KR100788458B1 - 유체영동기반 세포분리용 미세유체칩 및 이를 이용한혈액분리방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 유체영동기반 세포분리용 미세유체칩 및 이를 이용한 혈액분리방법에 관한 것으로서, 압력구배를 이용하여 유체 유동 방향에 대하여 경사를 갖는 제 1 경사미세구조물에 의해 유동 측면 방향으로 압력구배를 형성시키고, 압력구배를 따라 이동하는 세포와 제 2 경사미세구조물간의 기계적 상호 작용이 발생함을 이용하여 미세유체칩 내에서 세포를 크기에 따라 연속적으로 정렬 및 분리할 수 있음을 특징으로 한다. 본 발명에 의한 유체영동기반 세포분리용 미세유체칩 및 이를 이용한 혈액분리방법은 분리과정에서 정교한 유량제어를 필요로 하지 않기 때문에 세포의 분리 및 분석 기능이 집적화된 진단용 랩온어칩(Lap-on-a-chip)에 응용할 수 있으며, 별도의 외부 전압을 인가 및 유지할 필요가 없는 장점이 있다. 또한, 그 기술적 구성은 소정의 폭으로 내경이 감소하는 미세유체 채널 내부의 상, 하층 적소에 유체의 유동 방향과 평행한 면에 일정한 경사면이 형성되는 제 1 경사미세구조물; 및 소정의 폭으로 내경이 감소하는 미세유체 채널 내부의 상, 하층 적소에 유체의 유동 방향과 평행한 면에 일정한 경사면이 형성되되, 일측에 통로가 형성되는 제 2 경사미세구조물; 을 포함하는 구성으로 이루어지는 것을 특징으로 한다.
세포분리칩, 유체영동, 경사미세구조물, 제 2 경사미세구조물, 세포와 경사미세구조물간의 기계적 상호 작용
Description
도 1a는 본 발명에 따른 유체영동기반 세포분리용 미세유체칩 내 미세유체채널의 구성도.
도 1b는 도 1a의 제 1 경사미세구조물의 3차원 확대도.
도 1c는 도 1a의 제 2 경사미세구조물의 3차원 확대도.
도 2a는 본 발명에 따른 제 1 경사미세구조물과 제 2 경사미세구조물을 갖는 채널의 평면도.
도 2b는 도 2a의 입구쪽에서 본 제 1 경사미세구조물의 횡단면도.
도 2c는 도 2a의 입구쪽에서 본 제 2 경사미세구조물의 횡단면도.
도 3은 본 발명에 따른 유체영동기반 세포분리용 미세유체칩을 이용한 혈액분리방법의 흐름도.
도 4는 본 발명에 따른 유체영동기반 세포분리용 미세유체칩의 측면도.
도 5는 본 발명에 따른 미세공정기술로 제작된 유체영동기반 세포분리용 미세유체칩의 구성도.
도 6a는 채널 출구에서 크기에 따른 미세입자의 위치를 측정한 결과를 나타 내는 그래프.
도 6b는 미세입자를 분리한 결과를 나타내는 그래프.
도 7은 다수의 시료 배출구를 갖는 유체영동기반 세포분리용 미세유체칩 내 채널구조의 구성도.
도 8a는 광학 현미경 및 형광 현미경으로 촬영한 분리전 혈액 세포를 나타내는 도.
도 8b는 광학 현미경 및 형광 현미경으로 촬영한 분리후 혈액 세포를 나타내는 도.
<도면의 주요 부분에 대한 부호의 설명>
1: 유체영동기반 세포분리용 미세유체칩
10: 시료 주입구 20: 시료 배출구
21: 제1 시료 배출구 22: 제2 시료 배출구
30: 경사미세구조물 31: 하위 제 1 경사미세구조물
31a: 제1 횡단면 31b: 제2 횡단면
31c: 제3 횡단면 32: 상위 제 1 경사미세구조물
32a: 제1 영역 32b: 제2 영역
40: 제 2 경사미세구조물 41: 하위 제 2 경사미세구조물
41a: 제4 횡단면 41b: 제5 횡단면
41c: 제6 횡단면 42: 상위 제 2 경사미세구조물
50: 통로 60: 제1 세포
61: 제2 세포 62: 이차유동의 궤적
71: 상위 플라스틱층 부 73: 하위 플라스틱층 부
81: 제1 채널 영역 82: 제2 채널 영역
83: 제3 채널 영역
본 발명은 유체영동기반 세포분리용 미세유체칩 및 이를 이용한 혈액분리방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 압력구배를 이용하여 유체 유동 방향에 대하여 경사를 갖는 제 1 경사미세구조물에 의해 유동 측면 방향으로 압력구배를 형성시키고, 압력구배를 따라 이동하는 세포와 제 2 경사미세구조물간의 기계적 상호 작용이 발생함을 이용하여 미세유체칩 내에서 세포를 크기에 따라 연속적으로 정렬 및 분리할 수 있음을 특징으로 한다. 본 발명에 의한 유체영동기반 세포분리용 미세유체칩 및 이를 이용한 혈액분리방법은 분리과정에서 정교한 유량제어를 필요로 하지 않기 때문에 세포의 분리 및 분석 기능이 집적화된 진단용 랩온어칩(Lap-on-a-chip)에 응용할 수 있으며, 별도의 외부 전압을 인가 및 유지할 필요가 없는 장점이 있다. 제조가 용이한 유체영동기반 세포분리용 미세유체칩 및 이를 이용한 혈액분리방법에 관한 것이다.
