CN107974400A - 一种耦合介电泳和空间分离的微流控细胞分选芯片及方法 - Google Patents

一种耦合介电泳和空间分离的微流控细胞分选芯片及方法 Download PDF

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姚洁
陈景煊
曹晓东
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    • C12M47/04—Cell isolation or sorting

Abstract

本发明属于细胞分选技术领域，公开了一种耦合介电泳和空间分离的微流控细胞分选芯片及方法。所述微流控细胞分选芯片包括主通道及设置在主通道两侧的电极，主通道内设置多个横向的收缩膨胀结构。在分选芯片的电极施加交流电场，不同的细胞因自身介电性质的差异在交流电场中产生不同的介电力，从而在主通道内发生程度不同的偏移；与此同时，流动的细胞还受到因主通道收缩膨胀结构而产生的横向迁移力，这两种作用的耦合导致不同种类的细胞从不同出口流出，实现细胞的分选。本发明解决了传统单一使用介电泳进行细胞分选所面临的不同细胞介电差异不明显的难题，同时也解决了单一利用空间分离技术进行细胞分选所用芯片通道太长的缺陷。

Description

一种耦合介电泳和空间分离的微流控细胞分选芯片及方法
技术领域
本发明属于细胞分选技术领域，具体涉及一种耦合介电泳和空间分离的微流控细胞分选芯片及方法。
背景技术
现阶段商品化的细胞分选产品主要分两类。第一类为流式细胞分选。荧光标记的细胞悬液在鞘液的包裹和推动下，通过超高频压电晶体，使喷出的混合液断裂为均匀的液滴，在激光束的照射下，根据细胞的散射光和荧光强度实现分选，该方法的缺点是容易发生细胞污染且设备庞大。第二类为免疫磁珠分选。将磁珠与细胞通过特异性抗体结合，磁珠携带与之结合的细胞或吸附于分离柱上，或因重量和大小差异与未结合磁珠的细胞分开，从而实现阳性细胞或阴性细胞的分离，该方法的缺点是免疫磁珠标记会降低细胞活性，妨碍分选后的细胞进一步的生物学表征和测试。
微流控芯片是一个多学科交叉的新兴领域,它借助微机电加工、生物、化学和物理等相关原理和技术，将样品制备、反应、分离和检测等基本操作单元集成在一块几平方厘米的芯片上，由微通道形成网络，以可控流体贯穿整个系统，用以实现常规化学或生物实验室的各种功能。基于微流控芯片的细胞分选具有通量高，可持续性强，便携和杜绝细胞污染等优点。目前，微流控芯片内细胞分选方法主要分为生物化学方法和物理方法两大类。生物化学方法指的是选择特异性抗体对细胞表面表达的标志物进行特异性的抗原抗体吸附，从而分选富集目标细胞。根据分选富集目标细胞的不同可分为阳性选择及阴性选择。物理方法指的是在外力场(例如磁场、电场、流体场、超声波等)的作用下，利用细胞间的物理特性差异(大小、变形性、密度、介电性等)进行分选。根据分选作用力的来源可将物理方法分为流体动力分选、介电泳分选、声动力分选、磁场力分选等。
微流控介电泳细胞分选是指在微流控芯片中外加不均匀电场对介电特性不同的细胞进行分离。介电泳分选细胞具有较高的特异性，并且分选的细胞能保持高活性。Becker等使用交叉性微电极阵列芯片成功利用介电泳进行了人类癌细胞与血细胞之间的分选，随后在该芯片内从人全血中分选出了人白血病细胞(HL-60)和腺癌细胞(MDA-231)，分选速度为103cells/s。
基于空间分离的微流控细胞分选是由通道中收缩膨胀结构产生的横向迁移力将不同的细胞迁移至两侧或中间的平衡位置，以此达到细胞分离的效果。空间分离效应具有操作简便，聚焦性能好和无需后续化学除杂等特点，一般用于细胞分选前期的粗分选。其缺点是芯片通道需足够长才能达到较理想的分选效果，因而芯片尺寸较大。
发明内容
针对以上现有技术存在的缺点和不足之处，本发明的首要目的在于提供一种耦合介电泳和空间分离的微流控细胞分选芯片。
