipulationsbereich oder stromaufwärts vom Manipulationsbereich transportiert, in dem die elektrischen und/oder magnetischen Trennfelder erzeugt werden. Anschließend wird die Flüssigkeitshebereinrichtung in eine Halteeinrichtung eingesetzt. Während der nachfolgenden Sedimentationsbewegung werden die Trennfelder erzeugt, so dass die Partikel selektiv in ihrer Sedimentationsgeschwindigkeit (Betrag und/oder Richtung) be- einflusst werden.
Wenn gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung die magnetischen Trennfelder mindestens einen Magnetfeldgradienten in der Flüssigkeitshebereinrichtung bilden, ergeben sich Vorteile für die zuverlässige Trennung von Partikeln, die im Magnetfeld eine Kraftwirkung erfahren (magnetische Partikel) und anderen Partikeln, auf die das Magnetfeld keine Wirkung hat (nicht-magnetische Partikel) . Im Magnetfeldgradienten können vorteilhafterweise Partikel, die aus Magnetbeads be- stehen oder mit Magnetbeads verbunden sind, von nichtmagnetisch markierten Partikeln getrennt werden.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung kann es von Vorteil sein, elektrische und magnetische Trennfelder in der Flüssigkeitshebereinrichtung zu kombinieren. Die gleichzeitige Erzeugung elektrischer und magnetischer Trennfelder erlaubt die gleichzeitige Trennung der Partikel in Abhängigkeit von verschiedenen Partikeleigenschaften (z.B. dielektrische und magnetische Eigenschaften) . Alternativ können die elektrischen und magnetischen Trennfelder während der Sedimentationsbewegung mit einem zeitlichen Abstand bzw. in verschiedenen Teil-Manipulationsbereichen in der Flüssigkeitshebereinrichtung erzeugt werden. Beispielsweise kann nach Beginn der Sedimentation zunächst die Erzeugung magnetischer Trennfelder und anschließend die Erzeugung von dielektropho- retisch wirkenden Trennfeldern vorgesehen sein, um zunächst magnetisch markierte Partikel von nicht-magnetisch markierten Partikeln zu trennen und anschließend eine Trennung in Abhän- gigkeit von den dielektrischen Eigenschaften durchzuführen. Alternativ können zunächst die elektrischen Trennfelder und anschließend die magnetischen Trennfelder erzeugt werden.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung kann vor- gesehen sein, dass die Trennfelder mindestens ein Trennfeld und/oder einen Trennfeldgradienten bilden, in dem die Partikel in Abhängigkeit von einer vorbestimmten Partikeleigenschaft (z. B. Polarisierbarkeit , magnetischer Dipol) eine Orientierungsbewegung ausführen. Vorteilhafterweise kann durch die Orientierungsbewegung die Sedimentationsgeschwindigkeit und damit die Trennung der Partikel in die Partikelfraktion beeinflusst werden. Besonders bevorzugt ist die Einstellung einer Orientierung der Partikel in Abhängigkeit von der Partikelform, der Partikelgeometrie, dem Partikelaufbau und/oder der Partikelzusammensetzung.
Ein weiterer wichtiger Vorteil der Erfindung besteht in der Vielfalt verfügbarer Sedimentationskräfte, mit denen die Sedimentationsbewegung induziert werden kann. Die Sedimentati- onskräfte bewirken eine konstante Kraftwirkung, die in gleicher Weise auf alle Partikel ausgeübt wird. Gemäß bevorzugten Varianten umfassen die Sedimentationskräfte die Gravitationskraft und/oder Zentrifugationskraft, da für diese herkömmliche Sedimentationstechniken im ruhenden Gefäß oder in einer Zentrifuge verfügbar sind. Des Weiteren können eine magnetische Sedimentationskraft, eine dielektrophoretische Sedimentationskraft, eine elektrophoretische Sedimentationskraft, eine elektromagnetische Sedimentationskraft oder eine Kombi- nation aus diesen Kräften zur Unterstützung der Sedimentati- onsbewegung verwendet werden.
Wenn gemäß einer weiteren Modifizierung der Erfindung die Trägerflüssigkeit mit den suspendierten Partikel in der Flüssigkeitshebeeinrichtung mit Ultraschall beaufschlagt wird, können vorteilhafterweise unerwünschte Partikelaggregationen aufgelöst werden. Diese Ausführungsform ermöglicht, eine Verstopfung eines Heberkanals zu vermeiden. Außerdem kann durch Ultraschall auch die Bewegungsbahn der Partikel verändert werden.
Gemäß einer weiteren Variante der Erfindung ist nach der Aufnahme der Trägerflüssigkeit eine Überführung der Flüssig- keitshebereinrichtung in eine Halteeinrichtung vorgesehen. Wenn die Sedimentation im wesentlichen durch die Gravitationskraft induziert wird, wird die Flüssigkeitshebereinrichtung in der Halteeinrichtung so positioniert, dass die Längsausdehnung des mindestens einen Hebekanals vertikal verläuft. Die Positionierung der Flüssigkeitshebereinrichtung kann ein Einsetzen oder ein Einhängen in ein angepasstes Gestell umfassen. Vorteilhafterweise kann die Bedienung der Flüssigkeitshebereinrichtung vereinfacht werden, wenn gleichzeitig mit der Positionierung der Flüssigkeitshebereinrichtung in der Halteeinrichtung die Trenneinrichtung mit einer Stromversorgungseinrichtung elektrisch verbunden wird.
Die Halteeinrichtung kann zur Ausübung weiterer Sedimentationskräfte ausgelegt sein, und zum Beispiel eine Zentrifuge und/oder einen schaltbaren Sedimentationsmagneten umfassen.
Ein weiterer wichtiger Vorteil der Erfindung besteht darin, dass die Partikel, abgesehen von der positiv-dielektropho- retischen Fixierung, in der Flüssigkeitshebereinrichtung be- rührungslos manipuliert werden. Bevorzugte Anwendungen der Erfindung sind daher in der Biologie und Biochemie gegeben. Die suspendierten Partikel umfassen vorzugsweise biologische Zellen, Zellbestandteile, Zellgruppen, Zellorganellen, Viren, biologische Makromoleküle oder Kombinationen aus diesen. Die Umsetzung der Erfindung ist jedoch nicht auf die biologischen Anwendungen beschränkt, sondern auch mit nicht-biologischen Partikeln möglich, die beispielsweise aus Kunststoff, Glas, Mineralen oder Keramiken hergestellt sind. Des Weiteren kön- nen die suspendierten Partikel in einer Probe Partikel biologischen Ursprungs und nicht-biologische Partikel umfassen, die beispielsweise mit der erfindungsgemäßen Manipulation voneinander getrennt werden. Die Partikel weisen vorzugsweise eine charakteristische Dimension im Bereich von 500 μm bis 50 nm auf. Die Trägerflüssigkeit kann in Abhängigkeit von der Anwendung der Erfindung gewählt werden und eine einphasige oder eine mehrphasige Flüssigkeit umfassen.
Eine weitere bevorzugte Anwendung der Erfindung ist die Tren- nung von Partikeln für die Aufreinigung von Zellsuspensionen, z.B. für die Patch-Clamp-Technik. Beispielsweise können mit dem erfindungsgemäßen Verfahren lebende biologische Zellen von toten oder geschädigten Zellen oder von Zellbruchstücken getrennt werden. Damit wird eine Blockade der Ansaugstellen einer Patch-Einrichtung durch unerwünschte Probenbestandteile vermieden oder es werden Zielzellen bzw. Aggregate von größeren bzw. kleineren Objekten abgetrennt. Dies funktioniert mit der erfindungsgemäßen Technik besser als in horizontalen Durchflusssystemen in denen die größeren Objekte leicht in strömungsberuhigte Zonen sedimentieren und es dort zu Verstopfungen kommen kann.
Gemäß einer weiteren Variante der Erfindung ist eine elektrische Feldbehandlung der suspendierten Partikel in der Flüs- sigkeitshebereinrichtung vorgesehen, die alternativ oder parallel zu der Trennung in verschiedene Partikelfraktionen auch eine Veränderung der Partikel umfasst. Vorteilhafterweise können in der Flüssigkeitshebereinrichtung eine Zellpora- tion oder eine Zellfusion durchgeführt werden. Die Erfindung ermöglicht, mit einfachen, mit der Labortechnik kompatiblen Mitteln eine Elektrotransfektion (z.B. von siRNA) durchzufüh¬ ren.
