KR100593792B1

KR100593792B1 - 다중 유전영동 기반 미세유체칩, 이를 채용한 전혈 분석용미세 유체 시스템 및 전혈 분석 방법

Info

Publication number: KR100593792B1
Application number: KR1020040115303A
Authority: KR
Inventors: 박제균; 최성용
Original assignee: 한국과학기술원
Priority date: 2004-12-29
Filing date: 2004-12-29
Publication date: 2006-06-30

Abstract

본 발명은 다중 유전영동 기반 미세유체칩, 이를 채용한 전혈분석용 미세유체 시스템 및 전혈분석 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 세포 또는 미세입자 주입부(1)와; 주입된 상기 세포 또는 미세입자를 유전영동력(dielectrophoresis force)에 의해 선택적으로 편향시켜 다종의 세포 또는 미세입자들로 분리하기 위한 적어도 1 개 이상으로 구성된 구부러진 미세유체 채널부와; 상기 편향된 세포입자를 확장분리하기 위한 미세확장채널(3)(microexpansion channel)부와; 및 상기 세포입자의 타입수 만큼의 배출부(4)~(7)로 구성된 것임을 특징으로 하는 다중 유전영동(multistage dielectrophoresis; MSDEP) 기반 미세유체칩, 전혈분석용 미세유체 시스템 및 상기 다중 유전영동 기반 전혈 분석 방법에 대한 것으로서, 본 발명에 의하면 종래 일선 병원 등에서 수행되고 있는 전혈분석 방법과는 달리 세포 회수율이 높고 극소량(nl)의 혈액으로부터 빠르고 정확하게 또한 편리하게 전혈의 특성을 분석할 수 있는 이점을 갖는다.

다중 유전영동 분리 칩, 사다리꼴 전극어레이, 미세 확장 채널, 분리 기반 생물입자 분석시스템

Description

다중 유전영동 기반 미세유체칩, 이를 채용한 전혈 분석용 미세 유체 시스템 및 전혈 분석 방법{Multistage Dielectrophoretic Separation Chip, Its Application to Microfluidic System for Total Blood Cell Analysis, and Assaying Method of the Total Blood Cell Using Thereof}

도 1은 본 발명의 실시형태에 따른 다중 유전영동 미세유체칩의 구성 및 개요도;

도 2는 본 발명의 실시형태에 따른 사다리꼴 전극어레이의 일부를 나타낸 구성 및 개요도;

도 3은 본 발명의 실시형태에 따른 미세확장채널의 구성 및 개요도;

도 4는 본 발명의 실시형태에 따른 다중유전영동 미세유체칩의 세포 분리과정 개념도;

도 5는 본 발명의 실시형태에 따른 다중유전영동 미세유체칩에 통합된 레이저소스와 펄스계수기(pulse counter)를 이용한 세포의 계수 및 분석 개념도; 및

도 6은 본 발명의 실시형태에 따른 다중유전영동 미세유체칩의 측면도를 각각 나타낸다.

<도면의 주요 부분에 대한 부호의 설명>

1 : 세포 주입구 2 : 사다리꼴 전극어레이

3 : 미세확장채널 4 : 세포 배출구 1

5 : 세포 배출구 2 6 : 세포 배출구 3

7 : 세포 배출구 4 8 : 미세유체채널영역

9 : 단일 사다리꼴 전극 10 : 강한 전기장이 형성된 영역

11 : 약한 전기장이 형성된 영역 12 : 일반 채널 영역

13 : 확장된 채널 영역 14 : 미세입자의 편향 자취

15 : 세포 주입구

16 : 세포를 한쪽 벽으로 편향시키기 위한 사다리꼴 전극

17 : 특정 세포만을 선택적으로 편향시키기 위한 사다리꼴 전극

18 : 미세확장채널

19 : 다중유전영동칩에서의 두번째 단계(stage)

20 : 세포 배출구 1

21 : 세포 배출구 2

22 : 세포 배출구 3

23 : 세포 배출구 4

24 : 어두운 회색 입자로 표현된 과립구

25 : 밝은 회색 입자로 표현된 T-림프구

26 : 검은색 입자로 표현된 B-림프구

27 : 하얀색 입자로 표현된 단핵구

28 : 레이져 소스 1

29 : 레이져 소스 2

30 : 레이져 소스 3

31 : 레이져 소스 4

32 : 미세유체채널을 위한 플라스틱 칩

33 : 미세전극이 패턴된 유리칩

34 : 미세유체채널

35 : 세포 주입구

36 : 세포 배출구

37 : 미세채널패턴을 위한 플라스틱 칩

38 : 미세전극이 패턴된 유리 칩

39 : 사다리꼴 모양으로 패턴된 미세 전극

본 발명은 세포회수율이 높고, 극소량(nl)의 혈액으로부터 빠르고 정확하게 또한 편리하게 전혈을 분석하는 방법을 제공하는 다중 유전영동 분리(multistage dielectrophoretic separation) 기반 미세유체칩, 이를 채용한 전혈 분석용 미세유체 시스템 및 다중 유전영동 분리 기반 전혈분석 방법에 관한 것이다.