本发明的另一目的在于提供一种耦合介电泳和空间分离的微流控细胞分选方法。
本发明目的通过以下技术方案实现：
一种耦合介电泳和空间分离的微流控细胞分选芯片，所述微流控细胞分选芯片包括主通道及设置在主通道两侧的电极，所述主通道内设置多个横向的收缩膨胀结构。
优选地，所述主通道的长度为5～8mm。
所述主通道的收缩膨胀结构或电极的数目根据分选效果的好坏可以减少或增加，优选地，所述主通道内收缩膨胀结构的数目为4～8个，所述电极的数目为两侧各设置1～2个。
所述芯片的主通道高度和电极厚度相同或差别微小，且主通道高度和电极厚度均大于分选细胞的直径。优选地，所述主通道高度和电极厚度为20～200um。
一种耦合介电泳和空间分离的微流控细胞分选方法，包括如下步骤：
在上述微流控细胞分选芯片的电极施加交流电场，不同的细胞因自身介电性质的差异在交流电场中产生不同的介电力，从而在主通道内发生程度不同的偏移；与此同时，流动的细胞还受到因主通道收缩膨胀结构而产生的横向迁移力(即空间分离效应)，这两种作用的耦合导致不同种类的细胞从不同出口流出，进而实现细胞的分选。
优选地，所述在电极施加交流电场的电压范围为5～30V，频率范围为100KHz～500MHz。
对于非细胞的带电微粒(直径在几十微米)本发明同样适用。
相对于现有技术，本发明具有如下优点及有益效果：
(1)本发明提供了一种在细胞介电特性差异不明显的情况下仍能用介电泳以高的响应性和可靠性分选细胞的芯片及方法装置。
(2)本发明解决了传统单一使用介电泳进行细胞分选所面临的不同细胞介电差异不明显的难题，同时也解决了单一利用空间分离技术进行细胞分选所用芯片通道太长的缺陷。
附图说明
图1为本发明实施例1的一种耦合介电泳和空间分离的微流控细胞分选芯片的结构示意图。
图2为本发明实施例1的一种耦合介电泳和空间分离的微流控细胞分选芯片主通道的结构尺寸示意图。
图3为本发明实施例1中用于比较的主通道为平行通道，无收缩膨胀结构的介电泳微流控细胞分选芯片的结构示意图。
图4为将兔血红细胞RBC和肺癌细胞PC-9注入本发明实施例1的分选芯片后，施加交流电信号前细胞在通道中的分布图。
图5为将兔血红细胞RBC和肺癌细胞PC-9注入本发明实施例1的分选芯片后，施加交流电信号前细胞在出口三通道中的分布图。
图6为将兔血红细胞RBC和肺癌细胞PC-9注入本发明实施例1的分选芯片后，施加交流电信号后细胞在通道中的分布图。
图7为将兔血红细胞RBC和肺癌细胞PC-9注入本发明实施例1的分选芯片后，施加交流电信号后细胞再出口三通道中的分布图。
图8为将兔血红细胞RBC和肺癌细胞PC-9注入用于比较的平行通道芯片后，施加交流电信号前细胞在通道中的分布图。
图9为将兔血红细胞RBC和肺癌细胞PC-9注入用于比较的平行通道芯片后，施加交流电信号后细胞在通道中的分布图。
图10为将兔血红细胞RBC和肺癌细胞PC-9注入用于比较的平行通道芯片后，施加交流电信号后细胞在出口三通道中的分布图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
本实施例的一种耦合介电泳和空间分离的微流控细胞分选芯片，其结构示意图如图1所示。由玻璃基底①、玻璃基底上的主通道②及主通道两侧的电极③构成。所述主通道含有8个收缩膨胀结构，并在主通道两侧各设置1个厚度为100um的电极。所述主通道的高度为100um，长度为8mm，通道的收缩部位的宽度为200um和膨胀部位的宽度为600um，膨胀部位在通道一侧的形状为半径R为200um的半圆，其结构尺寸示意图如图2所示。
本实施例的微流控细胞分选芯片通过如下方法制备得到：
以导电碳油墨为材质，采用丝网印刷的方法在浮法玻璃基底材料上制备微电极(电极厚100um)；以聚二甲基硅氧烷(PDMS)为材质，通过微加工(MEMS)的方法制作主通道，然后将含PDMS主通道和碳电极的玻璃基底通过氧等离子体处理精准对位封接，得到所述微流控细胞分选芯片。