Gemäß einem weiteren, unabhängigen Gesichtspunkt der Erfindung ist in der Flüssigkeitshebereinrichtung ausschließlich die elektrische Feldbehandlung der suspendierten Partikel ohne eine Sedimentation und ohne eine Trennung vorgesehen. In diesem Fall ist die hier beschriebene Flüssigkeitsheberein- richtung mit einer Porations- und/oder Fusions-Elektroden- anordnung ausgestattet, wie sie zum Beispiel aus der Mikro- systemtechnik bekannt ist und so aufgebaut sein kann, wie es hier unter Bezug auf die Trenneinrichtung beschrieben ist.
Bei einer für die Parallelbehandlung größerer Suspensionsproben bevorzugten Ausführungsform der Erfindung umfasst die Aufnahme der Trägerflüssigkeit in die Flüssigkeitshebereinrichtung ein gleichzeitiges Ansaugen in mehrere Heberkanäle. Diese Variante ermöglicht die parallele Aufnahme von Proben z. B. aus den Kompartimenten einer Mikrotiterplatte .
Besonders bevorzugt wird als Flüssigkeitshebereinrichtung eine Pipettiereinrichtung oder ein Teil von dieser verwendet. Die Behandlung der suspendierten Partikel mit elektrischen und/oder magnetischen Feldern kann beispielsweise in mindestens einer Pipettenspitze oder mindestens einem Pipettenreservoir einer Einfach- oder Mehrfachpipette vorgesehen sein. Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung kann vorgesehen sein, dass die Trennung und/oder Effizienz der Trennung durch optische und/oder elektrische Messverfahren überwacht wird. Zur optischen Überwachung ist die Flüssigkeitshe- bereinrichtung z. B. mit einer Kameraeinrichtung ausgestattet. Die elektrische Überwachung kann auf einer Impedanzmessung in der Flüssigkeitshebereinrichtung basieren.
Vorrichtungsbezogen wird die obengenannte Aufgabe gelöst, in- dem eine Flüssigkeitshebereinrichtung zur Aufnahme einer Suspensionsprobe mit einer Trenneinrichtung (z. B. Elektrodeneinrichtung oder Magnetfeldeinrichtung) zur Erzeugung von elektrischen und/oder magnetischen Trennfeldern in der Flüssigkeitshebereinrichtung ausgestattet wird. Vorteilhafterwei- se wird damit eine multifunktionale Manipulationsvorrichtung bereitgestellt, die mit der in der Praxis verwendeten Labortechnik kompatibel ist.
Die Flüssigkeitshebereinrichtung weist einen oder mehrere He- berkanäle auf. Die Heberkanäle verlaufen vorzugsweise gerade mit einer vorbestimmten Längsausdehnung. Typischerweise sind die mehreren Heberkanäle parallel zueinander in einer Ebene (eindimensionaler Heber) oder als Matrix (zweidimensionaler Heber) angeordnet.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die Trenneinrichtung in mindestens einem der Heberkanäle angeordnet. Diese Variante ist wegen der unmittelbaren Feldwirkung der Trenneinrichtung bevorzugt. Die Einkopplung der elektri- sehen und/oder magnetischen Trennfelder in die Trägerflüssigkeit wird vereinfacht. Alternativ kann die Trenneinrichtung auf einer Außenseite der Flüssigkeitshebereinrichtung in der Umgebung von mindestens einem der Heberkanäle angeordnet sein. In diesem Fall werden vorteilhafterweise mögliche uner- wünschte Effekte einer Substanz (z. B. der Trägerflüssigkeit) in der Flüssigkeitshebereinrichtung auf die Trenneinrichtung vermieden. Des Weiteren vereinfacht sich der Aufbau und die Herstellung der Flüssigkeitshebereinrichtung. Die Trennein- richtung kann z. B. auf der Außenseite der Flüssigkeitshebereinrichtung lösbar befestigt sein. Vorteilhafterweise wird damit ermöglicht, herkömmliche Flüssigkeitshebereinrichtungen, wie z. B. Pipetten oder Pipettenspitzen mit einer Trenneinrichtung zur Schaffung der erfindungsgemäßen Manipulati- onseinrichtung auszurüsten.
Zur Erzeugung elektrischer Trennfelder umfasst die Trenneinrichtung vorzugsweise eine Elektrodeneinrichtung mit mindestens zwei streifenförmigen oder ringförmigen Elektroden. Vor- teilhafterweise kann die Elektrodeneinrichtung so gestaltet werden, wie es aus der herkömmlichen Technik fluidischer Mik- rosysteme bekannt ist. Zur Erzeugung magnetischer Trennfelder umfasst die Trenneinrichtung vorzugsweise eine Magnetfeldeinrichtung. Wenn die Magnetfeldeinrichtung mindestens eine Spu- Ie aufweist, kann die magnetische Trennwirkung vorteilhafterweise in Abhängigkeit von der konkreten Anwendung der Erfindung eingestellt werden. Wenn die Magnetfeldeinrichtung mindestens einen Permanentmagneten aufweist, ergeben sich Vorteile durch einen vereinfachten Aufbau der Manipulationsvor- richtung.
Vorteile in Bezug auf eine besonders effektive Feldwirkung können sich ergeben, wenn die Elektroden der Trenneinrichtung möglichst geringe Elektrodenabstände aufweisen. Entsprechend ist gemäß einer vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung vorgesehen, den mindestens einen Heberkanal der Flüssigkeitshebereinrichtung mit mindestens einem Subkanal auszustatten, dessen charakteristische Querschnittsdimension geringer als die Querschnittsdimension des Heberkanals ist und in dem die Elektroden der Trenneinrichtung angeordnet sind.
Erfindungsgemäß besteht eine hohe Vielfalt verfügbarer Mate- rialien, aus denen die Flüssigkeitshebereinrichtung oder zumindest die Wand der Heberkanäle hergestellt ist. Es können insbesondere Glas, Kunststoff, Keramik, Silizium, Kunststoff- Nanopartikel-Komposite oder Zusammensetzungen aus diesen Materialien verwendet werden. Für die Wirkung von elektrischen Trennfeldern kann es von Vorteil sein, wenn sich das Material, aus dem die Flüssigkeitshebereinrichtung oder zumindest die Wände der Heberkanäle aufgebaut ist, dielektrisch von der Trägerflüssigkeit, z. B. von einer Salzlösung unterscheidet. In diesem Fall wird ein möglicher Einfluss z. B. eines Wand- materials der Flüssigkeitshebereinrichtung auf die Trennfelder vermindert oder ausgeschlossen.
Gemäß einer besonders bevorzugten Anwendung der Erfindung um- fasst die Flüssigkeitshebereinrichtung eine Pipettiereinrich- tung oder ein Teil von dieser. Die Pipettiereinrichtung (z.
B. Laborhubpipette), die im Wesentlichen wie herkömmliche Laborgeräte aufgebaut sein kann, ist mit der Trenneinrichtung zur Erzeugung der Trennfelder im Pipettenreservoir und/oder in der Pipettenspitze ausgestattet. Besonders vorteilhaft für eine hohe Flexibilität bei der Anwendung der Erfindung ist es, wenn die Manipulationsvorrichtung eine Pipettenspitze uiti- fasst, die mit der Trenneinrichtung verbunden ist. In diesem Fall kann eine herkömmliche Pipettiereinrichtung mit der erfindungsgemäß funktionalisierten Pipettenspitze ausgestattet werden.
Die Verwendung einer Pipettenspitze, die mit einer Trenneinrichtung zur Erzeugung von elektrischen und/oder magnetischen Trennfeldern ausgestattet ist, zur Manipulation suspendierter Partikel stellt entsprechend einen unabhängigen Gegenstand der Erfindung dar.
Weitere Einzelheiten und Vorteile der Erfindung werden aus der Beschreibung der beigefügten Zeichnung ersichtlich. Es zeigen :
Figuren 1 und 2: Ausführungsformen des erfindungsgemäßen
Verfahrens zur Manipulation suspendierter Partikel,
Figur 3 Ausführungsformen von Elektrodeneinrichtungen gemäß verschiedenen Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Manipulationsvorrichtung,
Figur 4 eine weitere Ausführungsform der erfindungsgemäßen Manipulationsvorrichtung mit mehreren Hebekanälen,
Figur 5 : eine weitere Ausführungsform der erfindungsgemäßen Manipulation von suspendierten Partikeln,
Figuren 6 und 7: Illustrationen der in einer erfindungsgemäßen Manipulationsvorrichtung erzeugten Trennfelder,
Figuren 8 und 9: Illustrationen von Sedimentations- und Orientierungsschritten in einer erfindungsgemäßen Manipulationsvorrichtung, und
Figur 10: Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Manipulationsvorrichtung, bei der eine Pipet- tenspitze mit einer Magnetfeldeinrichtung ausgestattet ist.