일반적으로, 생화학 시료는 이종 이상의 물질이 혼재되어 존재하기 때문에 원하는 성분만을 분석하거나, 혼합물에서 특정 성분만을 정제하기 위한 분리 기술은 시료의 전처리 과정에서 매우 중요하다. 특히, 미세 유로, 혼합기, 펌프, 벨브 등을 단일 칩에 집적화하여 소량의 시료를 고속, 고효율로 처리하고자 하는 개념인 랩온어칩(Lab-on-a-chip)에서도 정제 및 분리와 같은 시료 준비 과정은 하위 분석 과정에 앞서 선행되어야 할 핵심 기술이다.
또한, 생물학 또는 의학적 분석에 있어 중요한 세포에 기반한 임상 진단(Cell-based diagnostics)은 혈액 분석, 세포 연구, 미생물 분석, 그리고 조직 이식으로 이루어진다. 최근 세포 연구 및 세포 분석, 그리고 단백질과 DNA 분석 기술 발전에 의하여 이러한임상 진단 절차를 미세유체소자(Microfluidic Device)의 형태로 단일화, 집적화하려는 연구가 선행되고 있다.
여기서, 임상 진단을 위한 미세유체소자는 분석의 대상인 세포의 분리, 관찰, 그리고 분리된 세포의 용해 과정을 거쳐 추출한 단백질 및 DNAfmf 분석하는 일련의 절차가 통합된 단일 소자를 의미한다. 이종 이상의 세포가 혼재된 시료에서 분석하고자 하는 세포의 분리 과정은 정확한 임상정보를 얻기 위하여 필수적이다. 이를 위해 세포 고유의 물리적 특성과 화학적 특성의 차이를 이용하는 미세유체역학(Microfluidics)에 기반한 세포 분리 방법이 제시되었다.
이를 위한 유전 영동(Dielectorophoresis) 분리법은 불균일한 전기장에 세포를 노출시켜 전기적 특성에 따라 나타나는 유전 영동력의 차이를 이용하는데, 미국 특허 제6,641,708호에서 속도 프로파일을 형성하는 박막형 챔버(Chamber)로 백혈구를 분리하는 방법을 제시하고 있으며, 또한 유전 영동력을 증폭시킬 수 있는 마커 입자를 세포에 특이적으로 접합시킴으로써 희귀 세포를 고효율적으로 분리할 수 있는 방법(PNAS 102; 15757, 2005)이 발표된 바 있다.
그러나, 유전 영동은 비극성 분자 및 세포를 전처리 과정없이 분리할 수 있지만, 세포 배지와 같은 전해질 용액 내에서 전기 분해를 일으킬 수 있기 때문에 세포 친화적인 용액을 분리 용액으로 사용할 수 없고, 세포가 함유된 생물학 시료의 경우에는 인가된 전압에 의하여 세포의 활성도가 좌우되기 때문에 분리 수확물을 세포 치료용의 목적으로 사용할 수 없는 문제점이 있었다.
한편, 수동적 분리 방법은 외부 전기장을 이용하는 유전 영동과 다르게 세포의 밀도 및 크기의 차이를 이용하여 시료 공급을 위한 유동 에너지로 세포를 분리하는데, 예를 들어 복잡한 미세 채널 내에서 크기에 따라 정렬되는 세포의 위치 차이를 이용하여 혈액 세포를 분리하는 방법(Lab Chip 5: 1233. 2005) 및 혈관을 모사로 미세 채널을 이용하여 혈액 세포를 분리하는 방법(Anal. Chem. 77: 933, 2005)이 제시되었다. 이 방법은 미세 유로 이외에 부가적인 장비를 필요로 하지 않기 때문에 추가적인 비용 및 과정을 제거할 수 있다.