采用本实施例的微流控细胞分选芯片对细胞进行分选的效果测试，并与主通道为平行通道，无收缩膨胀结构的介电泳微流控细胞分选芯片(结构示意图如图3)进行比较，具体步骤如下：
将人肺癌细胞(PC-9)和兔血红细胞(RBC)的混合溶液以一定的流速(15ul/h)注入到上述制备的两种微流控细胞分选芯片中。在电极两端接上信号发生器，将信号发生器调到合适的电信号(选择方波或正弦波，电压选择15v，频率选择900kHz，待细胞稳定流动后，开启或关闭信号发生器，在显微镜下观察细胞的运动轨迹和状态。
经观察，本实施例耦合介电泳和空间分离的微流控细胞分选芯片，关闭信号发生器即未接入电信号时，PC-9肺癌细胞和兔血红细胞均随机分布在主通道中(如图4)和三出口处(如图5)。说明低流速下，没有介电泳的加入，微通道中的空间分离效应不明显，PC-9肺癌细胞和兔血红细胞受到的横向迁移力差异甚微，两者的运动轨迹不能发生显著差异。开启信号发生器即接入电信号时，PC-9肺癌细胞向通道中央迁移，而兔血红细胞向通道两侧迁移(如图6)，PC-9肺癌细胞和兔血红细胞的运动轨迹有明显差异，导致PC-9肺癌细胞从中间的出口流出，兔血红细胞从两侧的出口流出(如图7)。这说明低流速下，介电泳的引入，使得此时微通道中的细胞同时受到介电力和空间分离效应的共同作用。尽管PC-9肺癌细胞和兔血红细胞具有较小的介电差异，PC-9的细胞直径也仅仅是兔血红细胞的两倍，介电泳和空间分离效应的耦合却进一步扩大了PC-9肺癌细胞和兔血红细胞的物理差异，使得两种细胞横向偏移距离不同，从而将两者的运动轨迹分开，实现两者的分选。而采用平行通道，无收缩膨胀结构的介电泳微流控细胞分选芯片，关闭信号发生器即未接入电信号时，PC-9肺癌细胞和兔血红细胞随机分布主通道中和三出口处(如图8)。说明低流速下，没有介电泳效应与空间效应，微通道对细胞聚焦没有影响。当微通道的接入电信号时，PC-9肺癌细胞和兔血红细胞均往通道两侧聚集(如图9)和两侧出口处(如图10)。说明低流速下，没有空间效应下，微通道的细胞只受到介电泳的作用，由于PC-9肺癌细胞和兔血红细胞具有较小的介电差异，因此两种细胞均横向偏移至微通道两侧，两者的运动轨迹不能发生显著差异。
实施例2
本实施例的一种耦合介电泳和空间分离的微流控细胞分选芯片，由玻璃基底、玻璃基底上的主通道及主通道两侧的电极构成。所述主通道含有8个收缩膨胀结构，并在主通道两侧各设置1个厚度为130um的电极。所述主通道的长度为8mm，高度为130um，通道的收缩部位的宽度为200um和膨胀部位的宽度为600um，膨胀部位在通道一侧的形状为半径为200um的半圆。
本实施例的微流控细胞分选芯片通过如下方法制备得到：
以导电碳油墨为材质，采用丝网印刷的方法在浮法玻璃基底材料上制备微电极(电极厚130um)；以聚二甲基硅氧烷(PDMS)为材质，通过微加工(MEMS)的方法制作主通道，然后将含PDMS主通道和碳电极的玻璃基底通过氧等离子体处理精准对位封接，得到所述微流控细胞分选芯片。
采用本实施例的微流控细胞分选芯片对细胞进行分选的效果测试，具体步骤如下：
将人乳腺癌细胞(MCF-7)和兔血红细胞(RBC)的混合溶液以一定的流速(15ul/h)注入到上述制备的微流控细胞分选芯片中。在电极两端接上信号发生器，将信号发生器调到合适的电信号(选择方波或正弦波，电压选择20v，频率选择500kHz，待细胞稳定流动后，开启信号发生器，在显微镜下观察细胞的运动轨迹和状态。
经观察，开启信号发生器即接入电信号时，MCF-7乳腺癌细胞向通道中央迁移，而兔血红细胞向通道两侧迁移，MCF-7乳腺癌细胞和兔血红细胞的运动轨迹有明显差异，导致MCF-7乳腺癌细胞从中间的出口流出，兔血红细胞从两侧的出口流出。这说明低流速下，介电泳的引入，使得此时微通道中的细胞同时受到介电力和空间分离效应的共同作用。尽管MCF-7乳腺癌细胞和兔血红细胞具有较小的介电差异，MCF-7乳腺癌细胞的细胞直径也仅仅是兔血红细胞的三倍，介电泳和空间分离效应的耦合却进一步扩大了MCF-7乳腺癌细胞和兔血红细胞的物理差异，使得两种细胞横向偏移距离不同，从而将两者的运动轨迹分开，实现两者的分选。