미세유체공학장치(microfluidics) 산업은 크게 신약 개발을 위한 플랫폼과 진단용 응용 기기을 위한 영역을 중심으로 급속히 성장하고 있는 분야이다.

현재의 주된 응용 분야는 분리, 신약스크리닝, 시료 전처리의 3가지 영역에 집중되고 있으며, 랩온어칩(lab-on-a-chip; 칩 속의 실험실) 형태의 모든 기능이 집적된 기능을 하는 경우와 몇 가지 특정 기능을 수행하는 형태의 미세유체 소자(microfluidic device)에 대한 개발이 활발히 이루어지고 있다.

이 중 미세유체공학을 이용한 진단용 현장자가진단(point-of-care; POC, 이하 "POC"로 약기한다) 시스템의 경우, 크기, 속도, 기능 등의 집적화를 토대로 감염성 질병의 진단 또는 군사용 응용분야로의 발전이 기대되고 있다.

특히, 유세포분석기(flow cytometry)란 세포 또는 생물입자의 물리화학적인 특성을 연속적으로 측정 분석하는 방법이다(미국특허 제4,284,355호, 미국특허 제4,673,288호, 미국특허 제4,352,558호 및 미국특허 제4,915,501호). 혈구세포를 흐르는 상태에서 미세한 유리관을 통과시켜 측정하고자 하는 이론이 몰다반(Moldavan, 1934)에 의해 제안되었고, 이것이 유세포 분석기의 시초이다(Science 80: 188, 1934). 이를 바탕으로 크로슬랜드테일러(Crosland-taylor, 1953)에 의해 유체 속에 흐르는 세포를 정밀하게 유체 단면의 정 중앙에 위치하게 하는 기술(hydrodynamic focusing)이 적용되어 현재의 유세포 분석기기의 토대를 마련하였다(Nature 171: 37-38, 1953).

그 후, 세포 분석기의 발달, 전자계측장비의 진보 등에 힘입어 1970년대 초에 임상적으로 이용이 가능한 유세포분석기가 만들어졌으며, 현재는 기초 및 임상의학 연구 및 진단 분야에 있어서 중요한 위치를 차지하고 있다.

그러나, 이러한 기술에서는 각기 다른 세포를 분석하기 위한 방법으로 생물 입자에 따라 레이저 빛의 산란정도의 차이를 이용하고 있기 때문에 광학 장비의 소형화 및 집적화에 있어 한계를 갖고 있으며, 형광 염색과 같은 시료 전처리 과정이 필요하므로 앞서 언급한 미세유체 진단용 POC 시스템으로의 적용이 불가능하다.

최근, 미세 유세포 분류기(microflow cytometry)의 발전(Nautre Biotechnology 17: 1109-1111, 1999; 미국특허 제6,540,895호; 미국특허 제6,597,438호)과 더불어 세포의 전처리 과정이 없는 의료 진단 분석기 등이 개발되고 있다.

자기 형광(autofluorescence)을 이용한 유세포 분류기는 세포의 고유한 형광을 이용하고(μTAS2003: 85-88, 2003), 임피던스 분광기(impedance spectroscopy)는 세포 고유의 전기적인 특성을 측정한다(Lab chip 1: 76-82, 2001).

비록, 상기의 방법들이 기존의 유세포분류기와는 달리 전처리 과정을 필요로 하지는 않지만, 세포 간의 분명한 차이를 갖고 분석을 하지 않아 정확성에 문제가 있으며, 몇몇의 경우에는 기존 방법과 마찬가지로 소형화 및 집적화에 한계를 갖고 있다.

이에 비해 세포의 고유한 특성만을 이용하여 분리를 하는 방법에 있어선 성공적인 결과들이 보고되어 왔다. 최근에 많은 연구 그룹에 의해, 다양한 세포의 유전특성(dielectric property)이 밝혀져 왔고, 이러한 특성을 바탕으로 유전영동(dielectrophoresis)을 통해 세포들을 분리해 왔다(Journal of Applied Physics 22: 869-871, 1951; Anal. Chem. 74: 3362-3371, 2002; Electrophoresis 24, 3703-3717, 2003, 미국특허 제5,489,506호, 미국특허 제6,287,832호).