그러나, 수동 분리 방법은 입자를 분리하기 전, 미세 유로 내에 초기 위치를 동일하게 정렬시키기 위하여 시료 유동(Sample Flow)과, 제어 유동(Sheath Flow)간의 정교한 미세 유량 제어가 필요하고, 층류 유동에 기반을 두기 때문에 미세 입자 분리를 위하여 필수적으로 채널 구조가 복잡해지는 문제점이 있었다.
본 발명은 상기한 문제점을 해결하기 위하여 안출한 것으로, 압력구배를 이용하여 유체 유동 방향에 대하여 경사를 갖는 제 1 경사미세구조물에 의해 유동 측면 방향으로 압력구배를 형성시키고, 압력구배를 따라 이동하는 세포와 제 2 경사미세구조물간의 기계적 상호 작용이 발생함을 이용하여 미세유체칩 내에서 세포를 크기에 따라 연속적으로 정렬 및 분리할 수 있음을 특징으로 한다. 본 발명에 의한 유체영동기반 세포분리용 미세유체칩 및 이를 이용한 혈액분리방법은 분리과정에서 정교한 유량제어를 필요로 하지 않기 때문에 세포의 분리 및 분석 기능이 집적화된 진단용 랩온어칩(Lap-on-a-chip)에 응용할 수 있으며, 별도의 외부 전압을 인가 및 유지할 필요가 없는 장점이 있다. 제조가 용이한 유체영동기반 세포분리용 미세유체칩 및 이를 이용한 혈액분리방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기한 바와 같은 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 소정의 폭으로 내경이 감소하는 미세유체 채널, 상기 미세유체 채널 내부의 상, 하층에 교대로 유체의 유동 방향에 경사지게 형성되는 제 1 경사미세구조물, 상기 미세유체 채널 내부의 상, 하층에 교대로 유체의 유동 방향에 경사지게 형성되되, 상기 제 1 경사미세구조물보다 짧은 길이로 형성되는 제 2 경사미세구조물 및 상기 제 2 경사미세구조물의 일단에 접하여 상기 미세유체 채널의 길이방향으로 형성되는 통로를 포함하여 구성되는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른, 상기 제 1 경사미세구조물은 상기 미세유체 채널 내에서 유동의 측면 방향으로 압력구배를 만들어 낮은 압력쪽으로 세포를 정렬시킨다.
본 발명에 따른, 상기 제 2 경사미세구조물은 미세유체 채널의 내경을 일정 배율 감소되도록 형성시키되, 유체영동기반 세포분리용 미세유체칩에 삽입되는 서로 다른 크기의 두 세포 중 큰 크기의 세포와 작은 크기의 세포 사이의 높이로 형성된다.
본 발명에 따른, 상기 제 2 경사미세구조물은 상기 제 1 경사미세구조물에 의해 정렬된 세포를 크기별로 분리시킨다.
본 발명에 따른, 상기 제 1 경사미세구조물 및 제 2 경사미세구조물의 경사구조는 경사각이 변형 가능하다.
본 발명에 따른, 상기 미세유체 채널, 제 1 경사미세구조물 및 제 2 경사미세구조물은 유리, 실리콘, 금속 또는 고분자 화합물로 이루어진 기판위에 형성된다.
본 발명에 따른, 상기 미세유체 채널의 유동 방향 일측에 시료 배출구가 형성되되, 상기 시료 배출구의 수는 하나 이상 다수개 형성 가능하다.
본 발명에 따른, 소정의 폭으로 내경이 감소하는 미세유체 채널, 상기 미세유체 채널 내부의 상, 하층에 교대로 유체의 유동 방향에 경사지게 형성되는 제 1 경사미세구조물, 상기 미세유체 채널 내부의 상, 하층에 교대로 유체의 유동 방향에 경사지게 형성되되, 상기 제 1 경사미세구조물보다 짧은 길이로 형성되는 제 2 경사미세구조물, 상기 제 2 경사미세구조물의 일단에 접하여 상기 미세유체 채널의 길이방향으로 형성되는 통로, 상기 미세유체 채널의 일단에 형성된 시료 주입구, 상기 미세유체 채널의 타단에 형성된 시료 배출구를 포함하는 유체영동기반 세포분리용 미세유체칩을 이용한 혈액분리방법에 있어서, 상기 시료 주입구에 이종 그룹으로 이루어진 혈액이 주입되는 단계, 상기 혈액 내 세포가 상기 제 1 경사미세구조물에 의하여 형성되는 압력구배에 의해 일측 방향으로 정렬되는 단계, 상기 혈액 내 세포가 상기 제 2 경사미세구조물의 기계적 상호 작용에 의하여 크기별로 분리되는 단계 및 크기별로 분리된 세포가 시료 배출구를 통해 배출되는 단계를 포함하여 이루어진다.
