KR20090083655A

KR20090083655A - Ｄｅｐ 미세분리기

Info

Publication number: KR20090083655A
Application number: KR1020080009589A
Authority: KR
Inventors: 한기호
Original assignee: 인제대학교 산학협력단
Priority date: 2008-01-30
Filing date: 2008-01-30
Publication date: 2009-08-04
Also published as: KR100947334B1

Abstract

DEP 미세분리기를 제공한다. DEP 미세분리기는 세포 혼합물이 입력되는 입구유로와 입구유로를 통해 입력된 세포 혼합물이 연속적으로 분리되면서 통과하는 중앙유로와 분리된 세포 혼합물이 출력되는 복수개의 출구유로를 포함하는 마이크로채널과, 세포 혼합물의 흐름 방향에 대해 소정 각도로 서로 교차되어 마이크로채널에 배열된 복수개의 전극 및 전극에 전압을 인가하여 전기장을 형성하는 전기장 생성 수단을 포함하고, 전기장을 이용하여 세포 혼합물을 연속적으로 분리하여 출구유로로 출력한다.

혈액, 세포 분리, 유전 영동(DEP), 마이크로플루이딕스(microfluidics)

Description

ＤＥＰ 미세분리기{Dielectrophoretic microseparator}

　본 발명은 DEP 미세분리기에 관한 것으로, 유체 방향에 소정 각도로 위치한 평면형으로 교차한 전극 배열에 의해 생성된 DEP 포스(force)에 기초하여, 세포(미립자)의 분리를 연속적으로 수행하는 DEP 미세분리기에 관한 것이다.

유전영동(dielectrophoresis; DEP) 방법은 이질성의 세포 혼합물(heterogeneous cell mixture)에서 타겟 세포를 분리하는 주요 기술로 알려져 있다. 이것은 혈액으로부터 암세포, 백혈구, 적혈구를 포함하고, CD34+ 조혈 줄기세포(hematopoietic cd34+ stem cell)로부터 암세포, 신경세포, 살아있는 및/또는 죽어있는 효모를 포함한다. DEP 방법의 주요 유익은 마이크로플루이딕 시스템(microfluidic system)과의 손쉬운 통합, 마그네틱 비드(magnetic bead) 또는 형광 프로브(fluorescent probe)와 같은 표지 물질(tagging material)에 대한 요구의 결핍 및 희귀 세포를 분리할 때의 높은 선택성에 있다.

종래 DEP 미세분리기는 분리 로딩(separate loading), 세정(washing), 및 용출(elution)의 단계들을 포함하는 불연속적인 과정으로 동작한다. 먼저, 이질성의 세포 혼합물의 샘플이 DEP 미세분리기에 로드된다. 특정 주파수의 인가 전압은 특 정 타겟 세포에만 양(positive)의 DEP 포스(force)를 생성시키고, 나머지 원치 않는 세포들이 음(negative)의 DEP 포스에 의해 힘을 받고 세정 단계에서 걸러지는 동안, 타겟 세포들은 전극에 트랩(trap)된다. 마지막으로 트랩된 타겟 세포들은 인가된 상기 전압을 차단시키거나 다른 주파수를 이용한 음(negative)의 DEP 포스를 생성시킴으로써 모아진다. 상기 DEP 방법은 그 자체로 타겟 세포들의 특별한 분리를 위한 탁월한 기술로 증명됨에도 불구하고, 종래 DEP 기술은 처리량의 한계를 갖고 있고, 불연속적인 동작 과정으로 인한 복잡한 유체(fluid) 조작을 요구한다. 게다가, DEP 미세분리기는 타겟 세포가 전극에 트랩되도록 하는 양(positive)의 DEP 포스로 이용함으로 인해, 세포와 전극간 원치 않는 부착(adhesion)을 유발시킨다. 트랩된 세포들은 쉽게 릴리스(release)될 수 없을 수 있고, 높은 경사(gradient)의 전기장에 오랫동안 노출됨으로 인해 영향을 받을 수 있다.

상술된 불연속적인 동작 과정의 문제점을 해결하기 위해, DEP 미세분리기들은 유체 흐름 변화(alternating fluid flow), 덮개 흐름(sheath flow), 형체 전극(shaped electrodes), 필러 배열(pillar arrays), 3차원 전극(three-dimensional electrodes) 등을 이용하여 개발되었다. 비록 이러한 DEP 미세분리기가 개발됨에도 불구하고, 이들은 여전히 복잡한 마이크로플루이딕 조작을 요구하고, 분리 처리량의 한계를 갖고 있으며, 구현되기에 어려움은 문제점을 가지고 있다.

가장 치명적인 결점은 종래 DEP 미세분리기가 생리 용액(physiological solution)과 비교하여 조작된 낮은 전도성(도)의 매질(low-conductive suspension medium)로 동작한다는 것이다. 이것은 일반적으로 200kHz 이하의 DEP 분할 주파수 에서 세포의 분리성(separability)을 높이기 위해 필요하다. 상기 주파수에서 DEP 포스는 0(zero)를 교차(traverse)한다. 낮은 전도성의 매질 내에서 조차 몇몇의 포유동물(mammalian) 세포간의 DEP 특성은 매우 비슷하다. DEP와 함께 또 다른 물리적 또는 화학적 원리들을 결합하는 새로운 분리 방법들은 세포 분리성을 증가시키기 위해 개발되어져 왔다. 이러한 것은 DEP field-flow fractionation(FFF)와 DEP-magnetophoretic FFF를 포함한다. 불행히도, 생물학적인 분석은 전도도가 10mScm^-1보다 큰 생리적 매질에서 자주 실행되어져야 한다. 따라서, 매질의 낮은 전도도는 종래 DEP 미세분리기의 치명적인 한계로 꼽힌다.

