-
Die
Erfindung betrifft ein Verfahren zur Manipulation von suspendierten
Partikeln unter der Wirkung von elektrischen und/oder magnetischen
Trennfeldern, insbesondere ein Verfahren zur Manipulation von biologischen
Partikeln unter der Wirkung von dielektrophoretischen und/oder magnetischen
Trennkräften.
Die Erfindung betrifft des Weiteren eine Vorrichtung zur Manipulation
von suspendierten Partikeln mit elektrischen und/oder magnetischen
Trennfeldern. Die Vorrichtung stellt insbesondere eine Manipulationsvorrichtung
für biologische
Partikel dar, die durch dielektrophoretische und/oder magnetische Trennkräfte in Abhängigkeit
von vorbestimmten Partikeleigenschaften in verschiedenen Partikelfraktionen
getrennt werden.
-
Es
ist bekannt, suspendierte Partikel unter der Wirkung negativ-dielektrophoretisch
wirkender Feldkräfte
zu manipulieren. Beispielsweise wird von T. Müller et al. in "Biosensors and Bioelectronics, Band
14, 1999, S. 247–256
beschrieben, einzelne biologische Zellen unter der Wirkung negativer
Dielektrophorese in Feldkäfigen
zu halten und zu untersuchen oder mit Feldbarrieren zu sortieren.
Die Feldkäfige
oder Feldbarrieren werden mit hochfrequenten elektrischen Feldern
gebildet, die mit Elektroden in Kompartimenten des Mikrosystems
erzeugt werden. Die Bewegung der Zellen zu einem Feldkäfig oder
zu einer Feldbarriere erfolgt durch hydrodynamische Kräfte. Die
Zellen werden mit einer Strömung
der Trägerflüssigkeit,
in der die Zellen suspendiert sind, durch die Kompartimente bewegt.
Zur Erzeugung der hydrodynamischen Kräfte ist das herkömmliche
Mikrosystem an eine Fluidikeinrichtung angeschlossen, mit der eine
kontinuierliche Strömung
der Trägerflüssigkeit
aufrechterhalten wird. Die Ankopplung des Mikrosystems an die Fluidikeinrichtung,
die z.B. eine Spritzenpumpe umfasst, kann die Beweglichkeit des Mikrosystems
einschränken.
Durch den Anschluss von Flüssigkeitsleitungen
wird die Bewegungsfreiheit des Mikrosystems eingeschränkt, was
insbesondere für
Laboranwendungen in der Zellbiologie von Nachteil sein kann. Ein
weiterer Nachteil der herkömmlichen
Partikelbewegung mittels hydrodynamischer Kräfte besteht darin, dass geringe
Geschwindigkeiten (kleiner als 50 μm/s) mit herkömmlichen
Fluidikeinrichtungen nur ungenau und mit geringer Reproduzierbarkeit
einstellbar sind. Aus
EP 1 089
823 ist bekannt, Partikel mittels einer Sedimentationsbewegung
im fluidischen Mikrosystem zu transportieren. Sedimentationskräfte, die
durch Gravitation oder Zentrifugation erzeugt werden, ermöglichen
eine genaue und reproduzierbare Einstellung von geringen Partikelgeschwindigkeiten.
Allerdings muss auch in diesem Fall das Mikrosystem zur Aufnahme
einer Partikelsuspension mit einer Fluidikeinrichtung verbunden
werden, so dass sich wiederum das Problem der eingeschränkten Bewegungsfreiheit
und aufwändigen
Handhabung des Mikrosystems ergibt.
-
Bei
den herkömmlichen
Techniken wird das Mikrosystem durch einen Fluidikchip gebildet.
Ein Nachteil bei der Verwendung des Fluidikchips kann in dessen
beschränkter
Kompatibilität
mit der übrigen Technik
bestehen, die in einem Labor z.B. für chemische, biologische und
insbesondere zellbiologische Untersuchungen verwendet wird. Die
Fluidikchips erfordern eine komplexe fluidische Peripherie, was
ggf. einen unakzeptabel hohen Aufwand darstellt, wenn nur wenige
Zellen manipuliert und insbesondere sortiert werden sollen. Während sich
die Bereitstellung der fluidischen Peripherie für Hochdurchsatzanwendungen
lohnt, sind Laborgeräte
zum flexiblen Einsatz auch bei kleinen Probenmengen und unter variierenden
Anwendungsbedingungen bisher nicht verfügbar.
-
Die
Aufgabe der Erfindung ist es, ein verbessertes Verfahren zur Manipulation
von suspendierten Partikeln bereitzustellen, mit dem die Nachteile
der herkömmlichen
Technik überwunden
werden und das einen erweiterten Anwendungsbereich aufweist. Das
erfindungsgemäße Verfahren
soll insbesondere eine verbesserte Kompatibilität mit verfügbaren Laborgeräten aufweisen
und einen flexiblen Einsatz unter verschiedenen Anwendungsbedingungen
selbst bei geringen Probenmengen ermöglichen. Die Aufgabe der Erfindung
besteht ferner darin, eine verbesserte Manipulationsvorrichtung
zur Manipulation von suspendierten Partikeln bereitzustellen, mit
der die Nachteile der herkömmlichen
fluidischen Mikrosysteme vermieden werden und die insbesondere einen erweiterten
Anwendungsbereich und eine im Vergleich zu herkömmlichen Fluidikchips vergrößerte Bewegungsfreiheit
und vereinfachte Handhabbarkeit aufweist.
-
Diese
Aufgaben werden durch ein Verfahren oder eine Manipulationsvorrichtung
mit den Merkmalen der Patentansprüche 1 oder 23 gelöst. Vorteilhafte
Ausführungsformen
und Anwendungen der Erfindung ergeben sich aus den abhängigen Ansprüchen.
-
Verfahrensbezogen
basiert die Erfindung auf der allgemeinen technischen Lehre, eine
Sedimentationsbewegung suspendierter Partikel in einer Flüssigkeitshebereinrichtung
durch elektrische und/oder magnetische Trennfelder derart zu beeinflussen, dass
die Partikel in Abhängigkeit
von der spezifischen Wechselwirkung mit den Trennfeldern eine charakteristische
Sedimentationsgeschwindigkeit erhalten. In Abhängigkeit von den Sedimentationsgeschwindigkeiten
der Partikel werden mehrere Partikelfraktionen gebildet, die getrennt
aus der Flüssigkeitshebereinrichtung
ausgegeben werden. Im Unterschied zur herkömmlichen Mikrosystemtechnik
erfolgt die Manipulation der suspendierten Partikel nicht in einem
Fluidikchip, sondern in einer Flüssigkeitshebereinrichtung.
-
Mit
dem Begriff "Flüssigkeitshebereinrichtung" (oder: "Heber") wird hier allgemein
eine Vorrichtung zur Aufnahme und/oder Abgabe von Flüssigkeiten
aus oder in offene Flüssigkeitsreservoire
bezeichnet. Die Flüssigkeitshebereinrichtung
ermöglicht
die Aufnahme, die zeitweilige Speicherung und die spätere Abgabe
einer Trägerflüssigkeit
mit suspendierten Partikeln und kann damit die Transportfunktion der
bei den herkömmlichen
Techniken verwendeten Fluidikeinrichtungen erfüllen. Ein wesentlicher Vorteil der
Erfindung besteht darin, dass durch die Erzeugung der elektrischen
und/oder magnetischen Trennfelder in der Flüssigkeitshebereinrichtung zusätzlich eine
Manipulation, insbesondere Sortierung der Partikel ermöglicht wird.
Die herkömmliche
Manipulation von suspendierten Partikeln im Fluidikchip in Kombination
mit der Fluidikeinrichtung wird erfindungsgemäß durch die Manipulation der
suspendierten Partikel in der Flüssigkeitshebereinrichtung
ersetzt.
-
Vorteilhafterweise
kann die Flüssigkeitshebereinrichtung
ohne zusätzliche
Fluidikeinrichtungen zum Flüssigkeitstransport
eigenständig
und flexibel verwendet werden. Die Flüssigkeitshebereinrichtung kann
insbesondere manuell oder mit einem mechanischen Stellantrieb nach
Aufnahme der suspendierten Partikel frei bewegt oder in eine Ruheposition
gebracht werden, während
die Manipulation der Partikel erfolgt. Ein weiterer wichtiger Vorteil
der Erfindung besteht darin, dass durch die z.B. dielektrophoretische
Trennung kleinste Zellmengen, z.B. zwei Zellen voneinander getrennt
werden können.
-
Zur
Manipulation der Partikel wird eine Wechselwirkung der Partikel
mit den elektrischen und/oder magnetischen Trennfeldern ausgenutzt. Die
Beeinflussung der Sedimentationsgeschwindigkeit der Partikel in
Abhängigkeit
von ihrer Wechselwirkung mit den Trennfeldern kann sich bei verschiedenen
Ausführungsformen
der Erfindung in einer Änderung
des Betrages und/oder der Richtung der Sedimentationsgeschwindigkeit
auswirken.