미국특허 제6,641,708호에는 종래의 유전영동력을 이용하여 속도 프로파일을 형성하는 박형 챔버(chamber)를 통해 백혈구를 분리하는 방법을 개시하고 있으나, 이는 연속적인 백혈구 분리가 이루어지지 않아 그 수를 계수하기가 어려운 문제점이 있다.

따라서, 현재까지의 세포 분리에 관한 연구는 미세 채널에서의 세포 회수율이 낮고, 순차적으로 분리하는 등 세포 분리 후의 분석 프로세스를 목적으로 이용하기엔 부적합한 문제점이 있었다.

본 발명은 상기의 문제점을 극복하기 위한 것으로, 시료 전처리(preprocessing) 과정이 필요 없고, 미세유체 전극에 유전영동력 인가 시 상기 전극에 세포가 불특정하게 달라붙는 현상을 방지함과 동시에 다양한 종류의 생물입자를 선택적으로 및 연속적으로 분리해 냄으로써 세포 회수율을 향상시키는 것에 의해 극소량(nl)의 혈액으로부터 빠르고 정확하게 또한 편리하게 세포 또는 미세입자를 고효율로 분리하고 그 전혈 특성을 분석해 내는 사다리꼴 전극 어레이(trapezoidal electrode array)가 구비된 다중 유전영동 기반 미세유체칩 (microfluidic chip based on multistage dielectrophoresis separation)을 제공하는데 그 목적이 있다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 다중 유전영동 미세유체칩을 이용하여 분석 기기의 소형화 및 집적화에 따른 일체화가 가능한 휴대용 랩카드 형태의 생물입자의 다중 유전영동 분리 기반 전혈 분석용 미세유체 시스템(microfluidic system for biological particle analysis based on multistage dielectrophoresis separation)을 제공하기 위한 것이다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 상기 다중 유전영동 기반 미세유체칩을 이용하여 전혈 및 백혈구 등의 생물입자(biological particle)를 그 특성에 따라 고효율로 분리·분석하는 방법을 제공하기 위한 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 세포 또는 미세입자 주입부(1)와; 주입된 상기 세포 혼합물을 유전영동력(dielectrophoresis force)에 의해 선택적으로 편향시켜 다종의 세포 또는 미세입자들로 분리하기 위한 적어도 1 개 이상으로 구성된 구부러진 미세유체 채널부와; 상기 편향된 세포 또는 미세입자를 더 확장편향시켜 분리하기 위한 미세확장채널부(3)(microexpansion channel)와; 및 상기 세포 또는 미세입자의 타입수 만큼의 배출부(4)~(7)로 구성된 것임을 특징으로 하는 다중 유전영동(multistage dielectrophoresis; MSDEP) 기반 미세유체칩을 제공한다.

본 발명에 따른 다중 유전영동 기반 미세유체칩에 있어서, 상기 구부러진 미세유체 채널 내에 음과 양의 유전영동력이 선택적으로 인가될 수 있는 것임을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 다중 유전영동 기반 미세유체칩에 있어서, 상기 구부러진 미세유체 채널 내에는 유전영동력이 선택적으로 인가되고, 특정 세포만을 선택적으로 편향시키기 위한 불균일한 전기장이 형성되며, 그러함으로써 세포 또는 미세입자를 연속적으로 분리해 낼 수 있는 사다리꼴 전극 어레이(trapezoidal electrode array)가 구현된 것임을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 다중 유전영동 기반 미세유체칩에 있어서, 상기 사다리꼴 전극 어레이는 유리, 실리콘 또는 고분자 화합물을 포함한 플라스틱 기판 위에 금, 백금 또는 카본 중에서 선택된 전극 재질로 패터닝된 것임을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 다중 유전영동 기반 미세유체칩에 있어서, 상기 기판은 폴리디메틸실록산(polydimethylsiloxane; PDMS), 폴리메틸메타크릴레이트(polymethylmethacrylate; PMMA), 폴리아크릴레이트(polyacrylate), 폴리카보네이트(polycarbonate), 폴리사이클릭올레핀(polycyclic olefine), 폴리이미드(polyimide) 및 폴리우레탄(polyurethane) 중에서 선택된 고분자 물질인 것임을 특징으로 한다.

또한, 상기의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기의 구성을 갖는 다중 유전영동 기반 미세유체칩과 펄스계수기(pulse counter) 및 입자분석기(coulter counter)를 포함하여 구성된 것임을 특징으로 하는 전혈 분석용 미세유체 시스템을 제공한다.

또한, 상기의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 상기 다중 유전영동 기반 미세유체칩을 사용하여 혈액세포 등의 생물 미세입자를 고효율로 분리 및 분석하는 방법을 제공한다.

