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Die
Erfindung betrifft eine Vorrichtung und ein Verfahren bezüglich der
Anwendung der Technik der Dielektrophorese und bezieht sich insbesondere auf
eine Anordnung zum Konzentrieren oder Verdünnen oder Transportieren oder
Trennen oder Erfassen oder Charakterisieren von Teilchen.
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Die
Technik der Dielektrophorese (DEP) ist in dem Buch "Nanotechnology in
Medicine and the Biosciences",
Herausgeber RRH Comos und D W Robinson, veröffentlicht von Gordon & Breach, Amsterdam,
Kapitel 11 von Ronald Pethig, insbesondere Seiten 88 bis 93, beschrieben.
Die Dielektrophorese ist die Bewegung von Teilchen in uneinheitlichen elektrischen
Feldern. Im Unterschied zur Elektrophorese sind Ladungen an den
Teilchen selbst nicht nötig,
damit die Wirkung eintritt, und es werden Wechselstromfelder anstelle
von Gleichstromfeldern angewandt.
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Wenn
ein elektrisches Feld auf ein System einwirkt, das aus in einem
flüssigen
Medium suspendierten Teilchen besteht, wird normalerweise in jedem
Teilchen ein Dipolmoment induziert, und zwar als Ergebnis der elektrischen
Polarisationen, die an den Grenzflächen entstehen, welche ihre
Struktur bilden. Wenn das Feld uneinheitlich ist, erfahren die Teilchen
eine Translationskraft, die als dielektrophoretische Kraft bekannt
ist, in einer Größe und mit
einer Polarität
in Abhängigkeit
von den elektrischen Eigenschaften der Teilchen und ihres umgebenden
Mediums. Diese Kraft ist auch eine Funktion der Größe und der
Frequenz des angewandten elektrischen Feldes.
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Eine
Anwendung der DEP-Technik ist in der Druckschrift WO 98/04355, British
Technology Group, beschrieben, wobei man eine teilchenhaltige Flüssigkeit über eine
kammartige Anordnung von Elektroden strömen lässt, an die Signale mit verschiedenen
Frequenzen übermittelt
werden. Teilchen mit verschiedenen Eigenschaften werden vorzugsweise
in Richtung auf verschiedene DEP-Bereiche der Anordnung oder von
diesen weg gezwungen, so dass die Teilchen charakterisiert werden
können.
Es wird ein strömendes
Fluid benutzt.
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Die
DEP-Technik mit einer wandernden Welle wird auch von Pethig, Kapitel
11, Seiten 93 bis 97, beschrieben. Eine Anwendung der Technik ist
in der Druckschrift WO 97/27933, University of Texas, angegeben,
wobei man eine teilchenhaltige Flüssigkeit durch eine flache
Zelle über
eine Anordnung aus kammartigen Elektroden strömen lässt, denen Signale bei verschiedenen
Phasen übermittelt
werden, so dass durch eine Kombination aus der DEP mit wandernder
Welle, dem Schweben und dem Feldfluss eine Fraktionierung, Trennung
und Charakterisierung der suspendierten Teilchen möglich ist.
Es wird ein strömendes
Fluid benutzt.
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Bei
der üblichen
DEP (d.h. bei der Anwendung von stationären und nicht wandernden oder
rotierenden Feldern) ist es auch bekannt, gezahnte Elektroden der
Art, wie sie in 1 dargestellt ist, zu verwenden,
wo jede Elektrode 10 einen geradlinigen Grundkörper 12 mit
an gegenüber
liegenden Seiten abwechselnd angeordneten halbkreisförmigen Vorsprüngen 14 aufweist.
Alternativ können
die Vorsprünge
im Wesentlichen eine quadratische Form haben. Bei einer Elektrodenanordnung
können
die Vorsprünge 14 an
benachbarten Elektroden ausgerichtet sein, wie dargestellt ist,
oder sie können
versetzt sein. Die Elektroden werden für die übliche DEP benutzt, d.h. für nicht
wandernde Felder.
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In
Zusammenhang mit der vorliegenden Beschreibung wird der Ausdruck "Teilchen" im Sinne von biologischen
Zellen, Bakterien, Viren, parasitischen Mikroorganismen, DNA, Proteinen,
Biopolymeren und nichtbiologischen Teilchen oder irgend welchen
anderen Teilchen, die in einer Flüssigkeit suspendiert sein können, in
welcher eine dielektrophoretische Kraft induzierbar ist, zu verstehen.
Der Ausdruck bezieht sich auch auf chemische Verbindungen oder Gase,
die in einer Flüssigkeit
gelöst oder
suspendiert sind.
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Erfindungsgemäß handelt
es sich um eine dielektrophoretische Zelle mit einer Anordnung von länglichen
Elektroden und um eine Vorrichtung zum Übermitteln mindestens eines
elektrischen Signals an die Elektroden, worin jede Elektrode entlang
ihrer Längserstreckung
eine fiktive Mittelachse aufweist, wobei die Elektrode eine oder
mehrere Abweichungen von der fiktiven Mittelachse hat, und die Elektroden
in der Anordnung ausgerichtet sind.
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In
dem Shorter Oxford Dictionary, ist "Abweichung" wie folgt definierts "1. Der Vorgang des
nach unten Biegens – gebogener
Zustand; eine Biegung oder Kurve. 2 Der Vorgang des Umdrehens oder
der Zustand des Umgedrehtwerdens aus einer geraden Linie oder einem
regelmäßigen Verlauf." Bei einem Beispiel
sind die Elektroden schlangenförmig
ausgebildet, wobei ihre Krümmungen
ausgerichtet sind. Bei einem anderen Beispiel haben die Elektroden
eine Zickzackgestalt, wobei ihre Punkte ausgerichtet sind.
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Bei
einem Beispiel sind die Elektroden in einer Anordnung alle identisch
und befinden sich parallel zueinander. Bei einem anderen Beispiel ändert sich
die Gestalt der Elektroden allmählich
entlang der Anordnung.
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Bei
der Erfindung handelt es sich auch um ein dielektrophoretisches
Verfahren, wobei eine Suspension von Teilchen in einer Flüssigkeit
in die Nähe einer
Elektrodenanordnung gebracht wird, wobei die Anordnung vorgegeben
ist, und mindestes ein elektrisches Signal an die Anordnung übermittelt
wird, wodurch Teilchen in solchen Bereichen der Elektroden eingeschlossen
oder davon ausgeschlossen werden, die den maximalen Elektrodenkrümmungen entsprechen.
Alternativ können
Teilchen in solche Bereiche der Elektroden eingeschlossen oder davon ausgeschlossen
werden, die den minimalen Elektrodenkrümmungen entsprechen.
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Weiss
und Thibodeaux beschreiben in dem US-Patent 4534856 eine elektrodynamische
Methode zum Trennen von Komponenten, wie Korn und Staub in landwirtschaftlichen
Nebenprodukten. Diese Trennung von Komponenten wird durch elektrisches Aufladen
derselben oberhalb einer Anordnung von parallelen Elektroden bewirkt,
die eine elektrische Wanderwelle erzeugen. Diese Wanderwelle wird durch
Zuführen
von Energie zu den Elektroden ausgebildet, wobei ein Dreiphasen-Hochspannungsgenerator
mit 60 Hz sowie eine angelegte Spannung von bis zu 10.000 Volt und
mehr benutzt werden. Die gemäß der
US 4534856 auf die Komponententeilchen
einwirkenden Kräfte
sind ihrer Natur nach elektrostatisch und beinhalten die Wirkung
von elektrischen Feldern auf geladene Körper, anders als bei den dielektrophoretischen
Kräften,
wie sie in der vorliegenden Erfindung beschrieben werden, bei der Hochfrequenzsignale
im Bereich von etwa 1 kHz bis 100 MHz und nur mäßige Spannungen im Bereich von
1 – 20
Volt angewandt werden.