-
Zur Änderung
des Betrages der Sedimentationsgeschwindigkeit werden Trennkräfte erzeugt, welche
in Abhängigkeit
von den Partikeleigenschaften bei einigen Partikeln in einer erhöhten Sedimentationsgeschwindigkeit
und bei anderen Partikeln in einer verminderten Sedimentationsgeschwindigkeit resultieren,
so dass sich die Partikel in den getrennten Partikelfraktionen sammeln
können.
Die Sedimentationsgeschwindigkeit kann ggf. bis auf Null vermindert
werden.
-
Im
Ergebnis einer Änderung
der Richtung der Sedimentationsgeschwindigkeit sammeln sich Partikel
mit verschiedenen Eigenschaften auf verschiedenen Sedimentationspfaden
in der Flüssigkeitshebereinrichtung,
so dass eine getrennte Ausgabe der Partikelfraktionen ermöglicht wird.
-
Ein
besonderer Vorteil der Erfindung besteht in der Vielfalt von Wechselwirkungen
zwischen den Partikeln und den Trennfeldern, auf deren Grundlage die
Trennkräfte
erzeugt werden können.
Es können beispielsweise
dielektrophoretische, elektrophoretische, magnetische und/oder elektromagnetische Trennkräfte erzeugt
werden, die entsprechend verschiedene Wirkungen auf Partikel mit
verschiedenen Eigenschaften aufweisen, die dielektrische Eigenschaften,
magnetische Eigenschaften, Polarisationseigenschaften und/oder Leitfähigkeitseigenschaften der
Partikel umfassen. Es wird beispielsweise ausgenutzt, dass durch
die geeignete Wahl der Frequenz des elektrischen Trennfeldes unterschiedliche
dielektrophoretische Kräfte
auf biologische Zellen ausgeübt
werden können,
die sich in Bezug auf wenigstens eine der Eigenschaften Zusammensetzung,
Größe und Form
voneinander unterscheiden. Wenn Partikel mit verschiedenen Eigenschaften
entsprechend verschieden starke negative Dielektrophorese-Trennkräfte erfahren,
können
sie in der Flüssigkeitshebereinrichtung
mit verschiedenen Geschwindigkeiten sedimentieren. Alternativ können unerwünschte Partikel
mittels positiver Dielektrophorese oder mittels Elektrophorese an
Elektroden zur Erzeugung der elektrischen Trennfelder fixiert werden
und somit eine eigene Partikelfraktion bilden.
-
Wenn
auf die suspendierten Partikel dielektrophoretische Trennkräfte ausgeübt werden,
ergeben sich besondere Vorteile für die Genauigkeit und Selektivität der Trennung.
Gemäß einer
ersten Variante erfolgt die Trennung, indem die Trennfelder so eingestellt
werden, dass auf verschiedene Partikel verschieden starke negativ-dielektrophoretische Trennkräfte wirken.
Unterschiede der negativ-dielektrophoretischen Trennkräfte können beispielsweise bewirken,
dass verschiedene Partikel verschieden schnell sedimentieren oder
dass verschiedene Partikel in Abhängigkeit von der Zusammenwirkung
der Trennkräfte
mit den Sedimentationskräften
auf verschiedene Sedimentationspfade bewegt werden. Die Ausübung verschieden
starker negativ-dielektrophoretischer Trennkräfte hat den Vorteil, dass auf
alle in der Suspension enthaltenen Partikel eine Feldwirkung ausgeübt wird
und die Partikel berührungslos
in der Flüssigkeitshebereinrichtung
manipuliert werden. Gemäß einer
zweiten Variante ist vorgesehen, dass für einen Teil der Partikel positiv-dielektrophoretische Trennkräfte ausgeübt werden.
In diesem Fall erfolgt eine Anziehung der betroffenen Partikel hin
zu einer Elektrode zur Erzeugung der Trennfelder. Diese Variante
hat den Vorteil, dass durch die zumindest zeitweilige Fixierung
der Partikel an der Elektrode die Trennschärfe der Partikelmanipulation
verbessert wird. Schließlich
ist gemäß einer
dritten Variante möglich,
dass für
einen Teil der Partikel die Trennfelder keinen Einfluss haben, so
dass diese unbeeinflussten Partikel ausschließlich die Sedimentationsbewegung
ausführen.
In diesem Fall ergeben sich Vorteile in Bezug auf die vereinfachte
Einstellung der Trennfelder.
-
Insbesondere
bei der Ausübung
positiv-dielektrophoretischer Trennkräfte, bei der ein Teil der Partikel
in der Flüssigkeitshebereinrichtung
zurückgehalten
wird, kann auf die Aufnahme der Pufferflüssigkeit verzichtet werden.
Die Erzeugung der Trennfelder kann in diesem Fall im Heberkanal
unmittelbar nach der Heberöffnung
erfolgen.
-
Die
Flüssigkeitshebereinrichtung
weist allgemein ein Reservoir zur Aufnahme der Trägerflüssigkeit
mit den suspendierten Partikeln auf, das mindestens einen Heberkanal
mit einer vorbestimmten Längsausdehnung
umfasst. In Betriebsposition ist die Flüssigkeitshebereinrichtung so
ausgerichtet, dass die Richtung der Längsausdehnung von der Horizontalen
abweicht und vorzugsweise vertikal verläuft. Jeder Hebekanal weist
an seinem freien Ende eine Heberöffnung
auf, durch welche die Trägerflüssigkeit
von einem Reservoir mit einer freien Flüssigkeitsoberfläche in die
Flüssigkeitshebereinrichtung aufgenommen
werden kann. Das Reservoir umfasst ein Gefäß, wie z. B. ein Kompartiment
einer Mikrotiterplatte, oder eine freie Substratoberfläche, wie
z.B. ein Trägerglas
für die
Mikroskopie.
-
Mit
dem erfindungsgemäßen Verfahren
kann eine Partikeltrennung insbesondere auf der Grundlage der folgenden Überlegun gen
erfolgen. Für
den vereinfachten Fall der Partikeltrennung ohne eine Änderung
der Sedimentationsrichtung bestimmt sich die Sedimentationsgeschwindigkeit
bekannterweise aus folgendem Kräftegleichgewicht: Fhyd =
Fg + Fz (1)wobei sich
die Gravitationskraft und hydrodynamische Kraft für ein sphärisches
Partikel mit dem Radius r zu Fg = g(ρparticle – ρmedium)
= 4/3πr3gδρ und Fhyd = 6πηrν (2)ergibt. Hierbei
stellen g, p, δρ, η und v die
Erdbeschleunigung, Dichte, Dichtedifferenz, Viskosität des Mediums
und die Partikelgeschwindigkeit dar. Um die Sedimentationsgeschwindigkeit
zu verändern, kann
entweder eine zusätzliche
Kraft auf die einzelnen Partikel in Sedimentationsrichtung ausgeübt werden
und oder der hydrodynamische Widerstand verändert werden. Der Strömungswiderstand
kann durch eine Umorientierung und/oder eine Deformation und/oder
eine Aggregation der Partikel (größere Objekte gleicher Dichte
und Symmetrie sedimentieren schneller) verändert werden. Dies lässt sich bspw.
in homogenen elektrischen oder magnetischen externen Feldern realisieren.
Bei Fz kann es sich um homogene Felder (bspw.
Elektrophorese) oder Gradientenfelder (bspw. Dielektrophorese oder
Magnetophorese), die wie die Sedimentationskraft mit r3 skalieren,
handeln. Es kann auch vorgesehen sein, dass die Partikel in Rotation
versetzt werden (z.B. Elektrorotation in rotierenden elektrischen
Felder) um so ihre Bewegungsbahn zu verändern (Magnuseffekt).
-
Wenn
gemäß einer
bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung die suspendierten Partikel mit einer Trägerflüssigkeit
durch die mindestens eine Heberöffnung
in die Flüssigkeitshebereinrichtung aufgenommen
werden, ergeben sich besondere Vorteile für die erfindungsgemäße Mehrfachfunktion
der Flüssigkeitshebereinrichtung
zum Transport der Trägerflüssigkeit
und zur Manipulation der suspendierten Partikel.
-
Besonders
bevorzugt ist eine Ausführungsform
der Erfindung, bei der die Flüssigkeitshebereinrichtung
nur eine Heberöffnung
aufweist, die als fluidischer Ein- und Ausgang verwendet wird.
-
Die
Aufnahme der Trägerflüssigkeit
mit den suspendierten Partikeln kann durch die Ausübung eines
Unterdrucks in der Flüssigkeitshebereinrichtung erreicht
werden. Im Unterschied zu herkömmlichen Fluidikeinrichtungen
ist es vorteilhafterweise ausreichend, wenn ein relativ geringer
Unterdruck für
eine vorbestimmte Ansaugzeit ausgeübt und dann aufrechterhalten
wird. Hierzu kann beispielsweise wie bei herkömmlichen Flüssigkeitshebereinrichtungen ein
Gummiballon oder ein Druckkolben verwendet werden.
