CN116445277A - 一种介电泳与磁泳联合的细胞颗粒分离装置及方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种介电泳与磁泳联合的细胞颗粒分离装置及方法。属于微流控技术领域。由于传统的分离装置单一使用介电泳或磁泳技术很难完全从全血中分离坏死的红细胞并分离其他细胞，因此，利用介电泳和磁泳相结合的方法对坏死的红细胞具有高特异性，本发明装置通过倾斜的驱动电极阵列和经过永磁铁磁化的软磁铁相结合对分离区的细胞颗粒混合液施加电场和磁场，利用不同细胞颗粒之间的物理性质的差异，并基于负介电泳力和磁泳力实现血液样品中坏死的红细胞、正常红细胞、血小板和白细胞的连续分选。无需预先标记细胞颗粒样品，不影响细胞颗粒生理活性。

Description

一种介电泳与磁泳联合的细胞颗粒分离装置及方法

技术领域

本发明涉及细胞颗粒分离技术领域，具体而言，尤其涉及一种介电泳与磁泳联合的细胞颗粒分离装置及方法。

背景技术

细胞颗粒分选是细胞分析工作和诊断治疗方法中必要的前处理环节，现有的细胞分选方式主要包括荧光标记细胞分选，然而荧光标记细胞分选在实验前需要实施复杂的样品处理，而且还会影响细胞的活性。介电泳和磁泳技术是一种为样品细胞鉴定和分离提供巨大潜力的方法，较传统的分离方法相比大大提升了工作效率。

介电泳分离技术是一种在微米和纳米尺度上进行颗粒操作的方法，通常作为预处理手段将目标捕获在检测区域，实现集中想要的目标并清除不想要的目标，不需要对颗粒进行标记。通过在微流控芯片上设计电极结构从而产生不均匀的电场，利用非均匀电场对颗粒进行极化，并根据颗粒和介质溶液的介电性质使具有不同物理性质的颗粒受到不同方向的介电泳力，从而达到分选的目的。

磁泳是指颗粒在粘性流体中受到磁场力产生的运动，发生在非均匀磁场中，使粒子向最大或最小的梯度区域移动。磁场力的方向由介质和颗粒的磁化率决定。当颗粒的磁化率小于介质溶液的磁化率时表现为抗磁性；当颗粒的磁化率大于介质溶液的磁化率时表现为顺磁性；当颗粒的磁化率远大于介质溶液的磁化率时表现为铁磁性。

坏死细胞由于被侵蚀，使细胞质膜离子通透性增加，在低电导率介质中，坏死的细胞失去内部离子，而正常细胞保留内部离子，从而产生介电差异。受坏死的红细胞由于血红蛋白含量降低，表现为比正常红细胞更具有顺磁性。

发明内容

根据上述提出的技术问题，提供一种介电泳与磁泳联合的细胞颗粒分离装置及方法。本发明的分离区通过联合介电泳和磁泳技术实现血液样品中坏死的红细胞，正常红细胞，血小板和白细胞的连续分选，无需预先标记细胞颗粒样品，不影响细胞颗粒的生理活性。

本发明采用的技术手段如下：

一种介电泳与磁泳联合的细胞颗粒分离装置，包括：玻璃基底层、设置在玻璃基底上的PDMS盖片层、驱动电极阵列层和磁体层，其中：

所述玻璃基底层的上表面与PDMS盖片的下表面相对且紧密结合；

所述PDMS盖片层上内陷设置有微通道层，包括流道区、分离区、进液口区以及出液口区；

所述驱动电极阵列层包括第一驱动电极和第二驱动电极，且均设置在所述玻璃基底层的上表面；

所述磁体层包括三块大小相同的永磁体和软磁体，永磁体设置在分离区的一侧，软磁体设置在分离区与永磁体之间，且紧贴分离区侧壁，永磁体设置于PDMS盖片上方。

进一步地，在所述微通道层中：

所述流道区包括第一流道、第二流道、第三流道、第四流道、第五流道、第六流道；

所述进液口区包括第一进液口和第二进液口；

所述出液口区包括第一出液口、第二出液口、第三出液口以及第四出液口；具体的：

所述第一进液口和所述第二进液口分别与所述第一流道的流入端口和所述第二流道的流入端口相连通，分离区分别与所述第一流道和所述第二流道的流出端口以及所述第三流道、第四流道、第五流道和第六流道的流入端口相连通。

