CN110628568B - 用于高通量连续流细胞分离的滑轨式介电泳电极结构 - Google Patents

Abstract

用于高通量连续流细胞分离的滑轨式介电泳电极结构，属于微流控芯片技术领域。包括与主流道方向呈倾斜角α并横跨主流道的滑轨式电极所形成的叉指电极阵列、交替延伸出叉指的位于主流道两侧的一对主体电极、由叉指电极非均匀侧壁结构划分主流道而形成的并行分流道、绝缘沟道以及样品的出入口。本发明通过将具有非均匀侧壁结构的滑轨式电极按一定倾斜角度置于主流道中，使细胞同时受到介电泳力和流体的拖拽力而沿着滑道层的两侧壁滑动并进入迁移流出口；实现细胞的连续分离。此外，通过将上述单向的滑轨式电极改为双向的V型滑轨式电极，在连续分离细胞的同时更进一步提高了通量。

Description

用于高通量连续流细胞分离的滑轨式介电泳电极结构

技术领域

本发明属于微流控芯片技术中的细胞分选技术领域，具体涉及一种用于高通量连续流细胞分离的滑轨式介电泳电极结构。

背景技术

细胞分离技术是指从含有多种细胞的样品中获得某一种细胞的技术，广泛应用于生物医学研究和临床治疗的多个领域。例如，水质检测时能够对水质中的细菌和寄生物实现分离和检测；在临床上与疾病相关细胞的筛选与分析可用于疾病诊断与病理研究，某些罕见细胞如循环肿瘤细胞(CTCs)、循环胎儿细胞(CFCs) 的筛选可以为疾病的早期诊断和精确治疗提供宝贵信息。

传统的细胞分离方法(如离心、过滤)所需样本量大且分离纯度低；而可以高精度的实现细胞分离的流式细胞术的复杂性和成本(如相关仪器设施、专业人员、标记的试剂)过高，甚至还需要对细胞使用荧光抗体，不适用于后续的细胞培养和研究。

微流控芯片是一种在微纳米级别对微粒进行控制的微芯片，通常其外观仅有几平方厘米，芯片内部结构中包含微纳米尺度的结构，可以自动完成实验及分析的过程。近年来，结合微流控芯片的细胞分离技术，因其具有高通量、所需样本量少以及简单易操作的优点而得到了广泛应用。目前基于微流控芯片的细胞分选方式主要分为生物化学方法和物理方法两大类。常见的生物化学方法包括荧光激活细胞分选技术(FACS)和磁激活细胞分选技术(MACS)等。FACS需要对细胞进行额外的特异性荧光染色步骤，然后通过激光激发使细胞产生荧光进而对染色的细胞进行检测和计数；MACS是基于细胞表面抗原能与连接有磁珠的特异性单抗相结合，在外加磁场中，通过抗体与磁珠相连的细胞被吸附并滞留在磁场中，从而实现细胞分离。这些方法虽然分离纯度高，但捕获的细胞表面均带有荧光标记或通道内的微珠等，导致捕获的细胞难以释放且细胞的生理状态被改变，不利于后续细胞的培养和其性质状态的进一步观察研究。相比之下，通过外加的水力场、声场、电场等环境，根据细胞自身物理形态或利用黏附分子等对细胞表面施加瞬间作用力，使不同细胞受力不同而实现细胞分选的物理方法应用更为广泛。其中，利用不同种类细胞在介电特性方面的差异来得到其在非均匀电场中不同的运动轨迹以实现细胞分离的介电泳细胞分选技术最受广大研究人员的青睐。

介电泳指的是可极化中性粒子在非均匀电场中被极化而产生运动的现象。通过设计合理高效的微电极结构制造非均匀电场，使不同种类的细胞感应出不同的偶极矩，从而实现细胞轨迹操控的技术即为介电泳细胞分离技术。与其他细胞分离方法相比，介电泳细胞分离技术在保持细胞高活性的同时还具有效率高、免标记、简单易操作、成本低等优势。但目前已报道的用于介电泳细胞分离的电极结构大都采用平面电极结构或者侧壁均匀的三维电极结构，如中国专利 201510585845.6，中国专利201510379158.9，这些类型的电极不能产生沿通道深度的有效的电场梯度，无法在竖直方向上控制细胞轨迹；而可以在通道深度方向产生有效电场梯度的具有非均匀侧壁的三微电极结构，由于结构限制只能实现低流速批量式的细胞分离，分离效率低，如中国专利201811550218.9。中国的 香港科技大学的Yobas课题组在2017-2018年的报道中介绍了一种可以实现连续流细胞分离的三维硅电极结构，但为了在竖直方向上产生有效的电场梯度以操纵细胞，只能将硅基电极刻蚀为波浪形，使得细胞在从波峰滑向波谷的过程中伴有明显的加速度，因此导致细胞不能在电极的上侧面滑动而只能在其下侧面滑动并流向收集出口，工作效率较低。此外，其使用的硅基电极还存在加工工艺复杂、成本过高、衬底不透明的缺陷。