-
Wenn
gemäß einer
weiteren bevorzugten Ausführungsform
des erfindungsgemäßen Manipulationsverfahrens
zunächst
die Trägerflüssigkeit
mit den suspendierten Partikeln und anschließend eine Pufferflüssigkeit
ohne Partikel in die Flüssigkeitshebereinrichtung
aufgenommen wird, können
sich Vorteile für
eine zuverlässige
Verschiebung der Trägerflüssigkeit
mit den suspendierten Partikeln zu einer vorbestimmten Startposition
relativ zu einem Manipulationsbereich ergeben, in dem die Trennfelder
ausgeübt
werden. Die Aufnahme der Pufferflüssigkeit hat den weiteren Vorteil,
dass die Trägerflüssigkeit
mit den suspendierten Partikeln in der Flüssigkeitshebereinrichtung von
der Heberöffnung
getrennt wird. Damit können
unerwünschte
Umwelteinflüsse
auf die Partikel, insbesondere auf biologische Zellen oder andere
biologische Partikel während
der Sedimentation ausgeschlossen werden. Die Pufferflüssigkeit kann
mit der Trägerflüssigkeit
identisch sein, ohne jedoch Partikel zu enthalten. Alternativ kann
als Pufferflüssigkeit
eine andere Flüssigkeit
verwendet werden. Bei biologischen Anwendungen der Erfindung umfasst
die Pufferflüssigkeit
z.B. eine isotonische wässrige
Lösung.
-
Durch
die Ausbildung einer von der jeweiligen Trennkraft abhängigen Sedimentationsgeschwindigkeit
sammeln sich die Partikel, falls nur ein Partikeltyp in der Probe
enthalten ist, in einer Partikelfraktion, und vorzugsweise für die Partikelsortierung
in mindestens zwei Partikelfraktionen. Vorteilhafterweise weist
das erfindungsgemäße Verfahren eine
große
Flexibilität
bei der getrennten Ausgabe der Partikelfraktionen aus der Flüssigkeitshebereinrichtung
auf. Gemäß einer
ersten Alternative können die
Partikelfraktionen zeitlich getrennt ausgegeben werden. Nach der
Sedimentation mit der Sammlung in den Partikelfraktionen können die
Partikel mit der höchsten
Sedimentationsgeschwindigkeit zuerst und anschließend die
Partikel mit geringeren Sedimentationsgeschwindigkeiten aus der
Flüssigkeitshebereinrichtung
austreten. Vorteilhafterweise kann dabei zwischen den Phasen der
Ausgabe einer bestimmten Partikelfraktion die Flüssigkeitshebereinrichtung zwischen
verschiedenen Zielreservoiren bewegt werden, so dass die verschiedenen
Partikel in verschiedenen Kompartimenten oder auf verschiedenen
Substraten zur weiteren Bearbeitung, Untersuchung oder dergleichen
abgelegt werden können.
Gemäß einer zweiten
Alternative können
die Partikelfraktionen räumlich
getrennt aus der Flüssigkeitshebereinrichtung
ausgegeben werden. Hierzu erfolgt während der Sedimentationsbewegung
unter der Wirkung der Trennfelder eine Ablenkung von verschiedenen
Partikeln in verschiedene Heberkanäle. Diese Ausführungsform
der Erfindung ist von Vorteil, da die Partikelfraktionen parallel
in oder auf verschiedenen Zielreservoiren abgelegt werden können. Die
beiden Varianten der zeitlich und räumlich getrennten Ausgabe der
Partikelfraktionen können
kombiniert werden.
-
Gemäß einer
besonders bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung erfolgt die Ausgabe der Partikelfraktionen durch die
mindestens eine Heberöffnung
der Flüssigkeitshebereinrichtung.
Die Heberöffnung
wird vorteilhafterweise sowohl zur Aufnahme als auch zur Ausgabe
der Trägerflüssigkeit
verwendet, wobei zur Ausgabe der zunächst vorhandene Unterdruck
durch einen konstanten Überdruck
ersetzt werden kann, um die Ausgabe der Trägerflüssigkeit mit den getrennten
Partikelfraktionen zu beschleunigen. Der Überdruck kann z.B. durch eine
integrierte Spritzenpumpe oder durch die Ausübung einer mechanischen Vorspannung,
z.B. durch eine Feder am Druckkolben, ausgeübt werden.
-
Zur
erfindungsgemäßen Manipulation
von suspendierten Partikeln wird zunächst ein vorbestimmtes Volumen
der Trägerflüssigkeit
(z.B. Suspension einer Zellprobe) mit der Flüssigkeitshebereinrichtung aufgenommen.
Anschließend
kann die weitere, partikelfreie Pufferflüssigkeit (Separationsmedium)
aufgenommen werden. Gleichzeitig zur Aufnahme der Pufferflüssigkeit
wird die Trägerflüssigkeit
mit den suspendierten Partikeln in die Startposition der Sedimentation
im Manipulationsbereich oder stromaufwärts vom Manipulationsbereich
transportiert, in dem die elektrischen und/oder magnetischen Trennfelder
erzeugt werden. Anschließend wird
die Flüssigkeitshebereinrichtung
in eine Halteeinrichtung eingesetzt. Während der nachfolgenden Sedimentationsbewegung
werden die Trennfelder erzeugt, so dass die Partikel selektiv in
ihrer Sedimentationsgeschwindigkeit (Betrag und/oder Richtung) beeinflusst
werden.
-
Wenn
gemäß einer
weiteren Ausführungsform
der Erfindung die magnetischen Trennfelder mindestens einen Magnetfeldgradienten
in der Flüssigkeitshebereinrichtung
bilden, ergeben sich Vorteile für
die zuverlässige
Trennung von Partikeln, die im Magnetfeld eine Kraftwirkung erfahren
(magnetische Partikel) und anderen Partikeln, auf die das Magnetfeld
keine Wirkung hat (nicht-magnetische Partikel). Im Magnetfeldgradienten
können
vorteilhafterweise Partikel, die aus Magnetbeads bestehen oder mit
Magnetbeads verbunden sind, von nicht-magnetisch markierten Partikeln getrennt
werden.
-
Gemäß einer
weiteren Ausführungsform
der Erfindung kann es von Vorteil sein, elektrische und magnetische
Trennfelder in der Flüssigkeitshebereinrichtung
zu kombinieren. Die gleichzeitige Erzeugung elektrischer und magnetischer
Trennfelder erlaubt die gleichzeitige Trennung der Partikel in Abhängigkeit
von verschiedenen Partikeleigenschaften (z.B. dielektrische und
magnetische Eigenschaften). Alternativ können die elektrischen und magnetischen Trennfelder
während
der Sedimentationsbewegung mit einem zeitlichen Abstand bzw. in
verschiedenen Teil-Manipulationsbereichen in der Flüssigkeitshebereinrichtung
erzeugt werden. Beispielsweise kann nach Beginn der Sedimentation
zunächst
die Erzeugung magnetischer Trennfelder und anschließend die
Erzeugung von dielektrophoretisch wirkenden Trennfeldern vorgesehen
sein, um zunächst
magnetisch markierte Partikel von nicht-magnetisch markierten Partikeln
zu trennen und anschließend
eine Trennung in Abhängigkeit
von den dielektrischen Eigenschaften durchzuführen. Alternativ können zunächst die
elektrischen Trennfelder und anschließend die magnetischen Trennfelder
erzeugt werden.
-
Gemäß einer
weiteren Ausführungsform
der Erfindung kann vorgesehen sein, dass die Trennfelder mindestens
ein Trennfeld und/oder einen Trennfeldgradienten bilden, in dem
die Partikel in Abhängigkeit
von einer vorbestimmten Partikeleigenschaft (z.B. Polarisierbarkeit,
magnetischer Dipol) eine Orientierungsbewegung ausführen. Vorteilhafterweise kann
durch die Orientierungsbewegung die Sedimentationsgeschwindigkeit
und damit die Trennung der Partikel in die Partikelfraktion beeinflusst
werden. Besonders bevorzugt ist die Einstellung einer Orientierung
der Partikel in Abhängigkeit
von der Partikelform, der Partikelgeometrie, dem Partikelaufbau und/oder
der Partikelzusammensetzung.
-
Ein
weiterer wichtiger Vorteil der Erfindung besteht in der Vielfalt
verfügbarer
Sedimentationskräfte,
mit denen die Sedimentationsbewegung induziert werden kann. Die
Sedimentationskräfte
bewirken eine konstante Kraftwirkung, die in gleicher Weise auf
alle Partikel ausgeübt
wird. Gemäß bevorzugten
Varianten umfassen die Sedimentationskräfte die Gravitationskraft und/oder
Zentrifugationskraft, da für diese
herkömmliche
Sedimentationstechniken im ruhenden Gefäß oder in einer Zentrifuge
verfügbar sind.
Des Weiteren können
eine magnetische Sedimentationskraft, eine dielektrophoretische
Sedimentationskraft, eine elektrophoretische Sedimentationskraft,
eine elektromagnetische Sedimentationskraft oder eine Kombination
aus diesen Kräften
zur Unterstützung
der Sedimentationsbewegung verwendet werden.
-
Wenn
gemäß einer
weiteren Modifizierung der Erfindung die Trägerflüssigkeit mit den suspendierten
Partikel in der Flüssigkeitshebeeinrichtung mit
Ultraschall beaufschlagt wird, können
vorteilhafterweise unerwünschte
Partikelaggregationen aufgelöst
werden. Diese Ausführungsform
ermöglicht,
eine Verstopfung eines Heberkanals zu vermeiden. Außerdem kann
durch Ultraschall auch die Bewegungsbahn der Partikel verändert werden.