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Die
WO 97/34689 A1 beschreibt eine Vorrichtung zum Manipulieren von
Teilchen entlang von Kanälen
unter Anwendung der Dielektrophorese. 3 zeigt
eine Elektrodenanordnung des sogenannten interdigitalen, gezahnten
Typs. Dies ist keine Schlangengeometrie. Die Zahnungen sind derart ausgebildet,
dass in hohem Maße
uneinheitliche Feldmuster erzeugt werden, die Teilchen an den Rändern der
Elektrodenzahnung durch positive dielektrophoretische Kräfte leicht
einfangen können.
Die Wirkung der Zahnung besteht nicht darin, eine Verkehrssteuerung
oder ein Sieben von Teilchen hervorzurufen, was mittels der Vorrichtung
und der Verfahren der vorliegenden Erfindung erreicht werden kann.
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Die
WO 98/04355 A1 beschreibt ein Verfahren zum Charakterisieren, wie
Teilchen über
einen breiten Frequenzbereich unter Anwendung von nur einem Test
auf dielektrophoretische Kräfte
reagieren. Die Teilchen sind in einer Kammer suspendiert, die eine
Anordnung von Elektrodenelementen enthält, wie in der 3 der
WO 98/04355 A1 dargestellt ist. Jede Elektrode wird bei einer unterschiedlichen
elektrischen Frequenz mit Energie versorgt, um einen breiten Bereich
verschiedener dielektrophoretischer Kräfte zu erzeugen. Das dielektrophoretische
Ansprechen über
diesen Bereich wird dadurch bestimmt, dass geprüft wird, wie die Teilchen von
jedem Elektrodenelement entweder angezogen oder davon abgestoßen werden.
Die WO 98/04355 A1 benutzt keine elektrischen Wanderfelder oder
Verkehrssteuerungswirkungen, die bei der Anwendung der Verfahren
der Vorrichtung sowie der vorliegenden Erfindung erreicht werden.
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Die
US 5795457 A beschreibt
eine Methode zum Manipulieren von Teilchen unter Anwendung stationärer dielektrophoretischer
Kräfte – elektrische Wanderfelder
werden nicht benutzt.
1B (1)(a) in der
US 5795457 A zeigt
eine der verwendbaren Elektrodenanordnungen, nämlich die sogenannte interdigitale,
gezahnte Ausführungsform.
Dies ist die gleiche Elektrodengeometrie, wie sie in
3 der
WO 97/34689 A1 dargestellt ist, und es handelt sich hierbei, wie
oben erwähnt,
nicht um eine Schlangengeometrie. Die Zahnung ist derart ausgebildet,
dass in hohem Maße
uneinheitliche Feldmuster erzeugt werden, welche Teilchen an den
Rändern
der Elektrodenzahnung durch positive dielektrophoretische Kräfte leicht
einfangen. Die Wirkung der Zahnung besteht nicht darin, die Verkehrssteuerung
oder ein Aussieben von Teilchen zu bewirken, was durch die Verfahren
und die Vorrichtung der vorliegenden Erfindung erreicht werden kann.
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Die
Erfindung wird jetzt nur unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen
beispielhaft beschrieben, in denen Folgendes dargestellt ist:
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2 zeigt
schematisch ein dielektrophoretisches System (TDW-System) mit einer
Wanderwelle;
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3A,
B, C, D, E, F und G zeigen verschiedene Anordnungen von TWD-Elektroden;
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4A,
B, C, D, E und F sind aufeinanderfolgende Fotografien einer experimentellen
Trennung von Teilchen durch TWD;
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5 erläutert eine
Anordnung von TWD-Elektroden, die insbesondere zum Trennen von zwei
Teilchen von zwei oder mehr unterschiedlichen Arten besonders geeignet
sind;
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6 erläutert schematisch
eine alternative Anordnung von TWD-Elektroden;
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7 erläutert eine
alternative Anordnung von schlangenförmigen TWD-Elektroden;
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8 zeigt
eine Kombination. aus üblichen und
schlangenförmigen
TWD-Elektrodenanordnungen;
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9A und 9B erläutern jeweils
eine Anordnung von Elektroden für
die statische Dielektrophorese und geeignete elektrische Verbindungen für die Anordnung;
und
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10 zeigt
eine Variante der 3A.
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In 2 weist
ein Glassubstrat 20 an seiner oberen Oberfläche eine
Anordnung 22 aus schlangenförmigen Elektroden auf, von
denen jede mit einem Mehrfachverbinder 24 mit einem Signalgenerator 26 verbunden
ist. Das Substrat 20 kann mit einer Schutzabdeckung 28 (zweckmäßigerweise
mit einem zweiten Glassubstrat) abgedeckt werden, wobei die Substrate
durch einen nicht gezeigten Abstandshalter getrennt sind, um eine
dünne Zelle
zu bilden. Ein geeigneter Abstandshalter ist ein Kunststoffstreifen.
Bei einer Variante (nicht dargestellt) kann die Elektrodenanordnung 22 auf
der Schutzabdeckung 28 angebracht sein.
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Die
DEP-Zelle wird mit einer Lichtquelle 30 von unten beleuchtet
und mit einem an einen Bildschirm 36 angeschlosse nen optischen
Mikroskop/Videorekorder 32 von oben betrachtet.
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Beim
Gebrauch wird eine Suspension der Teilchen in einer Flüssigkeit
auf ein Substrat 20 aufgebracht, und die Abdeckung 28 wird
an ihre Stelle gesetzt. Der Signalgenerator 26 wird derart
eingerichtet, dass er Signale mit verschiedenen Phasen an die Elektroden
in der Anordnung 22 übermittelt.
Beispielsweise kann der Signalgenerator 26 ein Vier-Phasen-Sinussignalgenerator
sein, der mit aufeinanderfolgenden Elektroden für Signale der relativen Phase
0°, 90°, 180° und 270° verbunden
ist und dann der Zyklus über
die ganze Anordnung 22 wiederholt wird. Wie gut bekannt
ist, erzeugt eine derartige Anordnung den Zustand der DEP mit einer
Wanderwelle. Alternativ kann auf ein Teilchen eine stationäre DEP-Kraft
ausgeübt
werden, und zwar durch Übermitteln
von sinusförmigen
Signalen in Gegenphase (0°,
180°, 0°, 180°, usw.) an
aufeinanderfolgende benachbarte Elektroden.
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Die
DEP-Zelle wird durch die Lichtwelle 30 beleuchtet und auf
dem Schirm 36 betrachtet. Bei der Übertragung sind die Teilchen
als unterschiedliche Flächen
zu erkennen, und ihre Bewegung kann auf dem Schirm deutlich gesehen
werden.
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Es
ist zu bemerken, dass keine Flüssigkeitsströmung durch
die Zelle nötig
ist.
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3A bis 3F erläutern sechs
verschiedene schlangenförmige
Elektrodenanordnungen. In jeder Darstellung zeigen die Pfeile die
allgemeinen Richtungen der Vorwärtsbewegung
der Teilchen unter dem Einfluss des Wanderwellenfelds und auch die
Bereiche der Vorwärtsbewegung
innerhalb des Feldes an.