본 발명에 따른, 유체영동기반 세포분리용 미세유체칩에 이종 이상의 그룹으로 이루어지는 세포를 포함하는 혈액을 주입하여 하나 이상 다수개로 이루어진 시료 배출구에 각 크기별로 분리시킬 수 있다.
본 발명에 따른, 유체영동기반 세포분리용 미세유체칩에 적혈구 및 백혈구를 포함하는 혈액을 주입하여, 각 크기별로 분리시킬 수 있는 것을 특징으로 한다.
이하, 본 발명의 바람직한 실시예를 첨부된 도면을 참조하여 보다 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시 예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 내용이 하기 실시 예에 한정되는 것은 아니다.
도 1a는 본 발명에 따른 유체영동기반 세포분리용 미세유체칩 내 미세유체채널의 구성 및 구성도이고, 도 1b는 도 1a의 제 1 경사미세구조물의 3차원 확대도이며, 도 1c는 도 1a의 제 2 경사미세구조물의 3차원 확대도이다.
도면에서 도시한 바와 같이, 유체영동기반 세포분리용 미세유체칩(1)은 다종의 세포를 포함하는 시료 주입구(10) 및 시료 배출구(20)와 크기에 따라 입자를 정렬 및 분리하기 위하여 미세유로의 중심부까지의 높이로 형성된 제 1 경사미세구조물(Slanted Obstacle, 30)과 미세유체 채널의 일측에 통로(50)가 형성된 제 2 경사미세구조물(SOG: Slanted Obstacle with a Drainage Gap, 40)로 구성된다.
여기서, 제 1 경사미세구조물(30)은 미세유체 채널의 상부면으로부터 채널의 내부로 돌출되어 형성되는 상위 제 1 경사미세구조물(32)과 미세유체 채널의 하부면으로부터 채널의 내부로 돌출되어 형성되는 하위 제 1 경사미세구조물(31)로 이루어진다.
이때, 상기 상위 제 1 경사미세구조물(32)은 미세유체 채널의 상부면의 경사구조에 대응되어 형성되고, 상기 하위 제 1 경사미세구조물(31)은 미세유체 채널의 하부면의 경사구조에 대응되어 형성되는데, 상기 상, 하위 제 1 경사미세구조물(32, 31)은 유체 유동의 측면 방향으로 압력구배를 형성시키고, 이에 따라 유도된 유동을 따라 세포를 측면벽으로 정렬시킨다.
한편, 제 2 경사미세구조물(40)은 미세유체 채널의 상부면으로부터 채널의 내부로 돌출되어 형성되는 상위 제 2 경사미세구조물(42)과 미세유체 채널의 하부면으로부터 채널의 내부로 돌출되어 형성되는 하위 제 2 경사미세구조물(41)로 이루어지는데, 미세유체 채널의 일측면에 통로(50)가 형성된다.
더불어, 세포는 상기 상위 제 1 경사미세구조물(32) 및 하위 제 1 경사미세구조물(31) 을 통과하여 정렬되고, 상기 상위 제 2 경사미세구조물(42) 및 하위 제 2 경사미세구조물(41)을 통과하면서 기계적 상호 작용을 발생시켜, 세포의 크기별로 분리된다.
도 2a는 본 발명에 따른 제 1 경사미세구조물과 제 2 경사미세구조물을 갖는 채널의 평면도이고, 도 2b는 도 2a의 입구쪽에서 본 제 1 경사미세구조물의 횡단면도이며, 도 2c는 도 2a의 입구쪽에서 본 제 2 경사미세구조물의 횡단면도이다.
도면에서 도시한 바와 같이, 제 1 경사미세구조물(30)은 미세 채널 영역에서 불균일한 압력구배장을 형성시키고, 유체 진행 방향의 좌측에 강한 압력구배장이 형성된 제1 영역(32a)과 유체 진행 방향의 우측에 약한 압력구배장이 형성된 제2 영역(32b)이 형성되어 유체를 유동하는 세포가 약한 압력구배장이 형성된 제2 영역(32b)으로 정렬된다.
