CN113262828A - 一种结合磁泳与介电泳的血细胞微流控分离装置及方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种结合磁泳与介电泳的血细胞微流控分离装置及方法，本发明装置包括：微通道、两个进液口、四个出液口、永磁体、铁磁体、两对微电极。本装置按照样品流动方向依次设置磁泳分离区域和介电泳分离区域，其中，磁泳分离区域利用永磁体产生磁场，实现红细胞和血小板混合样品与循环肿瘤细胞和白细胞混合样品的分离。介电泳分离区域利用不对称孔结构，产生高梯度不均匀电场，分别实现红细胞与血小板的分离，以及循环肿瘤细胞与白细胞的分离。本发明以磁泳作为介电泳分离的预富集阶段实现一级分离，并利用介电泳实现二级分离，从而实现血液样品中循环肿瘤细胞、红细胞、血小板和白细胞的连续分离，无需预先标记细胞样品，不影响细胞生理活性。

Description

一种结合磁泳与介电泳的血细胞微流控分离装置及方法

技术领域

本发明涉及细胞分离技术领域，具体而言，尤其涉及一种结合磁泳与介电泳的血细胞微流控分离装置及方法。

背景技术

细胞的分离是细胞生物学研究和许多诊断以及治疗方法中必不可少的步骤。因为血液是一种信息极其丰富、易于获取的组织，所以目前许多的诊断测试依赖于分离的血液成分，如白细胞是几项血液学测试和DNA测序所必需的。血液成分也可用于治疗学，手术过程中经常需要输入纯化的血小板。血液中的一些特殊细胞还常常预示着某种疾病，例如单核红细胞是红细胞异常转换相关疾病标志物。再比如用常规临床筛查方法检测出原发性肿瘤之前，就可以在患者体内发现循环肿瘤细胞这一稀有细胞。因此，有必要从血液中分离出一些特殊细胞进行准确的相关性分析。

微流控芯片是进行细胞分离的技术之一，其可以在一个小型化的平台上完成对如细胞这样的微小颗粒的精确操控。微流控细胞分离技术可以分为基于标记技术的和基于无标记技术两种类型。基于标记技术的细胞分离技术包括荧光标记细胞分离和磁珠标记细胞分离等。被荧光标记的细胞，其收集的散射和荧光数据可用来分析鉴定细胞类型或基因表达。被磁珠标记的细胞，在外加磁场的环境下会受到磁力的作用，有助于通过磁泳来进行细胞分离。而基于无标记技术的细胞分离技术无需预先标记细胞样品，依据细胞特异性物理差异，如形状、大小、密度、介电特性和磁特性等特征实现分离。下面主要介绍两种无标记分离技术，基于介电泳的分离技术和基于磁泳的分离技术。

介电泳是指可极化的颗粒在不均匀电场中产生的运动。其中，介电泳力的大小与颗粒的粒径尺寸成正比，介电泳力的方向由颗粒的介电性质决定。当颗粒的极化率高于溶液的极化率，颗粒在正介电泳力的作用下向不均匀电场强度较强的区域移动。反之，当颗粒的极化率低于溶液的极化率，颗粒会受到负介电泳力的作用，并向不均匀电场强度较弱的区域移动。因此，在高梯度不均匀电场中，不同尺寸和材质的颗粒(如细胞)在介电泳力的作用下产生不同的运动轨迹，从而移动至不同的收集通道实现介电泳分离。磁泳是指某种颗粒在磁场中迁移的现象。其中，磁泳力的大小与颗粒的粒径尺寸成正比，磁泳力的方向由颗粒与周围介质磁化率的差异决定。当颗粒的磁化率高于周围介质的磁化率，在正磁泳力的作用下，颗粒会向磁通密度的梯度较高的区域移动。反之，如果颗粒的磁化率低于周围介质的磁化率，则会受到负磁泳力，并向磁通密度的梯度较低的区域移动。因此，与介电泳类似，颗粒(如细胞)在磁泳力的作用下移动至不同的收集通道以实现分离。

一毫升血液中大约含有几百万个白细胞和几十亿个红细胞，但却只有1到10个循环肿瘤细胞。血液中类似于循环肿瘤细胞的其他稀有细胞还有造血干细胞和循环胎儿细胞等。由于这些细胞在血液中的浓度很低，所以其检测和分析具有一定难度。如果能从血液中分离出红细胞、白细胞等高浓度细胞，将给循环肿瘤细胞的治疗带来极大的便利。