Die Erfindung wird im Folgenden unter beispielhaftem Bezug auf die Verwendung von Pipettenspitzen zur elektrischen oder magnetischen Manipulation von suspendierten Partikeln beschrieben. Es wird betont, dass die Erfindung entsprechend umsetzbar ist, indem die Trenneinrichtung am Reservoir einer Flüssigkeitspipette oder einem anderen Flüssigkeitsheber (z. B. Saugpipette, Hubpipette, Kapillarrohr, fluidische Hohlleitung) vorgesehen ist.
Figur IA illustriert in schematischer, vergrößerter Schnittansicht die Manipulationsvorrichtung 100, bei der als Flüs- sigkeitshebereinrichtung eine Pipettenspitze 10 vorgesehen ist. Die Heberöffnung und der Heberkanal werden entsprechend durch die Pipettenöffnung 11 und den Pipettenkanal 12 gebildet. Mit einem Abstand vom freien Ende der Pipettenspitze 10 ist als Trenneinrichtung eine Elektrodeneinrichtung 20 mit streifenförmigen Elektroden 21.1, 21.2 angeordnet. Die Pipettenspitze 10 weist Abmessungen wie übliche, kommerziell verfügbare Pipettenspitzen von Herstellern wie z. B. Gilson oder Eppendorf auf. Das Innenvolumen des Pipettenkanals 12 beträgt beispielsweise 5 μl bis 200 μl .
Die Pipettenspitze 10 kann aus bekannten Materialien wie Glas, Kunststoffen, Keramik oder Silizium bestehen, welche sich leicht mit Elektroden versehen lassen. Verwendbar sind auch Kompositmaterialien wie mit leitfähigen Nanopartikeln versehene Kunststoffe, die sich über Spritzgussverfahren kostengünstig formen und bspw. optisch mit Leiterbahnen versehen lassen. Es kann insbesondere vorteilhaft sein, in den Pipettenkanal eine Vielzahl von Subkanälen zu integrieren. Dies lässt sich bspw. kostengünstig über die aus WO 2004/076060 bekannte Technologie realisieren. Der Manipulationsbereich der Pipette kann verschieden geformt (bspw. kreisförmiger oder rechteckiger Querschnitt) und mit konstanten Dimensionen oder konisch ausgeführt sein.
Zusätzlich kann in der Pipettenspitze 10 ein zum Medium dielektrisch (Leitfähigkeit/Dielektrizitätskonstante) verschieden) Material eingebracht werden, z. B. als poröser Pfropf, der Feldinhomogenitäten zur Partikeltrennung erzeugt (siehe Lapizco-Encinas et al. "Dielectrophoretic concentration and Separation of live and dead bacteria in an array of insula- tors" in "Analytical Chemistry" Bd. 76, 2004, S. 1571 - 1579) .
Die Elektroden 21.1, 21.2 umfassen mindestens zwei elektrisch leitfähige Leiterbahnen, die zur Erzeugung elektrischer Trennfelder mit einer Stromversorgungseinrichtung (nicht dargestellt) verbunden werden. Die Elektroden 21.1, 21.2 sind elektrisch voneinander isoliert vorzugsweise auf der Innen- seite der Pipettenspitze 10, oder alternativ in deren Wand oder auf deren äußeren Oberfläche angeordnet. Die Figuren zeigen zur verbesserten Erkennbarkeit die Elektroden auf der Außenseite der Pipettenspitze. Die mit den Elektroden erzeugten elektrischen Felder (Trennfelder) wirken entsprechend ih- rer Ausdehnung in einem bestimmten Raumbereich, der hier als Manipulationsbereich bezeichnet wird. Im Manipulationsbereich weist die Pipettenspitze 10 eine Querschnittsdimension vorzugsweise im Bereich von 100 μm bis 1 mm auf.
Alternativ zu der illustrierten konischen Form der Pipettenspitze 10 können andere Querschnittsformen des Pipettenkanals 12 vorgesehen sein. Der Pipettenkanal 12 kann sich beispielsweise ausgehend von der Pipettenöffnung 11 mit einem engen Abschnitt stufenförmig in einen Abschnitt mit einer größeren Innendimension erweitern, wobei die Elektrodeneinrichtung 20 in diesem Fall am oberen Ende des engen Abschnitts vor der stufenförmigen Erweiterung vorgesehen ist.
Figur IA zeigt des Weiteren in einem Probenreservoir 70 eine Suspensionsprobe mit verschiedenartigen Partikeln 1, 2 in einer Trägerflüssigkeit 3. Das Probenreservoir 70 ist beispielsweise ein Kompartiment einer Mikrotiterplatte . Die verschiedenen Typen der Partikel 1, 2 umfassen z. B. verschiede- ne Zellpopulationen, die sich in ihren passiven dielektrischen Eigenschaften und/oder ihrer Form, Geometrie oder Größe unterscheiden. Die Trennung der Zellpopulationen mit dem erfindungsgemäßen Verfahren ist in den Figuren IB bis IF illustriert und umfasst die folgenden Schritte.
Gemäß Figur IB ist zunächst die Aufnahme der Trägerflüssigkeit mit den Partikeln in die Pipettenspitze 10 vorgesehen. Hierzu wird die Pipettenspitze 10 an einer Laborpipette (nicht dargestellt) angebracht und mit einem Druckkolben mit einem Unterdruck beaufschlagt. Die Aufnahme der Trägerflüssigkeit erfolgt zunächst in den unteren Abschnitt der Pipettenspitze 10 unterhalb der Elektrodeneinrichtung 20 (Figur IB). Die gepunktete Linie 3.1 bezeichnet den Meniskus der Trägerflüssigkeit 3.
Anschließend wird gemäß Figur IC aus einem Pufferreservoir 71 weitere Pufferflüssigkeit 4 aufgenommen, so dass die Trägerflüssigkeit mit den Partikeln in den Manipulationsbereich zwischen den Elektroden 21.1, 21.2 verschoben werden. Die Grenzfläche zwischen der Trägerflüssigkeit 3 und der Pufferflüssigkeit 4 ist gepunktet markiert (3.2).
Die Pufferflüssigkeit 4 kann andere physikalische Eigenschaften als die Probe aufweisen. Insbesondere kann die Dichte oder Viskosität verändert sein oder es kann sich in der Leitfähigkeit bzw. Dielektrizitätskonstante unterscheiden. Mit einer erhöhten Dichte können die Partikel in der Pufferflüssigkeit zunächst verdichtet werden. Die schmalere Bande kann dann durch Anlegen zusätzlicher Kräfte (Zentrifugation, Magnetfeld) beschleunigt erfolgen. Geänderte dielektrische Eigenschaften der Pufferflüssigkeit können dazu dienen, günstigere Bedingungen für die Dielektrophorese einzustellen.
Nach der Beschickung der Pipettenspitze 10 mit den Trägerund Pufferflüssigkeiten 3, 4 wird die Pipettenspitze 10 (vorzugsweise gemeinsam mit der Laborpipette) in einer Halteeinrichtung 30 positioniert, wie dies schematisch in Figur ID illustriert ist. Die Halteeinrichtung 30 umfasst ein Gestell mit einem elektrischen Anschluss 31 zur Verbindung der Elektroden 21.1, 21.2 mit einer Stromversorgungseinrichtung.
Die Trennung der Partikel 1, 2 in verschiedene Partikelfraktionen erfolgt in drei Stufen, die in den Figuren ID bis IF illustriert sind. In einem ersten Schritt wird für eine vorbestimmte Trennzeit Tz die Pipettenspitze in der Halteeinrichtung 30 senkrecht aufgestellt. Die untere Pipettenspitze kann dabei in einem Gefäß oder auf einem Substrat ruhen (nicht dargestellt) . Gleichzeitig werden mit den Elektroden 21.1, 21.2 im Manipulationsbereich hochfrequente elektrische Felder erzeugt. Die Felder weisen in Abhängigkeit von der konkreten Trennaufgabe typischerweise Frequenzen im Bereich von 1 kHz bis 100 MHz und Spannungen im Bereich von 1 V bis 20 V auf. Die Felder werden mit Wechselspannungen oder mit getakteten Spannungen erzeugt.