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In
der 3A weist jede Elektrode eine sinusförmige Gestalt
auf. In der Figur werden drei sinusförmige Zyklen gezeigt, wobei
die Maxima und die Minima jeder Sinuskurve ausgerichtet sind, d.h. miteinander
fluchten. Die Pfeile entsprechen jenen zyklischen Maxima und Minima
und zeigen die Bereiche, in denen sich die Teilchen vorwärtsbewegen. Drei
Pfeile weisen in eine Richtung mit zwei Pfeilen, die zwischen den
dreien liegen und in die entgegengesetzte Richtung weisen. Die Pfeile
können
als Anzeigen für
Bewegungskanäle
betrachtet werden und zeigen, dass eine gleichzeitiges Vorwärtsbewegen
in entgegengesetzten Richtungen durch verschiedene Teilchenarten
möglich
ist. Die Anordnung kann als ein Verkehrssteuersystem betrachtet
werden – die sich
in entgegengesetzten Richtungen bewegenden Teilchen kollidieren
nicht miteinander.
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Bei
bekannten (TWD)-Anordnungen der DEP mit einer Wanderwelle unter
Verwendung von im Wesentlichen geraden parallelen Elektroden ist die
allgemeine Wanderwellenkraft die bezüglich der Zeit durchschnittliche
Translationswanderkraft, welche senkrecht zu den Elektroden auftritt.
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Bei
den schlangenförmigen
Elektrodenanordnungen gemäß der Erfindung
wird die allgemeine Wanderwellenkraft durch die Pfeile dargestellt.
Die Kraft "konzentriert" die Teilchen in
bestimmten Bereichen und zerstreut sie aus anderen Bereichen, in
Abhängigkeit
von der Gestalt der Elektrode. Mit anderen Worten, die Teilchen
werden in einigen Bereichen des wandernden Feldes eingeschlossen
und von anderen Bereichen ausgeschlossen.
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Die
Bedingungen können
derart gewählt werden,
dass die interessierenden Teilchen in eine Richtung und andere Teilchen
in der Gegenrichtung wandern.
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In 3B weist
jede Elektrode eine Reihe von Halbsinuskurven auf. Alle Teilchen,
die in 3B von links nach rechts wandern,
können
als in getrennten Bändern
in der Richtung der Pfeile wandernd betrachtet werden.
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In 3C hat
jede Elektrode eine längliche "C"-Form. Alle Teilchen, die in 3C von
links nach rechts wandern, werden von den Außenbereichen des Wanderfelds
ausgeschlossen. Dies kann günstig sein,
wenn sich am Rand des Feldes eine physikalische Wand befindet, wodurch
ein Zerbrechen oder eine andere Schädigung der Teilchen und ein
Verlust in dem Verfahren vermieden wird, wenn die Teilchen an der
benachbarten Wand haften. Ein zusätzlicher Effekt besteht darin,
dass im Ergebnis ein "Verstopfen" vermindert wird,
d.h. die Neigung des Aneinanderhaftens mehrerer Teilchen in einem
Klumpen an der Wandoberfläche
kann minimiert werden.
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In
der 3D hat jede Elektrode die Form einer einzigen
Halbsinuskurve, die mit geraden Seitenarmen verbunden ist. Bei dieser
Anordnung wandern die Teilchen entsprechend dem gekrümmten Teil (hauptsächlich an
der maximalen Krümmung).
Die von rechts nach links wandernden Teilchen werden von den Bereichen
ausgeschlossen, die dem mittleren gekrümmten Teil der Anordnung entsprechen. Die
Anordnung kann als ein Einwegkanal oder ein Ventil betrachtet werden.
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3E ist ähnlich 3B,
mit der Ausnahme, dass jede Elektrode gegenüber ihren Nachbarn leicht versetzt
ist, so dass die Stellen der maximalen Krümmung jeder Elektrode entlang
paralleler Kurven angeordnet sind. Die durch die Pfeile dargestellten vier
Kanäle
sind gekrümmt,
so dass die Anordnung benutzt werden kann, um Teilchen um Ecken
herumzuführen,
die einen kleineren Radius aufweisen als es bisher möglich war.
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3F ist ähnlich 3A,
mit der Ausnahme, dass die Elektroden zickzackförmig anstatt schlangenförmig sind.
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In 3G sind
die Elektroden geradlinig in Annäherung
an die Sinuskurven von 3A, wobei jede vollständige Sinuskurve
durch fünf
gerade Linien dargestellt ist, oder die Elektroden können als
eine Zickzackform der 3F mit abgeflachten Punkten betrachtet
werden. Die Pfeile in den Kanälen
zeigen nun in die beiden möglichen
Bewegungsrichtungen, im Gegensatz zu den Pfeilen in den 3A und 3F,
weil die Teilchen im geradlinigen Teil in der Mitte der Kanäle in jenem
Bereich bleiben, unabhängig
von der Bewegungsrichtung. Die Teilchen im "Übergangs"-Bereich der Elektroden,
d.h. zwischen den Kanälen,
bewegen sich so, wie in den 3A und 3F dargestellt
ist. Deshalb sind die Anordnungen der 3A und 3F bevorzugt.
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Die
Betrachtung der 3A bis 3F zeigt,
dass ein gemeinsames Merkmal aller dieser Elektroden darin besteht,
dass sie zwei oder mehr verschiedene Krümmungen aufweisen, entweder Krümmungen
mit entgegengesetzter Richtung oder einen gekrümmten Teil und in einigen Fällen gerade Abschnitte.
Bei einem anderen Beispiel könnte
eine Elektrodenanordnung eine Reihe von C-förmigen Elektroden, d.h. mit
einer einzigen Krümmung,
aufweisen. Andere Formen von schlangenförmigen Elektroden sind gleichfalls
möglich.
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Durch
Auswahl geeigneter Formen von schlangenförmigen oder zickzackförmigen Elektrodenanordnungen
ist es jetzt deshalb möglich,
sich vorwärts
bewegende Teilchen in die Kanäle
zu führen,
sie zu Bändern
zu formen, die Teilchen von einer mechanischen Einengung an der
Flüssigkeitsströmung, zum
Beispiel von Wänden
der Vorrichtung, wegzuführen
und sie leichter um Ecken herumzuführen. Die Teilchen können in
einen besonderen Bereich des DEP-Felds eingeschlossen oder davon ausgeschlossen
werden. Dies erlaubt es, dass Teilchen in einem Wanderfeld genau
positioniert werden und so leicht erfasst werden. Zusätzlich kann
die Technik dazu benutzt werden, die Teilchen an ein mit einem Antikörper beschichtetes
Objekt oder eine derartige Oberfläche heranzuführen.
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4 erläutert eine
Teilchenbewegung, bei der die Elektrodenanordnung von 3A und
die allgemeine Anordnung von 2 benutzt
werden. Es wurden vierundsechzig sinusförmige Elektroden in einer Anordnung 22 durch
Photolithographie auf einem Objektträger 20 hergestellt
und sie wiesen eine Chromschicht auf, die mit einer Goldschicht
bedeckt war. Jede Elektrode ist etwa 10 Mikrometer breit, und der
Zwischenelektrodenabstand beträgt
etwa 30 Mikrometer in den Mittelkanalbereichen. Es wurde eine Kultur
lebender Hefezellen, die in Wasser suspendiert waren, eingesetzt.
Die Zellkonzentration betrug 10,2 Millionen Zellen pro Milliliter,
und die Leitfähigkeit
der Suspension lag bei 10,5 mS pro Meter. Vor dem Experiment wurden
die Elektroden während über einer
Stunde in ultrareines Wasser getaucht, um ihre Reinigung zu unterstützen. In
dem Experiment wurde gefunden, dass durch Übertragen eines stationären DEP-Signals mit 150 Kilohertz
als Ergebnis einer negativen DEP-Kraft
nur ein Schweben der Teilchen ohne eine Translationskomponente stattfindet.