이때, 상기 제 1 경사미세구조물(30)은 미세유체 채널의 상, 하부면에 형성되는 상위 제 1 경사미세구조물(32)과 하위 제 1 경사미세구조물(31)로 이루어지고, 유체 유동의 측면 방향으로 압력구배를 형성시키고, 유도된 유동으로 세포를 측면 벽으로 정렬시킨다.
그리고, 제 2 경사미세구조물(40)의 높이는 세포의 큰 세포와 작은 세포 사이로 설정되어, 큰 세포는 상기 제 2 경사미세구조물(40)을 지나면서 기계적인 충돌이 발생하고, 세포의 유동방향이 제 2 경사미세구조물(40)의 통로(50)로 편향되는 반면, 작은 세포는 상기 제 2 경사미세구조물(40)을 통과하면서 정렬된 위치를 유지하게 된다.
한편, 제 1 경사미세구조물(30)의 입구쪽에서 본 제1 횡단면(31a)과 제 1 경사미세구조물(30)의 입구쪽에서 본 제2 횡단면(31b)과 제 1 경사미세구조물(30)의 입구쪽에서 본 제3 횡단면(31c)에서 도시된 바와 같이, 상기 제 1 경사미세구조물(30)에 의해 형성된 이차유동의 궤적(62)에 의하여 제 2 경사미세구조물(40)과 제 1 경사미세구조물(30) 사이의 높이를 갖는 제1 세포(60)와 제 1 경사미세구조물(30)과 제 2 경사미세구조물(40)의 높이보다 작은 제2 세포(61)가 측면 벽으로 정렬된다.
또한, 제 1 경사미세구조물(30)의 입구쪽에서 본 제4 횡단면(41a)와 제 2 경사미세구조물(40)의 입구쪽에서 본 제5 횡단면(41b)과 제 2 경사미세구조물(40)의 입구쪽에서 본 제6 횡단면(41c)에서 도시된 바와 같이, 상기 제 2 경사미세구조물(40)의 높이는 제 1 경사미세구조물(30)과 제 2 경사미세구조물(40) 사이의 높이를 갖는 제1 세포(60)에 따라 설정되며, 상기 제 2 경사미세구조물(40)의 높이보다 큰 세포는 상기 제 2 경사미세구조물(40)을 통과하지 못하고 통로(50)로 편향되는 반면, 상기 제 2 경사미세구조물(40)의 높이보다 작은 세포는 상기 제 2 경사미세구조물(40)을 통과하여 정렬된 위치를 유지하며 분리된다.
도 3은 본 발명에 따른 유체영동기반 세포분리용 미세유체칩을 이용한 혈액분리방법의 흐름도이다. 도면에서 도시한 바와 같이, 유체영동기반 세포분리용 미세유체칩(1)의 시료 주입구(10)에 이종 그룹의 세포가 포함된 혈액을 주입한다(S10).
그리고, 상기 시료 주입구(10)로 주입된 혈액은 소정의 폭으로 내경이 감소하는 미세유체 채널의 내부의 상, 하층 적소에 형성되어, 혈액의 유동 방향에 대하여 일정한 경사면을 형성시키는 제 1 경사미세구조물(30)에 의하여 유동의 측면 방향으로 압력구배가 형성되고, 혈액 내의 세포를 정렬시킨다(S20).
이때, 상기 단계(S20)에서 정렬된 세포는 소정의 폭으로 내경이 감소하는 미세유체 채널 내부의 상, 하층 적소에 형성되되, 혈액의 유동 방향에 대하여 일정한 경사면이 형성되고, 일측에 통로가 형성되는 제 2 경사미세구조물(40)의 기계적 상호 작용을 통하여 이종 그룹으로 이루어진 세포를 크기별로 분리시킨다(S30).
그래서, 크기별로 분리된 세포는 시료 배출구로 분리되어 배출된다(S40).
여기서, 유체영동기반 세포분리용 미세유체칩에 적혈구 및 백혈구를 포함하는 혈액을 주입하여, 적혈구 및 백혈구의 크기에 따라 분리시키는 것도 바람직하다.
또한, 유체영동기반 세포분리용 미세유체칩에 이종 이상의 그룹으로 이루어지는 세포를 포함하는 혈액을 주입하여 하나 이상 다수개로 이루어진 시료 배출구에 각 크기별로 분리하는 것도 바람직하다.
이하, 기술 내용에서는 유체영동을 통해 세포를 포함한 미세입자를 정렬 및 분리하는 미세유체칩과 이를 이용한 혈액분리방법의 응용 예를 설명한다. 그러나 이들 실시예에 의하여 본 발명의 범위가 제한되거나 한정되는 것은 아니다.