Die hochfrequenten elektrischen Trennfelder werden so erzeugt, dass der Typ der ersten Zellpopulation (weiße Kreise) eine erste Partikelfraktion 5 bildet und der Sedimentations- bewegung folgend in der Pipettenspitze 10 nach unten sinken kann, während der Typ der anderen Zellpopulation (schwarze Kreise) eine zweite Partikelfraktion 6 bildet und durch positive Dielektrophorese im Manipulationsbereich festgehalten wird. Welche Feldeigenschaften (Frequenzen, Phasen, Amplituden) konkret einzustellen sind, um die Trennung der Partikel zu erreichen, hängt von den konkret verwendeten Partikeln ab. Ansteuerprotokolle zur Beaufschlagung von Elektroden zur negativ- oder positiv-dielektrophoretischen Manipulation von Partikeln können vom Fachmann so gewählt werden, wie es aus der fluidischen Mikrosystemstechnik bekannt ist, oder durch Vorversuche ermittelt werden.
Die Trennzeit bestimmt sich aus dem Unterschied der Massen- dichten der Zellen (z. B. 1.05 g/cm3) und der Trägerflüssigkeit (z. B. 0.9 g/cm3) . Bei Zellgrößen im Bereich von 5 μm bis 30 μm ergibt sich eine Trennzeit von bis zu rund 60 min.
In einem weiteren Trennschritt (Figur IE) wird die sedimen- tierte Partikelfraktion 5 über ein vorbestimmtes Volumen aus der Pipettenspitze 10 in ein Zielreservoir 72 (z. B. Kompar- timent einer Mikrotiterplatte) abgegeben. In dieser Phase kann die Partikelfraktion 6 noch im Manipulationsbereich festgehalten oder wie illustriert aus diesem heraus gespült werden. Das Volumen zur Abgabe der Partikelfraktion 5 in das Zielreservoir ist jedoch so bemessen, dass die Partikelfraktion 6 nicht ebenfalls in das Zielreservoir 72 gelangt. In einem abschließenden Schritt wird die Partikelfraktion 6 in ein weiteres Zielreservoir 73 oder einen Abfallbehälter über- führt (Figur IF) .
Erfindungsgemäß kann vorgesehen sein, dass die Partikeltrennung in einer Zentrifuge beschleunigt wird. Nach erfolgter Separation können die Partikel/Zellen in einer oder mehreren Fraktionen aus der Pipette ausgespült werden.
Alternativ zu der in Figur 1 gezeigten Variante kann die Pi- pettenspitze auch direkt in ein Gefäß gestellt werden, wobei eine Partikelfraktion direkt in dieses Gefäß sedimentiert . Falls bei der Trennung zweier Partikelsorten eine vollständig im Manipulationsbereich zurückgehalten wird und der Manipulationsbereich unmittelbar an der Pipettenspitze beginnt, kann dann ggf. auch auf den Schritt des Aufziehens des Separationsmediums verzichtet werden. Damit entstehen fluidisch einfach handhabbare und mit der Labordiagnostik kompatible Systeme mit integrierter Zellaufbereitung (Zellfraktionierung, Zellreinigung etc) , die sich zudem leicht automatisieren las- sen (Pipetierautornaten) .
Zur Erleichterung der Einstellung der Volumina bei der Aufnahme und Abgabe der Träger- und Pufferflüssigkeiten 3, 4 kann die Pipettenspitze 10 oder die Laborpipette mit einer Skalierung versehen sein. Alternativ können die sich senkrecht zur Längsausdehnung des Pipettenkanals 12 erstreckenden Elektrodenstreifen als Skalierung verwendet werden.
Bei typischen Zellgrößen von ca. 15 μm und gegebenen Dichte- unterschieden von ca. 60 kg/m3 entspricht die im Erdfeld in der Pipettenspitze 10 wirkende Kraft ca. 1 pN. In wässrigen Lösungen ergibt sich damit eine unbeeinflusste Sinkgeschwindigkeit von ca. 7.4 μm/s. Damit werden ca. 135 s pro 1 mm Trennstrecke benötigt. Dielektrophoretische Kräfte können leicht im Bereich von nN bis zu mehreren 10 pN über geeignete Spannungen bzw. Frequenzeinstellungen eingestellt kann. Soll eine Probe der Höhe h in der Pipette vollständig separiert werden und werden die Dielektrophorese-Kräfte bspw. so eingestellt, dass Partikeltyp 1 ungestört und Partikeltyp 2 mit halber Sinkgeschwindigkeit sedimentiert , so muss eine Trennstrecke von mindestens h durchlaufen werden. Dies entspricht bei einer Probenhöhe von 1 cm einer Zeit von ca. 45 Minuten. Die erforderlichen Trennzeiten und -wege skalieren mit dem Geschwindigkeitsverhältnis. Die (theoretische) minimale
Trennstrecke und -zeit ergibt sich für den Fall, dass eine Partikelsorte vollständig zurückgehalten wird (0 cm und 22.5 min im obigem Beispiel) . Es ist daher vorteilhaft Einstellungen mit hohen Sinkgeschwindigkeitsverhältnissen zu realisie- ren.
Da sich die dazu erforderlichen Dielektrophorese-Kräfte in engen Kanälen bei geringen Spannungen realisieren lassen, ist es vorteilhaft mehrere/viele Subkanäle pro Pipettenkanal (DEP-well Technology) zu verwenden. Die Subkanäle haben zum charakteristische Dimensionen von z. B. 300 μm.
Während der Trennungsphase können die Partikel weiteren Kräften ausgesetzt sein, z.B. magnetischen Feldern (z.B. um die Sedimentation zu beschleunigen) oder Ultraschall (um Partikelverklumpungen zu vermeiden) . Magnetische Kräfte können von außen appliziert werden (siehe Figur 2D) oder aber intern mit Mikroelektroden, wie dies etwa in DE 103 55 460 Al gezeigt ist. Im letzteren Fall und bei Verwendung magnetischer bzw. magnetisierbarer Partikel (z. B. sog. Dynabeads) kann ggf. auf eine elektrische Separation ganz verzichtet werden.
Figur 2 illustriert eine abgewandelte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Manipulation suspendierter Partikel 1, 2 (z. B. biologische Zellen) in einer Trägerflüssigkeit 3. Bei dieser Ausführungsform besteht die Flüssigkeitshebereinrichtung aus einer Pipettenspitze 10 und einer Elektrodeneinrichtung 20 mit Elektroden 21.1, 21.2 (Figur 2A) , wie dies oben beschrieben ist (siehe Figur IA) . Im Un- terschied zum oben beschriebenen Verfahren ist gemäß Figur 2 jedoch vorgesehen, dass die zweistufige Aufnahme der Suspensionsprobe (Trägerflüssigkeit mit Partikeln) eine stärkere Verschiebung der Suspensionsprobe ergibt. In einem ersten Schritt werden die Partikel mit der Trägerflüssigkeit in den unteren Abschnitt der Pipettenspitze 10 aufgenommen. In einem zweiten Schritt wird aus einem Pufferreservoir 71 so viel Pufferflüssigkeit aufgenommen, dass die Partikel in einen Bereich oberhalb des Manipulationsbereichs transportiert werden (Figur 2C) .
Zur Trennung der Partikel in verschiedene Partikelfraktionen wird die Pipettenspitze 10 (mit der Laborpipette) in die Halteeinrichtung 30 eingesetzt (Figur 2D) . Die Partikel sedimen- tieren durch den Manipulationsbereich zwischen den Elektroden 20 hindurch, wobei mittels negativer Dielektrophorese auf die verschiedenen Partikel verschieden starke Trennkräfte entgegengesetzt zur Sedimentationsrichtung ausgeübt werden. Dadurch gelangt zunächst die Partikelfraktion 5 in das Zielre- servoir 72. Während die Partikelfraktion 5 am Manipulationsbereich durchgelassen wird, kann die Ansteuerung der Elektroden 21.1, 21.2 auf eine Betriebsart geschaltet sein, bei der positive Dielektrophorese erzeugt und die Partikelfraktion 6 im Manipulationsbereich zurückgehalten wird. Dadurch wird die Trennschärfe des erfindungsgemäßen Verfahrens erhöht.
Figur 2D illustriert schematisch weitere Einzelheiten der Halteeinrichtung 30 mit dem elektrischen Anschluss 31, der Stromversorgungseinrichtung (Generator) 32, einer Schalt- und Kontaktelektronik 33 und einer Magnetsteuerung 34. Mit der
Magnetsteuerung 34 kann ein elektrisch schaltbarer Magnet 35 unterhalb der Pipettenöffnung 11 der Pipettenspitze 10 einge¬ schaltet werden, um eine zusätzliche magnetische Sedimentati- onskraft zu erzeugen und die Absinkgeschwindigkeit von magnetischen Partikel zu erhöhen.
