CN113234588B - 一种基于不对称孔的直流介电泳细胞外泌体分离装置及方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种基于不对称孔的直流介电泳细胞外泌体分离装置及方法。本发明装置，包括相互贴合的第一基板和第二基板；第一基板上设置有主通道、两个进样通道以及三个出样通道，每个进样通道和每个出样通道均与主通道连接，且每个进样通道设置有一进样口，每个出样通道设置有一出样口；主通道的一侧壁开设有两个通孔；第二基板上设置有两对微型电极，两对微型电极对称嵌入在主通道两侧，一侧微型电极通过通孔与主通道连接，与另一侧微型电极在主通道处形成一高梯度不均匀电场。本发明通过不对称小孔结构及3D微型电极产生高梯度不均匀电场，利用介电泳力实现不同粒径细胞外泌体颗粒的分离，可用于细胞外泌体分离纯化。

Description

一种基于不对称孔的直流介电泳细胞外泌体分离装置及方法

技术领域

本发明涉及细胞外泌体分离技术领域，具体而言，尤其涉及一种基于不对称孔的直流介电泳细胞外泌体分离装置及方法。

背景技术

近年来，人们越来越关注生物液体中循环细胞外泌体的表征，以提高生物标志物检测策略的敏感性和特异性。例如，小的细胞外囊泡(sEVs)直径在几十微米到几百微米之间，可以在各种生物液体中循环。细胞外囊泡的蛋白质，DNA和RNA概况在癌症进展和治疗过程中受到调节，因此可以基于其分子概况用于疾病进展的非侵入性监测。目前已经开发出许多技术来选择性地从生物流体中的其他循环碎片和细胞中分离出此类物质。这些方法包括差速离心法，密度梯度分离法，亲和捕获法，尺寸排阻色谱法和超滤法或以上方法组合的方法，这些方法会根据大小，密度和表面标记分离出颗粒多样性。然而，这些方法相对麻烦，本质上产量低且价格昂贵，并且需要大量的生物流体，因此限制了它们在临床或诊断环境中的常规应用。

微流控芯片系统已成为充满前途的工具，可用于快速，高效，强大地聚焦并从生物流体中分离微米及纳米级目标。实际上，已经显示出多种微流控技术对于这种目的是有效的。基于所涉及的操纵方式，这些方法可以分为主动式或被动式两种。其中，介电泳(DEP)、磁电泳(MP)和声电泳(AP)等主动技术依赖于应用外力场，可以实现对颗粒的精确操控和分选。而夹流分流(PFF)、确定性侧向位移(DLD)和惯性微流体等被动式技术仅依赖于几何和流体特性(即内在流体动力)的控制，对颗粒的分选缺乏精确操控。在主动式操控方法中，介电泳(DEP)分离技术成为最受欢迎的技术之一，已经广泛应用于颗粒分选及生物细胞分选等领域。基于微流控芯片系统的介电泳分离技术，可以降低样品的消耗，实时控制样品的分离过程。

基于微流控芯片系统的介电泳分离技术中，电极的设计是微流控系统设计的关键。在传统的分离芯片中，常常使用平面电极来产生非均匀电场。平面电极一般布置在通道的底部或者顶部，只能在距离电极较近的区域产生电场，对微粒的操纵范围比较有限，分离效率较低。

发明内容

根据上述提出的技术问题，而提供一种基于不对称孔的直流介电泳细胞外泌体分离装置及方法。本发明通过不对称小孔结构及3D微型电极产生高梯度不均匀电场，利用介电泳力实现不同粒径细胞外泌体颗粒的分离。可用于细胞外泌体分离纯化，同时也可以推广应用于其他纳米颗粒分离纯化等领域。

本发明采用的技术手段如下：

一种基于不对称孔的直流介电泳细胞外泌体分离装置，包括相互贴合的第一基板和第二基板；

第一基板上设置有主通道、两个进样通道以及三个出样通道，每个进样通道和每个出样通道均与主通道连接，且每个进样通道设置有一进样口，每个出样通道设置有一出样口；主通道的一侧壁开设有两个通孔；