-
Gemäß einer
weiteren Variante der Erfindung ist nach der Aufnahme der Trägerflüssigkeit eine Überführung der
Flüssigkeitshebereinrichtung
in eine Halteeinrichtung vorgesehen. Wenn die Sedimentation im wesentlichen
durch die Gravitationskraft induziert wird, wird die Flüssigkeitshebereinrichtung
in der Halteeinrichtung so positioniert, dass die Längsausdehnung
des mindestens einen Hebekanals vertikal verläuft. Die Positionierung der
Flüssigkeitshebereinrichtung
kann ein Einsetzen oder ein Einhängen
in ein angepasstes Gestell umfassen. Vorteilhafterweise kann die
Bedienung der Flüssigkeitshebereinrichtung
vereinfacht werden, wenn gleichzeitig mit der Positionierung der
Flüssigkeitshebereinrichtung
in der Halteeinrichtung die Trenneinrichtung mit einer Stromversorgungseinrichtung
elektrisch verbunden wird.
-
Die
Halteeinrichtung kann zur Ausübung weiterer
Sedimentationskräfte
ausgelegt sein, und zum Beispiel eine Zentrifuge und/oder einen
schaltbaren Sedimentationsmagneten umfassen.
-
Ein
weiterer wichtiger Vorteil der Erfindung besteht darin, dass die
Partikel, abgesehen von der positiv-dielektrophoretischen Fixierung,
in der Flüssigkeitshebereinrichtung
berührungslos
manipuliert werden. Bevorzugte Anwendungen der Erfindung sind daher
in der Biologie und Biochemie gegeben. Die suspendierten Partikel
umfassen vorzugsweise biologische Zellen, Zellbestandteile, Zellgruppen, Zellorganellen,
Viren, biologische Makromoleküle oder
Kombinationen aus diesen. Die Umsetzung der Erfindung ist jedoch
nicht auf die biologischen Anwendungen beschränkt, sondern auch mit nicht-biologischen
Partikeln möglich,
die beispielsweise aus Kunststoff, Glas, Mineralen oder Keramiken
hergestellt sind. Des Weiteren können
die suspendierten Partikel in einer Probe Partikel biologischen
Ursprungs und nicht-biologische Partikel umfassen, die beispielsweise
mit der erfindungsgemäßen Manipulation
voneinander getrennt werden. Die Partikel weisen vorzugsweise eine
charakteristische Dimension im Bereich von 500 μm bis 50 nm auf. Die Trägerflüssigkeit
kann in Abhängigkeit
von der Anwendung der Erfindung gewählt werden und eine einphasige
oder eine mehrphasige Flüssigkeit
umfassen.
-
Eine
weitere bevorzugte Anwendung der Erfindung ist die Trennung von
Partikeln für
die Aufreinigung von Zellsuspensionen, z.B. für die Patch-Clamp-Technik.
Beispielsweise können
mit dem erfindungsgemäßen Verfahren
lebende biologische Zellen von toten oder geschädigten Zellen oder von Zellbruchstücken getrennt
werden. Damit wird eine Blockade der Ansaugstellen einer Patch-Einrichtung
durch unerwünschte
Probenbestandteile vermieden oder es werden Zielzellen bzw. Aggregate von
größeren bzw.
kleineren Objekten abgetrennt. Dies funktioniert mit der erfindungsgemäßen Technik besser
als in horizontalen Durchflusssystemen in denen die größeren Objekte
leicht in strömungsberuhigte
Zonen sedimentieren und es dort zu Verstopfungen kommen kann.
-
Gemäß einer
weiteren Variante der Erfindung ist eine elektrische Feldbehandlung
der suspendierten Partikel in der Flüssigkeitshebereinrichtung vorgesehen,
die alternativ oder parallel zu der Trennung in verschiedene Partikelfraktionen
auch eine Veränderung
der Partikel umfasst. Vorteilhafterweise können in der Flüssigkeitshebereinrichtung eine
Zellporation oder eine Zellfusion durchgeführt werden. Die Erfindung ermöglicht,
mit einfachen, mit der Labortechnik kompatiblen Mitteln eine Elektrotransfektion
(z.B. von siRNA) durchzuführen.
-
Gemäß einem
weiteren, unabhängigen
Gesichtspunkt der Erfindung ist in der Flüssigkeitshebereinrichtung ausschließlich die
elektrische Feldbehandlung der suspendierten Partikel ohne eine
Sedimentation und ohne eine Trennung vorgesehen. In diesem Fall
ist die hier beschriebene Flüssigkeitshebereinrichtung
mit einer Porations- und/oder Fusions-Elektrodenanordnung ausgestattet,
wie sie zum Beispiel aus der Mikrosystemtechnik bekannt ist und so
aufgebaut sein kann, wie es hier unter Bezug auf die Trenneinrichtung
beschrieben ist.
-
Bei
einer für
die Parallelbehandlung größerer Suspensionsproben
bevorzugten Ausführungsform der
Erfindung umfasst die Aufnahme der Trägerflüssigkeit in die Flüssigkeitshebereinrichtung
ein gleichzeitiges Ansaugen in mehrere Heberkanäle. Diese Variante ermöglicht die
parallele Aufnahme von Proben z.B. aus den Kompartimenten einer
Mikrotiterplatte.
-
Besonders
bevorzugt wird als Flüssigkeitshebereinrichtung
eine Pipettiereinrichtung oder ein Teil von dieser verwendet. Die
Behandlung der suspendierten Partikel mit elektrischen und/oder
magnetischen Feldern kann beispielsweise in mindestens einer Pipettenspitze
oder mindestens einem Pipettenreservoir einer Einfach- oder Mehrfachpipette
vorgesehen sein.
-
Gemäß einer
weiteren Ausführungsform
der Erfindung kann vorgesehen sein, dass die Trennung und/oder Effizienz
der Trennung durch optische und/oder elektrische Messverfahren überwacht
wird. Zur optischen Überwachung
ist die Flüssigkeitshebereinrichtung
z.B. mit einer Kameraeinrichtung ausgestattet. Die elektrische Überwachung
kann auf einer Impedanzmessung in der Flüssigkeitshebereinrichtung basieren.
-
Vorrichtungsbezogen
wird die obengenannte Aufgabe gelöst, indem eine Flüssigkeitshebereinrichtung
zur Aufnahme einer Suspensionsprobe mit einer Trenneinrichtung (z.B.
Elektrodeneinrichtung oder Magnetfeldeinrichtung) zur Erzeugung
von elektrischen und/oder magnetischen Trennfeldern in der Flüssigkeitshebereinrichtung
ausgestattet wird. Vorteilhafterweise wird damit eine multifunktionale
Manipulationsvorrichtung bereitgestellt, die mit der in der Praxis
verwendeten Labortechnik kompatibel ist.
-
Die
Flüssigkeitshebereinrichtung
weist einen oder mehrere Heberkanäle auf. Die Heberkanäle verlaufen
vorzugsweise gerade mit einer vorbestimmten Längsausdehnung. Typischerweise
sind die mehreren Heberkanäle
parallel zueinander in einer Ebene (eindimensionaler Heber) oder
als Matrix (zweidimensionaler Heber) angeordnet.
-
Gemäß einer
bevorzugten Ausführungsform der
Erfindung ist die Trenneinrichtung in mindestens einem der Heberkanäle angeordnet.
Diese Variante ist wegen der unmittelbaren Feldwirkung der Trenneinrichtung
bevorzugt. Die Einkopplung der elektrischen und/oder magnetischen
Trennfelder in die Trägerflüssigkeit
wird vereinfacht. Alternativ kann die Trenneinrichtung auf einer
Außenseite
der Flüssigkeitshebereinrichtung
in der Umgebung von mindestens einem der Heberkanäle angeordnet
sein. In diesem Fall werden vorteilhafterweise mögliche unerwünschte Effekte
einer Substanz (z.B. der Trägerflüssigkeit)
in der Flüssigkeitshebereinrichtung
auf die Trenneinrichtung vermieden. Des Weiteren vereinfacht sich
der Aufbau und die Herstellung der Flüssigkeitshebereinrichtung.
Die Trenneinrichtung kann z.B. auf der Außenseite der Flüssigkeitshebereinrichtung
lösbar
befestigt sein. Vorteilhafterweise wird damit ermöglicht,
herkömmliche
Flüssigkeitshebereinrichtungen,
wie z.B. Pipetten oder Pipettenspitzen mit einer Trenneinrichtung
zur Schaffung der erfindungsgemäßen Manipulationseinrichtung
auszurüsten.
-
Zur
Erzeugung elektrischer Trennfelder umfasst die Trenneinrichtung
vorzugsweise eine Elektrodeneinrichtung mit mindestens zwei streifenförmigen oder
ringförmigen
Elektroden. Vorteilhafterweise kann die Elektrodeneinrichtung so
gestaltet werden, wie es aus der herkömmlichen Technik fluidischer
Mikrosysteme bekannt ist. Zur Erzeugung magnetischer Trennfelder
umfasst die Trenneinrichtung vorzugsweise eine Magnetfeldeinrichtung.