Die Halteeinrichtung 30 kann mit weiteren Modulen ausgestat- tet sein, z. B. mit einem Antriebsmodul für den Druckkolben der Laborpipette. Mit dem Antriebsmodul könnte entsprechend der Funktion einer Spritzenpumpe ein leichter Volumenstrom durch den Pipettenkanal 12 erzeugt werden, wodurch die Trennung der Partikel vorteilhafterweise beschleunigt wird. Die Halteeinrichtung 30 kann auch Teil einer Zentrifuge sein.
Figur 3 illustriert drei Varianten der Gestaltung einer Elektrodeneinrichtung 20, die auf der Innenwand einer Pipettenspitze 10 angeordnet sein kann. Gemäß Figur 3A umfasst die Elektrodeneinrichtung 20 zwei kammförmig ineinander greifende Elektroden 21.1, 21.2 mit radial verlaufenden Elektrodenstreifen, die mit zwei Signalen angesteuert werden, die eine gegenseitige Phasenverschiebung von 180° aufweisen (+/- repräsentieren die Phasenverschiebung 180°). Gemäß Figur 3B ist eine komplexere Elektrodengeometrie vorgesehen, bei der vier kammförmige Elektroden ineinander greifend angeordnet sind, wobei jeweils zwei Elektrodenpaare eine relative Phasenverschiebung von 90° aufweisen. Die in den Figuren 3A und 3B gezeigten Gestaltungen werden vorzugsweise bei einer Pipetten- spitze mit einem zylinderförmigen Pipettenkanal 12 realisiert (Draufsicht in den unteren Teilen der Figuren 3A, 3B) .
Figur 3C zeigt eine Abwandlung, bei der die Elektroden als axial verlaufende Streifen auf der Innenwand eines konisch zulaufenden Pipettenkanals 12 angeordnet sind. Es sind beispielsweise vier, einander gegenüberliegende Elektroden vorgesehen (Draufsicht im unteren Teil der Figur 3C) , die mit Signalen einer relativen Phasenverschiebung von jeweils 90° beaufschlagt werden. Gemäß einer entsprechenden (nicht darge- stellten) Abwandlung können auch drei Elektroden jeweils um 120° versetzt angeordnet und mit Signalen beaufschlagt werden, die eine gegenseitige Phasenverschiebung von 120° aufweisen.
Figur 4 illustriert eine Ausführungsform der erfindungsgemäßen Manipulatorvorrichtung 100, bei der als Flüssigkeitshebereinrichtung eine Multipipette 10 mit mehreren Pipettenspitzen 10.1, 10.2, 10.3 und 10.4 vorgesehen ist. Die schema- tisch illustrierte Pipette 10 ist so wie herkömmliche Multi- pipetten aufgebaut. Die Trenneinrichtung 20 umfasst mehrere Elektrodeneinrichtungen 20.1, 20.2, 20.3 und 20.4, die jeweils an den Pipettenspitzen 10.1, 10.2, 10.3 und 10.4 angeordnet sind.
Die Manipulation einer Suspensionsprobe erfolgt mit der in Figur 4 gezeigten Manipulationsvorrichtung 100 analog zu den oben beschriebenen Verfahrensweisen. Vorteilhafterweise können mit dieser Ausführungsform jedoch mehrere Probensuspensi- onen gleichzeitig getrennt werden. Des weiteren ist diese Variante mit mehreren Pipettenspitzen pro Pipette besonders gut für eine Automatisierung der Partikelmanipulation geeignet.
Figur 5 zeigt ein weiteres Ausführungsbeispiel der erfin- dungsgemäßen Manipulationsvorrichtung 100, bei der die Flüs- sigkeitshebereinrichtung eine Zweikanal-Pipette 10 umfasst. Bei diesem Ausführungsbeispiel ist die Trenneinrichtung 20 im Pipettenreservoir oberhalb der Pipettenspitzen vorgesehen.
Die Zweikanal-Pipette 10 weist gemäß Figur 5A zwei rohrförmi- ge Pipettenkanäle 12.1, 12.2 für die Probenaufnahme und ein Pipettenreservoir 13 auf. Bei dieser Ausführungsform der Erfindung ist die Elektrodeneinrichtung 20 im Pipettenreservoir 13 angeordnet. Ausschließlich über einem der Pipettenkanäle (12.2) ist im oberen Bereich der Pipette 10 die Elektrodeneinrichtung 20 mit mindestens zwei elektrischen Leitern 21.1 elektrisch isoliert angebracht, die eine Applikation von elektrischen Wechselfelder ermöglichen. Die Pipette 10 weist ein asymmetrisches Pipettenreservoir 13 auf. Das Volumen des Pipettenreservoirs 13 ist über den Elektroden 21.1 und dem Pipettenkanal 12.2 größer als das entsprechende Volumen über dem Pipettenkanal 12.1.
Die Trägerflüssigkeit 3 im Probenreservoir 70 enthält zwei verschiedene Zellpopulationen 1, 2, die sich in ihren passiven dielektrischen Eigenschaften, Form, Geometrie, und/oder Größe unterscheiden.
Zur erfindungsgemäßen Trennung der Partikel werden gemäß Figuren 5A, B in einem ersten Schritt beide Pipettenkanäle mit der Mischpopulation der Partikel 1, 2 gefüllt. In einem zweiten Schritt wird zusätzlich Pufferflüssigkeit aus einem Pufferreservoir 71 aufgenommen (Figur 5B) . Im Ergebnis der Puf- feraufnahme gelangt die Mischpopulation der Partikel 1, 2 in den gemeinsamen Raum oberhalb der Elektroden 21.1 (Figur 5C).
Anschließend erfolgt gemäß Figur 5D die Zelltrennung. Die Partikelfraktionen 5, 6 werden nicht wie bei den oben be- schriebenen Verfahren zeitlich versetzt, sondern räumlich getrennt in den Pipettenkanälen erzeugt. Zur Sedimentation kann die Pipette 10 kann in eine Halteeinrichtung (nicht dargestellt, ähnlich wie bei Figur 2) eingesetzt werden.
Zur Trennung wird die Elektrodeneinrichtung 20 aktiviert. Be¬ vorzugt durch Sedimentation oder über einen manuellen oder mechanischen Vorschub gelangen die Zellen 1, 2 in den Bereich der Elektrodeneinrichtung 20. Infolge der dielektrischen Unterschiede kann der erste Partikeltyp die Elektrodeneinrich- tung 20 ungehindert passieren und in den Pipettenkanal 12.2 gelangen, während der zweite Partikeltyp durch die Elektrodeneinrichtung 20 abgelenkt und in den Pipettenkanal 12.1 überführt wird. Danach können die verschiedenen Fraktionen 5, 6 in separaten Gefäßen aufgefangen werden.
Ein besonderer Vorteil des hier beschriebenen Sortierprozesses besteht darin, dass die Partikel nach der Trennung im Bereich der Elektrodeneinrichtung zur Entnahme nicht bis zum unteren Ende der Pipettenkanäle sedimentieren müssen, sondern nach dem Eintreten in den Pipettenkanal getrennt ausgespült werden können.
Figur 6 illustriert das dielektrophoretisches Potential (mittleres E2) für eine Elektrodenstruktur mit 2-Ring-
Elektroden 21 einem konischem Kanal (wie in Figur 1) im zentralen Schnitt parallel zur Längsdehnung der Pipettenspitze. Zusätzlich sind zwei verschiedene Partikeltypen eingezeichnet, wobei die dunkel gezeigten Partikel stärker als die hell gezeigten Partikel durch negative Dielektrophorese zurückgehalten werden und daher nicht so schnell sedimentieren. Figur 7 illustriert das dielektrophoretisches Potential (mittleres E2) für die in Figur 3C gezeigten Elektroden 21 (schwarz gezeichnet) bei einer Ansteuerung mit einem Wechsel- feld ("ac", 2-Phasen, links) und mit einem Rotationsfeld ("rot", 4-Phasen, rechts) .
Die Figuren 6 und 7 zeigen, dass sich Partikel zwar auch in "der Nähe einer einzelnen Elektrode beeinflussen lassen. Je- doch erlaubt eine Zwei-Elektrodenanordnung die Einstellung von genauer definierten Bedingungen. Im einfachsten Fall besteht diese aus 2 Ringen (Figur 6) . Die Partikel werden im Feld dielektrophoretisch zentriert und sedimentieren zur Spitze 11 (siehe Figur IA) der Pipette 10 hin. In Figur 7 verschwindet in ac-Ansteuerung das elektrische Feld in der Symmetrieachse und die Partikel erfahren eine Kraft die proportional zur 5ten Potenz des Partikelradius ist. Damit sedi- mentieren kleinere Partikel unter Bedingungen der negativen Dielektrophorese schneller als größere. In Rotationsfeldan- steuerung rot dominieren die zum Partikelvolumen proportionalen Dielektrophorese-Dipolkräfte .