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In
dem Experiment wurde an alle Elektroden der Anordnung 22 ein
stationäres
DEP-Signal bei einer Frequenz von 150 Kilohertz und 3 Volt von Peak zu
Peak übertragen.
Dann wurde die Suspension der Hefezellen auf die Elektroden aufgebracht
und darüber
ein Abdeckstreifen 28 angeordnet. Das Signal mit 150 Kilohertz veranlasste
die Teilchen, über
den Elektroden zu schweben und minimierte das Haften der Hefezellen.
Nach einigen Sekunden wurde ein DEP-Feld mit wanderwelle mit 50
Kilohertz und 3 Volt von Peak zu Peak angelegt. Die Hefezellen begannen
unmittelbar, sich entlang des Wanderfeldes zu bewegen und sich zu
Bändern
zu formieren, wie aus der 4A ersichtlich
ist.
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Die
großen
Pfeile zeigen die allgemeine Richtung der Bewegung der Zellen. Die
kleinen Pfeile zeigen die lokale Bewegung der Zellen, wenn sie von einem
Kanal ausgeschlossen und in einem anderen eingeschlossen werden,
so dass sie Bänder
bilden. An der linken Seite der Fotografien wurden fünf Kanäle jeweils
mit einer Kanalnummer versehen.
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4B ist
eine Fotografie, die etwa drei Sekunden nach 4A aufgenommen
wurde. Es ist zu sehen, dass sich die Zellen nach rechts bewegen
und sich in den Kanälen 2 und 4 näher zusammen
in Bandform befinden sowie von den Kanälen 1, 3 und 5 zum
großen
Teil ausgeschlossen sind.
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4C wurde
aufgenommen, nachdem die Richtung des Wanderwelienfelds geändert wurde. Die
Zellen bewegen sich nun von rechts nach links, und man sieht, dass
sich die Bänder
aus den Kanälen 2 und 4 in
die Kanäle 3 und 5 bewegen. 4D wurde
drei bis vier Sekunden später
aufgenommen, und die Wanderung in die Bänder ist noch deutlicher.
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4E zeigt
die Bänder
einige wenige Sekunden später
und erläutert,
dass die Bewegung der Zellen beginnt, in den Kanälen 3 und 5 einen
freien Bereich zu bilden, wenn sich die Zellen nach links bewegen.
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4F ist
eine Fotografie, die entlang der Kanäle weiter nach links aufgenommen
wurde, und zeigt, dass die Bänder
entlang der Kanäle
einheitlich sind.
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Die
geringe Anzahl an Zellen, welche über die Elektroden verstreut
sind, haften an dem Glas und bewegen sich nicht. Bei derart hohen
Zellkonzentrationen tritt im Allgemeinen etwas ein Haften der Zellen
ein. Dies kann durch Anwendung spezieller Beschichtungen auf dem
Glas oder durch Benutzung chemischer Mittel, wie oberflächenaktiver
Mittel oder biochemischer Zusatzstoffe, zum Beispiel von Proteinen
(wie Casein, denaturiertes Albumin) sowie durch Verwenden eines
polymeren Materials als Substrat oder durch Aufbringen eines Film
aus einem polymeren Material auf einem Glassubstrat vermindert werden.
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Die
experimentellen Ergebnisse in 4 zeigen,
dass die Teilchen entlang der Richtung des Wanderfelds zu Bändern formiert
werden können und
sich in diesen Bändern
bewegen. Es wurde gefunden, dass bei hohen Teilchenkonzentrationen
ein Wandern in Bändern
besonders wirksam ist. Somit erlaubt es die Verwendung von schlangenartigen Elektrodengeometrien,
dass sehr hohe Teilchenkonzentrationen leichter gehandhabt werden
können
als es bisher unter Anwendung von Dielektrophoresetechniken möglich war.
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Wenn
zwei Teilchenarten vorliegen, die verschiedene Eigenschaften aufweisen,
lassen sich die Bedingungen derart wählen, dass die Teilchen veranlasst
werden, ungehindert in entgegengesetzte Richtungen zu wandern, was
ein Trennen der beiden Teilchenarten ermöglicht. Die Technik arbeitet
bei niedrigen Teilchenkonzentrationen. Es wurde aber auch gefunden,
dass sie besonders wirksam ist, wenn die Aggregat-Teilchenkonzentration
sehr hoch ist, zum Beispiel Millionen oder zig Millionen von Teilchen
pro Kubikzentimeter oder mehr, beträgt. Potentielle nützliche
industrielle Anwendungen kann das Entfernen von Bakterien aus Speichelflüssigkeiten
oder Stuhl, das Entfernen von Stammzellen, Fötuszellen oder Krebszellen
aus Blut oder das Entfernen von Meningitisviren aus Rückenmarksflüssigkeit
sein. In wenigstens einigen dieser Fälle kann die Anzahl der zu entfernenden
Teilchen im Vergleich zu der Anzahl der vorhandenen Teilchen sehr
gering sein, so dass die Möglichkeit,
mit hohen Teilchenkonzentrationen zu arbeiten, eine Trennung, die
in einem praktischen Zeitraum durchgeführt werden soll, erlaubt.
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Es
wurden Experimente mit menschlichen Blutzellen unter Benutzung einer
Elektrodenanordnung, die der in den 3A und 4 gezeigten
Anordnung ähnlich
war, durchgeführt.
Die verwendeten Elektroden waren 8 μm breit und hatten in den Mittelkanalbereichen
einen Zwischenelektrodenabstand von 17 μm. Die Experimente wurden bei
sehr hohen Zellkonzentrationen mit einer 10-fachen Verdünnung des
gesamten Bluts und einer Konzentration von etwa 5 × 108 Zellen pro Milliliter (d.h. 500 Millionen Zellen
pro Kubikzentimeter) durchgeführt.
Den Elektroden wurden mehrphasige Signale zugeführt, und die Blutzellen bewegten
sich mit TWD-Kräften.
Eine Verdünnung
auf das 20-fache des ganzen Bluts (d.h. auf eine Konzentration von
etwa 2,5 × 108 Zellen pro Milliliter) erwies sich als
bevorzugt, wenn eine Trennung und nicht nur eine Bewegung der Teilchen
erwünscht
war, insbesondere dann, wenn die Konzentrationen der zu trennenden Zellen
sehr unterschiedlich waren. Die Unterschiedlichkeit der Zellkonzentrationen
war beträchtlich.
Es gab etwa 700 rote Blutzellen für jede weiße Zelle.
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Eine
besonders nützliche
Anwendung der schlangenartigen Elektrodenform beinhaltet die Technik
der Signalüberlagerung,
die in der GB-Patentanmeldung 9916848.6 und in der darauf basierenden
internationalen Anmeldung, die gleichzeitig mit der vorliegenden
Anmeldung eingereicht wurde, beschrieben ist.