发明内容

针对以上现有技术存在的缺点和不足，本发明的目的为提供一种用于高通量连续流细胞分离的滑轨式介电泳电极结构。通过两层电极结构构成具有非均匀侧壁的三维电极，以在竖直方向产生高效的介电泳力；而且细胞可以在滑道层笔直均匀的两侧壁同时被吸附并滑动，大幅度的提高了通量。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

一种用于高通量连续流细胞分离的滑轨式介电泳电极结构，其特征在于，所述电极结构包含由与主流道(3)长度方向呈倾斜角α并横跨主流道(3)的滑轨式电极(2)所形成的叉指电极阵列、沿长度方向位于主流道(3)两侧的一对主体电极(1)、位于电极上游用于输入待滑动分离的细胞混合样品(24)的进样入口(7)以及位于进样入口(7)两侧用于控制细胞混合样品流体宽度和位置的右鞘流入口(8)和左鞘流入口(9)、位于电极下游用于收集原样品流(26)的原样流出口(6)和滑动迁移出原样品流的滑动细胞迁移流(25)的迁移流出口 (5)；所述电极结构与上、下游出入口围成样品的主流道(3)；

所述主体电极(1)为一对分别位于主流道(3)两侧的长方体；主体电极(1) 向外延伸的方向记为x方向，样品流动的方向记为y方向，与x、y方向垂直的主电极高度方向记为z方向；两个主体电极(1)等高且侧壁平行相对，构成沿 y方向的主流道(3)侧壁；

所述滑轨式电极(2)所形成的叉指电极阵列由位于两侧的一对主体电极(1) 交替平行引出，滑轨式电极(2)为单向结构，其延伸方向与y方向呈角度α并横跨主流道(3)，与延伸方向对面的主体电极(1)部分之间留有窄空隙(4)用于电极之间绝缘；滑轨式电极(2)与主体电极(1)高度相等，相邻滑轨式电极 (2)沿y方向等距分布；

所述滑轨式电极(2)分上、下两层结构；上层为长度方向与y方向成α角度的长条状薄层构成的滑道层(21)，下层为与滑道层(21)的下表面相连的沿滑道层(21)长度方向等距离排列的多个柱状结构(22)；柱状结构(22)的轴向沿z方向且与滑道层(21)下表面垂直；柱状结构(22)上端面的圆心在滑道层(21)沿α角度方向的中线上，且滑道层(21)完全覆盖柱状结构(22)的上端面；滑轨式电极(2)所形成的叉指电极阵列的下层的柱状结构(22)沿y方向前后对准形成阵列，同一滑轨式电极(2)的相邻柱状结构(22)之间具有柱子间隙(23)，滑轨式电极(2)所形成的叉指电极阵列中沿y方向上的多个柱子间隙(23)前后对准并形成多条并行分流道(20)。

或将所述叉指电极阵列中的单向的滑轨式电极(2)改为双向的V型滑轨式电极(15)以进一步提高通量，所述V型滑轨式电极(15)的上层滑道层(21) 由单向的长条状薄层结构改为V型薄层结构，下层柱状结构(22)随上层滑道层(21)一起改变且保证两者对应关系不变；所述V型滑轨式电极(15)与所述的滑轨式电极(2)一样为电极的一端与两侧的主体电极(1)连接，另一端留有窄空隙(4)，V型滑轨式电极(15)的V型结构为对称结构，叉指电极阵列中的多个V型尖端连成的线作为对称轴，V型的尖端指向上游中间位置的中间进样入口(18)。

所述用于高通量连续流细胞分离的滑轨式介电泳电极结构的滑轨式电极(2) 的长条状滑道层(21)由长方体沿y方向旋转角度α得到，其起始端与所连接的主体电极(1)融合为一体而末端平滑化为弧形；长方体宽度优选120-240μm，高度(即长方体侧壁厚度)优选15-30μm；长方体沿α角度方向延伸的两侧壁即为滑道层(21)用于细胞滑动的平面，该侧壁在其长度方向(即α角度方向) 和竖直方向(即z方向)均笔直均匀，为细胞稳定滑动提供了良好的条件。