Wenn die Magnetfeldeinrichtung mindestens eine Spule aufweist, kann
die magnetische Trennwirkung vorteilhafterweise in Abhängigkeit
von der konkreten Anwendung der Erfindung eingestellt werden. Wenn
die Magnetfeldeinrichtung mindestens einen Permanentmagneten aufweist,
ergeben sich Vorteile durch einen vereinfachten Aufbau der Manipulationsvorrichtung.
-
Vorteile
in Bezug auf eine besonders effektive Feldwirkung können sich
ergeben, wenn die Elektroden der Trenneinrichtung möglichst
geringe Elektrodenabstände
aufweisen. Entsprechend ist gemäß einer
vorteilhaften Ausführungsform
der Erfindung vorgesehen, den mindestens einen Heberkanal der Flüssigkeitshebereinrichtung
mit mindestens einem Subkanal auszustatten, dessen charakteristische Querschnittsdimension
geringer als die Querschnittsdimension des Heberkanals ist und in
dem die Elektroden der Trenneinrichtung angeordnet sind.
-
Erfindungsgemäß besteht
eine hohe Vielfalt verfügbarer
Materialien, aus denen die Flüssigkeitshebereinrichtung
oder zumindest die Wand der Heberkanäle hergestellt ist. Es können insbesondere Glas,
Kunststoff, Keramik, Silizium, Kunststoff-Nanopartikel-Komposite oder Zusammensetzungen
aus diesen Materialien verwendet werden. Für die Wirkung von elektrischen
Trennfeldern kann es von Vorteil sein, wenn sich das Material, aus
dem die Flüssigkeitshebereinrichtung
oder zumindest die Wände der
Heberkanäle
aufgebaut ist, dielektrisch von der Trägerflüssigkeit, z.B. von einer Salzlösung unterscheidet.
In diesem Fall wird ein möglicher
Einfluss z.B. eines Wandmaterials der Flüssigkeitshebereinrichtung auf
die Trennfelder vermindert oder ausgeschlossen.
-
Gemäß einer
besonders bevorzugten Anwendung der Erfindung umfasst die Flüssigkeitshebereinrichtung
eine Pipettiereinrichtung oder ein Teil von dieser. Die Pipettiereinrichtung
(z. B. Laborhubpipette), die im Wesentlichen wie herkömmliche
Laborgeräte
aufgebaut sein kann, ist mit der Trenneinrichtung zur Erzeugung
der Trennfelder im Pipettenreservoir und/oder in der Pipettenspitze
ausgestattet. Besonders vorteilhaft für eine hohe Flexibilität bei der Anwendung
der Erfindung ist es, wenn die Manipulationsvorrichtung eine Pipettenspitze
umfasst, die mit der Trenneinrichtung verbunden ist. In diesem Fall kann
eine herkömmliche
Pipettiereinrichtung mit der erfindungsgemäß funktionalisierten Pipettenspitze ausgestattet
werden.
-
Die
Verwendung einer Pipettenspitze, die mit einer Trenneinrichtung
zur Erzeugung von elektrischen und/oder magnetischen Trennfeldern
ausgestattet ist, zur Manipulation suspendierter Partikel stellt
entsprechend einen unabhängigen
Gegenstand der Erfindung dar.
-
Weitere
Einzelheiten und Vorteile der Erfindung werden aus der Beschreibung
der beigefügten Zeichnung
ersichtlich. Es zeigen:
-
1 und 2:
Ausführungsformen
des erfindungsgemäßen Verfahrens
zur Manipulation suspendierter Partikel,
-
3:
Ausführungsformen
von Elektrodeneinrichtungen gemäß verschiedenen
Ausführungsformen
der erfindungsgemäßen Manipulationsvorrichtung,
-
4:
eine weitere Ausführungsform
der erfindungsgemäßen Manipulationsvorrichtung
mit mehreren Hebekanälen,
-
5:
eine weitere Ausführungsform
der erfindungsgemäßen Manipulation
von suspendierten Partikeln,
-
6 und 7:
Illustrationen der in einer erfindungsgemäßen Manipulationsvorrichtung
erzeugten Trennfelder, und
-
8:
Ausführungsformen
der erfindungsgemäßen Manipulationsvorrichtung,
bei der eine Pipettenspitze mit einer Magnetfeldeinrichtung ausgestattet
ist.
-
Die
Erfindung wird im Folgenden unter beispielhaftem Bezug auf die Verwendung
von Pipettenspitzen zur elektrischen oder magnetischen Manipulation
von suspendierten Partikeln beschrieben. Es wird betont, dass die
Erfindung entsprechend umsetzbar ist, indem die Trenneinrichtung
am Reservoir einer Flüssigkeitspipette
oder einem anderen Flüssigkeitsheber
(z. B. Saugpipette, Hubpipette, Kapillarrohr, fluidische Hohlleitung)
vorgesehen ist.
-
1A illustriert in schematischer, vergrößerter Schnittansicht
die Manipulationsvorrichtung 100, bei der als Flüssigkeitshebereinrichtung
eine Pipettenspitze 10 vorgesehen ist. Die Heberöffnung und
der Heberkanal werden entsprechend durch die Pipettenöffnung 11 und
den Pipettenkanal 12 gebildet. Mit einem Abstand vom freien
Ende der Pipettenspitze 10 ist als Trenneinrichtung eine
Elektrodeneinrichtung 20 mit streifenförmigen Elektroden 21.1, 21.2 angeordnet.
Die Pipettenspitze 10 weist Abmessungen wie übliche,
kommerziell verfügbare
Pipettenspitzen von Herstellern wie z.B. Gilson oder Eppendorf auf.
Das Innenvolumen des Pipettenkanals 12 beträgt beispielsweise
5 μl bis
200 μl.
-
Die
Pipettenspitze 10 kann aus bekannten Materialien wie Glas,
Kunststoffen, Keramik oder Silizium bestehen, welche sich leicht
mit Elektroden versehen lassen. Verwendbar sind auch Kompositmaterialien
wie mit leitfähigen
Nanopartikeln versehene Kunststoffe, die sich über Spritzgussverfahren kostengünstig formen
und bspw. optisch mit Leiterbahnen versehen lassen. Es kann insbesondere
vorteilhaft sein, in den Pipettenkanal eine Vielzahl von Subkanälen zu integrieren.
Dies lässt
sich bspw. kostengünstig über die
aus WO 2004/076060 bekannte Technologie realisieren. Der Manipulationsbereich der
Pipette kann verschieden geformt (bspw. kreisförmiger oder rechteckiger Querschnitt)
und mit konstanten Dimensionen oder konisch ausgeführt sein.
-
Zusätzlich kann
in der Pipettenspitze 10 ein zum Medium dielektrisch (Leitfähigkeit/Dielektrizitätskonstante)
verschieden) Material eingebracht werden, z.B. als poröser Pfropf,
der Feldinhomogenitäten
zur Partikeltrennung erzeugt (siehe Lapizco-Encinas et al. "Dielectrophoretic
concentration and separation of live and dead bacteria in an array of
insulators" in "Analytical Chemistry" Bd. 76, 2004, S.
1571–1579).
-
Die
Elektroden 21.1, 21.2 umfassen mindestens zwei
elektrisch leitfähige
Leiterbahnen, die zur Erzeugung elektrischer Trennfelder mit einer
Stromversorgungseinrichtung (nicht dargestellt) verbunden werden.
Die Elektroden 21.1, 21.2 sind elektrisch voneinander
isoliert vorzugsweise auf der Innenseite der Pipettenspitze 10,
oder alternativ in deren Wand oder auf deren äußeren Oberfläche angeordnet.
Die Figuren zeigen zur verbesserten Erkennbarkeit die Elektroden
auf der Außenseite
der Pipettenspitze. Die mit den Elektroden erzeugten elektrischen
Felder (Trennfelder) wirken entsprechend ihrer Ausdehnung in einem
bestimmten Raumbereich, der hier als Manipulationsbereich bezeichnet
wird. Im Manipulationsbereich weist die Pipettenspitze 10 eine
Querschnittsdimension vorzugsweise im Bereich von 100 μm bis 1 mm
auf.
-
Alternativ
zu der illustrierten konischen Form der Pipettenspitze 10 können andere
Querschnittsformen des Pipettenkanals 12 vorgesehen sein.
Der Pipettenkanal 12 kann sich beispielsweise ausgehend
von der Pipettenöffnung 11 mit
einem engen Abschnitt stufenförmig
in einen Abschnitt mit einer größeren Innendimension
erweitern, wobei die Elektrodeneinrichtung 20 in diesem
Fall am oberen Ende des engen Abschnitts vor der stufenförmigen Erweiterung
vorgesehen ist.
-
1A zeigt des Weiteren in einem Probenreservoir 70 eine
Suspensionsprobe mit verschiedenartigen Partikeln 1, 2 in
einer Trägerflüssigkeit 3. Das
Probenreservoir 70 ist beispielsweise ein Kompartiment
einer Mikrotiterplatte. Die verschiedenen Typen der Partikel 1, 2 umfassen
z.B. verschiedene Zellpopulationen, die sich in ihren passiven dielektrischen
Eigenschaften und/oder ihrer Form, Geometrie oder Größe unterscheiden.