본 발명은 DEP 미세분리기를 제공하여, 유체 방향에 소정 각도로 위치한 평면형으로 교차한 전극 배열에 의해 생성된 DEP 포스(force)에 기초하여, 세포(미립자)의 분리를 연속적으로 수행하는 데에 그 목적이 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 실시예에 따른 DEP 미세분리기는 세포 혼합물이 입력되는 입구유로와 입구유로를 통해 입력된 세포 혼합물이 연속적으로 분리되면서 통과하는 중앙유로와 분리된 세포 혼합물이 출력되는 복수개의 출구유로를 포함하는 마이크로채널과, 세포 혼합물의 흐름 방향에 대해 소정 각도로 서로 교차되어 마이크로채널에 배열된 복수개의 전극 및 전극에 전압을 인가하여 전기장을 형성하는 전기장 생성 수단을 포함하고, 전기장을 이용하여 세포 혼합물을 연속적으로 분리하여 출구유로로 출력한다.

본 발명의 DEP 미세분리기에 따르면 다음과 같은 장점이 있다.

첫째, 유체 방향에 소정 각도로 위치한 평면형으로 교차한 전극 배열에 의해 생성된 DEP 포스(force)에 기초하여, 종래의 불연속적인 동작 과정으로 인한 복잡한 유체 조작의 한계를 극복하고, DEP 미세분리기가 세포(미립자)의 분리를 연속적으로 수행할 수 있는 장점이 있다.

둘째, 17mScm^-1에서 전도하는 매질(medium)(또는 부유물)에서 전극에 교류 신호를 인가하여 경사 전기장을 형성하고, 이를 통해 DEP 미세분리기가 소정 시간 이내에 희석된 전혈로부터 RBC 및 WBC를 연속적으로 분리할 수 있는 장점도 있다.

셋째, 종래의 매질의 전도도를 제어할 필요없이, DEP 미세분리기가 세포의 연속적인 분리를 수행할 수 있는 장점도 있다.

본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 첨부되는 도면과 함께 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있으며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다. 명세서 전체에 걸쳐 동일 참조 부호는 동일 구성 요소를 지칭한다.

본 발명은 유전영동(DEP) 기반의 측면 이끌림(lateral-driven) 연속형 DEP 미세분리기(이하, DEP 미세분리기라고도 함)를 제안하며, 이를 통해 마이크로채널의 입구유로를 통해 입력된 세포 혼합물(미립자)을 연속적으로 분리하여 복수개의 마이크로채널의 출구유로로 출력할 수 있다. 이하, 본 발명의 실시예에서는 본 발명의 이해를 돕기 위해, 생리적인 조건을 대표하는 PBS(Phosphate-Buffered Saline) 용액을 이용하여 희석된 전혈(whole blood)로부터 혈액 세포를 분리하는 것을 예로 들어 설명하지만 이에 한정되지 않고 다양한 세포 혼합물의 분리에 이용될 수 있음은 물론이다. 또한, 본 발명은 이를 위해 마이크로채널의 통로를 지나는 유체의 방향에 대해 소정 각도로 위치한 평면형으로 교차한 전극 배열(이하, 평면교차 전극배열이라고도 함)를 이용한다. 또한, 본 발명의 실시예에서는 바람직하게는 측면의 음(negative)의 DEP 포스에 기초한 연속적인 분기 타입(divergent type)과 수렴 타입(convergent type)의 DEP 미세분리기를 예로 들어 설명하지만, 이에 한정되지 않고 양(positive)의 DEP 포스를 이용할 수도 있음은 물론이다.

이하, 도 1 내지 도 9를 통해 평면교차 전극배열 및 그 개념적인 원리에 대해서 설명하기로 하며, 도 10 내지 도 13에서는 평면교차 전극배열을 포함한 본 발명의 DEP 미세분리기의 구성에 대해서, 그리고 도 14 내지 도 21에서는 본 발명의 DEP 미세분리기를 이용한 실험 및 그 결과치에 대해서 주로 설명하기로 한다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 평면교차 전극배열의 상면 뷰(top view) 를 도시한다. 도 2는 도 1에서

크로스 섹션(cross-section)을 따라 전속 분포에 대한 시뮬레이션 결과를 포함한 교차된 전극 배열의 크로스 섹션 뷰를 도시한다. 도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 전속선을 가진 교차된 전극 배열상의 전하 분포를 개념적으로 도시한다. 도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 평면교차 전극배열의 단순화된 선전하 모델을 도시한다. 이하 보다 구체적으로 설명하기로 한다.

도 1은 절연 기판(insulating substrate)에 패턴화된 평면교차 전극배열을 사용한 경사 전기장을 생성하는 것을 나타낸다. 평면교차 전극배열은 미립자의 트랩핑(trapping) 및 분리를 위한 효과적인 구조이다. 미립자는 극소형의 세포, 입자들을 포함한 개념일 수 있다. 또한, 도 2에 있어서, 평면교차 전극배열 주위의 전속 밀도 분포는 전극에서 전하의 대부분이 전극의 엣지(edge)에 존재함을 보여준다. 이것은 도 3에 도시된 바와 같이 단순화될 수 있으며, 전극 표면에서 수직 방향의 전속 밀도는 바람직하게는 이하 수식 1과 같이 표현될 수 있다.

[수식 1]

상기 수식 1에 있어서, DN은 전극 표면에서 수직 방향의 전속 밀도를 의미하며, ρ_s는 표면 전하 밀도를 의미한다.