发明内容

根据上述提出的技术问题，而提供一种结合磁泳与介电泳的血细胞微流控分离装置及方法。本发明装置按照样品流动方向依次设置磁泳分离区域和介电泳分离区域，可实现血液样品中循环肿瘤细胞、红细胞、血小板和白细胞的连续分离，无需预先标记细胞样品，不影响细胞生理活性。

本发明采用的技术手段如下：

一种结合磁泳与介电泳的血细胞微流控分离装置，包括：微通道层、微电极层以及磁体层；

微通道层包括沿样品流动方向依次设置的主通道、与主通道连通的第一次级通道和第二次级通道；第一次级通道的一侧壁开设有第一通孔，另一侧壁开设有第二通孔；第二次级通道的一侧壁开设有第三通孔；另一侧壁开设有第四通孔；第一通孔和第二通孔组成一个不对称孔结构，第三通孔和第四通孔组成另一个不对称孔结构；

微电极层包括第一微电极、第二微电极、第三微电极以及第四微电极；第一微电极通过第一通孔与第一次级通道连通，第二微电极通过第二通孔与第一次级通道连通，第一微电极和第二微电极通过第一通孔和第二通孔在第一次级通道处形成第一高梯度不均匀电场；第三微电极通过第四通孔与第二次级通道连通，第四微电极通过第三通孔与第二次级通道连通，第三微电极和第四微电极通过第四通孔和第三通孔在第二次级通道处形成第二高梯度不均匀电场；

磁体层包括铁磁体和永磁体，永磁体设置在主通道的一侧；铁磁体设置在主通道与永磁体之间，且紧贴主通道侧壁。

进一步地，所述第一次级通道和第二次级通道分别成一定角度的与所述主通道的一端连通，所述主通道的另一端分别连通有第一进液口和第二进液口，第一进液口和第二进液口之间设置有第一夹角。

进一步地，所述第一次级通道的后端连通有第一出液口和第二出液口，第一出液口和第二出液口之间设置有第二夹角；所述第二次级通道的后端连通有第三出液口和第四出液口，第三出液口和第四出液口之间设置有第三夹角。

进一步地，所述第一通孔的宽度小于所述第二通孔的宽度；所述第三通孔的宽度小于所述第四通孔的宽度；所述第一高梯度不均匀电场的强度取决于第一通孔和第二通孔的宽度比；所述第二高梯度不均匀电场的强度取决于第三通孔和第四通孔的宽度比。

进一步地，所述永磁体的长度大于所述铁磁体的长度。

进一步地，所述铁磁体和所述永磁体设置在所述主通道靠近所述第二次级通道的一侧。

本发明还提供了一种基于上述血细胞微流控分离装置的血细胞微流控分离方法，包括如下步骤：

S1、将血细胞微流控分离装置放入等离子清洗机清洗两分钟；

S2、用导线连接微电极层和交流稳压电源，打开交流稳压电源，调整电压与频率，对微电极层进行供电；

S3、用注射泵在所述第一进液口和第二进液口中同时注入血液样品和鞘液；

S4、用显微镜观察血细胞分离效果，在磁泳分离区域，适当调整血液样品和鞘液流速之比，提高一级分离效率。在介电泳分离区域，适当调整电压与频率，提高二级分离效率。

进一步地，所述磁泳分离区域为主通道内的区域；所述介电泳分离区域为所述第一次级通道和所述第二次级通道内的区域。

较现有技术相比，本发明具有以下优点：

本发明提供的结合磁泳与介电泳的血细胞微流控分离装置及方法，以磁泳作为介电泳分离的预富集阶段实现一级分离，并利用介电泳实现二级分离，从而实现血液样品中循环肿瘤细胞、红细胞、血小板和白细胞的连续分离，无需预先标记细胞样品，不影响细胞生理活性。

基于上述理由本发明可在细胞分离等领域广泛推广。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图做以简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明装置结构示意图。

图2为本发明装置中不对称孔结构的局部俯视图。

图中：1、微通道层；10、主通道；100、第一进液口；101、第二进液口；11、第一次级通道；110、第一出液口；111、第二出液口；12、第二次级通道；120、第三出液口；121、第四出液口；2、铁磁体；3、永磁体；40、第一通孔；41、第二通孔；42、第三通孔；43、第四通孔；50、第一微电极；51、第二微电极；52、第三微电极；53、第四微电极；60、第一夹角；61、第二夹角；62、第三夹角。

具体实施方式

需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。以下对至少一个示例性实施例的描述实际上仅仅是说明性的，决不作为对本发明及其应用或使用的任何限制。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