Für eine gleichmäßige Separation kann es vorteilhaft sein, konstante Dielektrophorese-Kräfte in Sedimentationsrichtung (Felder mit konstantem Gradienten, sogenannte „isomotive electric fields", siehe z. B. Li et al. "Dielectrophoretic fluidic cell fractionation System" in "Analytica Chimica Ac- ta" Bd. 507, 2004, S. 151-161) wirken zu lassen. Die Verände- rung der Sedimentationsgeschwindigkeit kann nicht nur über Dielektrophorese oder Wanderwellendielektrophorese, sondern auch über induzierte Partikelaggregation (siehe T. B. Jones "Electromechanics of Particles", Cambridge üniversity Press, New York City, NY, 1995, ISBN 0-521-43196-4, Kapitel 7.6, S. 212 - 216) und im Falle von nichtsphärischen Objekten (z.B. Bakterien, roten Blutzellen, Thrombozyten, CNTs (carbon nano tubes) etc.) über Umorientierung (siehe T. B. Jones "Electromechanics of Particles" Kapitel 5.4., S. 124-126) im elektrischen Feld erfolgen. Wenn diese Effekte nicht parallel, son- dern alternativ Verwendung finden, hat dies den Vorteil, dass nur besonders einfache Elektrodenanordnungen zur Erzeugung homogener elektrischer Felder erforderlich sind. Anstelle von der in Figur 3C gezeigten 4-Elektrodenanordnung können dazu bspw. einfach zwei gegenüberliegende und gegenphasig ange- steuerte Elektroden verwendet werden, wobei die Pipette nichtkonisch ausgeführt sein kann. Die gegenphasige Ansteuerung kann auch durch eine einphasige ersetzt werden, wobei sich die zweite Elektrode auf (virtueller) Masse befindet. Dies gilt analog auch für Magnetfelder in denen ebenfalls induzierte Aggregation bzw. Orientierung genutzt werden kann.
Da sowohl die Sedimentation als auch die Dielektrophorese in Dipolapproximation Volumenkräfte repräsentieren, können Zellen nach ihrer Größe besonders effektiv fraktioniert werden, wenn die Zellen durch geeignete Elektrodengeometrie und -ansteuerung in Bereichen mit verschwindenden Dipolkraftanteil manipuliert werden und bspw. eine Separation gemäß Quadrupolkraftanteilen erfolgt.
Auch die Reorientierung stellt eine generelle Trennmöglichkeit dar, da der Strömungswiderstand von der Orientierung der Partikel abhängt. Während die reine Partikelaggregation zu sphärischen Objekten nur in speziellen Feldverteilungen mit bspw. verschwindenden Dipolmoment in der Symmetrieachse (Figur 7, ac) hierzu nutzbar ist, eignet sich die feldinduzierte Partikelaggregation zu nichtsphärischen Objekten (z.B. Perlketten in homogenen Felder) hervorragend , da der Strömungs- widerstand von der Orientierung abhängt. Sollen z. B. nichtsphärische Partikel voneinander oder von sphärischen Partikeln getrennt werden, wird durch geeignete Wahl der Frequenz und ggf. der Pufferflüssigkeit mindestens ein Partikeltyp im Mittel mit der größeren „Halbachse" parallel bzw. antiparal- IeI zum elektrischen (magnetischen, optischen) Feld orientiert. Zusätzlich kann der zweite Partikeltyp senkrecht zum ersten orientiert werden. Eine wichtige 'technische Anwendung besteht bei der Separation von leitenden und halbleitenden CNTs, die zufällig bei der Produktion entstehen.
Erfindungsgemäß kann somit neben dem Phänomen verschiedener Sinkgeschwindigkeiten von orientierten nichtsphärischen Objekten,, wie nichtsphärischen biologischen Zellen, z. B. roten Blutzellen, oder künstlichen Objekten, z. B. Kohlenstoffnano- röhrchen, die Aggregation der Objekte in elektrischen und oder magnetischen Feldern und die damit einhergehende veränderte Sedimentationsgeschwindigkeit zur Partikelmanipulation und insbesondere -trennung genutzt werden. Diese Ausführungs- form der Erfindung basiert insbesondere auf der Erkenntnis, dass bei Zusammenlagerung von Partikeln der Strömungswiderstand i.A. schwächer ansteigt als die Sedimentationskraft. Für zwei sich berührende Kugeln mit gleichem Radius findet man bspw. bei verdoppelter Masse (Sedimentationskraft) je nach Orientierung nur eine ca. 1.3- bzw. 1.5-fache Vergrößerung der hydrodynamischen Reibungskraft im Vergleich zur einzelnen Kugel und damit eine entsprechende Erhöhung der Sedimentationsgeschwindigkeit (siehe z.B. C. Binder et al. in "Journal of Colloid and Interface Science" vol. 301, 2006, p. 155-167). Die Sedimentation von Aggregaten wird im Folgenden unter Bezug auf Figur 8 erläutert.
Die feldinduzierte Partikelaggregation kann gemäß einer ersten Variante in homogenen Feldern erreicht werden. Sie ist dort bspw. als Perlkettenbildung bekannt (siehe T. B. Jones "Electromechanics of Particles", Kapitel 6 "Theory of pearl chains", S. 139 ff.) . Figur 8A zeigt die Bildung von Partikelaggregaten (insbesondere Partikelketten oder Partikelteppiche) im homogenen oder nahezu homogenen elektrischen Feld. Die Manipulationsvorrichtung 100 (oben Seitenansicht, unten Draufsicht) weist an einander gegenüberliegenden Wänden des mit einem rechteckigen Querschnitt gebildeten Heberkanals 12 Elektroden 21.4 auf, die zur Bildung eines homogenen elektrischen Feldes wechselweise mit einer positiven oder negativen Spannung beaufschlagt werden. Die Symbole +/- verdeutlichen die Phase des elektrischen Feldes bzw. die Ladung an den Elektroden zu einem festen Zeitpunkt. Durch den verringerten Strömungswiderstand pro Partikel der aggregierten Objekte kommt es zu einer Partikelseparation. Hierbei wird die Feld- frequenz des elektrischen Feldes so gewählt, dass Partikeltyp 1 eine stärkere Aggregationskraft im elektrischen Feld erfährt als Partikeltyp 2.
Gemäß einer zweiten Variante können in inhomogenen Feldern durch Dielektrophorese oder Magnetophorese ebenfalls Aggregate erzeugt und zur Separation genutzt werden. Figur 8B zeigt, dass in einem Quadrupolfeld, das mit vier Elektroden 21.5 erzeugt wird, die Partikel 1 mit stärkerer negativer Die- lektrophorese in der Zentralachse (E==0) übereinander angeordnet werden und in dieser Formation schneller sedimentieren als die schwächer, d.h. kaum dielektrophoretisch zentrierten Partikel 2. Zur Magnetophorese werden entsprechend Spulen verwendet (siehe beispielsweise DE 10355460.2) .
Die Befüllung der Manipulationsvorrichtung 100 gemäß den Figuren 8A oder 8B mit einer Partikelsuspension kann von der unten vorgesehenen Heberöffnung 11 oder am entgegengesetzten, oberen Ende des Heberkanals 12 erfolgen. Eine besonders scharfe Trennung in Fraktionen kann erreicht werden, wenn sich die Partikel zunächst oberhalb der Elektroden befinden und die Feldfrequenz und -Spannung bzw. Phasenmuster so eingestellt werden, dass die Partikel zunächst nicht in den Trennbereich mit den Elektroden eindringen können. Dadurch werden vorteilhafterweise definierte Anfangsbedingungen gesetzt. Optional kann durch eingekoppelte Vibrationen (z.B. Ultraschall) in dieser Phase eine unerwünschte zufällige oder feldvermittelte Partikelaggregation minimiert bzw. unterbunden werden. Anschließend beginnt dann durch eine Änderung von Phasenmuster, Spannung und/oder Frequenz des elektrischen Feldes der eigentliche Trennprozess .