한편, 도 4에 도시된 바와 같이, 평면교차 전극배열은 전극의 양 엣지에 위치한 선전하에 대해 선전하 모델로 표현될 수 있다. 이러한 단순화된 모델을 사용하는 (고전도도) 매질(suspension medium)과 절연 기판(insulating substrate) 사 이에 위치한 선전하의 전기장 강도

는, 바람직하게는 이하 수식 2과 같이 표현될 수 있다.

[수식 2]

상기 수식 2에 있어서, εm와 εs은 매질과 절연 기판(도 3 참조)의 유전율을 의미하고, R은 선전하로부터의 거리,

는 선전하로부터 라디컬(radical) 방향에 있어서의 단위 벡터이다.

상기 도 1에서, 2d (후술될 도 5 참조)의 간격과 폭을 가진 교차된 전극에 교류 전압(신호) Vin이 적용될 때, 바람직하게는 선전하 밀도 ρ_L은 이하 수식 3와 같이 표현될 수 있다.

[수식 3]

상기 수식 3에 있어서,

는 도 4에 있어서 선전극의 유효 반경이다. 메탈 이베포레이션(metal evaporation)을 사용한 평면형 전극의 경우에 있어서, 선전극의 유효 반경

는 전극 자체의 두께에 근접한다.

이하, 도 5에서 교차된 전극 배열을 포함한 DEP 미세분리기의 원리에 대해서 보다 구체적으로 설명하기로 한다.

도 5에 도시된 바와 같이, 세포상에 작용하는 새로운 포스 벡터는 y’방향 콤포넌트이다. 결과적으로, 세포는 초기 x’방향에서 초기 트러젝토리(trajectory)로부터 측면으로 y’방향으로 전환된다.

도 5에서, x=-2d로부터 x=2d까지 교차된 전극을 통해 세포가 통과하는 동안 |x| ≥5d의 먼 전극으로부터의 전기장은 단순히 무시 할 수 있다. 상술된 수식 2와 수식 3을 사용한 세포상에서 작용하는 전기장 강도

은, 바람직하게는 이하 수식 4와 같이 표현될 수 있다.

[수식 4]

상기 수식 4에 있어서,

는 수식 5와 같이 정의될 수 있다.

[수식 5]

상기 수식 5에 있어서, z는 전극 배열로부터 세포의 부상 높이(levitation height)를 의미한다.

한편, 도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 2d(=50μm) 의 간격 및 폭을 가진 교차된 전극에서 x=-50μm로부터 50μm까지

의 계산된 값과 시뮬레이션된 값 들을 나타낸다. 계산된 결과값들은 C 프로그램을 사용하여 수치적으로 산출되었으며, 시뮬레이션된 결과값들은 ANSYS 소프트웨어(ANSYS, USA)를 사용하여 얻어졌다. x 축상에서 해치된 바(hatched bar)는 전극 요소를 나타낸다. 이하, 보다 구체적으로 설명하기로 한다.

도 6에서, z=5μm, z=7.5μm과 z=10μm의 다른 부상 높이에서 x=-2d로부터 x=2d까지

의 계산된 값과 시뮬레이션된 값을 비교한다. 이론적인 계산 및 시뮬레이션을 위해 사용된 값들은 전극의 두께인 전극의 유효 반경으로

=0.2μm, 매질과 (절연) 기판의 유전율로

과

, 교차된 전극의 간격 및 폭으로 2d =50μm 값들이 사용되었다.

전극의 안쪽에 위치된 전하들을 무시하는 상기 도 4의 단순화된 선전하 모델을 사용하고 있는, 도 6에서, 계산된 결과는 시뮬레이션된 결과보다 일반적으로 더 낮다. 두 결과의 절대 크기가 차이가 있음에도 불구하고 두 결과의 전체적인 형태는 잘 일치한다. 다시 말해, 후술될 수식 6에서 설명되는 DEP 포스에서 실제적인 역할을 수행하는

의 피크-투-피크(peak-to-peak) 값은 이론적인 결과와 시뮬레이션된 결과가 대략적으로 같다. 이로부터 단순화된 선전하 모델로부터의 이론적인 결과들은 또한 다른 교차된 전극 배열들의 연구 결과와 비교될 수 있다.

상술된 도 5에서 도시된, 시간 평균(time-averaged) x 방향의 DEP 포스인

는 바람직하게는 수식 6과 같이 정의될 수 있다.

[수식 6]

상기 수식 6에 있어서, fCM 는 이하 수식 7과 같이 정의될 수 있다.

[수식 7]

상기 수식 6 및 수식 7에 있어서, Vc는 세포 부피, fCM 는 Clausius-Mossitti 팩터(factor), ε^*c(ω) 및 ε^*m(ω)는 각각 세포와 매질의 콤플렉스(complex) 유전율을 의미한다. 파라미터 ω는 전기장의 라디안(radian) 주파수이다. 각 유전율은 ε^*=ε-j(σ/ω) 형식을 취하고, 여기서 j =

이고, ε 는 유전상수, σ은 전기 전도도를 의미한다.