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In
einem Experiment wurde eine 6-Milliliter-Probe von menschlichem
ganzen Blut in einem Lithiumheparinröhrchen gesammelt und innerhalb
einer Stunde in einer phosphatgepufferten Salzlösung, die Saccharose, Glucose,
Heparin und Calciumchlorid enthielt, auf das 40-fache verdünnt, um
eine Leitfähigkeit
der Endsuspension von 15 mS/m zu erhalten. Den schlangenartigen
Elektroden wurde Energie mit 20 kHz und 0,6 Vrms eines stationären DEP-Signals
zugeführt,
um die Blutzellen über
der Elektrodenebene schweben zu lassen, wenn sie in die Testkammer
eingeführt
wurden. Dieses DEP-Signal wurde dann gestoppt, und es wurden den
Elektroden zwei TWD-Signale zugeführt, das eine mit 50 kHz und
0,32 Vrms einer sich vorwärts
bewegenden Wanderwelle und die andere mit 400 kHz und einer 0,64 Vrms
sich umgekehrt bewegenden Wanderwelle. Der größte Teil der Blutzellen bewegte
sich rasch entlang den Kanälen
3 und 5, ähnlich
wie in dem in 4f gezeigten Fall, grundsätzlich unter
der Wirkung des 50 kHz-Signals. Eine kleine Anzahl der Blutzellen
in der Größenordnung
von 5 %oder weniger der gesamten Anzahl wurde an den Elektroden
festgehalten oder bewegte sich langsam entlang den Kanälen 2 und
4, ähnlich
dem in 4a gezeigten Fall. Eine mikroskopische Überprüfung mit
einem Objektiv mit 40-facher Vergrößerung zeigte, dass etwa 20 – 25 rote
Blutzellen festgehalten wurden oder sich in den Kanälen 2 und
4 bewegten, bezogen auf jede weiße Blutzelle. Beim erneuten
Zuführen
des stationären
DEP-Signals mit 20 kHz wurden die festgehaltenen roten Blutzellen
in die Kanäle
3 und 5 geführt,
und die größten der
weißen
Blutzellen wurden losgelöst
und bewegten sich entlang den Kanälen 2 und 4. Diese Zellen erwiesen
sich hauptsächlich
als Neutrophile und bewegten sich entlang den Kanälen 2 und
4 mit einer Geschwindigkeit in der Größenordnung von 15 Mikron pro
Sekunde. Beim Vermindern der Frequenz des umgekehrten TWD-Signals
von 400 kHz hinunter auf 150 kHz wurden die kleineren weißen Blutzellen von
den Elektroden freigegeben und wanderten entlang den Kanälen 2 und
4. Dieser Vorgang der Zelltrennung für verdünntes Blut wurde für verschiedene Grade
der Blutverdünnung
und der Zusammensetzung des Suspendiermediums wiederholt. In jedem Fall
wurden die spezielle Frequenz und die Spannungswerte, wie oben angegeben,
für die überlagerten
DEP- und TWD-Signale eingestellt, um die oben beschriebenen Ergebnisse
zu erhalten.
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Ein
anderes wertvolles Attribut der schlangenförmigen Elektrodenausbildung
besteht darin, dass sie bei einem Siebvorgang benutzt werden kann,
um die Wirksamkeit der Zelltrennung zu erhöhen. Dies wird durch einen
Zyklus von Vorgängen
erreicht, bei dem nach dem Sammeln der getrennten Subpopulationszellen
(Zielzellen) das Haupt-TWD-Signal umgekehrt wird, um jede der Zielzellen
auszusieben, die mit der Hauptmenge der Zellen entlang den Kanälen 3 und
5 mitgenommen wurde. Beim Wegführen
dieser Hauptmenge der Zellen in der umgekehrten Richtung entlang
den Kanälen
2 und 4 können
Zielzellen, die dem ersten Trennvorgang entkommen sein können, abgetrennt
werden und entlang den Kanälen
3 und 5 wandern. Dieser Vorgang kann wiederholt werden, so oft wie
es erforderlich ist, um die gewünschte
Wirksamkeit für
die Wiedergewinnung der Zielzellen und das Ausmaß der Trennung zu erreichen.
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In
der Druckschrift "Electromanipulation
and separation of cells using travelling electric fields", J. Phys. D: Appln.
Phys, 29, Seiten 2198 – 2203
(1996), beschreiben Talary et al. die Trennung von lebensfähigen und
nicht lebensfähigen
Hefezellen unter Einsatz von TWD-Elektroden. Die Größe der Hefezellen war
von der gleichen Größenordnung
wie jene der Blutzellen, und Konzentrationen von etwa 1 × 104 Zellen pro mi wurden TWD-Kräften unter
Benutzung üblicher
Elektroden mit einer Breite von 10 μm und einem Zwischenelektrodenabstand
von 10 μm
unterworfen. Aus den in der Veröffentlichung
enthaltenen Figuren kann entnommen werden, dass die Konzentrationen
in der Größenordnung
von 1 × 104 Zellen pro ml nahe an der Obergrenze für das wirksame
Manipulieren und Trennen von Zellen unter Anwendung von TWD mit üblichen
Elektrodenanordnungen lag. Dies ist vergleichbar mit der Zellkonzentration
von 2,5 × 108 Zellen pro ml, die mit schlangenförmigen Elektroden
der Anordnung in 3a angewandt wurde, was eine
Erhöhung
der Zellen pro ml auf das 25.0000-fache bedeutet. Ferner wurden
gemäß der Veröffentlichung
von Talary et al. ähnliche
Verhältnisse
verschiedener Zelltypen (d.h. lebensfähiger und nicht lebensfähiger Hefe)
manipuliert, wobei die bei der Manipulation von Ganzblutzellen unter
Verwendung von schlangenartigen TWD-Elektroden das Verhältnis von
roten Blutzellen zu weißen
Blutzellen in der Größenordnung
von 700:1 lag (eine beträchtlich
komplexere Trennung). Somit können
mittels der vorliegenden Erfindung erheblich größere Teilchenkonzentrationen
und größere Unterschiede
in der Teilchenart gehandhabt und die Teilchen getrennt werden.
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Mit
Hilfe der erfindungsgemäßen Anordnung können auch
niedrige Teilchenkonzentrationen gehandhabt und die Teilchen manipuliert,
charakterisiert und getrennt werden, und zwar mit erhöhten Steuerungsniveaus,
verglichen mit der Anwendung von geraden parallelen TWD-Elektroden.
Die Erfindung kann auf alle Bereiche der Teilchenkonzentration wirkungsvoll
angewandt werden, obwohl bei der Anwendung ihre Vorteile am deutlichsten
bei der Handhabung hoher Konzentrationen zum Ausdruck kommen.
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Die
erfindungsgemäße Technik überwindet auch
frühere
Nachteile der DEP insofern, als Teilchen, die sich entlang dem wandernden
Feld bewegen, dazu neigen können,
abzutreiben – der "fokussierende Effekt", welcher durch die
vorliegende Erfindung erreicht wird, minimiert ein solches Abtreiben. Die
Bewegung unter einem DEP-Feld kann nun von dem hydrodynamischen
Fluidstrom unterschieden werden, der ein vergleichsweise starkes
Abtreiben hervorrufen kann. Eine hydrodynamische Fluidströmung kann
durch Erwärmungseffekte
entstehen, welche durch die elektrischen Felder verursacht werden.
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5 erläutet eine
Elektrodenanordnung zum Trennen verschiedener Arten von Teilchen
mit verschiedenen Eigenschaften und verschiedenen Konzentrationen.
Die Bedingungen werden so gewählt,
dass die Teilchen durch Wandern in entgegengesetzte Richtungen auf
das gleiche Wanderfeld reagieren. Dies kann durch Ändern zum
Beispiel der Eigenschaften des angewandten Spannungssignals oder
der Dielektrizitätskonstante
oder der elektrischen Leitfähigkeit
der suspendierenden Flüssigkeit oder
durch Ändern
der Temperatur oder sogar durch Zugabe eines chemischen Stoffes
zu der suspendierenden Flüssigkeit
erreicht werden.