除非另外具体说明，否则在这些实施例中阐述的部件和步骤的相对布置、数字表达式和数值不限制本发明的范围。同时，应当清楚，为了便于描述，附图中所示出的各个部分的尺寸并不是按照实际的比例关系绘制的。对于相关领域普通技术人员己知的技术、方法和设备可能不作详细讨论，但在适当情况下，所述技术、方法和设备应当被视为授权说明书的一部分。在这里示出和讨论的所有示例中，任向具体值应被解释为仅仅是示例性的，而不是作为限制。因此，示例性实施例的其它示例可以具有不同的值。应注意到：相似的标号和字母在下面的附图中表示类似项，因此，一旦某一项在一个附图中被定义，则在随后的附图中不需要对其进行进一步讨论。

在本发明的描述中，需要理解的是，方位词如“前、后、上、下、左、右”、“横向、竖向、垂直、水平”和“顶、底”等所指示的方位或位置关系通常是基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，在未作相反说明的情况下，这些方位词并不指示和暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位或者以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明保护范围的限制：方位词“内、外”是指相对于各部件本身的轮廓的内外。

为了便于描述，在这里可以使用空间相对术语，如“在……之上”、“在……上方”、“在……上表面”、“上面的”等，用来描述如在图中所示的一个器件或特征与其他器件或特征的空间位置关系。应当理解的是，空间相对术语旨在包含除了器件在图中所描述的方位之外的在使用或操作中的不同方位。例如，如果附图中的器件被倒置，则描述为“在其他器件或构造上方”或“在其他器件或构造之上”的器件之后将被定位为“在其他器件或构造下方”或“在其位器件或构造之下”。因而，示例性术语“在……上方”可以包括“在……上方”和“在……下方”两种方位。该器件也可以其他不同方式定位(旋转90度或处于其他方位)，并且对这里所使用的空间相对描述作出相应解释。

此外，需要说明的是，使用“第一”、“第二”等词语来限定零部件，仅仅是为了便于对相应零部件进行区别，如没有另行声明，上述词语并没有特殊含义，因此不能理解为对本发明保护范围的限制。

如图1所示，本发明提供了一种结合磁泳与介电泳的血细胞微流控分离装置，包括：用于包含血细胞的血液样品流过的微通道层1、微电极层以及磁体层；

微通道层1包括沿样品流动方向依次设置的主通道10、与主通道10连通的第一次级通道11和第二次级通道12；第一次级通道11的一侧壁开设有第一通孔40，另一侧壁开设有第二通孔41；第二次级通道12的一侧壁开设有第三通孔42；另一侧壁开设有第四通孔43；第一通孔40和第二通孔41组成一个不对称孔结构，第三通孔42和第四通孔43组成另一个不对称孔结构；

微电极层包括第一微电极50、第二微电极51、第三微电极52以及第四微电极53；第一微电极50通过第一通孔40与第一次级通道11连通，第二微电极51通过第二通孔41与第一次级通道11连通，第一微电极50和第二微电极51通过第一通孔40和第二通孔41在第一次级通道11处形成第一高梯度不均匀电场；第三微电极52通过第四通孔43与第二次级通道12连通，第四微电极53通过第三通孔42与第二次级通道12连通，第三微电极52和第四微电极53通过第四通孔43和第三通孔42在第二次级通道12处形成第二高梯度不均匀电场；

磁体层包括铁磁体2和永磁体3，永磁体3设置在主通道10的一侧；铁磁体2设置在主通道10与永磁体3之间，且紧贴主通道10侧壁。

具体实施时，作为本发明优选的实施方式，所述第一次级通道11和第二次级通道12分别成一定角度的与所述主通道10的一端连通，所述主通道10的另一端分别连通有用于流入鞘液的第一进液口100和用于流入血液样品的第二进液口101，第一进液口100和第二进液口101之间设置有第一夹角60。

具体实施时，作为本发明优选的实施方式，所述第一次级通道11的后端连通有用于流出分离后的白细胞的第一出液口110和流出分离后的循环肿瘤细胞的第二出液口111，第一出液口110和第二出液口111之间设置有第二夹角61；所述第二次级通道12的后端连通有用于流出分离后的血小板的第三出液口120和用于流出分离后的红细胞的第四出液口121，第三出液口120和第四出液口121之间设置有第三夹角62。