In Abwandlung zu Figur 8 können zwei Elektrodenbereiche vorgesehen sein, wobei die Partikel in einem oberen Elektroden- bereich zunächst eingefüllt und einem ersten Aggregationsfeld ausgesetzt werden, welches die Objekte gleichzeitig zurückhält, und in einem unteren Elektrodenbereich sedimentieren. Falls die Partikel zur aktiven Aggregation nach Berührung neigen (bspw. biologische Zellen) kann der untere Elektrodenbereich entfallen.
Die Orientierung von Aggregaten wird im Folgenden unter Bezug auf Figur 9 erläutert, die beispielhaft zwei kraftinduzierte Orientierungseffekte illustriert, die zu einer unterschiedlichen Probenauftrennung führen können. Für den ersten Effekt ist im Heberkanal 12 mindestens eine Orientierungselektrode 21.6 angeordnet. Die Orientierungselektrode 21.6 ist z. B. ein dielektrophoretischer Trichter ("Funnel"), wie er aus der fluidischen Mikrosystemtechnik bekannt ist. Die Orientierungselektrode 21.6 ist im Heberkanal 12 sich axial erstreckend angeordnet. Für den zweiten Effekt ist zusätzlich oder alternativ mindestens eine Halteelektrode 21.7 vorgesehen. Die Halteelektrode 21.7 umfasst z. B. parallele, ringförmige Teilelektroden in Form von Streifen oder so genannten ZigZag- Elementen, wie sie aus der dielektrophoretischen Manipulation bekannt sind. Die Halteelektrode 21.7 ist im Heberkanal 12 radial umlaufend angeordnet. Erfindungsgemäß kann eine Trennkaskade gebildet werden, die eine Kombination aus mindestens einer Orientierungselektrode 21.6 und mindestens einer Halteelektrode 21.7, z. B. mindestens zwei Halteelektroden 21.7 und/oder mindestens zwei Orientierungselektroden 21.6 umfasst, die z. B. mit zwei unterschiedlichen Frequenzen angesteuert werden.
Eine Suspension, die in der Manipulationsvorrichtung 100 (teilweise gezeigt) getrennt werden soll, enthält z. B. kugelförmige Partikel 7 und zwei Typen ellipsoider Partikel 8, 9. Gelangt die Suspension an die mit einer Wechselspannung beaufschlagte Orientierungselektrode 21.6, werden die Partikel in Abhängigkeit von der Frequenz der Wechselspannung im Wirkungsbereich der Orientierungselektrode 21.6 gedreht (umorientiert) . Beispielsweise werden für Ellipsoide vorbestimm- te Vorzugsfrequenzen eingestellt, bei denen eine Orientierung quer oder längs zum Feldvektor der Orientierungselektrode 21.6 auftritt. Diese Drehung (Orientierung) wirkt sich dann auf das Sedimentationsverhalten der Partikel aus. Für das Gemisch aus verschiedenen Partikeltypen werden an die Orientie- rungselektrode 21.6 elektrische Felder mit verschiedenen Frequenzen angelegt, die an die jeweiligen Partikeltypen ange- passt sind. Die verschiedenen Frequenzen können gleichzeitig überlagert oder abwechselnd erzeugt werden.
Gelangt die Suspension an die mit einer Wechselspannung beaufschlagte Halteelektrode 21.7 und wird an einer Teilelektrode die Frequenz der Wechselspannung so gewählt, dass sich alle ellipsoiden Partikel oder eine bestimmte Teilgruppe von diesen quer zur Strömung legen, so ist die entsprechende HaI- tekraft erhöht und die Partikel werden deutlich länger retardiert als Kugeln oder andere Ellipsoide, die sich in Strömungsrichtung ausrichten.
Die zu trennende Suspensionen enthält z. B. biologische Mate- rialien, wie Zellen, oder artifizielle Bestandteilen, wie
Kohlenstofffasern, die jeweils aus kugelförmigen und längli- chen-ellipsoidähnlichen Objekten bestehen können. Mit besonderem Vorteil kann die Erfindung mit Suspensionen angewendet werden, die Blutzellen enthalten. Aus der Rheologie ist be- kannt, dass sich Blutzellen bei unterschiedlich starker Strömung unterschiedlich anordnen (so genanntes "Geldrollen"- Phänomen) . Dies verändert ihr strömungstechnisches Verhalten. Außerdem kann bei Blutzellen von ihrem rheologischen Verhalten auf bestimmte Krankheiten bzw. krankhafte Veränderungen geschlossen werden. Des weiteren kann die Geschwindigkeit der Trennung von Serum- und Plasmabestandteilen bei der klassischen Blutsenkung zur Beurteilung von krankhaften Veränderungen im Blut herangezogen werden.
Figur 10 zeigt Ausführungsformen einer erfindungsgemäßen Manipulationsvorrichtung 100 mit einer magnetischen Trennung in einer Pipettenspitze 10. Gemäß Figur 10A wird eine konische Pipettenspitze 10 mit einer Magnetfeldeinrichtung 20 ausges- tattet, die eine Spulen-Umwicklung 21.3 auf der äußeren Oberfläche der Pipettenspitze 10 umfasst. Bei der Beaufschlagung der Spulen-Umwicklung 21.3 mit einem elektrischen Strom wird in der Pipettenspitze 10 ein inhomogenes Magnetfeld erzeugt. Alternativ dazu wird die Pipettenspitze 10 gemäß Figur 1OB in einen entsprechenden Spuleneinsatz 22 eingesetzt, was den besonderen Vorteil hat, dass in die Pipettenspitze 10 keine Elektrode integriert werden muss. Übliche Pipettenmaterialien wie Glas Keramik oder Kunststoff werden vorteilhafterweise gut vom Magnetfeld penetriert. Die Trennung von Partikeln er- folgt analog zu den oben beschriebenen Verfahren.
Analog zu Figur 1OB kann auch für die elektrische Trennung auf interne Elektroden in der Flüssigkeitshebereinrichtung verzichtet werden. Dies ist wird für relativ einfach aufge- baute Elektrodenanordnungen (bspw. in Figur 3) bevorzugt. Für wässrige Lösungen ist bei äußeren Elektroden die Verwendung von elektrisch stark polarisierbaren Pipettenmaterials (Kom- posite) bevorzugt, um bei hinreichend hohen Feldfrequenzen genügend Feldstärke in die Probe einkoppeln zu können (elekt- rische Felder niedriger Frequenzen werden von den Ladungsträgern in wässrigen Lösungen i. A. gut abgeschirmt). Für künstliche Partikel (wie etwa CNTs) oder Bakterien (z. B. in Trinkwasser) , die in niedrigleitfähigen und niedrig-DK Medien supendiert werden können, kann das erforderliche (homogene) elektrische Feld besonders einfach vollständig von außen erzeugt werden.
Die Ausführungsführungsformen können auch derart modifiziert sein, dass die Magnetseparation nur auf einen oberen Bereich der Pipettenspitze 10 beschränkt ist. Damit werden nichtmag- netisierte Zeilchen zuerst abgetrennt. Eine schaltbare und in der Magnetfeldstärke einstellbare Ausführung gestattet dann sogar eine kontinuierliche Trennung der Objekte. Zusätzliche kann die elektrische Trennung wie oben beschrieben vorgesehen sein.
Die in der vorstehenden Beschreibung, den Ansprüchen und den Zeichnungen offenbarten Merkmale der Erfindung können sowohl einzeln als auch in Kombination für die Verwirklichung der Erfindung in ihren verschiedenen Ausgestaltungen von Bedeutung sein.

Claims

Ansprüche
1. Verfahren zur Manipulation von Partikeln (1, 2), die in einer Trägerflüssigkeit (3) suspendiert sind, mit den Schritten:
- Aufnahme der Trägerflüssigkeit (3) mit den Partikeln (1, 2) in eine Flüssigkeitshebereinrichtung (10), - Erzeugung von elektrischen und/oder magnetischen Trennfel¬ dern in der Flüssigkeitshebereinrichtung (10),
- Sedimentationsbewegung der Partikel (1, 2) in der Flüssigkeit, wobei jedes Partikel eine Sedimentationsgeschwindigkeit aufweist, die von der Wirkung der Trennfelder auf dieses Par- tikel (1, 2) abhängt, und die Partikel (1, 2) in Abhängigkeit von ihren Sedimentationsgeschwindigkeiten mehrere Partikelfraktionen (5, 6) bilden, und
- Ausgabe der Partikelfraktionen (5, 6) aus der Flüssigkeitshebereinrichtung (10).
2. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Trägerflüssigkeit (3) mit den Partikeln (1, 2) unter der Wirkung eines Unterdrucks durch mindestens eine Heberöffnung (11) in die Flüssigkeitshebereinrichtung (10) aufgenommen wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, bei dem nach der Aufnahme der Trägerflüssigkeit (3) eine Pufferflüssigkeit (6) in die Flüssigkeitshebereinrichtung (10) aufgenommen wird.