进一步地，所述驱动电极阵列层为倾斜的叉指电极，利用交流电场驱动细胞颗粒移动，所述第一驱动电极接交流电源正极，所述第二驱动电极接地。

进一步地，所述第一驱动电极和第二驱动电极的结构相同，叉指电极的宽度和电极之间的距离以及倾斜角度都相等。

进一步地，所述第一驱动电极和第二驱动电极均采用Ag-PDMS复合材料制作，Ag-PDMS复合材料由Ag和PDMS以4：1的比例搅拌而成，因此Ag-PDMS复合材料既有导电性能，又能与玻璃基底层和微通道层键合。

进一步地，所述分离区为长方形，长度和宽度分别为5000μm和400μm；所述第一流道和第二流道的宽度均为200μm，所述第三流道、第四流道、第五流道以及第六流道的宽度均为100μm。

进一步地，所述软磁体和所述永磁体的宽度相同，均设置在与第一流道相连的分离区一侧。

本发明还提供了一种基于上述介电泳与磁泳联合的细胞颗粒分离装置的介电泳与磁泳联合的细胞颗粒分离方法，包括：

S1、将细胞颗粒分离装置放入等离子清洗机中清洗两分钟；

S2、用导线连接所述驱动电极阵列层和交流稳压电源，打开电源开关，调节电压和频率，对驱动电极进行供电；

S3、用注射泵在所述第一进液口和第二进液口中同时注入血液样品和鞘液；

S4、用显微镜观察分离效果，通过调节血液样品与鞘液的流速比，以及调节电压和频率，提高分离效率。

较现有技术相比，本发明具有以下优点：

1、本发明提供的介电泳与磁泳联合的细胞颗粒分离装置及方法，利用细胞颗粒之间介电性质的差异对其实施介电泳分选，利用细胞颗粒之间磁化性质的差异对其实施磁泳分选，两者相结合实现了从血液样品中对坏死的红细胞、正常红细胞、血小板和白细胞的一步分选，无需预先对细胞颗粒进行标记，不影响细胞颗粒生理活性。

2、本发明提供的介电泳与磁泳联合的细胞颗粒分离装置及方法，利用负介电泳力抵消一部分正磁泳力作用，解决了传统磁泳分离红细胞颗粒时由于受正磁泳力作用经常附着在通道壁上的问题。

基于上述理由本发明可在细胞颗粒分离等领域广泛推广。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图做以简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明装置的结构示意图。

图2为本发明装置的平面结构示意图。

图中：1、玻璃基底层；2、PDMS盖片层；3、第一进液口；4、第二进液口；5、第一出液口；6、第二出液口；7、第三出液口；8第四出液口；9、第一流道；10、第二流道；11第三流道；12、第四流道；13、第五流道；14、第六流道；15、分离区；16、永磁体；17、软磁体；18、第一驱动电极；19、第二驱动电极；20、引线电极。

具体实施方式

需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。以下对至少一个示例性实施例的描述实际上仅仅是说明性的，决不作为对本发明及其应用或使用的任何限制。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

除非另外具体说明，否则在这些实施例中阐述的部件和步骤的相对布置、数字表达式和数值不限制本发明的范围。同时，应当清楚，为了便于描述，附图中所示出的各个部分的尺寸并不是按照实际的比例关系绘制的。对于相关领域普通技术人员己知的技术、方法和设备可能不作详细讨论，但在适当情况下，所述技术、方法和设备应当被视为授权说明书的一部分。在这里示出和讨论的所有示例中，任向具体值应被解释为仅仅是示例性的，而不是作为限制。因此，示例性实施例的其它示例可以具有不同的值。应注意到：相似的标号和字母在下面的附图中表示类似项，因此，一旦某一项在一个附图中被定义，则在随后的附图中不需要对其进行进一步讨论。