상기와 같은 구성에 따른 본 발명의 다중유전영동 기반 미세유체칩을 구비한 전혈분석용 미세유체 시스템을 이용하여 전혈(total blood) 및 백혈구 등의 생물 미세입자를 분리 및 분석하면, 종래의 유전영동 분리시스템과는 달리 다양한 종류의 생물 미세입자에 대한 연속적이면서도 선택적인 분리가 가능하여 전혈 및 백혈구 등의 생물 미세입자의 회수율이 높으며, 고효율로 상기 미세입자를 그 입자 고유의 특성에 따라 정확하게 분리 및 분석할 수 있는 이점을 얻는다.

이하, 본 발명의 바람직한 실시형태를 첨부도면을 참조하여 상세히 설명한다.

본 발명에 의한 다중유전영동 기반 미세유체칩(microfluidic chip based on multistage dielectrophoresis separation)을 이용한 세포 분리·분석용 칩의 구성 및 동작 원리는 다음과 같다.

본 발명에 의한 다중유전영동 기반 미세유체칩의 구조는 도 1 에서 보여주는 바와 같이, 혈액세포 등 생물입자를 고효율로 분리·분석하기 위한 것으로, 세포 또는 생물 미세입자 혼합물을 주입하기 위한 주입부(1)와; 주입된 상기 세포 또는 미세입자 혼합물을 유전영동력(dielectrophoresis force)에 의해 선택적으로 편향시켜 다종의 세포입자들로 분리하기 위한 적어도 1 개 이상으로 구성된 구부러진 미세유체 채널부와; 상기 편향된 세포입자를 더욱 편향시켜 확장분리하기 위한 미세확장채널부(3)(microexpansion channel)와; 및 상기 세포입자의 타입수 만큼의 배출부(4)~(7)로 구성된 것임을 특징으로 한다.

상기 구부러진 미세유체 채널 내에는 음과 양의 유전영동력을 선택적으로 인가할 수 있으며, 상기 세포 또는 미세입자 주입부로부터 주입된 세포혼합물을 상기 유전영동력에 의해 선택적으로 편향시켜 분리할 수 있는 수단을 제공하는 사다리꼴 전극어레이(2)(trapezoidal electrode array)가 구현되어 있다.

도 2는 도 1의 사다리꼴 전극어레이(2)의 일부를 나타낸다. 도 2에서 보여 지는 바와 같이, 본 발명에 의한 사다리꼴 전극은 유체버퍼(buffer)와 만나는 전극 영역(8)이 윗변과 아랫변의 길이가 다른 사다리꼴 형상(9)을 하고 있으며, 미세공정기술을 이용해 패턴된 사다리꼴전극은 유체버퍼속에 불균일한 전기장을 형성해준다. 일련의 사다리꼴 전극은 각기 다른 주파수를 갖는 전기장이 인가될 수 있다.

그러므로, 상기 사다리꼴 전극의 윗변(10)과 아랫변(11) 전극의 사이에 각기 강하고 약한 전기장이 형성됨으로써 음의 유전 영동력을 받는 세포는 강한쪽(10)에서 약한쪽(11)으로, 양의 유전 영동력을 받는 세포는 약한쪽(11)에서 강한쪽(10)으로 선택적으로 편향되게 된다. 따라서, 상기 사다리꼴 전극은 입자의 연속적인 분리를 가능하게 하고 특정 세포만을 선택적으로 편향시킬 수 있는 기능을 수행하게 된다.

또한, 미세유체 채널을 흐르는 세포 및 미세입자가 사다리꼴 미세 전극에 의해 형성된 불균일한 전기장에 노출되면 유전영동력(dielectrophoretic force)에 의해서 입자의 크기 또는 그 물리·화학적인 특성에 따라 채널 내에서 그 위치를 달리하게 되고, 나아가 미세 확장 채널을 이용해 이를 좀더 편향시켜 분할함으로써 다양한 종류의 생물분자 및 미세입자를 분리·분석할 수 있는 효과를 줄 수 있다.

상기 사다리꼴 전극 어레이는 유리, 실리콘 등의 무기물, 또는 고분자 화합물을 포함한 플라스틱 기판 위에 금, 백금 또는 카본 중에서 선택된 전극 재질로 패터닝된 것이 바람직하다. 이때, 상기 기판의 바람직한 예로는, 폴리디메틸실록산(polydimethylsiloxane; PDMS), 폴리메틸메타크릴레이트 (polymethylmethacrylate; PMMA), 폴리아크릴레이트(polyacrylate), 폴리카보네이트(polycarbonate), 폴리사이클릭올레핀(polyyclic olefin), 폴리이미드(polyimide) 및 폴리우레탄(polyurethane) 등과 같은 고분자 물질 중에서 선택된 재질로 제작될 수 있다.