상기 수식 6은 DEP 응답을 결정하는 세포의 속성들이 Clausius-Mossitti 팩터 fCM 에 의해 결정된다는 것을 설명한다. 다시 말해, 매질에서 유전체전기영동 속성들은 세포 내부의 유전율과 전도도, 매질(medium)의 유전율과 전도도, 적용되는 전기장의 주파수에 의해 결정된다. 음(negative)의 DEP가 Re[fCM]<0로 생성되는 동안, 양(positive)의 DEP는 Re[fCM]>0로 생성된다. 참고로, 음(negative)의 DEP는 미립자에 미치는 유전 상수가 매질보다 작을 경우로 미립자가 전기장의 구배가 작은 쪽으로, 양(positive)의 DEP는 미립자에 미치는 유전 상수가 매질보다 클 경우 로 미립자가 전기장의 구배가 큰 쪽으로 움직이는 것을 의미할 수 있다. 세포와 매질의 유전체 속성들의 어떠한 주어진 조건에서, 매질에서 부유된 세포에서의 DEP 응답은 적용된 주파수 및 부상 높이의 함수이다. 수식 3 내지 수식 5로부터 수식 6은 이하, 수식 8과 같이 표현될 수 있다.

[수식 8]

그리고, 도 7은 RBC(Red blood cell)(Vc=90μm³)에서 작용하는 x 방향 DEP 포스를 나타낸다. 다른 파라미터들은 Re[fCM]=-0.5, Vin=1Vrms, θ=30°와

=0.2μm이다. 즉, 상기 도 5에서 x=-2d로부터 x=2d 까지 지나가는 세포에서 계산된 x 방향 DEP 포스를 나타낸다. 전극 엣지로부터 약간 안쪽으로 생성된 DEP 포스 피크(peak)는 전극 엣지의 바깥쪽으로 생성된 것보다 다소 더 크다. 이러한 것은 도 6와 일치하고, 도 6은 전극에 대해 생성된

의 피크-투-피크(peak-to-peak) 값이 전극 사이 생성된 것보다 더 크다는 것을 나타낸다. 전극과 흐름 방향 사이 각도 θ에서 도 5에 도시된 바와 같이 교차된 전극 배열을 통해 지나가는 세포를 고찰해 보자.

[수식 9]

상기 수식 9에 있어서, Ff는 세포에 있어서 유체 드래그(drag) 포스이고, 그리고 세포는 ±ρ_L 선전하를 포함한 선전극을 지나갈 것이다. 세포에 있어서 전체 포스 벡터는 바람직하게는 이하 수식 10과 같이 표현될 수 있다.

[수식 10]

그리고, 세포의 속도(velocity)

는 이하 수식 11과 같이 표현될 수 있다.

[수식 11]

상기 수식 11에 있어서,

은 매질에서 세포의 점성률(viscosity)을 의미하고,

는 속도에 수직된 최대 횡단면을 의미하고,

은 속도 벡터의 방향에서 세포의 특징적인 길이를 의미한다. 부상 높이 z는 상수이고, 속도

는 수식 12와 같이 정의될 수 있다.

[수식 12]

수식 11 및 수식 12에 있어서, x 및 y 방향 컴포넌트들은 매치되고, 수식 13 및 수식 14와 같이 정의될 수 있다.

[수식 13]

[수식 14]

도 5에서, del y 는 수식 13과 수식 14의 수치적인 결과를 사용하여 얻어질 수 있으며, 바람직하게는 수식 15와 같이 정의될 수 있다.

[수식 15]

도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 z=5μm, z=7.5μm과 z=10μm 부상 높이에서 x=-50μm과 50μm 사이 값들에 대해 del y’의 계산된 값을 나타낸다. 전극과 유체 흐름의 방향 사이 θ각도를 가진 교차된 전극 배열에 대해 지나가는 세포는 도 5에 도시된 바와 같이 측 방향으로 이끌린다. 측면(lateral) DEP 포스는, 도 8에 도시된 바와 같이, 세포에서 DEP 포스의 크기에 의해 결정된다. 이것은 수식 8에서 설명된 바와 같이, 부상 높이 z와 적용된 주파수에 의해 결정된다.

도 9는 17mScm-1의 높은 전도성을 가진 매질에서, RBC, Monocytes, T- 및 B- Lymphocytes, 그리고 Granulocytes 에 대해 Re[fCM]를 의존하는 주파수를 도시한다. 계산된 결과값들은 세포의 유전영동 특성연구인 Yang의 연구들로부터 얻어진 세포의 유전체 파라미터들을 기초한다. 이하, 보다 구체적으로 후술하기로 한다.

수식 7에서, 17mScm^-1의 전도도를 가진 생리 용액과 같은 전도성의 매질에 대해, Yang의 연구들로부터 이러한 유전체의 파라미터에 기초한, 세포를 위한 Clausius-Mossitti 팩터의 실질적인 부분은, 도 9에 도시된 바와 같이 2MHz 미만의 전기적인 주파수에 대해 약 -0.5이다. 다시 말해, 생리적인 매질에서 부양되는 세포에서 작용하는 DEP 포스는 5MHz 미만 주파수 범위에 대해 전형적으로 음(negative)의 DEP 포스고, 마이크로채널(microchannel)에서 세포들을 상향으로 움직이게 한다. 결론적으로, 2MHz 미만 주파수 범위에 대한 조건하에서, del y는 세포의 부상 높이에 의해 크게 좌우된다. 혈액에 있어서, 인간의 RBC(Red Blood Cell)와 WBC(White Blood Cell)의 전형적인 밀집 밀도는 각각 약 1130과 1050~1080 kg/m³이다. 따라서, RBC의 부상 높이는 WBC의 부상 높이보다 낮고, RBC에서 작용하는 DEP 포스는 WBC에서 작용하는 DEP 포스보다 더 강하게 된다.

이하에서는, 상술된 원리를 이용하여, 유체 방향의 소정 각도로 위치한 평면형으로 교차한 전극 배열(평면교차 전극배열)에 의해 생성된 DEP 포스(force)에 기초한 연속적인 분기 타입(divergent type)과 수렴 타입(convergent type) 미세분리기에 대해 구체적으로 설명하기로 한다.