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Wie
aus 5 ersichtlich ist, haben die Elektroden im oberen
Teil der Figur die Form von zwei Zyklen einer Sinuskurve in Ausrichtung,
jedoch weisen die Elektroden im unteren Teil der Figur die Form
von zwei Zyklen auf, die durch einen fast geraden Teil getrennt
sind, wobei sich die Gestalt der Elektrode allmählich von der einen Form zur
anderen Form ändert.
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Bei
der Benutzung kann die Probensuspension an dem unteren Teil der
Elektrodenanordnung eingeführt
oder direkt auf die ganze Elektrodenanordnung aufgebracht werden.
Teilchen mit der höheren
Konzentration werden veranlasst, sich zum oberen Teil der Figur
in dem Mittelkanal zu bewegen, während
Teilchen mit der geringeren Konzentration dazu gebracht werden,
sich nach unten entlang den zwei Außenkanälen zu bewegen und aus dem
Mittelbereich der Anordnung abzuwandern.
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In
der Praxis können
Teilchen mit der hohen Konzentration einige Teilchen mit der niedrigen
Konzentration einfangen und sie nach oben transportieren. Dies ist
der Wirkung der DEP-Wanderwelle auf die Teilchen mit der niedrigen
Konzentration entgegengesetzt, und möglicherweise befreien sie sich selbst
und bewegen sich in die zwei Außenkanäle, wie
erforderlich – eine
wesentliche Länge
des Mittelkanals maximiert diese Möglichkeit, zum Beispiel 0,5 bis
5 cm. Um dieses Entkommen aus dem eingefangenen Zustand zu unterstützen, kann
das Feld mit der Wanderwelle intermittierend abgeschaltet werden,
was den Teilchen erlaubt, aus ihrem Band etwas herauszustreuen und
deshalb ein Entkommen der Teilchen mit der niedrigeren Konzentration
unterstützt.
Die gleiche "Siebwirkung" kann durch intermittierendes
Umkehren der Feldrichtung erreicht werden. Diese "Siebwirkung" ist besonders nützlich, wenn
mit Teilchen gearbeitet wird, die zum Zusammenklumpen neigen, wie
zum Beispiel Blutzellen.
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Die
Anordnung gemäß 5 kann
beispielsweise zum Trennen von Organismen, wie Salmonellen von nativen
E-Coli und Bakteroiden in einer Stuhlprobe oder zum Abtrennen von
Krebszellen aus Blut angewandt werden. Die Zelltrennung unter Anwendung
dieser Siebwirkung kann auch durch Benutzen anderer schlangenartiger
Elektrodengeometrien, wie jener gemäß 3A oder 3B,
erreicht werden.
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Wenn
die Forderung besteht, eine oder mehrere Arten von Teilchen in einem
Flüssigkeitsvolumen zu
trennen oder zu konzentrieren oder zu verdünnen und eine zweite Art von
Teilchen zu verwerfen, kann die Anordnung gemäß 6 benutzt
werden. Die Elektroden sind als dicke Linien, gerade oder gekrümmt, dargestellt,
jedoch ist jede Elektrode tatsächlich
eine schlangenförmige
Elektrode wie in 3A gezeigt wird.
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Die
schlangenförmigen
Elektroden sind in zwei Bereichen angeordnet. Der eine ist der Mittelbereich
A, in dem jede schlangenförmige
Elektrode eine gerade Achse aufweist, und die Achsen verlaufen parallel
und quer zu der Figur – wie
in der vergrößerten Ansicht
gezeigt wird. Der andere Bereich ist der Außenbereich B, in dem die Achsen
der schlangenförmigen
Elektroden "U"-förmig sind.
Der Außenbereich B
hat deshalb zwei Seitenarme B1 und B2, in denen die Elektrodenachsen
gerade verlaufen, und einen mittleren Verbindungsteil B3, in dem
die Elektrodenachsen gekrümmt
sind.
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Die
Suspension des Gemisches der Teilchen wird in beiden Bereichen A
und B mit den Elektroden in Kontakt gebracht, und die Trennung erfolgt
in drei Stufen:
- 1. Es werden Signale an die
Elektroden in dem Mittelbereich A gesandt, so dass Teilchen einer ersten
gewünschten
Art in der Figur nach unten wandern und sich am unteren Rand des
mittleren Elektrodenbereichs sammeln sowie Teilchen der zweiten
Art nach oben wandern und sich über
den äußeren Elektrodenbereich
B bewegen. Durch Auswahl der geeigneten Elektrodenform wandern die
Teilchen in entgegengesetzten Richtungen entlang verschiedener Kanäle.
- 2. Die Signale werden nicht mehr an die Elektroden in dem Mittelbereich
A gesandt sondern an den Außenbereich
B übermittelt,
so dass Teilchen der gewünschten
Art nach innen zu dem Innenbereich A wandern und die Teilchen der
anderen Art sich nach außen
und von den Rändern
des Bereichs B weg bewegen und verworfen werden.
- 3. Es werden die Signale zu dem Bereich B gestoppt und wieder
dem Bereich A zugeführt,
so dass sich die gewünschte
Teilchenart nach unten bewegt und am Boden des Mittelbereichs sammelt.
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Bei
einer Variante wird eine Mehrschichten-Fabrikationstechnik angewandt.
Der Innenbereich A und der Außenbereich
B werden an ihren Rändern übereinandergelegt
und durch eine dünne Isolierschicht
getrennt. Es gibt dann keinen Bereich, in dem die Teilchen eingefangen
werden können.
Für eine
erhöhte
Vielseitigkeit der Teilchenmanipulation können verschiedene Bereiche
der Elektrodenabschnitte A und B getrennt gesteuert werden.
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Wenn
die Technik der Erfindung einmal angewandt wurde, kann die ausgewählte abgetrennte oder
konzentrierte Teilchenart zu einer Stelle geführt werden, an der sie analysiert
oder durch eine weitere DEP-Analyse oder irgend eine andere Analysentechnik,
zum Beispiel eine Analysentechnik auf optischem Weg, durch Ultraschall,
auf elektrischem Weg, auf. magnetischem Weg, durch PLR, durch FISH,
usw., charakterisiert werden können.
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Bei
allen beschriebenen Anordnungen wurde darauf Bezug genommen, dass
die Flüssigkeit-Teilchen-Suspension
auf die DEP-Elektrodenanordnung aufgebracht wird. Bei einer ersten
Alternative kann die Suspension auf ein Substrat aufgebracht werden,
das die Elektrodenanordnung auf seiner gegenüberliegenden Seite trägt. Bei
einer zweiten Alternative kann die suspendierende Flüssigkeit
zuerst auf oder neben die Elektrodenanordnung aufgebracht werden,
und die Teilchen können
anschließend
eingeführt
werden. Beispielsweise könnten
in der Anordnung gemäß 5 die
Teilchen in den Mittelbereich an der Unterseite der Figur eingeführt werden.
Bei einer dritten Alternative kann die Suspension zwischen zwei
oder mehr gegenüberliegenden Elektrodenanordnungen
aufgebracht werden, die auf getrennten ebenen Substraten oder auf
einem rohrförmigen
Substrat ausgebildet worden sind. Jedoch ist keine der Anordnungen
von einer Anordnung einer Fluidströmung abhängig, wie jene, die bei üblicher DEP
benutzt wird. Es kann eine Fluidströmung verwendet werden, ist
aber kein Erfordernis.