Die Trennung der Zellpopulationen mit dem erfindungsgemäßen Verfahren ist
in den 1B bis 1F illustriert
und umfasst die folgenden Schritte.
-
Gemäß 1B ist zunächst die Aufnahme der Trägerflüssigkeit
mit den Partikeln in die Pipettenspitze 10 vorgesehen.
Hierzu wird die Pipettenspitze 10 an einer Laborpipette
(nicht dargestellt) angebracht und mit einem Druckkolben mit einem
Unterdruck beaufschlagt. Die Aufnahme der Trägerflüssigkeit erfolgt zunächst in
den unteren Abschnitt der Pipettenspitze 10 unterhalb der
Elektrodeneinrichtung 20 (1B).
Die gepunktete Linie 3.1 bezeichnet den Meniskus der Trägerflüssigkeit 3.
-
Anschließend wird
gemäß 1C aus einem Pufferreservoir 71 weitere
Pufferflüssigkeit 4 aufgenommen,
so dass die Trägerflüssigkeit
mit den Partikeln in den Manipulationsbereich zwischen den Elektroden 21.1, 21.2 verschoben
werden. Die Grenzfläche
zwischen der Trägerflüssigkeit 3 und
der Pufferflüssigkeit 4 ist
gepunktet markiert (3.2).
-
Die
Pufferflüssigkeit 4 kann
andere physikalische Eigenschaften als die Probe aufweisen. Insbesondere
kann die Dichte oder Viskosität
verändert sein
oder es kann sich in der Leitfähigkeit
bzw. Dielektrizitätskonstante
unterscheiden. Mit einer erhöhten
Dichte können
die Partikel in der Pufferflüssigkeit zunächst verdichtet
werden. Die schmalere Bande kann dann durch Anlegen zusätzlicher
Kräfte
(Zentrifugation, Magnetfeld) beschleunigt erfolgen. Geänderte dielektrische
Eigenschaften der Pufferflüssigkeit
können
dazu dienen, günstigere
Bedingungen für
die Dielektrophorese einzustellen.
-
Nach
der Beschickung der Pipettenspitze 10 mit den Träger- und Pufferflüssigkeiten 3, 4 wird
die Pipettenspitze 10 (vorzugsweise gemeinsam mit der Laborpipette)
in einer Halteeinrichtung 30 positioniert, wie dies schematisch
in 1D illustriert ist. Die Halteeinrichtung 30 umfasst
ein Gestell mit einem elektrischen Anschluss 31 zur Verbindung
der Elektroden 21.1, 21.2 mit einer Stromversorgungseinrichtung.
-
Die
Trennung der Partikel 1, 2 in verschiedene Partikelfraktionen
erfolgt in drei Stufen, die in den 1D bis 1F illustriert sind. In einem ersten Schritt wird
für eine
vorbestimmte Trennzeit Tz die Pipettenspitze
in der Halteeinrichtung 30 senkrecht aufgestellt. Die untere
Pipettenspitze kann dabei in einem Gefäß oder auf einem Substrat ruhen
(nicht dargestellt). Gleichzeitig werden mit den Elektroden 21.1, 21.2 im
Manipulationsbereich hochfrequente elektrische Felder erzeugt. Die
Felder weisen in Abhängigkeit
von der konkreten Trennaufgabe typischerweise Frequenzen im Bereich
von 1 kHz bis 100 MHz und Spannungen im Bereich von 1 V bis 20 V
auf. Die Felder werden mit Wechselspannungen oder mit getakteten
Spannungen erzeugt.
-
Die
hochfrequenten elektrischen Trennfelder werden so erzeugt, dass
der Typ der ersten Zellpopulation (weiße Kreise) eine erste Partikelfraktion 5 bildet
und der Sedimentationsbewegung folgend in der Pipettenspitze 10 nach
unten sinken kann, während der
Typ der anderen Zellpopulation (schwarze Kreise) eine zweite Partikelfraktion 6 bildet
und durch positive Dielektrophorese im Manipulationsbereich festgehalten
wird. Welche Feldeigenschaften (Frequenzen, Phasen, Amplituden)
konkret einzustellen sind, um die Trennung der Partikel zu erreichen,
hängt von den
konkret verwendeten Partikeln ab. Ansteuerprotokolle zur Beaufschlagung
von Elektroden zur negativ- oder positiv-dielektrophoretischen Manipulation von
Partikeln können
vom Fachmann so gewählt werden,
wie es aus der fluidischen Mikrosystemstechnik bekannt ist, oder
durch Vorversuche ermittelt werden.
-
Die
Trennzeit bestimmt sich aus dem Unterschied der Massendichten der
Zellen (z.B. 1.05 g/cm3) und der Trägerflüssigkeit
(z.B. 0.9 g/cm3). Bei Zellgrößen im Bereich
von 5 μm
bis 30 μm
ergibt sich eine Trennzeit von bis zu rund 60 min.
-
In
einem weiteren Trennschritt (1E) wird die
sedimentierte Partikelfraktion 5 über ein vorbestimmtes Volumen
aus der Pipettenspitze 10 in ein Zielreservoir 72 (z.B.
Kompartiment einer Mikrotiterplatte) abgegeben. In dieser Phase
kann die Partikelfraktion 6 noch im Manipulationsbereich
festgehalten oder wie illustriert aus diesem heraus gespült werden.
Das Volumen zur Abgabe der Partikelfraktion 5 in das Zielreservoir
ist jedoch so bemessen, dass die Partikelfraktion 6 nicht
ebenfalls in das Zielreservoir 72 gelangt. In einem abschließenden Schritt
wird die Partikelfraktion 6 in ein weiteres Zielreservoir 73 oder einen
Abfallbehälter überführt (1F).
-
Erfindungsgemäß kann vorgesehen
sein, dass die Partikeltrennung in einer Zentrifuge beschleunigt
wird. Nach erfolgter Separation können die Partikel/Zellen in
einer oder mehreren Fraktionen aus der Pipette ausgespült werden.
-
Alternativ
zu der in 1 gezeigten Variante kann die
Pipettenspitze auch direkt in ein Gefäß gestellt werden, wobei eine
Partikelfraktion direkt in dieses Gefäß sedimentiert. Falls bei der
Trennung zweier Partikelsorten eine vollständig im Manipulationsbereich
zurückgehalten
wird und der Manipulationsbereich unmittelbar an der Pipettenspitze
beginnt, kann dann ggf. auch auf den Schritt des Aufziehens des
Separationsmediums verzichtet werden. Damit entstehen fluidisch
einfach handhabbare und mit der Labordiagnostik kompatible Systeme
mit integrierter Zellaufbereitung (Zellfraktionierung, Zellreinigung etc),
die sich zudem leicht automatisieren lassen (Pipetierautomaten).
-
Zur
Erleichterung der Einstellung der Volumina bei der Aufnahme und
Abgabe der Träger-
und Pufferflüssigkeiten 3, 4 kann
die Pipettenspitze 10 oder die Laborpipette mit einer Skalierung
versehen sein. Alternativ können
die sich senkrecht zur Längsausdehnung
des Pipettenkanals 12 erstreckenden Elektrodenstreifen
als Skalierung verwendet werden.
-
Bei
typischen Zellgrößen von
ca. 15 μm
und gegebenen Dichteunterschieden von ca. 60 kg/m3 entspricht
die im Erdfeld in der Pipettenspitze 10 wirkende Kraft
ca. 1 pN. In wässrigen
Lösungen
ergibt sich damit eine unbeeinflusste Sinkgeschwindigkeit von ca.
7.4 μm/s.
Damit werden ca. 135 s pro 1 mm Trennstrecke benötigt. Dielektrophoretische
Kräfte können leicht
im Bereich von nN bis zu mehreren 10 pN über geeignete Spannungen bzw.
Frequenzeinstellungen eingestellt kann. Soll eine Probe der Höhe h in
der Pipette vollständig
separiert werden und werden die Dielektrophorese-Kräfte bspw.
so eingestellt, dass Partikeltyp 1 ungestört und Partikeltyp 2 mit
halber Sinkgeschwindigkeit sedimentiert, so muss eine Trennstrecke
von mindestens h durchlaufen werden. Dies entspricht bei einer Probenhöhe von 1
cm einer Zeit von ca. 45 Minuten. Die erforderlichen Trennzeiten
und -wege skalieren mit dem Geschwindigkeitsverhältnis. Die (theoretische) minimale
Trennstrecke und -zeit ergibt sich für den Fall, dass eine Partikelsorte
vollständig
zurückgehalten
wird (0 cm und 22.5 min im obigem Beispiel). Es ist daher vorteilhaft
Einstellungen mit hohen Sinkgeschwindigkeitsverhältnissen zu realisieren.
-
Da
sich die dazu erforderlichen Dielektrophorese-Kräfte in engen Kanälen bei
geringen Spannungen realisieren lassen, ist es vorteilhaft mehrere/viele
Subkanäle
pro Pipettenkanal (DEP-well Technology) zu verwenden. Die Subkanäle haben zum
charakteristische Dimensionen von z.B. 300 μm.