도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 교차된 전극 배열에서 DEP 미세분리기의 분기 타입을 도시한다. 그리고, 도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른 교차된 전극 배열에서 DEP 미세분리기의 수렴 타입을 도시한다. 마이크로채널은 세포 혼합물 이 입력되는 입구유로와 입구유로를 통해 입력된 세포 혼합물이 연속적으로 분리되면서 통과하는 중앙유로와 분리된 세포 혼합물이 출력되는 복수개의 출구유로를 포함한다.

도 10의 분기 타입에 있어서, 전극은 입구유로 방향으로 중심선을 중심으로 소정 각도(θ)로 꺾여 교차된 형태이고, 따라서 세포들은 마이크로채널의 통로를 지나갈 때, θ 각에서 평면형 교차 전극을 지나간다. 즉, 전극1은 중심선을 중심으로 소정 각도로 꺾여 있고, 전극2도 중심선을 중심으로 소정 각도(θ)로 꺾여 전극1과 서로 교차되어 배열된다. 한편, 다른 실시예에서는 전극1과 전극2가 중심선을 중심으로 소정 각도로 꺾이지 않고, 단지 세포 혼합물의 흐름 방향에 대해 소정 각도로 서로 교차되어 상기 마이크로채널에 배열된 형태일 수 있다. 상술된 분석에 따라, 세포들은 마이크로채널의 측면(엣지)으로 이끌려진다. 이에 반해, 수렴 타입 DEP 미세분리기에 있어서, 세포들은 마이크로채널의 중앙으로 힘을 받는다.

미세분리기의 분기 타입에서, WBC 및 RBC이 마이크로채널의 양쪽 엣지로 이끌려짐에도 불구하고, RBC에서 작용하는 측면(lateral) DEP 포스는 상술된 바와 같이 WBC에서 작용하는 측면(lateral) DEP 포스 보다 강하다. 따라서, WBC는 마이크로채널 양쪽 엣지의 RBC의 고밀도 스트림으로부터 떨어진 마이크로채널의 (중심선을 중심으로) 중앙으로 향해 확산한다. 결과적으로, 도 10에 도시된 바와 같이, WBC는 중앙 출구유로 #2, RBC는 두 개의 가장 바깥쪽 출구유로 #1 및 #3로 연속적으로 분리된다.

도 11에 도시된 바와 같이, 미세분리기의 수렴 타입에서 전극은 출구유로 방 향으로 중심선을 중심으로 소정 각도로 꺾여 교차된 형태이다. 여기서 WBC에서 작용하는 측면(lateral) DEP 포스는 RBC에서 작용하는 측면(lateral) DEP 포스 보다 강하다. 따라서, WBC는 마이크로채널의 중앙의 RBC의 고밀도 스트림으로부터 떨어진 마이크로채널의 엣지 쪽으로 확산한다. 결과적으로, WBC는 두 개의 가장 바깥쪽 출구유로 #1 및 #3와 RBC는 중앙 출구유로 #2로 연속적으로 분리된다.

이하, 마이크로 제조 공정에 대해서 구체적으로 설명하기로 한다.

도 12는 본 발명의 일 실시예에 따른 글라스 및 PDMS 매질에 기초한 DEP 미세분리기의 마이크로 제조 공정을 나타낸다.

DEP 미세분리기에 대해 마이크로 제조 공정은 0.7 mm 두께 보로플로트 글라스 슬라이드(Borofloat glass slide)(Howard glass, USA)와, 메탈 이베포레이션 및 글라스-투-PDMS(glass-to-PDMS) 본딩(bonding)과 함께 주요 구조 재료로서 polydimethylsiloxane(PDMS) 몰드(mold)를 사용된다.

도 12의 (a)에 도시된 바와 같이, DEP 전극(전극1, 전극2)들은 AZ1512 포토레지스트(photoresist)(AZ Electronic Materials, USA)를 사용한 글라스 기판(602)상에 패턴화 및 이베포레이트(evaporated)된 Cr/Au(200Å/2000Å)로 만들어진다.

도 12의 (b)에 도시된 바와 같이, SU-8 2050 포토레지스트(Microchem, USA)의 100μm 레이어는 스펀(spun) 및 패턴화되어 SU-8(604) 및 글라스(602) 사이 부착(adhesion)을 늘리기 위해 이베포레이트된 1000Å Cr 레이어(606)와 함께, 글라스 마스터상에 마이크로채널을 위해 폴리머 몰드를 생성한다. 도 12의 (b)에서 폴리머 몰드(polymer mold)(608)는 stereolithography(Viper SI2, 3D Systems, USA) 를 사용하여 생성되고, 액체 PDMS를 붓기 위해 사용되어진다. PDMS 몰드(608)는 글라스 마스터 및 폴리머 몰드를 조합함으로써 구현될 수 있다. 10:1 비율 (Sylgard 184, Dow Corning, USA)에서 레진(resin)과 경화 에이전트(curing agent)를 혼합하여 만들어진 액체 단계 PDMS는, PDMS 몰드(608)에 부어지고 진공 오븐(oven) (OV-11, JeioTech, Republic of Korea)에서 80°C에서 60분 동안 경화된다. PDMS 몰드(608)에서 PDMS 복제(replica)를 벗겨낸 후, PDMS 복제의 입구유로와 출구유로 레저보어(reservoir)들은 2mm 직경 펀치(punch)를 사용하여 만들어진다. 평면형 교차된 전극 배열을 가진 글라스 기판 및 PDMS 복제는 6.8W RF 파워(PDC-32G-2, Harrick Plasma, USA)에 대해 산소 플라즈마로 다루어진다. 이러한 것들은 PDMA 얼라이너(aligner)(MDA-4000B, Midas System, Republic of Korea)를 사용하여 한 줄로 정렬되거나 접착된다. 마지막으로, 마이크로채널 벽으로 세포의 부착을 감소시키기 위해, 마이크로채널 표면은 Pluronic-F108 surfactant (BASF, USA)로 24시간 동안 코팅된다.