도 3에서는 상기와 같이 편향된 세포를 확장 분할하기 위한 미세확장채널(3)을 나타낸다. 유체채널의 너비를 갑자기 확장해 줄 때(12)-(13), 유체유선간의 거리 또한 넓어지며 이 유선을 따라 흐르는 미세 입자 또한 확장편향(14)되게 된다. 그러므로, 이러한 원리를 이용하여 유전영동력에 의해 미세유체 채널 내의 사다리꼴 전극에 의해 양쪽 채널 벽으로 위치하게 된 세포 간의 거리를 넓혀 줌으로써 세포에 의한 채널의 막힘현상(clogging)을 완화시킬 수 있다.

도 4는 상술한 구성요소들로 구성된 다중유전영동칩의 세포 분리 및 분석 과정의 일예시를 보여준다. 다중유전영동 플랫폼(platform)은 한 개의 세포 주입구(15)와 다수의 배출구(20)-(23)를 갖는다. 첫 단계(stage)에서 4 가지의 서로 다른 세포는 모든 세포에 대해 음의 유전영동력이 작용하도록 전기장의 주파수를 설정해 놓은 첫째의 일련의 사다리꼴 전극(16)을 만나게 되고 유전영동력에 의해 미세채널의 한쪽 벽으로 위치하게 된다. 그 다음, 두번째 일련의 사다리꼴 전극(17)에서는 앞서와 달리 밝은회색(25)과 검정색(26) 입자에 한해서만 음의 유전영동력이 작용하도록 전기장의 주파수를 설정하면, 한쪽 벽에 위치해 있었던 4 가지 종류 의 세포 중에서 밝은회색(25)과 검정색(26)만이 유전영동력에 의해 다른 쪽 벽으로 편향되게 되고, 이는 다시 미세확장채널(18)을 통해 확장편향되어 분리되게 된다. 이를 단일단계유전영동력(single stage dielectrophoresis)이라 명하며, 이러한 단계들이 모여 다중유전영동력(multistage dielectrophoresis)을 이루게 된다.

이후의 단계(19)에서도 앞서와 같은 과정을 반복하여 어두운회색(24)과 하얀색(27)입자에서 어두운회색 입자를 밝은회색(25)과 검정색(26) 입자에서 밝은회색입자를 분리해냄으로써 4 가지의 서로 다른 미세 입자를 각기 다른 배출구(20)-(23)를 통해 얻어낼 수 있다.

또한, 본 발명은 상기와 같은 구성을 갖는 다중 유전영동 미세유체칩을 구비하고, 부가적으로 혈구 등의 미세입자로 증가된 저항값에 의해 전극 사이의 전압이 증가됨으로써 생성된 펄스를 감지하는 펄스계수기(pulse counter) 및 상기 입자들의 존재 외에 일정한 파라미터를 결정하기 위한 입자분석기(coulter counter)를 더 포함한 구성을 갖는 전혈 분석용 미세유체 시스템을 제공한다.

도 5에서 볼 수 있듯이, 각 배출구를 통해 나오는 입자의 수를 배출구에 통합된 레이저소스(28)-(31)와 펄스계수기(pulse counter)(도시되지 않음)를 이용하여 펄스의 빈도와 강도 등을 차례로 통계함으로써 각 입자타입(type)의 분포 및 농도 등을 계산할 수 있게 된다. 펄스계수기 및 입자분석기는 필수적인 것이며, 상술한 선행 참조문헌에 개시된 것과 유사하기 때문에 도시를 생략하였다.

또한, 본 발명은 세포혼합물을 다중 유전영동 미세유체칩에 주입하고; 유전영동력이 인가되어 내부에 상대적으로 강하거나 약한 전기장이 형성된 사다리꼴 전극 어레이에 상기 세포혼합물을 통과시켜 상기 사다리꼴의 윗변 및 아랫변 벽에 상기 세포혼합물을 선택적으로 편향시켜 1차 분리한 후; 상기 1차 분리된 세포혼합물을 미세확장채널에 통과시켜 세포간의 거리를 넓혀 줌으로써 더욱 확장편향시키는 것에 의해 개별 세포입자들로 2차 분리한 다음; 상기 세포입자들을 배출구로 배출하고; 배출된 다종의 세포입자들을 펄스계수기(pulse counter) 또는 미세입자분석기(microcoulter counter) 등을 이용하여 세포 고유의 특성을 분석하는 단계로 구성된 것을 특징으로 하는 전혈 분석 방법을 제공한다.