-
Während der
Trennungsphase können
die Partikel weiteren Kräften
ausgesetzt sein, z.B. magnetischen Feldern (z.B. um die Sedimentation
zu beschleunigen) oder Ultraschall (um Partikelverklumpungen zu
vermeiden). Magnetische Kräfte
können von
außen
appliziert werden (siehe
2D) oder aber
intern mit Mikroelektroden, wie dies etwa in
DE 103 55 460 A1 gezeigt
ist. Im letzteren Fall und bei Verwendung magnetischer bzw. magnetisierbarer Partikel
(z.B. sog. Dynabeads) kann ggf. auf eine elektrische Separation
ganz verzichtet werden.
-
2 illustriert
eine abgewandelte Ausführungsform
des erfindungsgemäßen Verfahrens
zur Manipulation suspendierter Partikel 1, 2 (z.B.
biologische Zellen) in einer Trägerflüssigkeit 3.
Bei dieser Ausführungsform
besteht die Flüssigkeitshebereinrichtung
aus einer Pipettenspitze 10 und einer Elektrodeneinrichtung 20 mit
Elektroden 21.1, 21.2 (2A),
wie dies oben beschrieben ist (siehe 1A).
Im Unterschied zum oben beschriebenen Verfahren ist gemäß 2 jedoch
vorgesehen, dass die zweistufige Aufnahme der Suspensionsprobe (Trägerflüssigkeit
mit Partikeln) eine stärkere
Verschiebung der Suspensionsprobe ergibt. In einem ersten Schritt
werden die Partikel mit der Trägerflüssigkeit
in den unteren Abschnitt der Pipettenspitze 10 aufgenommen.
In einem zweiten Schritt wird aus einem Pufferreservoir 71 so
viel Pufferflüssigkeit
aufgenommen, dass die Partikel in einen Bereich oberhalb des Manipulationsbereichs
transportiert werden (2C).
-
Zur
Trennung der Partikel in verschiedene Partikelfraktionen wird die
Pipettenspitze 10 (mit der Laborpipette) in die Hal teeinrichtung 30 eingesetzt (2D). Die Partikel sedimentieren durch
den Manipulationsbereich zwischen den Elektroden 20 hindurch,
wobei mittels negativer Dielektrophorese auf die verschiedenen Partikel
verschieden starke Trennkräfte
entgegengesetzt zur Sedimentationsrichtung ausgeübt werden. Dadurch gelangt
zunächst
die Partikelfraktion 5 in das Zielreservoir 72.
Während
die Partikelfraktion 5 am Manipulationsbereich durchgelassen
wird, kann die Ansteuerung der Elektroden 21.1, 21.2 auf
eine Betriebsart geschaltet sein, bei der positive Dielektrophorese
erzeugt und die Partikelfraktion 6 im Manipulationsbereich
zurückgehalten wird.
Dadurch wird die Trennschärfe
des erfindungsgemäßen Verfahrens
erhöht.
-
2D illustriert schematisch weitere Einzelheiten
der Halteeinrichtung 30 mit dem elektrischen Anschluss 31,
der Stromversorgungseinrichtung (Generator) 32, einer Schalt-
und Kontaktelektronik 33 und einer Magnetsteuerung 34.
Mit der Magnetsteuerung 34 kann ein elektrisch schaltbarer
Magnet 35 unterhalb der Pipettenöffnung 11 der Pipettenspitze 10 eingeschaltet
werden, um eine zusätzliche
magnetische Sedimentationskraft zu erzeugen und die Absinkgeschwindigkeit
von magnetischen Partikel zu erhöhen.
-
Die
Halteeinrichtung 30 kann mit weiteren Modulen ausgestattet
sein, z.B. mit einem Antriebsmodul für den Druckkolben der Laborpipette.
Mit dem Antriebsmodul könnte
entsprechend der Funktion einer Spritzenpumpe ein leichter Volumenstrom
durch den Pipettenkanal 12 erzeugt werden, wodurch die Trennung
der Partikel vorteilhafterweise beschleunigt wird. Die Halteeinrichtung 30 kann
auch Teil einer Zentrifuge sein.
-
3 illustriert
drei Varianten der Gestaltung einer Elektrodeneinrichtung 20,
die auf der Innenwand einer Pipettenspitze 10 angeordnet
sein kann. Gemäß 3A umfasst die Elektrodeneinrichtung 20 zwei
kammförmig
ineinander greifende Elektroden 21.1, 21.2 mit
radial verlaufenden Elektrodenstreifen, die mit zwei Signalen angesteuert
werden, die eine gegenseitige Phasenverschiebung von 180° aufweisen
(+/– repräsentieren
die Phasenverschiebung 180°).
Gemäß 3B ist eine komplexere Elektrodengeometrie
vorgesehen, bei der vier kammförmige
Elektroden ineinander greifend angeordnet sind, wobei jeweils zwei
Elektrodenpaare eine relative Phasenverschiebung von 90° aufweisen.
Die in den 3A und 3B gezeigten
Gestaltungen werden vorzugsweise bei einer Pipettenspitze mit einem
zylinderförmigen
Pipettenkanal 12 realisiert (Draufsicht in den unteren
Teilen der 3A, 3B).
-
3C zeigt eine Abwandlung, bei der die Elektroden
als axial verlaufende Streifen auf der Innenwand eines konisch zulaufenden
Pipettenkanals 12 angeordnet sind. Es sind beispielsweise
vier, einander gegenüberliegende
Elektroden vorgesehen (Draufsicht im unteren Teil der 3C), die mit Signalen einer relativen
Phasenverschiebung von jeweils 90° beaufschlagt
werden. Gemäß einer
entsprechenden (nicht dargestellten) Abwandlung können auch
drei Elektroden jeweils um 120° versetzt angeordnet
und mit Signalen beaufschlagt werden, die eine gegenseitige Phasenverschiebung
von 120° aufweisen.
-
4 illustriert
eine Ausführungsform
der erfindungsgemäßen Manipulatorvorrichtung 100,
bei der als Flüssigkeitshebereinrichtung
eine Multipipette 10 mit mehreren Pipettenspitzen 10.1, 10.2, 10.3 und 10.4 vorgesehen
ist. Die schematisch illustrierte Pipette 10 ist so wie
herkömmliche
Multipipetten aufgebaut. Die Trenneinrichtung 20 umfasst
mehrere Elektrodeneinrichtungen 20.1, 20.2, 20.3 und 20.4,
die jeweils an den Pipettenspitzen 10.1, 10.2, 10.3 und 10.4 angeordnet
sind.
-
Die
Manipulation einer Suspensionsprobe erfolgt mit der in 4 gezeigten
Manipulationsvorrichtung 100 analog zu den oben beschriebenen
Verfahrensweisen. Vorteilhafterweise können mit dieser Ausführungsform
jedoch mehrere Probensuspensionen gleichzeitig getrennt werden.
Des weiteren ist diese Variante mit mehreren Pipettenspitzen pro
Pipette besonders gut für
eine Automatisierung der Partikelmanipulation geeignet.
-
5 zeigt
ein weiteres Ausführungsbeispiel der
erfindungsgemäßen Manipulationsvorrichtung 100,
bei der die Flüssigkeitshebereinrichtung
eine Zweikanal-Pipette 10 umfasst. Bei diesem Ausführungsbeispiel
ist die Trenneinrichtung 20 im Pipettenreservoir oberhalb
der Pipettenspitzen vorgesehen.
-
Die
Zweikanal-Pipette 10 weist gemäß 5A zwei
rohrförmige
Pipettenkanäle 12.1, 12.2 für die Probenaufnahme
und ein Pipettenreservoir 13 auf. Bei dieser Ausführungsform
der Erfindung ist die Elektrodeneinrichtung 20 im Pipettenreservoir 13 angeordnet.
Ausschließlich über einem
der Pipettenkanäle
(12.2) ist im oberen Bereich der Pipette 10 die Elektrodeneinrichtung 20 mit
mindestens zwei elektrischen Leitern 21.1 elektrisch isoliert
angebracht, die eine Applikation von elektrischen Wechselfelder ermöglichen.
Die Pipette 10 weist ein asymmetrisches Pipettenreservoir 13 auf.
Das Volumen des Pipettenreservoirs 13 ist über den
Elektroden 21.1 und dem Pipettenkanal 12.2 größer als
das entsprechende Volumen über
dem Pipettenkanal 12.1.
-
Die
Trägerflüssigkeit 3 im
Probenreservoir 70 enthält
zwei verschiedene Zellpopulationen 1, 2, die sich
in ihren passiven dielektrischen Eigenschaften, Form, Geometrie,
und/oder Größe unterscheiden.
-
Zur
erfindungsgemäßen Trennung
der Partikel werden gemäß 5A, B in einem ersten Schritt beide Pipettenkanäle mit der
Mischpopulation der Partikel 1, 2 gefüllt. In
einem zweiten Schritt wird zusätzlich
Pufferflüssigkeit
aus einem Pufferreservoir 71 aufgenommen (5B).
Im Ergebnis der Pufferaufnahme gelangt die Mischpopulation der Partikel 1, 2 in
den gemeinsamen Raum oberhalb der Elektroden 21.1 (5C).