이하, 분기 타입 DEP 미세분리기에 대해 보다 구체적으로 설명하기로 한다.

도 13은 본 발명의 일 실시예에 따른 DEP 미세분리기의 제조된 마이크로그래프를 도시한다. 상술된 바와 같이 DEP 미세분리기는 분기 타입(710)과 수렴 타입(720)으로 구현될 수 있으며, 도 13은 이에 대한 제조된 마이크로그래프의 예를 도시한다. 여기서, 붉은 염료가 마이크로채널을 선명하게 묘사하는 데에 사용되었으며, 이하 보다 구체적으로 설명하기로 한다.

DEP 미세분리기에 있어서, 전기장 생성 수단(1302)(AFG3021, Tektronix, USA)은 바람직하게는 3Vp-p의 2MHz 정현파 전압(교류 신호)을 인가하여 전기장을 형성하고 이를 통해 세포에서 작용하는 DEP 포스를 생성한다. 그리고, 상기 전기장을 통해 생성된 DEP 포스(force)에 기초하여 세포 혼합물은 연속적으로 분리될 수 있다. 전기장 생성 수단(1302)은 분기 타입에서 입구유로를 통해 입력된 전혈(whole blood)에 대해 WBC(White Blood Cell)에 작용하는 측면(lateral) DEP 포스보다 RBC(Red blood cell)에 작용하는 DEP 포스가 더 강하도록 전기장을 형성하여, 상기 WBC를 상기 마이크로채널의 중앙 출구유로로 흐르도록 하고 상기 RBC를 상기 마이크로채널의 바깥쪽 출구유로로 흐르도록 하여 각각 연속적으로 분리한다. 또한, 전기장 생성 수단(1302)은 수렴 타임에서 입구유로를 통해 입력된 전혈에 대해 RBC에 작용하는 DEP 포스보다 WBC에 작용하는 측면(lateral) DEP 포스가 더 강하도록 전기장을 형성하여, 상기 RBC를 상기 마이크로채널의 중앙 출구유로로 흐르도록 하고 상기 WBC를 상기 마이크로채널의 바깥쪽 출구유로로 흐르도록 하여 각각 연속적으로 분리한다.

한편, 시린지 펌프(1304)(syringe pump)(KD100, KD Scientific, USA)를 사용하여 마이크로채널을 통해 흐르는 유체의 흐름을 제어한다. 또한, 가스-타이트 시린지(1306)(gas-tight syringe)(81227, Hamilton, USA)는 유체의 흐름 속도에서 변화를 최소화한다. 상기 입력 수단(1304, 1306)은 0.25mm 내부 직경 모세 유관(capillary tubing)(

FER

tubing, Upchurch Scientific, USA)을 통해 입구유로로 연결되어 마이크로채널에서 혈액(또는 세포 혼합물)을 푸쉬한다. 또한, 마이크로채널을 통해 지나가는 세포의 이미지들을 측정하고 캡쳐하기 위해, 형 광 검출기(Y-FL, Nikon Instruments)를 포함한 마이크로스코프(microscope)(ME600, Nikon Instruments, USA)가 사용된다.

한편, 혈액(샘플)은 PBS 용액 (

10010, Invitrogen, USA)을 포함한 1 대 5 비율에서 희석된 항응고처리된(anti-coagulated)(Heparin-Agarose, H-1027, Sigma Diagnostics, USA) 사람 전혈로부터 준비될 수 있다.

또한, 전도도 미터(

740, Nova Analytics, Germany)(미도시)가 사용되어, 생리적 매질의 전도도에 해당하는 17mScm-1이 보장된다. 형광 프로브는 cell-permeable nucleic acid fluorescent dye(S-7575, Invitrogen, USA)를 포함한 20분 동안 37°C에서 인큐베이팅함으로써 WBC에 추가된다.

도 14 및 도 15는 2MHz의 정현파 전압 3Vp-p를 가진

(예를 들어,) 체적(volumetric) 흐름 비율에서 분기 타입 DEP 미세분리기(710)의 마이크로채널을 통해 지나가는 형광 프로브를 포함한 RBC 및 WBC의 이미지를 도시한다.

그리고, 도 16은 인가된 전압 없이

흐름 비율에서 분기 타입 DEP 미세분리기(710)의 마이크로채널을 통해 지나가는 세포를 도시한다. 이미지는 WBC가 마이크로채널의 중앙에 집중되고, 중앙 출구유로 #2로 흐르는 동안, RBC가 마이크로채널의 엣지에 가깝게 이끌려지고, 두 개의 가장 바깥쪽 출구유로 #1및 #3로 흐르는 것을 보여준다.

도 17은 본 발명의 일 실시예에 따른 분기 타입 DEP 미세분리기의 각 출구유 로에서 RBC 및 WBC의 측정된 상대적인 분리 퍼센티지를 도시한다. 에러 바(error bar)들은 세 개의 데이터셋으로부터 하나의 표준 편차를 나타낸다. 이하, 보다 구체적으로 설명한다.