第二基板上设置有两对微型电极，两对微型电极对称嵌入在主通道两侧，一侧微型电极通过通孔与主通道连接，与另一侧微型电极在主通道处形成一高梯度不均匀电场。

进一步地，所述主通道沿流体的流动方向依次设置为液体交汇区和颗粒分离区，所述液体交汇区与两个进样通道直接相连，所述颗粒分离区通过不对称孔与一对3D微型电极相连，并沿流体流动方向与三个出样通道直接相连。

进一步地，所述两对微型电极包括一对3D微型电极和一对供电平面电极；其中：

一对3D微型电极与主通道同高，位于所述主通道颗粒分离区两侧，包括第一电极和第二电极，第一电极通过两个通孔与主通道相连，第二电极直接与主通道相连；

一对供电平面电极包括第三电极和第四电极，第三电极位于所述第一电极下方，从第一电极处延伸到所述主通道外侧，第四电极位于所述第二电极下方，从第二电极处延伸到所述主通道外侧。

进一步地，所述主通道包括第一电极通道和第二电极通道，第一电极通道和第二电极通道内分别内嵌金属以形成所述第一电极和所述第二电极。

进一步地，所述第一电极和第二电极尺寸相同，长3000μm，宽1000μm；所述第一电极与所述主通道相连的两个通孔尺寸相同，长10μm,宽10μm，间隔30μm；所述第三电极和第四电极宽1500μm。

进一步地，所述第一基板的贴合面上设置凹槽，与所述第二基板贴合后形成所述进样通道、所述主通道、所述出样通道、所述第一电极通道以及所述第二电极通道。

进一步地，所述进样通道按逆时针依次设置为第一进样通道和第二进样通道，第一进样通道的宽度小于等于第二进样通道的宽度；所述出样通道按顺时针依次设置为第一出样通道、第二出样通道和第三出样通道，三个出样通道将主通道等分为三个通道。

本发明还提供了一种基于上述直流介电泳细胞外泌体分离装置的直流介电泳细胞外泌体分离方法，包括如下步骤：

步骤S1、将键合后的细胞外泌体分离装置放入等离子清洗机进行清洗，提高通道的亲水性，便于液体流动；

步骤S2、用导线连接供电平面电极和直流稳压电源，打开直流稳压电源，调整电压，对微型电极进行供电；

步骤S3、用注射泵同时注入待分离液和缓冲液，缓冲液的注入速度要高于待分离液的注入速度；

步骤S4、用显微镜观察细胞外泌体颗粒分离效果，适当调整电压，提高分离效率。

较现有技术相比，本发明具有以下优点：

1、本发明提供的直流介电泳细胞外泌体分离装置，通过不对称小孔结构及3D微型电极产生高梯度不均匀电场，提高分离的分辨率及效率。

2、本发明提供的直流介电泳细胞外泌体分离装置，利用介电泳力实现不同粒径微粒的分离，可用于细胞外泌体分离纯化，同时也可以广泛推广到其他纳米颗粒分离领域。

基于上述理由本发明可在细胞外泌体分离等领域广泛推广。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图做以简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明装置结构示意图。

图2为本发明装置的俯视示意图。

图3为图2的局部放大图。

图中：1、第一基板；110、主通道；1101、液体交汇区；1102、颗粒分离区；120、进样通道；1201、第一进样通道；1202、第二进样通道；130、出样通道；1301、第一出样通道；1302、第二出样通道；1303、第三出样通道；2、微型电极；210、3D微型电极；2101、第一电极；2102、第二电极；220、供电平面电极；2201、第三电极；2202、第四电极；2101A、第一通孔；2101B、第二通孔；3、第二基板。

具体实施方式

需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。以下对至少一个示例性实施例的描述实际上仅仅是说明性的，决不作为对本发明及其应用或使用的任何限制。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