(실시예 1) 유체영동기반 세포분리용 미세유체칩의 제작
도 4은 본 발명에 따른 유체영동기반 세포분리용 미세유체칩의 측면도이다. 도면에서 도시한 바와 같이, 유체영동기반 세포분리용 미세유체칩(1)은 다종의 세포를 포함하는 시료주입구(10) 및 시료 배출구(20)와 상위 제 1 경사미세구조물(32)과 상위 제 2 경사미세구조물(42)로 구성된 상위 플라스틱층 부(71)와 하위 제 1 경사미세구조물(31)과 하위 제 2 경사미세구조물(41)이 형성된 하위 플라스틱층 부(73)가 적층된 구조를 갖는다.
*그리고, 몰딩을 위한 주형은 실리콘 웨이퍼(Silicon Wafer) 기판 위에 감광 물질(Photoresist)을 패터닝(Patterning)하는 기법을 적용한다. 감광 물질은 SU-8을 사용하여 제 2 경사미세구조물(40)을 패터닝하고, 상기 제 2 경사미세구조물(40) 패턴 위에 다시 SU-8을 부어 상, 하위 제 2 경사미세구조물(42, 41)을 패터닝하며, 상기 상, 하위 제 1 경사미세구조물(32, 31)이 상, 하위 제 2 경사미세구조물(42, 41)보다 큰 높이로 형성된다.
또한, 상기 상위 플라스틱층 부(71)과 하위 플라스틱층 부(73)은 폴리다이메틸실록산(Poly(dimethylsiloxane), PDMS)을 이용한 몰딩(Molding) 방법으로 제작되는데, 본 실시예에서는 18.6 μm 과 11.6 μm 높이의 상, 하위 제 1 경사미세구조물(32, 31)과 상, 하위 제 2 경사미세구조물(42, 41)로 구성된 미세유체칩(1)을 제작한다. 또한, 16.2 μm 과 8.6 μm 높이의 상, 하위 제 1 경사미세구조물(32, 31)과 상, 하위 제 2 경사미세구조물(42, 41)로 구성된 미세유체칩도 제작한다.
도 5는 본 발명에 따른 미세공정기술로 제작된 유체영동기반 세포분리용 미세유체칩의 구성도이다. 도면에서 도시된 바와 같이, 채널 폭은 100 μm 너비의 제1 채널 영역(81) 및 제2 채널 영역(82)에서 1,000 μm 너비의 제3 채널 영역(83)으로 확장되는 구조로 형성되고, 채널의 상, 하부면에 교대로 형성된 제 1 경사미세구조물(30)을 갖는 100μm 너비의 제1 채널 영역(81)과, 채널의 상, 하부면에 교대로 형성된 제 2 경사미세구조물(40)로 구성된 100 μm 너비의 제2 채널 영역(82)으로 구성되되, 상, 하위 제 1 경사미세구조물(32, 31) 및 상, 하위 제 2 경사미세구조물(42, 41)은 각기 20개로 이루어진다.
여기서, 상기 제 1 경사미세구조물(30) 및 제 2 경사미세구조물(40)로 이루어진 약 13 mm 길이의 채널을 통하여 세포가 분리되며, 이렇게 분리된 입자는 분리된 입자의 측정을 위한 폭 1,000 μm 너비를 갖는 제3 채널영역(83)을 통하여 관찰된다. 몰딩 과정 후 폴리다이메틸실록산 기판에 홀을 형성시켜, 생화학입자 혼합물의 시료 주입구(10)와 시료 배출구(20)을 제작하고, 도 4에 도시된 바와 같은 상, 하위 플라스틱층 부(71, 73)은 공기 플라즈마를 이용하여 산화 및 적층함으로써, 두 층의 세포분리용 미세유체칩이 이루어진다.
(실시예 2) 유체영동기반 세포분리용 미세유체칩을 이용한 미세입자의 정렬 및 분리
도 6a는 채널 출구에서 크기에 따른 미세입자의 위치를 측정한 결과를 나타내는 그래프이며, 도 6b는 미세입자를 분리한 결과를 나타내는 그래프이며, 도 1을 참조한다.
도면에서 도시한 바와 같이, 실시예 1을 통하여 제작된 각기 8.6 μm와 11.6 μm 높이의 제 2 경사미세구조물(40)으로 구성된 두가지 종류의 칩을 이용하였다. 폴리스타이렌(Polystyrene) 미세입자의 위치를 측정한 결과는 제 2 경사미세구조물(40)의 높이보다 작은 크기를 갖는 미세입자의 경우에는 정렬된 위치를 유지하여 미세채널의 하단부에 위치되는 반면, 제 2 경사미세구조물(40)의 높이보다 큰 크기를 갖는 미세입자의 경우에는 상기 제 2 경사미세구조물(40)을 통과하지 못하여 정렬된 위치를 벗어나 통로(50)로 이동한다.