Hemocytometer를 사용하는 각 측정된 출구유로에서 RBC 및 WBC의 상대적인 분리 퍼센티지(percentage)를 보여주는 도 17은, 분기 타입 DEP 미세 분리기가 가장 바깥쪽 출구유로를 지나가는 RBC의 87.0% 및

흐름 비율에서 중앙 출구유로를 지나가는 WBC의 92.1%를 분리하는 것을 나타낸다. 도 16은 인가된 전압이 없는 것을 나타내고, 동일한 흐름 비율에서 분기 타입 DEP 미세 분석기의 마이크로채널을 지나가는 세포의 분리가 없다.

이하, 수렴 타입 DEP 미세분리기에 대해 보다 구체적으로 설명하기로 한다.

도 18 및 도 19는 2MHz의 정현파 전압 3Vp-p를 가진

체적(volumetric) 흐름 비율에서 수렴 타입 DEP 미세분리기(720)의 마이크로채널을 통해 지나가는 형광 프로브(또는 형광 물질)를 포함한 RBC 및 WBC의 이미지를 도시한다. 그리고, 도 20은 인가된 전압 없이

흐름 비율에서 수렴 타입 DEP 미세분리기(720)의 마이크로채널을 통해 지나가는 세포를 도시한다. 분기 타입과 달리, 이미지는 WBC가 마이크로채널의 엣지에 가깝게 이끌려지고 두 개의 가장 바깥쪽 출구유로 #1및 #3로 흐르는 동안, RBC가 마이크로채널의 중앙에 집중되고, 중앙 출구유로 #2로 흐르는 것을 보여준다.

도 21은 수렴 타입 DEP 미세분리기의 각 출구유로에서 RBC 및 WBC의 측정된 상대적인 분리 퍼센티지를 도시한다. 에러 바(error bar)들은 세개의 데이터셋으로부터 하나의 표준 편차를 나타낸다. 이하, 보다 구체적으로 설명한다.

각 출구유로에서 RBC와 WBC의 측정된 상대적인 분리 퍼센티지를 나타내는 도 21은, 수렴 타입 DEP 미세분리기가 중앙 출구유로를 지나가는 RBC의 93.6% 및

흐름 비율에서 가장 바깥쪽 출구유로를 지나가는 WBC의 76.9%를 분리하는 것을 나타낸다. 도 20은 인가된 DEP 전압이 없는 동일한 흐름 비율에서 수렴 타입 DEP 미세분리기의 마이크로채널을 지나가는 혈액 흐름을 나타낸다.

이러한 실험 결과들은 분기 타입과 수렴 타입 DEP 미세분리기들 양쪽 모두가 연속적인 동작으로 5분 이내에 RBC 및 WBC를 분리할 수 있음을 나타낸다.

상술된 바와 같이, DEP 포스에 기초한 DEP 미세분리기의 분기 타입과 수렴 타입을 제안한다. 본 발명의 실시예를 통해 17mScm^-1의 높은 전도도를 포함한 매질에서 RBC 및 WBC가 성공적으로 분리될 수 있다. 그리고, 상술된 바와 같이 평면형 전극 배열에 의해 생성된 DEP 현상의 분리를 단순화하기 위해 선전하 모델이 제시되었다. 실험적인 결과치들은 수렴 타입이 RBC의 93.6% 및 WBC의 76.9%를 분리할 수 있는 동안, 분기 타입 DEP 미세 분리기가 17mScm^-1의 높은 전도도를 포함한 매질에서 (경사) 전기장을 생성하기 위해 2MHz의 3Vp-p 교류 전압(정현파 전압)을 사용함으로써 소정 시간 이내에RBC의 87.0% 및 희석된 전혈로부터 WBC의 92.1%를 연속적으로 분리할 수 있음을 나타낸다. 이러한 DEP 미세분리기는 유전자 샘플 표본 및 혈액 원인 질병과 같은 특정 용도에서 전혈로부터 핵이 있는 세포 또는 WBC의 분리 를 용이하게 한다.

이상 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 실시예를 설명하였지만, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 평면교차 전극배열의 상면 뷰(top view)를 도시한다.

도 2는 도 1에서

크로스 섹션(cross-section)을 따라 전속 분포에 대한 시뮬레이션 결과를 포함한 교차된 전극 배열의 크로스 섹션 뷰를 도시한다.

도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 전속선을 가진 교차된 전극 배열상의 전하 분포를 개념적으로 도시한다.

도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 평면교차 전극배열의 단순화된 선전하 모델을 도시한다.

도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 교차된 전극 배열을 포함한 DEP 미세분리기의 원리를 도시한다.

도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 2d =(50μm)의 간격 및 폭을 가진 교차된 전극에서 x=-50μm로부터 50μm까지

의 계산된 값과 시뮬레이션된 값들을 나타낸다.

도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 RBC(Vc=90μm³)에서 작용하는 x방향 DEP 포스를 나타낸다.

도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 z=5μm, z=7.5μm과 z=10μm 부상 높이에서 x=-50μm과 50μm 사이 값들에 대해 del y’의 계산된 값을 나타낸다.

도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 17mScm-1의 높은 전도성을 가진 매질에 서, RBC(Red blood cell), Monocytes, T- 및 B- Lymphocytes, 그리고 Granulocytes 에 대해 Re[fCM]를 의존하는 주파수를 도시한다.

도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 교차된 전극 배열에서 DEP 미세분리기의 분기 타입을 도시한다.

도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른 교차된 전극 배열에서 DEP 미세분리기의 수렴 타입을 도시한다.

도 12는 본 발명의 일 실시예에 따른 글라스 및 PDMS 매질에 기초한 DEP 미세분리기의 마이크로 제조 공정을 도시한다.