除非另外具体说明，否则在这些实施例中阐述的部件和步骤的相对布置、数字表达式和数值不限制本发明的范围。同时，应当清楚，为了便于描述，附图中所示出的各个部分的尺寸并不是按照实际的比例关系绘制的。对于相关领域普通技术人员己知的技术、方法和设备可能不作详细讨论，但在适当情况下，所述技术、方法和设备应当被视为授权说明书的一部分。在这里示出和讨论的所有示例中，任向具体值应被解释为仅仅是示例性的，而不是作为限制。因此，示例性实施例的其它示例可以具有不同的值。应注意到：相似的标号和字母在下面的附图中表示类似项，因此，一旦某一项在一个附图中被定义，则在随后的附图中不需要对其进行进一步讨论。

在本发明的描述中，需要理解的是，方位词如“前、后、上、下、左、右”、“横向、竖向、垂直、水平”和“顶、底”等所指示的方位或位置关系通常是基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，在未作相反说明的情况下，这些方位词并不指示和暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位或者以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明保护范围的限制：方位词“内、外”是指相对于各部件本身的轮廓的内外。

为了便于描述，在这里可以使用空间相对术语，如“在……之上”、“在……上方”、“在……上表面”、“上面的”等，用来描述如在图中所示的一个器件或特征与其他器件或特征的空间位置关系。应当理解的是，空间相对术语旨在包含除了器件在图中所描述的方位之外的在使用或操作中的不同方位。例如，如果附图中的器件被倒置，则描述为“在其他器件或构造上方”或“在其他器件或构造之上”的器件之后将被定位为“在其他器件或构造下方”或“在其位器件或构造之下”。因而，示例性术语“在……上方”可以包括“在……上方”和“在……下方”两种方位。该器件也可以其他不同方式定位(旋转90度或处于其他方位)，并且对这里所使用的空间相对描述作出相应解释。

此外，需要说明的是，使用“第一”、“第二”等词语来限定零部件，仅仅是为了便于对相应零部件进行区别，如没有另行声明，上述词语并没有特殊含义，因此不能理解为对本发明保护范围的限制。

下面，结合附图对本发明的具体实施例进行详细的描述，但不作为本发明的限定。

如图1所示，本发明提供了一种基于不对称孔的直流介电泳细胞外泌体分离装置，包括相互贴合的第一基板1和第二基板3；第一基板1的贴合面上设置凹槽，与第二基板3贴合后形成细胞外泌体分离装置的各通道。在本实施例中，第一基板1的材料为聚二甲基硅氧烷(PDMS)，第二基板3的材料为玻璃。

继续参看图1，第一基板1上设置有主通道110、两个进样通道120以及三个出样通道130，每个进样通道120和每个出样通道130均与主通道110连接，且每个进样通道120设置有一进样口，每个出样通道130设置有一出样口；主通道的一侧壁开设有两个通孔；本实施例中，进样通道120按逆时针依次设置为第一进样通道1201和第二进样通道1202，第一进样通道1201用于注入包含颗粒的待分离液，第二进样通道1202用于注入缓冲液，第一进样通道1201和第二进样通道1202与主通道110前端相连，用于使包含细胞外泌体颗粒的待分离液和缓冲液汇合注入主通道110，主通道110宽度为200μm。第一进样通道1201的宽度小于等于第二进样通道1202的宽度；出样通道130按顺时针依次设置为第一出样通道1301、第二出样通道1302和第三出样通道1303，三个出样通道130将主通道110等分为三个通道，使得在高梯度非均匀电场中受介电泳力驱使而偏移到不同轨迹的细胞外泌体颗粒分离流出。

具体实施时，作为本发明优选的实施方式，如图2所示，主通道110沿流体的流动方向依次设置为液体交汇区1101和颗粒分离区1102，液体交汇区1101与两个进样通道120直接相连，颗粒分离区1102通过不对称孔与一对3D微型电极相连，并沿流体流动方向与三个出样通道130直接相连。