所述用于高通量连续流细胞分离的滑轨式介电泳电极结构的滑轨式电极 (2)，其下层柱状结构(22)厚度(即轴向或z向长度)优选40-70μm，柱状结构(22)的径向最大长度优选80-200μm；对于同一滑轨式电极(2)下层的柱状结构(22)，柱子间隙(23)优选100-200μm，柱子数量优选15-25个，柱子形状可选但不限于圆柱、圆角矩形柱、立方体柱。

所述用于高通量连续流细胞分离的滑轨式介电泳电极结构的滑轨式电极(2) 与y方向的夹角α优选5-50°。

所述用于高通量连续流细胞分离的滑轨式介电泳电极结构的叉指电极阵列中滑轨式电极(2)对数优选5-15对，相邻两滑轨式电极(2)在y方向的间距优选200-400μm。

所述用于高通量连续流细胞分离的滑轨式介电泳电极结构的滑轨式电极(2) 末端与极性相反的主电极(1)之间的窄空隙(4)优选40-80μm。

所述用于高通量连续流细胞分离的滑轨式介电泳电极结构采用导电聚合物电极材料，优选AgPDMS填充物；可以使用绝缘透明材料作为天花板(11)和基底(12)来封装成微流控介电泳芯片，其中天花板(11)材料优选聚二甲基硅氧烷(PDMS)，基底(12)材料优选玻璃。

所述V型滑轨式电极(15)可实现更高通量的细胞分离(拓展了宽度，提高了通量，不增加滑动时间，即细胞暴露在电场强度极大值区域的时间)；所述 V型滑轨式电极(15)与主电极(14)、各样品出入口共同构成用于高通量连续流细胞分离的V型的扩展电极结构(13)，所述扩展电极结构(13)的主电极(14) 与原电极结构的主体电极(1)相同。

所述用于高通量连续流细胞分离的V型的扩展电极结构(13)，其工作所需的出入口包括位于电极上游用于输入待滑动分离的细胞混合样品(24)的中间进样入口(18)以及位于中间进样入口(18)两侧的用于控制细胞混合样品流体宽度和位置的两个等宽的两侧鞘流入口(19)、位于电极下游用于收集原样品流(26) 的中间原样流出口(17)和滑动迁移出原样品流的滑动细胞迁移流(25)的两侧迁移流出口(16)。

所述用于高通量连续流细胞分离的V型的扩展电极结构(13)，可以使用绝缘透明材料作为天花板(11)和基底(12)来封装成微流控介电泳芯片，其中天花板(11)材料优选聚二甲基硅氧烷(PDMS)，基底(12)材料优选玻璃。

本发明所述介电泳电极结构及其形成的完整微流控芯片的加工过程如下：

(1)、模具加工；优选通过光刻加工多层SU-8结构，得到电极和流道一体化的结构所需的模具；该模具可以重复多次使用；

(2)、在模具定义的沟槽中填充导电聚合物电极材料，优选AgPDMS填充物，并通过研磨使得AgPDMS填充物与模具上表面平齐，置于加热板上固化 AgPDMS；

(3)、在模具上表面固化一层微流控芯片的天花板(11)的材料，优选PDMS，厚度优选2～6mm；这里的PDMS用于封装一体化的电极和流道结构，上面没有任何图案；

(4)、固化后的PDMS与前述步骤中固化得到的AgPDMS层自然键合成为一体，将这一结构整体从模具上揭下，并在PDMS上打孔形成宏观的流道出入口，然后再将该结构与基底(12)键合，优选玻璃-AgPDMS等离子键合。

本发明采用的滑轨式电极(2)由平整的滑道层(21)连接下层一排等距柱状结构(22)，具有非均匀的侧壁结构，整体呈现为桥梁式结构。由于该滑轨式电极(2)与y方向成一定角度α，所以进入主流道(3)内的细胞同时受到水平方向与竖直方向的介电泳力以及沿样品流动方向的拖拽力，受到正介电泳力的细胞将沿着滑道层(21)的两侧壁向下滑动，最终进入迁移流出口(5，16)，而受到负介电泳力的细胞将随缓冲液流向原样流出口(6，17)，从而实现了对细胞的连续的三维控制与分离，大幅提高了微流控芯片的工作效率。

所述滑轨式电极(2)下层的桥墩型柱状结构(22)沿y方向前后对准形成阵列，同时相邻柱子间隙(23)前后对准形成沿y方向的数条并行分流道(20)，保证受负介电泳力的细胞能够自然顺畅的随缓冲液向下游流动。该并行分流道(20)穿插于滑轨式电极(2)的下层而不影响整根电极的导电的连续性，且流道数量易于扩展，有益于更进一步提高样本通量。