-
Anschließend erfolgt
gemäß 5D die Zelltrennung. Die Partikelfraktionen 5, 6 werden
nicht wie bei den oben beschriebenen Verfahren zeitlich versetzt,
sondern räumlich
getrennt in den Pipettenkanälen
erzeugt. Zur Sedimentation kann die Pipette 10 kann in
eine Halteeinrichtung (nicht dargestellt, ähnlich wie bei 2)
eingesetzt werden.
-
Zur
Trennung wird die Elektrodeneinrichtung 20 aktiviert. Bevorzugt
durch Sedimentation oder über
einen manuellen oder mechanischen Vorschub gelangen die Zellen 1, 2 in
den Bereich der Elektrodeneinrichtung 20. Infolge der dielektrischen
Unterschiede kann der erste Partikeltyp die Elektrodeneinrichtung 20 ungehindert
passieren und in den Pipettenkanal 12.2 gelangen, während der
zweite Partikeltyp durch die Elektrodeneinrichtung 20 abgelenkt
und in den Pipettenkanal 12.1 überführt wird. Danach können die
verschiedenen Fraktionen 5, 6 in separaten Gefäßen aufgefangen
werden.
-
6 illustriert
das dielektrophoretisches Potential (mittleres E2)
für eine
Elektrodenstruktur mit 2-Ring-Elektroden 21 einem
konischem Kanal (wie in 1) im zentralen Schnitt parallel
zur Längsdehnung
der Pipettenspitze. Zusätzlich
sind zwei verschiedene Partikeltypen eingezeichnet, wobei die dunkel
gezeigten Partikel stärker
als die hell gezeigten Partikel durch negative Dielektrophorese
zurückgehalten
werden und daher nicht so schnell sedimentieren. 7 illustriert
das dielektrophoretisches Potential (mittleres E2)
für die
in 3C gezeigten Elektroden 21 (schwarz
gezeichnet) bei einer Ansteuerung mit einem Wechselfeld ("ac", 2-Phasen, links) und
mit einem Rotationsfeld ("rot", 4-Phasen, rechts).
-
Die 6 und 7 zeigen,
dass sich Partikel zwar auch in der Nähe einer einzelnen Elektrode beeinflussen
lassen. Jedoch erlaubt eine Zwei-Elektrodenanordnung definiertere
Bedingungen. Im einfachsten Fall besteht diese aus 2 Ringen (6).
Die Partikel werden im Feld dielektrophoretisch zentriert und sedimentieren
zur Spitze 11 (siehe 1A)
der Pipette 10 hin. In 7 verschwindet
in ac-Ansteuerung das elektrische Feld in der Symmetrieachse und die
Partikel erfahren eine Kraft die proportional zur 5ten Potenz des
Partikelradius ist. Damit sedimentieren kleinere Partikel unter
Bedingungen der negativen Dielektrophorese schneller als größere. In
Rotationsfeldansteuerung rot dominieren die zum Partikelvolumen
proportionalen Dielektrophorese-Dipolkräfte.
-
Für eine gleichmäßige Separation
kann es vorteilhaft sein, konstante Dielektrophorese-Kräfte in Sedimentationsrichtung
(Felder mit konstantem Gradienten sogenannte „isomotive electric fields" siehe z.B. Li et
al. "Dielectrophoretic
fluidic cell fractionation system" in "Analytica
Chimica Acta" Bd.
507, 2004, S. 151–161)
wirken zu lassen. Die Veränderung
der Sedimentationsgeschwindigkeit kann nicht nur über Dielektrophorese
oder Wanderwellendielektrophorese, sondern auch über induzierte Partikelaggregation (siehe "Electromechanics
of Particles", Cambridge University
Press, New York City, NY, 1995) und im Falle von nichtsphärischen
Objekten (z.B. Bakterien, roten Blutzellen, Thrombozyten, CNTs (carbon
nano tubes) etc.) über
Umorientierung (siehe "Electromechanics
of Particles", Cambridge
University Press, New York City, NY, 1995) im elektrischen Feld
erfolgen. Wenn diese Effekte nicht parallel, sondern alternativ
Verwendung finden, hat dies den Vorteil, dass nur besonders einfache
Elektrodenanordnungen zur Erzeugung homogener elektrischer Felder
erforderlich sind. Anstelle von der in 3C gezeigten 4-Elektrodenanordnung
können
dazu bspw. einfach zwei gegenüberliegende
und gegenphasig angesteuerte Elektroden verwendet werden, wobei
die Pipette nichtkonisch ausgeführt
sein kann. Die gegenphasige Ansteuerung kann auch durch eine einphasige
ersetzt werden, wobei sich die zweite Elektrode auf (virtueller)
Masse befindet. Dies gilt analog auch für Magnetfelder in denen ebenfalls
induzierte Aggregation bzw. Orientierung genutzt werden kann.
-
Da
sowohl die Sedimentation als auch die Dielektrophorese in Dipolapproximation
Volumenkräfte repräsentieren,
können
Zellen nach ihrer Größe besonders
effektiv fraktioniert werden, wenn die Zellen durch geeignete Elektrodengeometrie
und -ansteuerung in Bereichen mit verschwindenden Dipolkraftanteil
manipuliert werden und bspw. eine Separation gemäß Quadrupolkraftanteilen erfolgt.
-
Während die
reine Partikelaggregation zu sphärischen
Objekten nur in speziellen Feldverteilungen mit bspw. verschwindenden
Dipolmoment (7, ac) nutzbar ist, stellt die
feldinduzierte Partikelaggregation zu nichtsphärischen Objekten (z.B. Perlketten
in homogenen Felder) sowie die Reorientierung eine generelle Trennmöglichkeit
dar, da der Strömungswiderstand
von der Orientierung abhängt. Sollen
etwa nichtsphärische
voneinander bzw. von sphärischen
Partikeln getrennt werden, wird durch geeignete Frequenzwahl und
ggf. der Pufferflüssigkeit
mindestens ein Partikeltyp im Mittel mit der größeren „Halbachse" parallel bzw. antiparallel zum elektrischen
(magnetischen, optischen) Feld orientiert. Zusätzlich kann der zweite Partikeltyp
senkrecht zum ersten orientiert werden. Eine wichtige technische
Anwendung besteht bei der Separation von leitenden und halbleitenden
CNTs, die zufällig
bei der Produktion entstehen.
-
8 zeigt
Ausführungsformen
einer erfindungsgemäßen Manipulationsvorrichtung 100 mit
einer magnetischen Trennung in einer Pipettenspitze 10.
Gemäß 8A wird eine konische Pipettenspitze 10 mit
einer Magnetfeldeinrichtung 20 ausgestattet, die eine Spulen-Umwicklung 21.3 auf
der äußeren Oberfläche der
Pipettenspitze 10 umfasst. Bei der Beaufschlagung der Spulen-Umwicklung 21.3 mit
einem elektrischen Strom wird in der Pipettenspitze 10 ein
inhomogenes Magnetfeld erzeugt. Alternativ dazu wird die Pipettenspitze 10 gemäß 8B in einen entsprechenden Spuleneinsatz 22 eingesetzt, was
den besonderen Vorteil hat, dass in die Pipettenspitze 10 keine
Elektrode integriert werden muss. Übliche Pipettenmaterialien
wie Glas Keramik oder Kunststoff werden vorteilhafterweise gut vom
Magnetfeld penetriert. Die Trennung von Partikeln erfolgt analog
zu den oben beschriebenen Verfahren.
-
Analog
zu 8B kann auch für die elektrische Trennung
auf interne Elektroden in der Flüssigkeitshebereinrichtung
verzichtet werden. Dies ist wird für relativ einfach aufgebaute
Elektrodenanordnungen (bspw. in 3) bevorzugt.
Für wässrige Lösungen ist
bei äußeren Elektroden
die Verwendung von elektrisch stark polarisierbaren Pipettenmaterials (Komposite)
bevorzugt, um bei hinreichend hohen Feldfrequenzen genügend Feldstärke in die
Probe einkoppeln zu können
(elektrische Felder niedriger Frequenzen werden von den Ladungsträgern in wässrigen
Lösungen
i. A. gut abgeschirmt). Für künstliche
Partikel (wie etwa CNTs) oder Bakterien (z.B. in Trinkwasser), die
in niedrigleitfähigen
und niedrig-DK Medien supendiert werden können, kann das erforderliche
(homogene) elektrische Feld besonders einfach vollständig von
außen
erzeugt werden.
-
Die
Ausführungsführungsformen
können auch
derart modifiziert sein, dass die Magnetseparation nur auf einen
oberen Bereich der Pipettenspitze 10 beschränkt ist.
Damit werden nichtmagnetisierte Zeilchen zuerst abgetrennt. Eine
schaltbare und in der Magnetfeldstärke einstellbare Ausführung gestattet
dann sogar eine kontinuierliche Trennung der Objekte. Zusätzliche
kann die elektrische Trennung wie oben beschrieben vorgesehen sein.
-
Die
in der vorstehenden Beschreibung, den Ansprüchen und den Zeichnungen offenbarten
Merkmale der Erfindung können
sowohl einzeln als auch in Kombination für die Verwirklichung der Erfindung
in ihren verschiedenen Ausgestaltungen von Bedeutung sein.