第二基板上设置有两对微型电极，两对微型电极对称嵌入在主通道两侧，一侧微型电极通过通孔与主通道连接，与另一侧微型电极在主通道处形成一高梯度不均匀电场。具体实施时，作为本发明优选的实施方式，如图3所示，两对微型电极2包括一对3D微型电极和一对供电平面电极；其中：

一对3D微型电极与主通道110同高，位于主通道颗粒分离区两侧，包括第一电极2101和第二电极2102，第一电极2101通过两个通孔与主通道110相连，第二电极2102直接与主通道110相连；

一对供电平面电极包括第三电极2201和第四电极2202，第三电极2201位于第一电极2101下方，从第一电极2101处延伸到主通道110外侧，第四电极2202位于第二电极2102下方，从第二电极2102处延伸到主通道110外侧。供电平面电极用于外接直流稳压电源，对3D微型电极进行供电。

当待分离液和缓冲液共同注入液体交汇区1101时，待分离液中的细胞外泌体颗粒被流速更快的缓冲液挤压到小孔一侧的内壁附近流动，经过颗粒分离区1102时，高梯度非均匀电场施加更强的介电泳力。颗粒分离区1102通过不对称孔与一对3D微型电极210相连，产生了一高梯度非均匀电场。细胞外泌体颗粒经过该区域时受到介电泳作用。基于细胞外泌体颗粒粒径尺寸不同，不同细胞外泌体颗粒受到介电泳力作用强度不同，进而产生不同的运动轨迹并形成不同的轨迹偏移距离。

具体实施时，作为本发明优选的实施方式，主通道110包括第一电极通道和第二电极通道，第一电极通道和第二电极通道内分别内嵌金属以形成所述第一电极2101和所述第二电极2102。

具体实施时，作为本发明优选的实施方式，第一电极2101和第二电极2102尺寸相同，长3000μm，宽1000μm；第一电极2101与主通道110相连的两个通孔尺寸相同，长10μm,宽10μm，间隔30μm；第三电极2201和第四电极2202宽1500μm。第一电极处的第一通孔和第二通孔与第二电极处的孔宽度比为1：100。