所述用于高通量连续流细胞分离的介电泳电极结构全部由均一的导电聚合物构成，并且通过一次倒模工艺微加工而成，模具可以重复多次使用。填充而得的该电极结构不仅作为电极产生三维非均匀电场进而产生介电泳力场，而且作为流道边界定义了流场特性，担当了主流道(3)的边界和各出入口的边界，同时也将主流道(3)划分为多条并行分流道(20)，允许细胞通过。

所述用于高通量连续流细胞分离的介电泳电极结构，主体电极(1)与出入口流道边界之间设有主绝缘沟道(10)，以保证两侧主体电极(1)处于绝缘状态。在所述电极结构完成天花板与基底的封装后，需填充PDMS至各个主绝缘沟道 (10)中，以防止漏液。

所述用于高通量连续流细胞分离的介电泳电极结构，每根电极指末端与极性相反的主体电极(1)之间，设有窄空隙(4)，以保证相邻电极指的极性相反。

所述用于高通量连续流细胞分离的V型的扩展电极结构(13)，只有其双向的V型滑轨式电极(15)形状与原单向的滑轨式电极(2)不同，主电极(14) 与主绝缘沟道(10)等主流道外围的结构均与原电极结构相同。

所述用于高通量连续流细胞分离的V型的扩展电极结构(13)通过增大主流道(3)的横截面积与并行分流道(20)的数量而不改变芯片长度，进一步提高了样品通量，实现了高通量连续流的细胞分离。

相比现有技术，本发明具有以下有益效果：

本发明提供了一种使用导电聚合物AgPDMS为电极材料的可实现高通量连续流细胞分离的三维微电极结构。相比于现有的AgPDMS电极器件所使用的平面电极和均匀侧壁电极，本发明使用具有非均匀侧壁的三维电极在水平方面和竖直方向同时产生介电力场，实现了对细胞在水平和竖直方向上的三维控制和分离，提高分离纯度；相比于现有的具有非均匀侧壁的AgPDMS电极器件，本发明针对其只能低速批量的分离细胞这一缺陷，通过将叉指电极倾斜一定角度，使受力细胞不再处于被吸附停留的状态而是沿着电极斜向下滑动，并直接流进收集出口，实现了连续流的细胞分离，提高了分离效率。

相比于现有的使用硅基电极的用于连续流细胞分离的器件，本发明针对其由于刻蚀工艺导致的只能制备波浪形滑轨进而导致细胞只能沿电极下侧滑轨滑动的缺陷，利用模具的主观性制备得到平板式的滑道层，上下两侧滑轨均为平滑的直线型，细胞可以同时在电极两侧滑动，大幅提高了细胞分离纯度。此外，相比其金属电极材料，本发明所使用的AgPDMS电极材料以及软光刻倒模工艺避免了复杂的加工过程，降低了加工成本。

附图说明

图1为本发明所述用于高通量连续流细胞分离的介电泳电极结构的一种实施例的整体结构示意图，从左起依次为天花板、电极和流道一体化的结构、基底。

图2为本发明所述用于高通量连续流细胞分离的V型的扩展电极结构的一种实施例的整体结构示意图，从左起依次为天花板、电极和流道一体化的结构、基底。

图3为本发明所述用于高通量连续流细胞分离的介电泳电极结构的一种实施例的叉指电极示意图，分别为(a)俯视图和(b)正视图。

图4为本发明所述用于高通量连续流细胞分离的V型的扩展电极结构的一种实施例的叉指电极示意图，分别为(a)俯视图和(b)正视图。

图5为本发明所述用于高通量连续流细胞分离的介电泳电极结构的一种实施例的单根电极指示意图，分别为(a)主视图(b)翻转图(c)侧视图。

图6为本发明所述结构的微芯片加工流程图。

图7为本发明所述用于高通量连续流细胞分离的介电泳电极结构的一种实施例的细胞分选示意图，分别为(a)通电前，细胞混合状态(b)通电后，细胞分离状态。

图8为本发明所述用于高通量连续流细胞分离的V型的扩展电极结构的一种实施例的细胞分选示意图，分别为(a)通电前，细胞混合状态(b)通电后，细胞分离状态。

图9为将活海拉细胞和死海拉细胞的混合溶液注入本发明具体实施所得的电极结构所制备的微流控芯片中，通电前后两种细胞在流室中的分布图，分别为(a) 通电前(b)通电后。