4. Verfahren nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die Partikelfraktionen (5, 6) zeitlich getrennt aufeinanderfolgend aus der Flüssigkeitshebereinrichtung (10) ausgegeben werden.
5. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 3, bei dem die Partikelfraktionen (5, 6) räumlich getrennt aus der Flüssigkeitshebereinrichtung (10) ausgegeben werden.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 oder 5, bei dem die Partikelfraktionen (5, 6) durch die mindestens eine Heberöffnung (11) aus der Flüssigkeitshebereinrichtung (10) ausgegeben werden.
7. Verfahren nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die elektrischen Trennfelder für unterschiedliche Partikel (1, 2) verschieden starke negativ- dielektrophoretische Trennkräfte bewirken.
8. Verfahren nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die elektrischen Trennfelder für einen Teil der Partikel (1, 2) positiv-dielektrophoretische Trennkräfte bewirken.
9. Verfahren nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die elektrischen Trennfelder für einen Teil der Partikel (1, 2) keine Trennkräfte bewirken.
10. Verfahren nach mindestens einem der vorhergehenden An- sprüche, bei dem die magnetischen Trennfelder einen Magnetfeldgradienten in der Flüssigkeitshebereinrichtung (10) bilden.
11. Verfahren nach mindestens einem der vorhergehenden An- sprüche, bei dem die Partikel (1, 2) während der Sedimentationsbewegung gleichzeitig oder in zeitlich versetzter Abfolge verschiedenen Trennfeldern ausgesetzt werden.
12. Verfahren nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die Trennfelder so erzeugt werden, dass Aggregation und/oder eine Orientierung der Partikel (1, 2) in Abhängigkeit von einer vorbestimmten Partikeleigenschaft er- folgt.
13. Verfahren nach Anspruch 12, bei dem die Aggregation und/oder die Orientierung der Partikel (1, 2) in Abhängigkeit von der Partikelform, der Partikelgeometrie, dem Partikelauf- bau und/oder der Partikelzusammensetzung erfolgt.
14. Verfahren nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die Sedimentationsbewegung unter der Wirkung von wenigstens einer der Sedimentationskräfte erfolgt, welche die Gravitationskraft, eine magnetische Sedimentationskraft, eine dielektrophoretische Sedimentationskraft, eine elektrophoretische Sedimentationskraft, eine elektromagnetische Sedimentationskraft und eine Zentrifugationskraft umfassen.
15. Verfahren nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem eine Beaufschlagung der Trägerflüssigkeit (3) in der Flüssigkeitshebereinrichtung (10) mit Ultraschall vorgesehen ist.
16. Verfahren nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem nach der Aufnahme der Trägerflüssigkeit (3) eine Positionierung der Flüssigkeitshebereinrichtung (10) in einer Halteeinrichtung (30) vorgesehen ist.
17. Verfahren nach Anspruch 16, bei dem die Positionierung der Flüssigkeitshebereinrichtung (10) eine Herstellung einer elektrischen Verbindung zwischen einer Trenneinrichtung (20) zur Erzeugung der Trennfelder mit einer Stromversorgungseinrichtung (40) umfasst.
18. Verfahren nach mindestens einem der vorhergehenden An- sprüche, bei dem die Partikel (1, 2) biologische Zellen, biologische Zellaggregate, biologische Zellbestandteile, biologische Makromoleküle, Viren, synthetische Materialien oder eine Kombination aus diesen umfassen.
19. Verfahren nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem eine elektrische Feldbehandlung der Partikel (1, 2) vorgesehen ist.
20. Verfahren nach Anspruch 19, bei dem die Partikel (1, 2) biologische Zellen umfassen und die elektrische Feldbehandlung eine Zellporation oder eine Zellfusion umfasst.
21. Verfahren nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die Aufnahme der Trägerflüssigkeit (3) mit den Partikeln (1, 2) in die Flüssigkeitshebereinrichtung (10) ein gleichzeitiges Saugen der Trägerflüssigkeit (3) in mehrere Heberkanäle (12) der Flüssigkeitshebereinrichtung (10) umfasst .
22. Verfahren nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem als Flüssigkeitshebereinrichtung eine Pipet- tiereinrichtung (10) oder ein Teil von dieser verwendet wird.
23. Manipulationsvorrichtung (100) zur Manipulation von Par- tikeln (1, 2), die in einer Trägerflüssigkeit (3) suspendiert sind, umfassend:
- eine Flüssigkeitshebereinrichtung (10) zur Aufnahme der Trägerflüssigkeit (3) , und - eine Trenneinrichtung (20) zur Erzeugung von elektrischen und/oder magnetischen Trennfeldern in der Flüssigkeitshebereinrichtung (10) .
24. Manipulationsvorrichtung nach Anspruch 23, bei der die Trenneinrichtung (20) in mindestens einem Heberkanal (12) der Flüssigkeitshebereinrichtung (10) angeordnet ist.
25. Manipulationsvorrichtung nach Anspruch 23, bei der die Trenneinrichtung (20) auf einer Außenseite der Flüssigkeitshebereinrichtung (10) angeordnet ist.
26. Manipulationsvorrichtung nach Anspruch 25, bei der die Trenneinrichtung (20) auf der Außenseite der Flüssigkeitshe- bereinrichtung (10) lösbar befestigt ist.
27. Manipulationsvorrichtung nach mindestens einem der Ansprüche 23 bis 26, bei dem die Trenneinrichtung (20) zur Erzeugung der elektrischen Trennfelder eine Elektrodeneinrich- tung (21) umfasst.
28. Manipulationsvorrichtung nach mindestens einem der Ansprüche 23 bis 27, bei der die Trenneinrichtung (20) zur Erzeugung der magnetischen Trennfelder eine Magnetfeldeinrich- tung (22) umfasst.
29. Manipulationsvorrichtung nach mindestens einem der Ansprüche 23 bis 28, bei der die Flüssigkeitshebereinrichtung (10) einen oder mehrere Heberkanäle (12) umfasst, durch wel- che die Trägerflüssigkeit (3) in die Flüssigkeitshebereinrichtung (10) aufgenommen werden kann.
30. Manipulationsvorrichtung nach Anspruch 29, bei der min¬ destens einer der Heberkanäle (12) mehrere Subkanäle enthält.
31. Manipulationsvorrichtung nach mindestens einem der Ansprüche 23 bis 29, bei der die Flüssigkeitshebereinrichtung (10) ein Material umfasst, das sich dielektrisch von der Trä- gerflüssigkeit (3) unterscheidet.
32. Manipulationsvorrichtung nach mindestens einem der Ansprüche 23 bis 31, bei der die Flüssigkeitshebereinrichtung (10) wenigstens eines der Materialien Glas, Kunststoff, Kera- mik, Silizium und Kunststoff-Nanopartikel-Komposit umfasst.
33. Manipulationsvorrichtung nach mindestens einem der Ansprüche 23 bis 32, bei der die Flüssigkeitshebereinrichtung eine Pipettiereinrichtung (10) oder ein Teil von dieser um- fasst.
34. Manipulationsvorrichtung nach Anspruch 33, bei der die Flüssigkeitshebereinrichtung (10) eine Pipettenspitze (10.1) umfasst, mit der die Trenneinrichtung (20) verbunden ist.
35. Manipulationsvorrichtung nach Anspruch 33, bei der die Flüssigkeitshebereinrichtung (10) ein Pipettenreservoir (10.2) umfasst, mit dem die Trenneinrichtung (20) verbunden ist.
36. Manipulationsvorrichtung nach mindestens einem der Ansprüche 23 bis 35, die mit einer Halteeinrichtung (30) zur Positionierung der Flüssigkeitshebereinrichtung (10) ausgestattet ist.
37. Manipulationsvorrichtung nach Anspruch 36, bei der die Halteeinrichtung (30) zur elektrischen Verbindung der Trenneinrichtung (20) mit einer Stromversorgungseinrichtung (32) eingerichtet ist.
38. Verwendung eines Verfahrens oder einer Manipulationsvorrichtung nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche zur: - Sortierung von biologischen Partikeln (1, 2), oder - Reinigung von biologischen Partikelsuspensionen.
39. Verwendung einer Pipettenspitze (10.1), die mit einer Trenneinrichtung (20) zur Erzeugung von elektrischen und/oder magnetischen Trennfeldern ausgestattet ist, zur Manipulation von suspendierten Partikeln (1, 2).
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