여기서, 11.6 μm 높이의 제 2 경사미세구조물로 구성된 칩을 이용하여 9 μm과 12 μm의 크기를 갖는 미세입자를 분리한 결과에 있어서, 분리하기 위한 입자의 크기는 제 2 경사미세구조물(40)의 높이를 조정함으로써 설정가능하며, 이종간의 입자가 섞여있을지라도 각 입자 상호간의 방해 없이 분리 과정을 수행할 수 있다.
(실시예3) 유체영동기반 세포분리용 미세유체칩을 이용한 혈액분리
도 7은 다수의 시료 배출구를 갖는 유체영동기반 세포분리용 미세유체칩 내 채널 구조의 구성도이다. 도면에서 도시된 바와 같이, 본 실시예에서는 각기 13 μm 와 4 μm 높이의 상, 하위 제 1 경사미세구조물(32, 31)과 상, 하위 제 2 경사미세구조물(42, 41)로 구성된 미세유체칩을 제작한다.
제1 시료 배출구 및 제2 시료 배출구(21, 22)를 갖는 채널구조로 채널 통과 후 백혈구는 제1 시료 배출구(21)로, 적혈구는 제2 시료 배출구(22)로 배출된다. 백혈구 및 적혈구를 포함하는 혈액 세포가 시료 주입구를 통하여 주입되면, 13 μm 높이로 제작된 제 1 경사미세구조물(30)을 통과하면서 유체유동의 우측면으로 정렬되고 정렬된 세포들은 제 2 경사미세구조물(40)을 통과하면서 크기에 따라 분리된다.
즉, 4 μm 높이의 상기 제 2 경사미세구조물(40)의 높이보다 작은 적혈구는 정렬된 위치를 유지하는 반면, 상기 제 2 경사미세구조물(40)의 높이보다 큰 백혈구는 정렬된 위치를 벗어나 분리 배출된다.
도 8a는 광학 현미경 및 형광 현미경으로 촬영한 분리전 혈액 세포를 나타내는 도이며, 도 8b는 광학 현미경 및 형광 현미경으로 촬영한 분리후 혈액 세포를 나타내는 도이다.
도면에서 도시하고 있는 바와 같이, 좌측은 광학 현미경으로 촬영한 혈액 세포의 50배율 사진이고, 우측은 형광 현미경으로 촬영한 혈액 세포의 50배율 사진이다. 우측 형광 현미경 사진에서는 형광염료를 이용하여 선택적으로 염색된 백혈구를 보여준다.
여기서, 도 8b는 유체영동기반 세포분리용 미세유체칩을 이용한 쥐 혈액의 분리결과를 나타내는데, 분리 전과 비교하여 보면 백혈구가 약 210배 농축되어 58%의 순도를 가지며 분리되었고, 초당 4000개의 혈액세포가 처리되었으며 그 중 백혈구의 회수율은 85 % 이였다.
이상에서는 본 발명의 바람직한 실시예를 예시적으로 설명하였으나, 본 발명의 범위는 이같은 특정 실시예에만 한정되지 않으며 해당 분야에서 통상의 지식을 가진자라면 본 발명의 특허 청구 범위내에 기재된 범주 내에서 적절하게 변경이 가능 할 것이다.
이상에서 설명한 바와 같이 상기와 같은 구성을 갖는 본 발명은 압력구배를 이용하여 유체 유동 방향에 대하여 경사를 갖는 제 1 경사미세구조물에 의해 유동 측면 방향으로 압력구배를 형성시키고, 압력구배를 따라 이동하는 세포와 제 2 경사미세구조물간의 기계적 상호 작용이 발생함을 이용하여 미세유체칩 내에서 세포를 크기에 따라 연속적으로 정렬 및 분리할 수 있음을 특징으로 한다. 본 발명에 의한 유체영동기반 세포분리용 미세유체칩 및 이를 이용한 혈액분리방법은 분리과정에서 정교한 유량제어를 필요로 하지 않기 때문에 세포의 분리 및 분석 기능이 집적화된 진단용 랩온어칩(Lap-on-a-chip)에 응용할 수 있으며, 별도의 외부 전압을 인가 및 유지할 필요가 없는 장점이 있다. 제조가 용이한 효과를 거둘 수 있다.