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Eine
weitere Variante wird in 7 dargestellt. Bei allen vorhergehenden
Beispielen war der Zwischenelektrodenabstand, der in 7 mit
s angegeben ist, konstant. Jedoch nimmt bei der Variante das Marke-Raum-Verhältnis w/s
(worin w die Breite der Elektrode ist) entlang der Elektrodenanordung zu,
wie dargestellt ist.
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7B ist
eine Seitenansicht der schlangenartigen Elektroden 42 und
zeigt die Kräfte
auf ein Teilchen p. Das Ergebnis des variierenden Marke-Raum-Verhältnisses
ist derart, dass die Schwebehöhe
der Teilchen über
der Elektrodenanordnung, dargestellt durch eine Linie L, zunimmt.
Die Kräfte
auf ein Teilchen P werden aufgezeigt, d.h. eine nach oben gerichtete
Schwebekraft 1 (der wirkliche Teil der DEP-Kraft mit Wanderwelle), eine Translationskraft tw
(der imaginäre
Teil der DEP-Kraft der Wanderwelle) und die Schwerkraft g. Wenn
sich das Teilchen nach rechts bewegt, nimmt die Translationskraft
als Ergebnis des zunehmenden Marke-Raum-Verhältnisses ab. Gleichzeitig nimmt
die Schwebehöhe
der Teilchen zu, was zu einer weiteren Verminderung der Translationskraft
führt,
da das Teilchen von den Elektroden 42 weiter entfernt ist. An irgend
einer Stelle entlang der Linie L wird in Abhängigkeit von der Teilchengröße, den
relativen Komponenten der dielektrophoretischen Kraft, der elektrischen
Feldstärke
und der Elektrodengeometrie die Translationskraft null, so dass
kein weiteres Wandern stattfindet. Die Teilchen mit verschiedenen
Eigenschaften wandern deshalb über
unterschiedliche Entfernungen und bleiben in verschiedenen Positionen.
Eine Teilchentrennung ist deshalb möglich.
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Bei
einer Variante wird ein anfängliches Schweben
entweder durch Anwenden eines statischen DEP-Felds oder durch Anwenden
eines TWD-Felds bei einer Frequenz, bei welcher die Teilchen keine
Translationskraft erfahren, hervorgerufen.
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Bei
einer weiteren Variante ist es dann, wenn die Teilchen als Ergebnis
der Benutzung von Elektroden mit verschiedenem Marke-Raum-Verhältnis in verschiedenen
Bereichen einmal aufgetrennt worden sind, erwünscht, sie selektiv entfernen
zu können. 8 zeigte
eine Anordnung von Elektroden 44 mit verschiedenem Marke-Raum-Verhältnis, nämlich in diesem
Fall übliche
lineare Elektroden, die sich eng neben einer Anordnung von schlangenförmigen Elektroden 46 der
in 3B gezeigten Art (d.h. mit einem konstanten Marke-Raum-Verhältnis) befinden, für ein selektives
Entfernen von Teilchen. Die Elektrodenanordnungen können entweder
unter Anwendung von Mehrschichtentechniken oder durch Ausbilden
auf gegenüberliegenden
Substratseiten hergestellt werden. Ein Verwenden dieser zwei Elektrodenanordnungen
mit verschiedener Geometrie in Kombination erlaubt eine Teilchentrennung
als Ergebnis der unterschiedlichen Eigenschaften und dann ein selektives
Entfernen der abgetrennten Teilchen.
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Beispielsweise
können
die Teilchen eingeführt
werden, wie durch den Pfeil Idargestellt ist. Teilchen mit verschiedenen
Eigenschaften wandern über unterschiedliche
Entfernungen entlang der Anordnung der Elektroden 44 und
bleiben an verschiedenen Stellen. Diese Teilchen können dann
entlang der Kanäle "a" bis "h" durch
die Elektroden 46 entfernt werden.
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Es
existieren zahlreiche Varianten unter Einsatz verschiedener Ausführungsformen
der Schlangenform und von Kombinationen der Schlangenelektroden
mit Nicht-Schlangenelektroden. Jede der Ausführungsformen der Elektroden
gemäß den 3 und 5 kann
verwendet werden, ebenso Varianten hiervon. Die Wahl der Elektrodengeometrien hängt von
der Wahl der Anwendung ab. Ein Verändern des Marke-Raum-Verhältnisses
der Elektroden kann in Abhängigkeit
davon, welche Teilchen abgetrennt werden sollen, günstig sein.
Beispielsweise kann eine lineare oder nicht lineare Zunahme im Marke-Raum-Verhältnis benutzt
werden. Durch Anwenden dieser Varianten können Teilchen mit sehr geringen
Unterschieden getrennt und selektiv entfernt werden.
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Alle
oben beschriebenen Beispiele unter Bezugnahme auf die 2 bis 8 beziehen
sich auf eine Dielektrophorese mit Wanderwelle, obwohl die Elektrodenanordnungen
auch auf statische DEP-Felder angewandt werden können. Gemäß 9 wird ein
Satz schlangenförmiger
Elektroden dargestellt, der für
eine statische Dielektrophorese geeignet ist. Die Elektroden 48 sind "V"-förmig
und in parallelen Paaren angeordnet, wobei die Zwischenelektrodenlücke E wesentlich
größer als
die Zwischenpaarlücke P
ist. Jede Elektrode in einem Paar steht an einer Seite über die
andere Elektrode in jenem Paar vor, um die Verbindung mit den elektrischen
Kontakten 50, 52 zu erleichtern, die mit entgegengesetzten
Seiten einer Signalquelle 54 verbunden sind.
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Normalerweise
werden die Elektroden 48 und die Kontakte 50, 52 auf
einem Objektträger
aus Glas durch Photolithographie hergestellt, wobei die Elektroden 48 Goldelektroden
sind und eine Dicke von nominell 40 Mikron sowie eine Zwischenelektrodenlücke E von
auch nominell 40 Mikron aufweisen. Die Zwischenpaarlücke P liegt
nominell bei 200 – 1000 μm. Der Objektträger, der
die Elektroden trägt, wird
normalerweise mit einem Abstandshalter und einer Abdeckung, wie
in 2, zu einer Zelle ausgebildet, wobei die Kammerhöhe zwischen
500 und 300 Mikron beträgt.
Jedoch ist für
die statische Dielektrophorese gut bekannt, dass durch die Teilchensuspension
ein Strömungssystem
bereitgestellt werden muss, um eine Bewegung herbeizuführen, wie
in 9A durch den Pfeil dargestellt ist. Ein solches Strömungssystem
kann ein mechanisches System sein oder die Strömung kann durch die gut bekannte elektrohydrodynamische
Wirkung beim Zuführen
eines geeigneten elektrischen Signals zu der Elektrodenanordnung
verursacht werden.
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Wenn
das an die Elektroden 48 gegebene Signal eine solche Frequenz
aufweist, dass eine Teilchenart in einer Suspension, welche durch
die Zelle strömt,
eine starke negative DEP-Kraft erfährt, gemäß den bekannten DEP-Prinzipien,
werden solche Teilchen in Richtung des Bereichs der maximalen Krümmung der
Elektroden 48 hin konzentriert, während andere Teilchen, welche über die
Elektroden strömen
und eine viel schwächere
Kraft erfahren, relativ unbeeinflusst bleiben. Deshalb wird eine
Teilchenanreicherung erreicht.
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Die
Anordnung gemäß 3A bezieht
sich auf ein Verkehrssteuersystem, bei dem Teilchen, die in entgegengesetzte
Richtungen wandern, sich in den Kanalbereichen bewegen, wie durch
die Pfeile dargestellt ist, ohne zu kollidieren. Die 4A bis 4F zeigen
Elektroden mit der Anordnung gemäß 3A.