在本发明的描述中，需要理解的是，方位词如“前、后、上、下、左、右”、“横向、竖向、垂直、水平”和“顶、底”等所指示的方位或位置关系通常是基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，在未作相反说明的情况下，这些方位词并不指示和暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位或者以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明保护范围的限制：方位词“内、外”是指相对于各部件本身的轮廓的内外。

为了便于描述，在这里可以使用空间相对术语，如“在……之上”、“在……上方”、“在……上表面”、“上面的”等，用来描述如在图中所示的一个器件或特征与其他器件或特征的空间位置关系。应当理解的是，空间相对术语旨在包含除了器件在图中所描述的方位之外的在使用或操作中的不同方位。例如，如果附图中的器件被倒置，则描述为“在其他器件或构造上方”或“在其他器件或构造之上”的器件之后将被定位为“在其他器件或构造下方”或“在其位器件或构造之下”。因而，示例性术语“在……上方”可以包括“在……上方”和“在……下方”两种方位。该器件也可以其他不同方式定位(旋转90度或处于其他方位)，并且对这里所使用的空间相对描述作出相应解释。

此外，需要说明的是，使用“第一”、“第二”等词语来限定零部件，仅仅是为了便于对相应零部件进行区别，如没有另行声明，上述词语并没有特殊含义，因此不能理解为对本发明保护范围的限制。

分离细胞颗粒装置的关键在于利用一对倾斜的驱动电极产生高梯度不均匀电场和经过永磁体磁化后的软磁体产生的不均匀磁场。经过分离区时细胞颗粒所受力的大小和方向由细胞颗粒自身的物理特性决定，细胞颗粒在负介电泳作用下，与细胞颗粒所受的拖曳力结合从而产生横向位移。位移的大小由细胞颗粒所受介电泳力的大小相关。坏死的红细胞由于介电性质的改变使其在电场作用下受到较小的负介电泳力，从而使此细胞不易附着在通道壁上。坏死的红细胞和正常红细胞都表现为顺磁性，由于坏死的红细胞磁化率比正常的红细胞大，故坏死的红细胞所受的磁泳力更强。通过电磁结合使两种细胞颗粒得到很好的分离。

为了实现上述目的，本发明采用的技术手段如下：

如图1、2所示，本发明提供了一种介电泳与磁泳联合的细胞颗粒分离装置，包括玻璃基底层1、PDMS盖片层2、驱动电极层以及磁体层；其中：

所述玻璃基底层1的上表面与PDMS盖片层2的下表面相对且紧密结合；

所述PDMS盖片层2上内陷设置有微通道层，包括流道区、分离区15、进液口区以及出液口区；

所述驱动电极阵列层包括第一驱动电极18和第二驱动电极19，且均设置在所述玻璃基底层1的上表面；

所述磁体层包括三块大小相同的永磁体16和软磁体17，永磁体16设置在分离区15的一侧，软磁体17设置在分离区15与永磁体16之间，且紧贴分离区15侧壁，永磁体16设置于PDMS盖片层2上方。

具体实施时，作为本发明优选的实施方式，在所述微通道层中：

所述流道区包括第一流道9、第二流道10、第三流道11、第四流道12、第五流道13、第六流道14；

所述进液口区包括第一进液口3和第二进液口4；

所述出液口区包括第一出液口5、第二出液口6、第三出液口7以及第四出液口8；具体的：

所述第一进液口3和所述第二进液口4分别与所述第一流道9的流入端口和所述第二流道10的流入端口相连通，分离区15分别与所述第一流道9和所述第二流道10的流出端口以及所述第三流道11、第四流道12、第五流道13和第六流道14的流入端口相连通。