图10为将海拉细胞和7μm微球的混合溶液注入本发明具体实施所得的V型的电极结构所制备成的微流控芯片中，通电前后两种细胞在流室中的分布图，分别为 (a)通电前(b)通电后。

附图标记如下：1、主体电极，2、滑轨式电极，3、主流道，4、窄空隙，5、迁移流出口，6、原样流出口，7、进样入口，8、右鞘流入口，9、左鞘流入口，10、主绝缘沟道，11、天花板，12、基底，13、扩展电极结构，14、主电极(双向电极结构)，15、双向滑轨式电极，16、两侧迁移流出口，17、中间原样流出口，18、中间进样入口，19、两侧鞘流入口，20、并行分流道，21、滑道层，22、柱状结构，23、柱子间隙，24、细胞混合样品，25、滑动细胞迁移流，26、原样品流。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明进行详细描述，但本发明的实施方式不限于此。

本发明提供了一种用于高通量连续流细胞分离的介电泳电极结构，其制备而成的微流控芯片如图1所示，包括该电极结构和封装的天花板8、基底9。

所述电极结构包含由与主流道3方向呈倾斜角α并横跨主流道3的滑轨式电极2所形成的叉指电极阵列、沿长度方向位于主流道3两侧一对主体电极1、位于电极上游用于输入待滑动分离的细胞混合样品24的进样入口7以及位于进样入口7两侧用于控制细胞混合样品流体宽度和位置的右鞘流入口8和左鞘流入口 9、位于电极下游用于收集原样品流26的原样流出口6和滑动迁移出原样品流的滑动细胞迁移流25的迁移流出口5；所述电极结构与上、下游出入口围成样品的主流道3；

所述主体电极1为一对分别位于主流道3两侧的长方体；主体电极1向外延伸的方向记为x方向，样品流动的方向记为y方向，与x、y方向垂直的主电极高度方向记为z方向；两个主体电极1等高且侧壁平行相对，构成沿y方向的主流道3侧壁；

所述滑轨式电极2所形成的叉指电极阵列由主体电极1位于两侧的电极对交替平行引出，延伸方向与y方向呈角度α并横跨主流道3，与延伸方向对面的主体电极1部分之间留有窄空隙4用于电极之间绝缘；滑轨式电极2与主体电极1 高度相等，相邻电极指沿y方向等距分布；

所述滑轨式电极2分上、下两层结构；上层为长度方向与y方向成α角度的长条状薄层构成的滑道层21，下层为与滑道层21的下表面相连的沿滑道层21 长度方向等距离排列的多个柱状结构22；柱状结构22的轴向沿z方向且与滑道层21下表面垂直；柱状结构22上端面的圆心在滑道层21沿α角度方向的中线上，且滑道层21完全覆盖柱状结构22的上端面；滑轨式电极2所形成的叉指电极阵列的下层的柱状结构22沿y方向前后对准形成阵列，同一滑轨式电极2的相邻柱状结构22之间具有柱子间隙23，滑轨式电极2所形成的叉指电极阵列中沿y方向上的多个柱子间隙23前后对准并形成多条并行分流道20。

或将所述叉指电极阵列中的单向的滑轨式电极2改为双向的V型滑轨式电极15以进一步提高通量，所述V型滑轨式电极15的上层滑道层21由单向的长条状薄层结构改为V型薄层结构，下层柱状结构22随上层滑道层21一起改变且保证两者对应关系不变；所述V型滑轨式电极15与所述的滑轨式电极2一样为电极的一端与两侧的主体电极1连接，另一端留有窄空隙4，V型滑轨式电极 15的V型结构为对称结构，叉指电极阵列中的多个V型尖端连成的线作为对称轴，V型的尖端指向上游中间位置的中间进样入口18。该V型滑轨式电极15制备而成的微流控芯片如图2所示。

所述用于高通量连续流细胞分离的滑轨式介电泳电极结构的滑轨式电极2，其长条状滑道层21由长方体沿y方向旋转角度α得到，其起始端与所连接的主体电极1融合为一体而末端平滑化为弧形；长方体宽度为140μm，高度(即长方体侧壁厚度)为20μm；长方体沿α角度方向延伸的两侧壁即为滑道层21用于细胞滑动的平面，该侧壁在其长度方向(即α角度方向)和竖直方向(即z方向)均笔直均匀，为细胞稳定滑动提供了良好的条件。

所述用于高通量连续流细胞分离的滑轨式介电泳电极结构的滑轨式电极2，其下层柱状结构22厚度(即轴向长度)为50μm，柱状结构的径向最大长度为 100μm；对于同一滑轨式电极2下层的柱状结构22，柱子间隙23为150μm，柱子数量为18个，柱子形状可选但不限于圆柱、圆角矩形柱、立方体柱。