도 13은 본 발명의 일 실시예에 따른 DEP 미세분리기의 제조된 마이크로그래프를 도시한다.

도 14 및 도 15는 본 발명의 일 실시예에 따른 2MHz의 정현파 전압 3Vp-p를 가진

체적(volumetric) 흐름 비율에서 분기 타입 DEP 미세분리기의 마이크로채널을 통해 지나가는 형광 프로브를 포함한 RBC 및 WBC의 이미지를 도시한다.

도 16은 본 발명의 일 실시예에 따른 인가된 전압 없이

흐름 비율에서 분기 타입 DEP 미세분리기의 마이크로채널을 통해 지나가는 세포를 도시한다.

도 17은 본 발명의 일 실시예에 따른 분기 타입 DEP 미세분리기의 각 출구유로에서 RBC 및 WBC의 측정된 상대적인 분리 퍼센티지를 도시한다.

도 18 및 도 19는 본 발명의 일 실시예에 따른 2MHz의 정현파 전압 3Vp-p를 가진

체적(volumetric) 흐름 비율에서 수렴 타입 DEP 미세분리기의 마이 크로채널을 통해 지나가는 형광 프로브를 포함한 RBC 및 WBC의 이미지를 도시한다.

도 20은 본 발명의 일 실시예에 따른 인가된 전압 없이

흐름 비율에서 수렴 타입 DEP 미세분리기의 마이크로채널을 통해 지나가는 세포를 도시한다.

도 21은 본 발명의 일 실시예에 따른 수렴 타입 DEP 미세분리기의 각 출구유로에서 RBC 및 WBC의 측정된 상대적인 분리 퍼센티지를 도시한다.

<도면의 주요 부분에 관한 부호의 설명>

602: 글라스 기판 604: SU-8

606: 1000Å Cr 레이어 608: 폴리머 몰드

1302: 전기장 생성 수단 1304: 시린지 펌프

1306:가스-타이트시린지

Claims

세포 혼합물이 입력되는 입구유로와 상기 입구유로를 통해 입력된 상기 세포 혼합물이 연속적으로 분리되면서 통과하는 중앙유로와 분리된 상기 세포 혼합물이 출력되는 복수개의 출구유로를 포함하는 마이크로채널;

상기 세포 혼합물의 흐름 방향에 대해 소정 각도로 서로 교차되어 상기 마이크로채널에 배열된 복수개의 전극; 및

상기 전극에 전압을 인가하여 전기장을 형성하는 전기장 생성 수단을 포함하고, 상기 전기장을 이용하여 세포 혼합물을 연속적으로 분리하여 상기 출구유로로 출력하는, DEP 미세분리기.
제 1항에 있어서,

상기 전기장 생성 수단은 상기 전극에 교류 신호를 인가하고 상기 전기장을 통해 생성된 DEP 포스(force)에 기초하여 상기 세포 혼합물을 연속적으로 분리하는, DEP 미세분리기.
제 2항에 있어서,

상기 전극은 상기 마이크로채널의 중심선을 중심으로 소정 각도로 꺾인 형태로 서로 교차되어 배열된, DEP 미세분리기.
제 3항에 있어서,

상기 전극은 상기 입구유로의 방향으로 상기 중심선을 중심으로 소정 각도로 꺾여 서로 교차되어 배열된, DEP 미세분리기.
제 3항에 있어서,

상기 전극은 상기 출구유로의 방향으로 상기 중심선을 중심으로 소정 각도로 꺾여 서로 교차되어 배열된, DEP 미세분리기.
제 4항에 있어서,

상기 전기장 생성 수단은 상기 입구유로를 통해 입력된 전혈(whole blood)에 대해 WBC(White Blood Cell)에 작용하는 측면(lateral) DEP 포스보다 RBC(Red Blood Cell)에 작용하는 DEP 포스가 더 강하도록 상기 전기장을 형성하여, 상기 WBC를 상기 마이크로채널의 중앙 출구유로로 흐르도록 하고 상기 RBC를 상기 마이크로채널의 바깥쪽 출구유로로 흐르도록 하여 연속적으로 분리하는, DEP 미세분리기.
제 5항에 있어서,

상기 전기장 생성 수단은 상기 입구유로를 통해 입력된 전혈에 대해 RBC에 작용하는 측면 DEP 포스보다 WBC에 작용하는 측면(lateral) DEP 포스가 더 강하도록 상기 전기장을 형성하여, 상기 RBC를 상기 마이크로채널의 중앙 출구유로로 흐르도 록 하고 상기 WBC를 상기 마이크로채널의 바깥쪽 출구유로로 흐르도록 하여 연속적으로 분리하는, DEP 미세분리기.
제 6항 또는 제 7항에 있어서,

상기 전극의 양 엣지에 위치한 선전하에 대한 선전하 모델에 있어서, 고전도도 매질과 기판 사이에 위치한 선전하의 전기장 강도
는,
수식으로 정의되고, 상기 수식에 있어서 εm와 εs은 각각 매질과 기판의 유전율, R은 선전하로부터의 거리,
는 선전하로부터 라디컬(radical) 방향에 있어서의 단위 벡터, ρ_L은선전하 밀도를 의미하는, DEP 미세분리기.
제 3항에 있어서,

상기 세포 혼합물을 상기 입구유로로 푸쉬(push)하는 입력 수단을 더 포함하는, DEP 미세분리기.
제 9항에 있어서,

상기 입력 수단은 상기 마이크로채널을 통해 흐르는 유체의 흐름을 제어하는 시린지 펌프를 포함하는, DEP 미세분리기.