具体实施时，作为本发明优选的实施方式，如图2所示，所述第一通孔40的宽度小于所述第二通孔41的宽度；所述第三通孔42的宽度小于所述第四通孔43的宽度；所述第一高梯度不均匀电场的强度取决于第一通孔40和第二通孔41的宽度比；所述第二高梯度不均匀电场的强度取决于第三通孔42和第四通孔43的宽度比。并且较小的孔(第一通孔40和第三通孔42)周围不均匀电场强度最强。在第一次级通道11与第二次级通道12中，均设计有如图2所示的不对称孔结构。为了减少第一次级通道11与第二次级通道12中电场的相互影响，将两个不对称孔结构中不均匀电场强度较弱的两个较大的第二通孔41和第四通孔43设于同一侧，即第一次级通道11中不对称结构中较大的第二通孔41与第二出液口111同侧，第二次级通道12中不对称结构中较大的第四通孔43与第三出液口120同侧。

具体实施时，本发明实施例提供的结合磁泳与介电泳的血细胞微流控分离装置设有两个分离区域。分别是主通道10内的磁泳分离区域与第一次级通道11和第二次级通道12内的介电泳分离区域。在磁泳分离区域，白细胞和循环肿瘤细胞混合样品流入第一次级通道11，红细胞和血小板混合样品流入第二次级通道12。流入第一次级通道11和第二次级通道12的细胞将进入介电泳分离区域，在介电泳分离区域，白细胞和循环肿瘤细胞在第一次级通道11中彼此分离，白细胞从第一出液口110流出，循环肿瘤细胞从第二出液口111流出；红细胞和血小板在第二次级通道12中彼此分离，血小板从第三出液口120流出，红细胞从第四出液口121流出。

具体实施时，作为本发明优选的实施方式，所述永磁体3的长度大于所述铁磁体2的长度。所述铁磁体2和所述永磁体3设置在所述主通道10靠近所述第二次级通道12的一侧。磁通密度的梯度越高，细胞所受磁泳力越大。因此分离的有效区域为主通道10内靠近铁磁体2的一侧，特别是在铁磁体2的起点和终点位置，该区域的磁通密度的梯度较高。为了在磁泳分离区域达到良好的分离效果，在第一进液口100引入比血液样品流速较高的鞘液。在适当的鞘液流速与血液样品流速之比下，从第二进液口101流入的血液样品被鞘液挤压至主通道10内靠近铁磁体2一侧。

由于红细胞内存在血红蛋白，红细胞的磁化率明显高于其他血细胞(白细胞、血小板和循环肿瘤细胞)。在磁泳分离区域红细胞的磁泳特性不同于其他血细胞。受正磁泳力的红细胞将被吸引在主通道10内靠近铁磁体2的一侧，因为该处磁通密度的梯度较高，红细胞最终流入第二次级通道12。除红细胞之外的其他细胞(白细胞、血小板和循环肿瘤细胞)将受到负磁泳力的作用，从而被排斥远离主通道10内的铁磁体2。由于白细胞和循环肿瘤细胞的粒径尺寸较大，受到的负磁泳力作用较强，最终流入第一次级通道11；而血小板的粒径尺寸较小，受到的负磁泳力作用较弱，最终与红细胞一起流入第二次级通道12，实现一级分离，即红细胞和血小板混合样品，与循环肿瘤细胞和白细胞混合样品的分离。

在交流电场中，细胞受到交流-介电泳力的方向与交流频率有关。通过调节第一次级通道11内交流电场的频率，第一次级通道11中的白细胞受到正交流-介电泳力的作用，向第一通孔40处运动，并从第一出液口110流出。而循环肿瘤细胞在负交流-介电泳力的作用下，向第二通孔41处运动，并从第二出液口111流出，实现白细胞与循环肿瘤细胞的分离。通过调节第二次级通道12内交流电场的频率，在第二次级通道12中的血小板受负交流-介电泳力的作用，向第四通孔43处运动，并从第三出液口120流出。而红细胞在正交流-介电泳力的作用下，向第三通孔42处运动，并从第四出液口121流出，实现血小板与红细胞的分离。