具体实施时，作为本发明优选的实施方式，所述驱动电极阵列层为倾斜的叉指电极，利用交流电场驱动细胞颗粒移动，所述第一驱动电极18接交流电源正极，所述第二驱动电极19接地。第一驱动电极18和第二驱动电极19的结构相同，通过引线电极20与电压源或电源地相连。叉指电极的宽度和电极之间的距离以及倾斜角度都相等。由于各细胞颗粒间介电性质的差异，因此各细胞颗粒在介电泳力作用下产生的横向位移不同。

具体实施时，作为本发明优选的实施方式，所述第一驱动电极和第二驱动电极均采用Ag-PDMS复合材料制作，Ag-PDMS复合材料由Ag和PDMS以4：1的比例搅拌而成，因此Ag-PDMS复合材料既有导电性能，又能与玻璃基底层和微通道层键合。其制作过程包括如下步骤：

清洗：使用流水冲洗干净，用高压氮气吹干；

压膜：负干膜抗蚀剂压在冲洗干净的ITO玻璃上方；

曝光：曝光时间为4s；

显影：将曝光后的玻璃底片放入Na2CO3溶液中进行显影，洗掉电极部分干膜，形成电极模具；

填充：使用Ag-PDMS复合导电材料填满电极模具；

去膜：固化后，将ITO玻璃放入NaOH溶液中,剩余的干膜破裂脱落，保留Ag-PDMS微电极。经过以上步骤，制作完成Ag-PDMS微电极。

具体实施时，作为本发明优选的实施方式，所述软磁体17和所述永磁体16的宽度相同，均设置在与第一流道9相连的分离区一侧。磁通密度梯度越高，细胞颗粒所受磁泳力越大。因此，磁泳分离有效区域为与第一流道9相连的分离区一侧。因此，在第二进液口4引入比血液样品流速高的鞘液，血液样品被挤压至有软磁体通道一侧。

本发明提供的介电泳与磁泳联合的细胞颗粒分离装置，其工作原理如下：

由于坏死的红细胞中血红蛋白含量降低，因此磁化率要高于正常的红细胞，而红细胞的磁化率明显高于其他细胞(血小板和白细胞)。在磁泳力作用下，坏死的红细胞受正磁泳力较大，被吸引至靠近软磁体的一侧；正常红细胞也受正磁泳力作用，也被吸引至靠近软磁体一侧；血小板和白细胞由于磁化率较小，表现为抗磁性，被排斥到远离软磁体的一侧。

在介电泳力作用下，通过调节频率和受介质溶液的影响，所有细胞颗粒均受负介电泳力。坏死的红细胞由于内部介电常数增大，受到负介电泳力作用变小，因此产生的横向位移最小，最终流入第三流道11进入第一出液口5；正常的红细胞受负介电泳力抵消一部分正磁泳力，与坏死的红细胞相比，产生更大的横向位移，最终流入第四流道12进入第二出液口6；而血小板和白细胞由于细胞颗粒尺寸存在较大差异，因此在负介电泳力和负磁泳力的作用下，血小板受到负介电泳力较小流入第五流道13进入第三出液口7；白细胞受负介电泳力较大流入第六流道14进入第四出液口8。

本发明提供了一种基于上述介电泳与磁泳联合的细胞颗粒分离装置的介电泳与磁泳联合的细胞颗粒分离方法，包括：

S1、将细胞颗粒分离装置放入等离子清洗机中清洗两分钟；

S2、用导线连接所述驱动电极阵列层和交流稳压电源，打开电源开关，调节电压和频率，对驱动电极进行供电；

S3、用注射泵在所述第一进液口3和第二进液口4中同时注入血液样品和鞘液；

S4、用显微镜观察分离效果，通过调节血液样品与鞘液的流速比，以及调节电压和频率，提高分离效率。

实施例

血液样品和鞘液分别从第一进液口3和第二进液口4引入，血液样品被鞘液挤压至分离区靠近软磁体17的一侧，此区域受到正磁泳力作用的坏死红细胞和正常红细胞被吸引，并与所受的负介电泳力相结合，坏死的红细胞流入第三流道11进入第一出液口5，正常红细胞流入第四流道12进入第二出液口6，血小板和白细胞由于细胞尺寸存在较大差异，因此在负介电泳力和负磁泳力的作用下，血小板受到负介电泳力较小流入第五流道13进入第三出液口7；白细胞受负介电泳力较大流入第六流道14进入第四出液口8。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (8)