Diese Elektroden haben die Form sehr niedriger oder flacher Sinuskurven.
Alternativ können deutlichere
oder tiefe Sinuskurven angewandt werden, wie in 10 gezeigt
wird. Aus 10 ist klar ersichtlich, dass
das Ergebnis bei Elektroden mit einer tieferen Sinuskurve eher Übergangsbereiche, d.h.
die Bereiche zwischen den Kanälen,
sind. Es ist auch klar ersichtlich, dass die Zwischenelektrodenlücken in
der Mitte der Kanäle
deutlich größer sind
als in den Übergangsbereichen.
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Das
Ergebnis der Variationen in den Zwischenelektrodenlücken über die
Elektrodenanordnung hinweg sind regionale Schwebegradienten. In den
Kanalbereichen schweben die Teilchen höher, während sie in den Übergangsbereichen
in einer geringeren Höhe
schweben. In der Mitte der Kanäle schweben
die Teilchen am höchsten,
während
sie sich in der Mitte der Übergangsbereiche
in ihrem untersten Schwebezustand befinden. Die Wirkungen hiervon
können
für die
Trennungen sehr günstig
sein.
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Wenn
ein statisches DEP-Feld zum Schweben oder ein wanderndes DEP-Feld,
bei dem die TWD-Translationskraft für die Teilchen minimal ist, angewandt
wird, schweben die Teilchen über
den Elektroden und dem Substrat. Dies ist günstig, um die Teilchen von
dem Substrat fern zu halten sowie ein Anhaften der Teilchen und
Verstopfen zu minimieren. In der Praxis ist es deshalb bevorzugt,
vor dem Aufbringen der Teilchen ein solches Feld auszubilden. Wenn
ein solches Feld auf die Elektroden gemäß 10 angewandt
und eine Lösung
der Teilchen über
ihnen aufgebracht wird, kann nach einigen wenigen Sekunden festgestellt
werden, dass sich die Teilchen in den Übergangsbereichen zwischen
den Kanälen
konzentrieren, wobei die Teilchen aufgrund des regionalen Schwebegradienten
sich aus den Kanalbereichen hinaus bewegen. Teilchen, die stärkere Schwebekräfte erfahren,
bewegen sich schneller. Nachdem sich die Teilchen in den Übergangsbereichen
konzentriert haben und dann ein TWD-Feld angelegt worden ist, führt dies
zu Teilchen, die eine starke TWD-Translationskraft erfahren und
sich in die jeweiligen Kanäle
und entlang dieser Kanäle
bewegen. Als Ergebnis des regionalen Schwebegradienten sind die
Kanäle
hauptsächlich
frei von Teilchen. Dies ermöglicht
es, dass Teilchen unter starken TWD-Translationskräften ungehindert
entlang den Kanälen
frei wandern, wodurch die Trennungswirkung verbessert wird.
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Der
regionale Schwebegradient hat eine weitere Anwendung. Die Teilchen,
welche eine schwache TWD-Translationskraft, aber eine starke Schwebekraft
erfahren, bewegen sich entlang der dielektrophoretischen Zelle.
Jedoch ist die TWD-Translationskraft
ungenügend,
um den Schwebegradienten zu überwinden.
Die Teilchen sind somit in ihrer Bewegung auf den Übergangsbereich
beschränkt.
Dies kann benutzt werden, um diese Teilchen von den sich rasch bewegenden
Teilchen fern zu halten, die in den Kanälen eine starke TWD-Translationskraft
erfahren. Dies kann insoweit als ein sekundäres Verkehrssteuersystem betrachtet
werden, als nicht nur Teilchen, die in entgegengesetzte Richtungen
wandern, an einer gegenseitigen Beeinträchtigung gehindert werden,
sondern auch Teilchen, die sich schnell und langsam bewegen, voneinander
getrennt werden. Es können
verschiedene Elektrodengeometrien gewählt werden, um dies entweder
zu verstärken
oder zu minimieren. Bei einer weiteren Variante kann dieser regionale
Schwebegradient in Verbindung mit einer Fluidströmung benutzt werden. Eine geringe
Fluidströmung
kann in dem Kanal angewandt werden, um die Teilchen zu entfernen,
welche eine sehr schwache oder keine TWD-Translationskraft erfahren.
Die Fluidströmung
kann von einer externen Quelle an die dielektrophoretische Zelle
geführt
oder, noch eleganter, ein Signal kann an die TWD-Elektroden gesandt werden, das die Fluidströmung induziert,
wie bekannt ist. Das Ergebnis besteht darin, dass ein schwacher Fluidstrom
einen minimalen Effekt auf die Teilchen ausübt, die eine starke TWD-Translationskraft
erfahren, während
die Teilchen mit schwachen oder keinen TWD-Translationskräften sich innerhalb der Libergangsbereiche
entlang der dielektrophoretischen Zelle bewegen, wodurch in den
Kanälen
sich bewegende Teilchen nicht gestört werden. Die Bewegung der
Teilchen in einer solchen Weise mit einer hydrodynamischen Fluidströmung kann
mit irgend einer Elektrodenanordnung sowie mit oder ohne TWD-Kräften erreicht
werden.
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Wenn
die Trennungen an einer Suspension von Teilchen mit sehr verschiedenen
Konzentrationen durchgeführt
werden, ist es günstig,
die Trennung zu unterstützen,
wenn Bedingungen derart gewählt
werden können,
dass die Teilchen in einem TWD-Feld zum Wandern in entgegengesetzte
Richtungen veranlasst werden. In diesem Fall kann es günstig sein,
die Elektroden der 3A, 3F, 4 und 10 zu
modifizieren. In den dargestellten Figuren weisen die Kanäle zum Wandern
der Teilchen in entgegengesetzte Richtungen die gleiche Breite auf.
Die Breite der Kanäle
kann geändert
werden, um mehr dem Unterschied in den Konzentrationen der in den
Kanälen
wandernden Teilchen zu entsprechen. Dies macht den Einsatz der Elektrodenanordnungen
hinsichtlich der Teilchenbewegung und der Trennung wirkungsvoller
und kann beim Handhaben höherer
Konzentrationen unterstützend
sein.
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Die
Beispiele haben gezeigt, dass schlangenförmige oder zickzackförmige Elektroden
gemäß der Erfindung
benutzt werden können,
und zwar sowohl mit stationären
als auch mit wandernden elektrischen Feldern, um Teilchen aus Bereichen
der Elektrodenanordnung und somit Bereichen oder Regionen einer
Kammer anzureichern und/oder auszuschließen und/oder einzuschließen. Dies
bietet viele Anwendungen für
das Charakterisieren, Trennen und/oder Identifizieren von Teilchengruppen
oder Einzelteilchen. Es können
sowohl ein stationäres
Fluid als auch ein Fluidstrom in Verbindung mit den Elektrodenanordnungen
sowie andere externe Kräfte
benutzt werden. Es können
sowohl positive als auch negative dielektrophoretische Kräfte mit
den Elektroden angewandt werden. Eine kontinuierliche Trennung von
Teilchen mit sehr hohen Konzentrationen ist möglich. Durch den Einsatz dieser
Elektrodenanordnungen und der hauptsächlich negativen DEP-Kräfte tritt
kein Einfangen von Zellen auf: So können relativ kleine Elektrodenanordnungen
verwendet werden, um sehr hohe Teilchenkonzentrationen und sehr
große
Volumina zu handhaben, wobei eine Anreicherung der Probe erfolgt.