所述用于高通量连续流细胞分离的滑轨式介电泳电极结构的叉指电极2与y 方向的夹角α为30°。

所述用于高通量连续流细胞分离的滑轨式介电泳电极结构的滑轨式电极2 对数为10对，相邻电极指在y方向的间距为320μm。

所述用于高通量连续流细胞分离的滑轨式介电泳电极结构的滑轨式电极2 末端与极性相反的主体电极1之间的窄空隙4为60μm。

所述用于高通量连续流细胞分离的滑轨式介电泳电极结构使用绝缘透明材料作为天花板11和基底12来封装成微流控介电泳芯片，其中天花板11材料为 PDMS，基底12材料为玻璃。

图3为所述用于高通量连续流细胞分离的滑轨式介电泳电极结构的单向的滑轨式电极2，图4为由单向的滑轨式电极2变化而得的双向的V型滑轨式电极 15。所述V型滑轨式电极15可实现更高通量的细胞分离(拓展了宽度，提高了通量，不增加滑动时间，即细胞暴露在电场强度极大值区域的时间)；所述V型滑轨式电极15与主体电极14、各样品出入口共同构成用于高通量连续流细胞分离的V型的扩展电极结构13，所述扩展电极结构13的主电极14与原电极结构的主体电极1相同。

所述用于高通量连续流细胞分离的V型的扩展电极结构13工作所需的出入口包括位于电极上游用于输入待滑动分离的细胞混合样品24的中间进样入口18 以及位于中间进样入口18两侧的用于控制细胞混合样品流体宽度和位置的两个等宽的两侧鞘流入口19、位于电极下游用于收集原样品流26的中间原样流出口 17和滑动迁移出原样品流的滑动细胞迁移流25的两侧迁移流出口16。

所述用于高通量连续流细胞分离的V型的扩展电极结构13使用绝缘透明材料作为天花板11和基底12来封装成微流控介电泳芯片，其中天花板11材料为 PDMS，基底12材料为玻璃。

本发明所述介电泳电极结构及其形成的完整微流控芯片的加工过程如图6 所示，详细描述如下：

(1)模具加工；在硅晶片上分别旋涂并曝光两层SU-8光刻胶，得到相应的图案(如图6步骤1-2)，然后两层光刻胶同时显影得到电极结构的模具(如图 6步骤3)，包括第一层光刻胶形成的待填充的柱状结构和第二层光刻胶形成的待填充的平板滑道结构。

(2)将洗净烘干的银粉按照85％的质量分数比与PDMS混合在一起，在研钵中研磨至AgPDMS呈现膏状(时间约一小时及以上)。将膏状的AgPDMS 均匀覆盖在SU-8模具表面，通过在平整的纸面上按压和研磨使AgPDMS填充满模具上的空白区域且没有多余的AgPDMS残留；将填充好的SU-8模具放在70℃的加热板上加热3小时，使AgPDMS固化(如图6步骤4)。

(3)在(2)所得的填充有AgPDMS的模具表面浇筑PDMS，高度为2-4mm，在70℃的加热板上加热3小时使其固化，形成微流控芯片的天花板11(如图6 步骤5)。

(4)、固化后的PDMS天花板11与AgPDMS电极结构自然键合成为一体，将这一结构整体从模具上揭下，在对应芯片出入口位置的PDMS表面向下方打孔，获得与外界连通的可以插管的流道出入口。

(5)对(4)所得的器件和载玻片进行超声清洗、IPA冲洗、去离子水冲洗，然后用氮气吹干清洁后的器件和载玻片，并在120℃的加热板上加热10分钟以完全去除水分。

(6)将(5)所得的清洁过的器件和载玻片进行等离子键合，获得最终的芯片(如图6步骤6)。

实施例1

本实施例使用上述实施方式所得的滑轨式电极结构所制备成的微芯片和活/ 死海拉细胞进行细胞分离的效果测试，具体步骤如下：

提取出贴壁生长的海拉细胞使其悬浮于细胞培养基中，从中取出约1.5ml细胞悬浮液置于容积为1.5ml的小离心管中，在65℃水浴环境下处理15分钟，用于杀死细胞，将处理后的细胞离心并替换溶液为300mM的D-甘露醇溶液，随后使用碘化丙啶(PI)对死细胞染色两分钟；在剩余的活细胞悬浮液内加入钙黄绿素对活细胞染色10分钟。染色后的活/死细胞按照活细胞：死细胞＝10：1的浓度比混合在电导率为0.01S/m的300mM的D-甘露醇溶液中，得到的混合溶液中活细胞浓度为1×10⁶个/ml，死细胞浓度为1×10⁵个/ml。将该混合溶液以1ml/h的流速由进样入口7注入到上述的微流控芯片中，同时在右鞘流入口8中以0.5ml/h 的速度注入缓冲液(0.01S/m的300mM D-甘露醇溶液)，使用止流夹封闭左鞘流入口9。从两端主体电极1输入幅值为15V_pp，频率为400kHz的正弦信号，在显微镜下观察细胞的运动轨迹。