本发明还提供了一种基于上述血细胞微流控分离装置的血细胞微流控分离方法，包括如下步骤：

S1、将血细胞微流控分离装置放入等离子清洗机清洗两分钟；用于提高流道的亲水性，便于液体流动；

S2、用导线连接微电极层和交流稳压电源，打开交流稳压电源，调整电压与频率，对微电极层进行供电；

S3、用注射泵在所述第一进液口100和第二进液口101中同时注入血液样品和鞘液；

S4、用显微镜观察血细胞分离效果，在磁泳分离区域，适当调整血液样品和鞘液流速之比，提高一级分离效率。在介电泳分离区域，适当调整电压与频率，提高二级分离效率。

所述磁泳分离区域为主通道10内的区域；所述介电泳分离区域为所述第一次级通道11和所述第二次级通道12内的区域。

实施例

鞘液和血液样品分别从第一进液口100与第二进液口101引入，血液样品将被流速更高的鞘液挤压至主通道10内靠近铁磁体2的一侧，此时血液样品进入磁泳分离区域。此区域受到较强负磁泳力作用的白细胞和循环肿瘤细胞被铁磁体2排斥流入第一次级通道11，而受到正磁泳力的红细胞与受到较弱负磁泳力的血小板流入第二次级通道12。流入第一次级通道11和第二次级通道12的细胞将进入介电泳分离区域。通过调节交流电场及不对称孔结构，细胞在交流-介电泳力的作用下实现分离并流入不同的出液口。在第一次级通道11中的白细胞受正交流-介电泳力的作用从第一出液口110流出，循环肿瘤细胞受负交流-介电泳力的作用从第二出液口111流出；第二次级通道12中的血小板受负交流-介电泳力的作用从第三出液口120流出，红细胞受正交流-介电泳力的作用从第四出液口121流出。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (8)

1.一种结合磁泳与介电泳的血细胞微流控分离装置，其特征在于，包括：微通道层、微电极层以及磁体层；

微通道层包括沿样品流动方向依次设置的主通道、与主通道连通的第一次级通道和第二次级通道；第一次级通道的一侧壁开设有第一通孔，另一侧壁开设有第二通孔；第二次级通道的一侧壁开设有第三通孔；另一侧壁开设有第四通孔；第一通孔和第二通孔组成一个不对称孔结构，第三通孔和第四通孔组成另一个不对称孔结构；

微电极层包括第一微电极、第二微电极、第三微电极以及第四微电极；第一微电极通过第一通孔与第一次级通道连通，第二微电极通过第二通孔与第一次级通道连通，第一微电极和第二微电极通过第一通孔和第二通孔在第一次级通道处形成第一高梯度不均匀电场；第三微电极通过第四通孔与第二次级通道连通，第四微电极通过第三通孔与第二次级通道连通，第三微电极和第四微电极通过第四通孔和第三通孔在第二次级通道处形成第二高梯度不均匀电场；

磁体层包括铁磁体和永磁体，永磁体设置在主通道的一侧；铁磁体设置在主通道与永磁体之间，且紧贴主通道侧壁。

2.根据权利要求1所述的结合磁泳与介电泳的血细胞微流控分离装置，其特征在于，所述第一次级通道和第二次级通道分别成一定角度的与所述主通道的一端连通，所述主通道的另一端分别连通有第一进液口和第二进液口，第一进液口和第二进液口之间设置有第一夹角。

3.根据权利要求1所述的结合磁泳与介电泳的血细胞微流控分离装置，其特征在于，所述第一次级通道的后端连通有第一出液口和第二出液口，第一出液口和第二出液口之间设置有第二夹角；所述第二次级通道的后端连通有第三出液口和第四出液口，第三出液口和第四出液口之间设置有第三夹角。

4.根据权利要求1所述的结合磁泳与介电泳的血细胞微流控分离装置，其特征在于，所述第一通孔的宽度小于所述第二通孔的宽度；所述第三通孔的宽度小于所述第四通孔的宽度；所述第一高梯度不均匀电场的强度取决于第一通孔和第二通孔的宽度比；所述第二高梯度不均匀电场的强度取决于第三通孔和第四通孔的宽度比。

5.根据权利要求1所述的结合磁泳与介电泳的血细胞微流控分离装置，其特征在于，所述永磁体的长度大于所述铁磁体的长度。

6.根据权利要求1所述的结合磁泳与介电泳的血细胞微流控分离装置，其特征在于，所述铁磁体和所述永磁体设置在所述主通道靠近所述第二次级通道的一侧。

7.一种基于权利要求1-6中任意一项权利要求所述血细胞微流控分离装置的血细胞微流控分离方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、将血细胞微流控分离装置放入等离子清洗机清洗两分钟；

S2、用导线连接微电极层和交流稳压电源，打开交流稳压电源，调整电压与频率，对微电极层进行供电；

S3、用注射泵在所述第一进液口和第二进液口中同时注入血液样品和鞘液；

S4、用显微镜观察血细胞分离效果，在磁泳分离区域，适当调整血液样品和鞘液流速之比，提高一级分离效率。在介电泳分离区域，适当调整电压与频率，提高二级分离效率。

8.根据权利要求7所述的血细胞微流控分离方法，其特征在于，所述磁泳分离区域为主通道内的区域；所述介电泳分离区域为所述第一次级通道和所述第二次级通道内的区域。

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