앞서 상술한 바와 같이, 일선 병원에서 혈구의 분석이 일반적으로 빈번히 수행된다. 이러한 분석 방법 중의 하나인 유세포분석기(flow cytometry)는 혈구세포가 흐르는 상태에서 입자에 따른 레이저 빛의 산란 정도의 차이를 이용하여 혈구의 종류를 구분하고 분석하는 방법이다. 그러나, 이러한 종래 방법은 비교적 정확하고 오랜기간 발전해왔다는 장점이 있지만, 세포의 용해(lysis) 또는 형광 염색과 시료 전처리 과정이 필요하고, 세포에 주사하기 위한 레이저 및 산란된 빛을 모으기 위한 일련의 광학장비로 인해 소형집적화 함에 불리한 면이 있었다.

반면, 본 발명에 따른 분석 방법은, 최근 U-헬스(ubiquitous health care)를 위한 휴대용 진단 POC 시스템 구현에 적합하며, 랩온어칩(lab-on-a-chip) 적용이 가능하고, 의료진단 분야에 중요한 기반 기술이 될 수 있는 새로운 혈구 분석 방법인 것이다.

또한, 종래의 유전영동 분리시스템과 비교할 때 분명한 세포 회수율의 향상을 기대할 수 있다. 이는 본 발명에 의한 사다리꼴 전극의 경우 기존 유전영동에 있어 세포 회수율이 낮은 단점을 갖는 양의 유전영동력(positive dielectrophoresis) 뿐만 아니라, 음의 유전영동력(negative dielectrophoresis)에 의해 입자를 분리하기 때문이다. 음의 유전영동력을 이용할 경우 양의 유전영동력과 달리 전극에 입자가 달라붙는 현상을 방지할 수 있으므로 세포 회수율을 높일 수 있다. 또한, 분석 후에 분리하는 기존의 미유세포 분석기와 달리, 다중 유전영동 기반 미세유체 시스템에 집적화(integration)된 펄스계수기 및 입자분석기 등을 이용할 경우, 모든 과정이 일체화된 휴대용 랩카드 형태의 분리 기반 생물입자 분석시스템을 구현할 수 있다.

따라서, 상기와 같은 구성을 갖는 본 발명의 유전영동칩은 신용카드 크기의 플라스틱 칩 등으로 일체화 시킬 수 있고, 펄스계수기가 내장된 휴대용 계측기를 이용하여 자동으로 혈구 분석이 가능한 POC 시스템 구현에 적합하다.

이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 보다 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 하기 실시예에 의하여 제한되거나 한정되는 것은 아니며, 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 아니하는 범위 내에서 본 발명에 대한 다양한 변형 및 변경이 가능하며, 이 또한 본 발명의 범위에 속하게 됨을 이해할 수 있을 것이다.

<실시예 1> 다중유전영동기반 미세유체칩의 제작

도 5에서와 같이 전혈분석용 미세유체칩은 미세채널을 위한 플라스틱층(33)과 미세전극패턴(pattern)을 위한 유리층(32)이 적층된 구조를 갖는다.

도 6에서와 같이 플라스틱층(37)은 투명하고 탄성을 갖는 PDMS(polydimethylsiloxane)을 이용한 몰딩(molding) 방법으로 제작 하였다. 몰딩(molding)을 위한 주형(master)은 실리콘 웨이퍼(silicon wafer) 기판 위에 감광물질(photoresist)을 패터닝하는 방법을 이용하였다. 사용된 감광물질은 SU-8을 사용하여 폭 50 μm, 높이 35 μm인 마이크로채널(34)을 제작하였다. 이 주형에 경화제와 10:1의 비율로 섞은 pre-PDMS를 붓고 50℃에서 2시간동안 경화시켰다. 경화 과정을 거친 후 PDMS기판에 구멍을 내어 세포혼합물의 주입구(35)와 각 배출구(36)를 제작하였다.

미세전극패터닝을 위해 두께 약 500 μm의 유리 웨이퍼(38)를 사용하였다. 금속 박막을 형성하기 위해, 상기 유리 웨이퍼 위에 스퍼터(sputter)를 사용하여 금을 얇게 도포하였다. 그 위에 마스크(Mask)와 감광물질(photoresist)을 이용하여 도 2에 도시된 모양으로 금 박막을 패터닝함으로써 사다리꼴 전극(39)을 형성하였다.

이렇게 형성된 플라스틱층과 유리층을 공기 플라즈마(air plasma)를 이용해 산화시키고 적층함으로써 두 층으로 이루어진 다중유전영동칩을 완성하였다.