1.一种介电泳与磁泳联合的细胞颗粒分离装置，其特征在于，包括：玻璃基底层、设置在玻璃基底上的PDMS盖片层、驱动电极阵列层和磁体层，其中：

所述玻璃基底层的上表面与PDMS盖片层的下表面相对且紧密结合；

所述PDMS盖片层上内陷设置有微通道层，包括流道区、分离区、进液口区以及出液口区；

所述驱动电极阵列层包括第一驱动电极和第二驱动电极，且均设置在所述玻璃基底层的上表面；

所述磁体层包括三块大小相同的永磁体和软磁体，永磁体设置在分离区的一侧，软磁体设置在分离区与永磁体之间，且紧贴分离区侧壁，永磁体设置于PDMS盖片上方。

2.根据权利要求1所述的介电泳与磁泳联合的细胞颗粒分离装置，其特征在于，在所述微通道层中：

所述流道区包括第一流道、第二流道、第三流道、第四流道、第五流道、第六流道；

所述进液口区包括第一进液口和第二进液口；

所述出液口区包括第一出液口、第二出液口、第三出液口以及第四出液口；具体的：

所述第一进液口和所述第二进液口分别与所述第一流道的流入端口和所述第二流道的流入端口相连通，分离区分别与所述第一流道和所述第二流道的流出端口以及所述第三流道、第四流道、第五流道和第六流道的流入端口相连通。

3.根据权利要求1所述的介电泳与磁泳联合的细胞颗粒分离装置，其特征在于，所述驱动电极阵列层为倾斜的叉指电极，利用交流电场驱动细胞颗粒移动，所述第一驱动电极接交流电源正极，所述第二驱动电极接地。

4.根据权利要求3所述的介电泳与磁泳联合的细胞颗粒分离装置，其特征在于，所述第一驱动电极和第二驱动电极的结构相同，叉指电极的宽度和电极之间的距离以及倾斜角度都相等。

5.根据权利要求4所述的介电泳与磁泳联合的细胞颗粒分离装置，其特征在于，所述第一驱动电极和第二驱动电极均采用Ag-PDMS复合材料制作，Ag-PDMS复合材料由Ag和PDMS以4：1的比例搅拌而成，因此Ag-PDMS复合材料既有导电性能，又能与玻璃基底层和微通道层键合。

6.根据权利要求1所述的介电泳与磁泳联合的细胞颗粒分离装置，其特征在于，所述分离区为长方形，长度和宽度分别为5000μm和400μm；所述第一流道和第二流道的宽度均为200μm，所述第三流道、第四流道、第五流道以及第六流道的宽度均为100μm。

7.根据权利要求1所述的介电泳与磁泳联合的细胞颗粒分离装置，其特征在于，所述软磁体和所述永磁体的宽度相同，均设置在与第一流道相连的分离区一侧。

8.一种基于权利要求1-7中任意一项权利要求所述介电泳与磁泳联合的细胞颗粒分离装置的介电泳与磁泳联合的细胞颗粒分离方法，其特征在于，包括：

S1、将细胞颗粒分离装置放入等离子清洗机中清洗两分钟；

S2、用导线连接所述驱动电极阵列层和交流稳压电源，打开电源开关，调节电压和频率，对驱动电极进行供电；

S3、用注射泵在所述第一进液口和第二进液口中同时注入血液样品和鞘液；

S4、用显微镜观察分离效果，通过调节血液样品与鞘液的流速比，以及调节电压和频率，提高分离效率。