经观察，在未输入电信号时，活细胞和死细胞都分散在流道中，随溶液流动方向原样流出口6移动，如图9(a)所示。输入电信号后，活细胞受正向介电泳力(pDEP)被吸引至滑道层21侧壁，并在流体拖拽力的作用下沿滑道层21 向下滑动，最终进入迁移流出口5；而死细胞受弱负向介电泳力(nDEP)，随缓冲液通过下层柱状电极间的并行分流道20流向原样流出口6，如图9(b)所示。说明上述介电泳电极结构可以实现细胞的连续分离。

实施例2

本实施例使用上述实施方式所得的V型滑轨式电极结构所制备的微流控芯片和海拉细胞与聚苯乙烯微球的混合溶液进行粒子分选的效果测试，具体步骤如下：

提取出贴壁生长的海拉细胞使其悬浮于细胞培养基中，加入钙黄绿素进行 10分钟染色，随后将细胞悬浮液离心并替换溶液为电导率为0.01S/m的300mM 的D-甘露醇溶液。将离心后7μm微球加入该细胞溶液，得到细胞浓度为1.2× 10⁷个/ml、7μm微球浓度为1×10⁶个/ml的混合溶液。将该溶液以1.2ml/h的流速由中间进样入口18注入到上述的微流控芯片中，同时在两侧鞘流入口19中以 0.5ml/h的速度注入缓冲液(0.01S/m的300mM D-甘露醇溶液)。从两端主电极 14输入幅值为35Vpp，频率为400kHz的正弦信号，在显微镜下观察粒子的运动轨迹。

经观察，在未输入电信号时，绝大部分海拉细胞和7μm微球分散在流道中，在两侧缓冲液的束缚下，随溶液流动方向流向中间原样流出口17，只有少量粒子进入两侧迁移流出口16，如图10(a)所示。输入电信号后，海拉细胞受到正向介电泳力(pDEP)，因此被吸引至滑道层17侧壁，并在流体拖拽力的作用下沿滑道层17向下滑动，最终进入两侧迁移流出口16；而7μm微球受负向介电泳力(nDEP)被电场强度高的区域排斥，聚集在流道中间随缓冲液通过下层柱状电极间的并行分流道20流向中间原样流出口17，如图10(b)所示。说明上述双向介电泳电极结构可以实现连续流的粒子分选，且受到较强nDEP的粒子会聚焦在通道中间，得到更高的分离纯度。

Claims (7)

1.一种用于高通量连续流细胞分离的滑轨式介电泳电极结构，其特征在于，所述电极结构包含由与主流道（3）长度方向呈倾斜角α并横跨主流道（3）的滑轨式电极（2）所形成的叉指电极阵列、沿长度方向位于主流道（3）两侧的一对主体电极（1）、位于电极上游用于输入待滑动分离的细胞混合样品（24）的进样入口（7）以及位于进样入口（7）两侧用于控制细胞混合样品流体宽度和位置的右鞘流入口（8）和左鞘流入口（9）、位于电极下游用于收集原样品流（26）的原样流出口（6）和滑动迁移出原样品流的滑动细胞迁移流（25）的迁移流出口（5）；所述电极结构与上、下游出入口围成样品的主流道（3）；

所述主体电极（1）为一对分别位于主流道（3）两侧的长方体；主体电极（1）向外延伸的方向记为x方向，样品流动的方向记为y方向，与x、y方向垂直的主电极高度方向记为z方向；两个主体电极（1）等高且侧壁平行相对，构成沿y方向的主流道（3）侧壁；

所述滑轨式电极（2）所形成的叉指电极阵列由主体电极（1）位于两侧的电极对交替平行引出，滑轨式电极（2）为单向结构，其延伸方向与y方向呈角度α并横跨主流道（3），与延伸方向对面的主体电极（1）部分之间留有窄空隙（4）用于电极之间绝缘；滑轨式电极（2）与主体电极（1）高度相等，相邻滑轨式电极（2）沿y方向等距分布；