<실시예 2> 다중유전영동 미세유체칩을 이용한 혈구 및 미세 입자 분리방법

실시예 2에서는 본 발명에 의해 개발된 다중유전영동 미세유체칩을 이용한 백혈구의 분리 과정을 예시한다.

본 발명에 의한 다중유전영동력을 이용한 혈구 분리 과정은 다음과 같다. 다중유전영동칩을 이용해 백혈구를 분리 분석 하기 위해 도 4에서 세포 주입구(15)에 사람의 혈액으로부터 추출한 백혈구가 전기전도도가 10 mS/m를 갖는 수크로오스 버퍼(sucrose buffer)에 용해된 샘플을 주입하였다. 앞에서 기술한 바와 같이 각 단계(stage)마다 두개의 일련의 사다리꼴 전극이 다른 주파수에서 작동시켰다. 사다리꼴전극(16) 부위에서는 5 kHz의 주파수 하에서 단핵구(27), 과립구(24), B-림프구(26) 및 T-림프구(25)를 한쪽벽으로 모아주게 된다. 두번째 사다리꼴전극(17) 부위에서는 40-45 kHz의 주파수를 갖고 선택적으로 음의 유전영동력을 받는 B-림프구(26)와 T-림프구(25) 만을 아래쪽 벽으로 분리해 주게 된다. 이렇게 각기 양쪽 벽으로 편향된 세포는 미세유체채널(18)을 통해 확장분리되었다.

이때 단핵구(27)와 과립구(24)는 왼쪽으로, B-림프구(26)와 T-림프구(25)는 오른쪽으로 분리되었다. 이렇게 편향 분리된 세포는 각기 다음 단계(stage)에 다다르게 되고 앞서와 같이 단핵구(27)와 과립구(24)에 대해 음의 유전영동력이 작용하게 전기장의 주파수(5kHz)를 설정해 놓아 유전영동력에 의해 미세채널의 한쪽 벽으로 위치하게 하고, 다음 과립구(24)에 한해서만 음의 유전영동력이 작용하게 전기장의 주파수(30-35kHz)를 설정해 놓아 한쪽 벽에서 위치해 있었던 단핵구(27)와 과립구(24) 중 과립구만이 유전영동력에 의해 아래쪽 벽으로 편향되게 하였다.

또 다른 단계에서는 B-림프구(26)와 T-림프구(25)에 대해 음의 유전영동력이 작용하게 전기장의 주파수(5kHz)를 설정해 놓아 유전영동력에 의해 미세채널의 한쪽 벽으로 위치하게 하고, 다음 T-립프구(25)에 한해서만 음의 유전영동력이 작용하게 전기장의 주파수(60kHz)를 설정해 놓아 한쪽 벽에서 위치해 있었던 B-림프구(26)와 T-림프구(25) 중 T-림프구만이 유전영동력에 의해 아래쪽 벽으로 편향되게 하였다.

결과적으로, 단핵구(27)와 과립구(24)는 각각 (21)과 (20) 출구에서, B-림프구(26)와 T-림프구(25)는 각각 (22)와 (23) 출구에서 분리된 세포를 얻게 되었다.

본 발명에서는 이와 같이 모든 분리 과정에서 사다리꼴 전극을 이용해 양의 유전영동력이 아닌 음의 유전영동력만을 이용해 세포를 편향시켜 줌으로써 일반적으로 양의 유전영동력을 사용할 시에 발생하는 전극에 세포가 불특정하게 달라붙는 현상을 막아줌으로써 세포의 회수율을 높이고, 고효율의 분리를 수행할 수 있는 장점을 제공해 준다.

<실시예 3> 다중유전영동 미세유체칩을 이용한 혈구 및 미세 입자 분석방법

실시예 3에서는 본 발명에 의해 개발된 미세전극과 채널을 통한 전혈분석용 칩을 이용하여 백혈구의 분석 과정을 예시한다.

혈구의 농도 및 수치가 인체의 여러 질병에 관련되는 사실에 적용하여 휴대용 진단장비를 위한 새로운 방법은 본 발명에 의한 다중유전영동칩을 이용해 혈구를 분석하는 것이다. 다중유전영동칩을 이용한 백혈구 분석 과정은 실시예 2에서 설명한 바와 같고, 도 5에서처럼 연속적으로 분리되어 나오는 혈구를 배출구에서 펄스계수기(pulse counter) 또는 미세입자분석기(microcoulter counter)를 이용하여 측정함으로써 혈구를 분석할 수 있게 된다.

결과적으로, 다중유전영동칩은 신용카드 크기의 플라스틱 칩으로 일체화 시키고, 펄스계수기가 내장된 휴대용 계측기를 이용하면 자동으로 혈구 분석이 가능해 POC 시스템을 구현할 수 있다.