具体实施时，作为本发明优选的实施方式，本发明实施例还提供了一种3D微型电极的制作方法，包括：

步骤A1：在干净的氧化铟锡(ITO)玻璃板上覆上一层铜；

步骤A2：以3000转/分的速度在覆铜玻璃板上旋涂一层SU-8光刻胶；

步骤A3：将未曝光的光刻胶通过烘焙处理和紫外线曝光溶解在SU-8显影剂中；

步骤A4：将覆盖有曝光光致抗蚀剂的图案化铜玻璃板浸入65℃的铜蚀刻液中，直到所有未覆盖的铜都被刻蚀完毕；

步骤A5：在130℃的30％氢氧化钠(NaOH)溶液中去除光刻胶，时间为40分钟，将具有图案化结构的铜电极释放出来，形成3D微型电极。

本发明还提供了一种基于上述直流介电泳细胞外泌体分离装置的直流介电泳细胞外泌体分离方法，包括如下步骤：

S1、将键合后的细胞外泌体分离装置放入等离子清洗机进行清洗，提高通道的亲水性，便于液体流动；

S2、用导线连接供电平面电极和直流稳压电源，打开直流稳压电源，调整电压，对微型电极进行供电；

S3、用注射泵同时注入待分离液和缓冲液，缓冲液的注入速度要高于待分离液的注入速度；

S4、用显微镜观察细胞外泌体颗粒分离效果，适当调整电压，提高分离效率。

实施例：

将包含细胞外泌体颗粒的待分离液和缓冲液分别注入第一进样通道1201和第二进样通道1202，两股液体会在主通道110的液体交汇区1101合并，待分离液中的细胞外泌体颗粒被流速更快的缓冲液挤压到第一通孔2101A和第二通孔2012B一侧墙壁附近，沿墙壁流动，细胞外泌体颗粒经过颗粒分离区1102时受到介电泳作用。基于细胞外泌体颗粒粒径尺寸不同，不同细胞外泌体颗粒受到介电泳力作用强度不同，进而产生不同的运动轨迹并形成不同的轨迹偏移。通过调整直流电压并结合使用不对称孔结构，提高分离的分辨率及效率，颗粒粒径＞150nm的微囊颗粒受到较强的介电泳作用并偏移至外壁附近，并从第三出样通道1303分离流出，而直径在50-150nm之间的小囊泡受到一定的介电泳作用，并进入第二出样通道1302被收集；最后粒径尺寸<50nm，约为35nm的非膜性纳米颗粒继续沿内壁附近流动并进入第一出样通道1301被收集。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (6)

1.一种基于不对称孔的直流介电泳细胞外泌体分离装置，其特征在于，包括相互贴合的第一基板和第二基板；

第一基板上设置有主通道、两个进样通道以及三个出样通道，每个进样通道和每个出样通道均与主通道连接，且每个进样通道设置有一进样口，每个出样通道设置有一出样口；主通道的一侧壁开设有两个通孔；

第二基板上设置有两对微型电极，两对微型电极对称嵌入在主通道两侧，一侧微型电极通过通孔与主通道连接，与另一侧微型电极在主通道处形成一高梯度不均匀电场；两对微型电极包括一对3D微型电极和一对供电平面电极；其中：

一对3D微型电极与主通道同高，位于所述主通道颗粒分离区两侧，包括第一电极和第二电极，第一电极通过两个通孔与主通道相连，第二电极直接与主通道相连；

一对供电平面电极包括第三电极和第四电极，第三电极位于所述第一电极下方，从第一电极处延伸到所述主通道外侧，第四电极位于所述第二电极下方，从第二电极处延伸到所述主通道外侧；

主通道沿流体的流动方向依次设置为液体交汇区和颗粒分离区，液体交汇区与两个进样通道直接相连，所述颗粒分离区通过不对称孔与一对3D微型电极相连，并沿流体流动方向与三个出样通道直接相连。

2.根据权利要求1所述的基于不对称孔的直流介电泳细胞外泌体分离装置，其特征在于，所述主通道包括第一电极通道和第二电极通道，第一电极通道和第二电极通道内分别内嵌金属以形成所述第一电极和所述第二电极。

3.根据权利要求1所述的基于不对称孔的直流介电泳细胞外泌体分离装置，其特征在于，所述第一电极和第二电极尺寸相同，长3000μm，宽1000μm；所述第一电极与所述主通道相连的两个通孔尺寸相同，长10μm,宽10μm，间隔30μm；所述第三电极和第四电极宽1500μm。

4.根据权利要求1所述的基于不对称孔的直流介电泳细胞外泌体分离装置，其特征在于，所述第一基板的贴合面上设置凹槽，与所述第二基板贴合后形成所述进样通道、所述主通道、所述出样通道、所述第一电极通道以及所述第二电极通道。

5.根据权利要求1所述的基于不对称孔的直流介电泳细胞外泌体分离装置，其特征在于，所述进样通道按逆时针依次设置为第一进样通道和第二进样通道，第一进样通道的宽度小于等于第二进样通道的宽度；所述出样通道按顺时针依次设置为第一出样通道、第二出样通道和第三出样通道，三个出样通道将主通道等分为三个通道。

6.一种基于上述权利要求1-5中任意一项权利要求所述直流介电泳细胞外泌体分离装置的直流介电泳细胞外泌体分离方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、将键合后的细胞外泌体分离装置放入等离子清洗机进行清洗，提高通道的亲水性，便于液体流动；

S2、用导线连接供电平面电极和直流稳压电源，打开直流稳压电源，调整电压，对微型电极进行供电；

S3、用注射泵同时注入待分离液和缓冲液，缓冲液的注入速度要高于待分离液的注入速度；

S4、用显微镜观察细胞外泌体颗粒分离效果，适当调整电压，提高分离效率。

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