所述滑轨式电极（2）分上、下两层结构；上层为长度方向与y方向成α角度的长条状薄层构成的滑道层（21），下层为与滑道层（21）的下表面相连的沿滑道层（21）长度方向等距离排列的多个柱状结构（22）；柱状结构（22）的轴向沿z方向且与滑道层（21）下表面垂直；柱状结构（22）上端面的圆心在滑道层（21）沿α角度方向的中线上，且滑道层（21）完全覆盖柱状结构（22）的上端面；滑轨式电极（2）所形成的叉指电极阵列的下层的柱状结构（22）沿y方向前后对准形成阵列，同一滑轨式电极（2）的相邻柱状结构（22）之间具有柱子间隙（23），滑轨式电极（2）所形成的叉指电极阵列中沿y方向上的多个柱子间隙（23）前后对准并形成多条并行分流道（20）；

或所述叉指电极阵列中的单向的滑轨式电极（2）改为双向的V型滑轨式电极（15）以进一步提高通量，所述V型滑轨式电极（15）的上层滑道层（21）由单向的长条状薄层结构改为V型薄层结构，下层柱状结构（22）随上层滑道层（21）一起改变且保证两者对应关系不变；所述V型滑轨式电极（15）与所述的滑轨式电极（2）一样为电极的一端与两侧的主体电极（1）连接，另一端留有窄空隙（4），V型滑轨式电极（15）的V型结构为对称结构，叉指电极阵列中的多个V型尖端连成的线作为对称轴，V型的尖端指向上游中间位置的中间进样入口（18）；

所述滑轨式电极（2）的长条状滑道层（21）由长方体沿y方向旋转角度α得到，其起始端与所连接的主体电极（1）融合为一体而末端平滑化为弧形；长方体宽度为120-240μm，高度为15-30μm；长方体沿α角度方向延伸的两侧壁即为滑道层（21），用于细胞滑动的平面，该侧壁在其长度方向和竖直方向均笔直均匀，为细胞稳定滑动提供了良好的条件；

所述介电泳电极结构的滑轨式电极（2）与y方向的夹角α为5-50°。

2.根据权利要求1所述的用于高通量连续流细胞分离的滑轨式介电泳电极结构，其特征在于，所述滑轨式电极（2），其下层柱状结构（22）厚度为40-70μm，柱状结构的径向最大长度为80-200μm；对于同一滑轨式电极（2）下层的柱状结构（22），柱子间隙（23）为100-200μm，柱子数量为15-25个，柱子形状选自圆柱、圆角矩形柱、立方体柱。

3.根据权利要求1所述的用于高通量连续流细胞分离的滑轨式介电泳电极结构，其特征在于，所述叉指电极阵列中滑轨式电极（2）对数为5-15对，相邻两滑轨式电极（2）在y方向的间距为200-400μm。

4.根据权利要求1所述的用于高通量连续流细胞分离的滑轨式介电泳电极结构，其特征在于，所述介电泳电极结构的滑轨式电极（2）末端与极性相反的主体电极（1）之间的窄空隙（4）为40-80μm。

5.根据权利要求1-4任一项所述的用于高通量连续流细胞分离的滑轨式介电泳电极结构，其特征在于，所述电极结构采用导电聚合物电极材料AgPDMS填充物；使用绝缘透明材料作为天花板（11）和基底（12）来封装成微流控介电泳芯片，其中天花板（11）材料选自聚二甲基硅氧烷（PDMS），基底（12）材料选自玻璃。

6.根据权利要求1所述的一种用于高通量连续流细胞分离的滑轨式介电泳电极结构，其特征在于，所述V型滑轨式电极（15）实现更高通量的细胞分离；所述V型滑轨式电极（15）与主电极（14）、各样品出入口共同构成用于高通量连续流细胞分离的V型的扩展电极结构（13），所述扩展电极结构（13）的主电极（14）与原电极结构的主体电极（1）相同。

7.根据权利要求6所述的一种用于高通量连续流细胞分离的滑轨式介电泳电极结构，其特征在于，所述扩展电极结构（13）工作所需的出入口包括位于电极上游用于输入待滑动分离的细胞混合样品（24）的中间进样入口（18）以及位于中间进样入口（18）两侧的用于控制细胞混合样品流体宽度和位置的两个等宽的两侧鞘流入口（19）、位于电极下游用于收集原样品流（26）的中间原样流出口（17）和滑动迁移出原样品流的滑动细胞迁移流（25）的两侧迁移流出口（16）。

Images