상기의 구성을 갖는 본 발명에 따른 다중 유전영동 기반 미세유체칩, 사다리꼴 전극, 미세 확장 채널, 분리 기술 등을 이용한 생물입자 분석시스템은, 진단용 POC 시스템으로 크기, 속도, 기능 등을 집적화하여 백혈구 등 다양한 생물입자의 분리용 플라스틱 랩 카드(lab-card)로의 구현이 가능하며 휴대용 U-헬스(ubiquitous health care) 응용기기의 제품화에 기여할 수 있다.

또한, 본 발명에 의하면, 세포 회수율이 낮은 기존의 유전영동 분리시스템과 비교할 때 양의 유전영동력 뿐만 아니라 음의 유전영동력에 의해 입자를 분리하기 때문에 전극에 입자가 달라붙는 현상을 방지할 수가 있어 분명한 세포 회수율의 향상을 기대할 수 있다.

아울러, 본 발명에 의한 다중 유전영동 기반 미세유체 시스템은 연속적으로 세포를 분리하면서 시스템의 각 단계(stage)마다 선택적인 유전영동력을 입자에 가해줌으로써 다양한 종류의 생물입자를 연속적으로 분리하고, 미세 확장 채널을 통 해 확장분할함으로써 다양한 종류의 생물분자 및 미세입자를 분리 및 분석할 수 있게 한다.

더욱이, 분석 후에 분리하는 기존의 미유세포 분석기와 달리, 다중 유전영동 기반 미세유체 시스템에 집적화된 펄스계수기 및 입자분석기 등을 이용할 경우, 모든 과정이 일체화된 휴대용 랩카드 형태의 분리 기반 생물입자 분석시스템을 구현할 수 있다.

Claims

세포 또는 미세입자 주입부(1)와; 주입된 상기 세포 혼합물을 유전영동력에 의해 선택적으로 편향시켜 다종의 세포 또는 미세입자들로 분리하기 위한 적어도 1 개 이상으로 구성된 구부러진 미세유체 채널부와; 상기 편향된 세포 또는 미세입자를 더 확장편향시켜 분리하기 위한 미세확장채널부(3)와; 및 상기 세포 또는 미세입자의 타입수 만큼의 배출부(4)~(7)로 구성된 것임을 특징으로 하는 다중 유전영동 기반 미세유체칩.
제 1 항에 있어서, 상기 구부러진 미세유체 채널 내에 음과 양의 유전영동력이 선택적으로 인가될 수 있는 것임을 특징으로 하는 다중유전영동 기반 미세유체칩.
제 1 항에 있어서, 상기 구부러진 미세유체 채널 내에는 유전영동력이 선택적으로 인가되고, 특정 세포만을 선택적으로 편향시키기 위한 불균일한 전기장이 형성되며, 그러함으로써 세포 또는 미세입자를 연속적으로 분리해 낼 수 있는 사다리꼴 전극 어레이가 구현된 것임을 특징으로 하는 다중유전영동 기반 미세유체칩.
제 3 항에 있어서, 상기 사다리꼴 전극 어레이는 유리, 실리콘 또는 고분자 화합물을 포함한 플라스틱 기판 위에 금, 백금 또는 카본 중에서 선택된 전극 재질로 패터닝된 것임을 특징으로 하는 다중유전영동 기반 미세유체칩.
제 4 항에 있어서, 상기 기판은 폴리디메틸실록산(polydimethylsiloxane; PDMS), 폴리메틸메타크릴레이트(polymethylmethacrylate; PMMA), 폴리아크릴레이트(polyacrylate), 폴리카보네이트(polycarbonate), 폴리사이클릭올레핀(polycyclic olefine), 폴리이미드(polyimide) 및 폴리우레탄(polyurethane) 중에서 선택된 고분자 물질인 것임을 특징으로 하는 다중유전영동 기반 미세유체칩.
청구항 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 하나의 항에 따른 다중유전영동 기반 미세유체칩에 펄스계수기(pulse counter) 및 입자분석기(coulter counter)를 더 포함하여 구성된 것임을 특징으로 하는 미세유체칩을 이용한 전혈분석 장치.
1)청구항 제 1 항의 다중유전영동 기반 미세유체칩을 사용하여 혈액세포 등의 생물 미세입자를 분리하는 단계;

2) 단계 1)의 생물 미세입자들을 배출구로 배출하는 단계;

3) 배출된 생물 미세입자들을 펄스계수기 또는 입자분석기를 이용하여 상기 생물 미세입자의 고유 특성을 분석하는 단계로 구성되는 전혈 분석 방법.