Claims (10)
- 소정의 폭으로 내경이 감소하는 미세유체 채널;상기 미세유체 채널 내부의 상, 하층에 교대로 유체의 유동 방향에 경사지게 형성되는 제 1 경사미세구조물;상기 미세유체 채널 내부의 상, 하층에 교대로 유체의 유동 방향에 경사지게 형성되되, 상기 제 1 경사미세구조물보다 짧은 길이로 형성되는 제 2 경사미세구조물; 및상기 제 2 경사미세구조물의 일단에 접하여 상기 미세유체 채널의 길이방향으로 형성되는 통로를 포함하여 구성되는 것을 특징으로 하는 유체영동기반 세포분리용 미세유체칩.
- 제1항에 있어서,상기 제 1 경사미세구조물은 상기 미세유체 채널 내에서 유동의 측면 방향으로 압력구배를 만들어 낮은 압력쪽으로 세포를 정렬시키는 것을 특징으로 하는 유체영동기반 세포분리용 미세유체칩.
- 제1항에 있어서,상기 제 2 경사미세구조물은 미세유체 채널의 내경을 일정 배율 감소되도록 형성시키되, 유체영동기반 세포분리용 미세유체칩에 삽입되는 서로 다른 크기의 두 세포 중 큰 크기의 세포와 작은 크기의 세포 사이의 높이로 형성되는 것을 특징으로 하는 유체영동기반 세포분리용 미세유체칩.
- 제1항에 있어서,상기 제 2 경사미세구조물은 상기 제 1 경사미세구조물에 의해 정렬된 세포를 크기별로 분리시키는 것을 특징으로 하는 유체영동기반 세포분리용 미세유체칩.
- 제1항에 있어서,상기 제 1 경사미세구조물 및 제 2 경사미세구조물의 경사구조는 경사각이 변형 가능한 것을 특징으로 하는 유체영동기반 세포분리용 미세유체칩.
- 제1항에 있어서,상기 미세유체 채널, 제 1 경사미세구조물 및 제 2 경사미세구조물은 유리, 실리콘, 금속 또는 고분자 화합물로 이루어진 기판 위에 형성되는 것을 특징으로 하는 유체영동기반 세포분리용 미세유체칩.
- 제1항에 있어서,상기 미세유체 채널의 유동 방향 일측에 시료 배출구가 형성되되, 상기 시료 배출구의 수는 하나 이상 다수개 형성 가능한 것을 특징으로 하는 유체영동기반 세포분리용 미세유체칩.
- 소정의 폭으로 내경이 감소하는 미세유체 채널, 상기 미세유체 채널 내부의 상, 하층에 교대로 유체의 유동 방향에 경사지게 형성되는 제 1 경사미세구조물, 상기 미세유체 채널 내부의 상, 하층에 교대로 유체의 유동 방향에 경사지게 형성되되, 상기 제 1 경사미세구조물보다 짧은 길이로 형성되는 제 2 경사미세구조물, 상기 제 2 경사미세구조물의 일단에 접하여 상기 미세유체 채널의 길이방향으로 형성되는 통로, 상기 미세유체 채널의 일단에 형성된 시료 주입구, 상기 미세유체 채널의 타단에 형성된 시료 배출구를 포함하는 유체영동기반 세포분리용 미세유체칩을 이용한 혈액분리방법에 있어서,상기 시료 주입구에 이종 그룹으로 이루어진 혈액이 주입되는 단계;상기 혈액 내 세포가 상기 제 1 경사미세구조물에 의하여 형성되는 압력구배에 의해 일측 방향으로 정렬되는 단계;상기 혈액 내 세포가 상기 제 2 경사미세구조물에 의하여 크기별로 분리되는 단계; 및크기별로 분리된 세포가 시료 배출구를 통해 배출되는 단계;를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 유체영동기반 세포분리용 미세유체칩을 이용한 혈액분리방법.
- 제8항에 있어서,상기 유체영동기반 세포분리용 미세유체칩에 이종 이상의 그룹으로 이루어지는 세포를 포함하는 혈액을 주입하여 하나 이상 다수개로 이루어진 시료 배출구에 각 크기별로 분리시킬 수 있는 것을 특징으로 하는 유체영동기반 세포분리용 미세유체칩을 이용한 혈액분리방법.
- 제8항에 있어서,상기 유체영동기반 세포분리용 미세유체칩에 적혈구 및 백혈구를 포함하는 혈액을 주입하여, 각 크기별로 분리시킬 수 있는 것을 특징으로 하는 유체영동기반 세포분리용 미세유체칩을 이용한 혈액분리방법.
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