实施例3
本实施例的一种耦合介电泳和空间分离的微流控细胞分选芯片，由玻璃基底、玻璃基底上的主通道及主通道两侧的电极构成。所述主通道含有4个收缩膨胀结构，并在主通道两侧各设置1个厚度为150um为电极。所述主通道的长度为6mm，高度为150um，通道的收缩部位的宽度为200um和膨胀部位的宽度为600um，膨胀部位在通道一侧的形状为半径为200um的半圆。
本实施例的微流控细胞分选芯片通过如下方法制备得到：
以导电碳油墨为材质，采用丝网印刷的方法在浮法玻璃基底材料上制备微电极(电极厚150um)；以聚二甲基硅氧烷(PDMS)为材质，通过微加工(MEMS)的方法制作主通道，然后将含PDMS主通道和碳电极的玻璃基底通过氧等离子体处理精准对位封接，得到所述微流控细胞分选芯片。
采用本实施例的微流控细胞分选芯片对细胞进行分选的效果测试，具体步骤如下：
将人肺癌细胞(PC-9)和兔血红细胞(RBC)的混合溶液以一定的流速(15ul/h)注入到上述制备的微流控细胞分选芯片中。在电极两端接上信号发生器，将信号发生器调到合适的电信号(选择方波或正弦波，电压选择15v，频率选择1MHz，待细胞稳定流动后，开启信号发生器，在显微镜下观察细胞的运动轨迹和状态。
经观察，本实施例的一种耦合介电泳和空间分离的微流控细胞分选芯片，开启信号发生器即接入电信号时，PC-9肺癌细胞向通道中央迁移，而兔血红细胞向通道两侧迁移，PC-9肺癌细胞和兔血红细胞的运动轨迹有明显差异，导致PC-9肺癌细胞从中间的出口流出，兔血红细胞从两侧的出口流出。这说明低流速下，介电泳的引入，使得此时微通道中的细胞同时受到介电力和空间分离效应的共同作用。尽管PC-9肺癌细胞和兔血红细胞具有较小的介电差异，PC-9的细胞直径也仅仅是兔血红细胞的两倍，介电泳和空间分离效应的耦合却进一步扩大了PC-9肺癌细胞和兔血红细胞的物理差异，使得两种细胞横向偏移距离不同，从而将两者的运动轨迹分开，实现两者的分选。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其它的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种耦合介电泳和空间分离的微流控细胞分选芯片，其特征在于：所述微流控细胞分选芯片包括主通道及设置在主通道两侧的电极，所述主通道内设置多个横向的收缩膨胀结构。
2.根据权利要求1所述的一种耦合介电泳和空间分离的微流控细胞分选芯片，其特征在于：所述主通道的长度为5～8mm。
3.根据权利要求1所述的一种耦合介电泳和空间分离的微流控细胞分选芯片，其特征在于：所述主通道内收缩膨胀结构的数目为4～8个，所述电极的数目为两侧各设置1～2个。
4.根据权利要求1所述的一种耦合介电泳和空间分离的微流控细胞分选芯片，其特征在于：所述主通道高度和电极厚度为20～200um。
5.一种耦合介电泳和空间分离的微流控细胞分选方法，其特征在于包括如下步骤：
在权利要求1～4任一项所述的微流控细胞分选芯片的电极施加交流电场，不同的细胞因自身介电性质的差异在交流电场中产生不同的介电力，从而在主通道内发生程度不同的偏移；与此同时，流动的细胞还受到因主通道收缩膨胀结构而产生的横向迁移力，这两种作用的耦合导致不同种类的细胞从不同出口流出，进而实现细胞的分选。
6.根据权利要求5所述的一种耦合介电泳和空间分离的微流控细胞分选方法，其特征在于：所述在电极施加交流电场的电压范围为5～30V，频率范围为100KHz～500MHz。
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