CN210916029U - 一种用于分离和检测循环肿瘤细胞的简易型微流控芯片 - Google Patents
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Abstract
本实用新型提供一种用于分离和检测循环肿瘤细胞的简易型微流控芯片,由基底层和芯片层键合而成,芯片层包括依次连接的进样口;分流区,包括一级分流区和二级分流区,一级分流区包括与进样口连接的两根分流支管,二级分流区连接于分流支管的末端;细胞拦截区,包括彼此平行间隔延伸的若干进样管道和出样管道,进样管道的前端敞开,后端设置过滤通道;出样管道的前端封闭,后端敞开;进样管道与出样管道之间通过微柱列间隔,微柱列包括彼此保持一定间隔的具有椭圆形横截面形状的若干微柱;与分流区具有相同结构的集流区;以及出样口。根据本实用新型,提供了一种制备工艺简单、快速高效、灵敏度高以及完好保留循环肿瘤细胞活性的简易型微流控芯片。
Description
技术领域
本实用新型涉及医学检测和微流控技术领域,更具体地涉及一种用于分离和检测循环肿瘤细胞的简易型微流控芯片。
背景技术
肿瘤转移是癌症患者发病率和死亡率的主要原因。据统计,90%以上肿瘤患者的死亡与肿瘤转移相关。在肿瘤转移过程中,部分肿瘤细胞进入到血液系统,形成循环肿瘤细胞(circulating tumor cells,CTCs),经过血液中游走、粘附,相互聚集在远端器官组织,形成继发性转移灶。因此,CTCs在肿瘤的转移过程中发挥重要作用。在常规手术及治疗原发性肿瘤后,通过检测患者外周血中CTCs类型和数量的变化,实时监测肿瘤动态,有利于预后评估,实现个体化治疗。
然而,如何从患者外周血中高效、纯净地捕获CTCs,仍是一项技术挑战。在患者血液中,CTCs极为罕见,10亿个血细胞中约有一个。而CTCs的另外一个挑战则是它的异质性,因为目前尚没有100%特异性的生物标记物来识别CTCs。在各种分离CTCs的技术中,微流控芯片技术由于样本及试剂的低消耗、大规模、高通量、明确的流体特性(溶液在微通道内易形成层流和液滴)、易与多种技术结合(如可通过集成光镊、磁、电、声波等多种生化和物理方法,形成强大的平台)等优点,在生物医学研究中具有巨大的发展潜力和广泛的应用前景。
微流控芯片技术分离CTCs的方法主要包括基于亲和力的细胞分离法以及基于物理性质的细胞分离法。基于亲和的细胞分离方法是利用亲和配体和细胞表面标记之间形成非共价键的优势,从混合物中分离目标细胞的最常用方法,包括基于免疫亲和性以及基于适配体两种。目前,市场上唯一通过美国食品和药品监督管理(FDA)认证的CTCs分离和计数系统Cellsearch,就是依赖于免疫磁珠原理进行工作的半自动化系统,主要利用抗上皮细胞黏附分子抗体EpCAM的磁珠和CTCs表面标志物EpCAM特异性结合。尽管该系统具有较高的富集效率和回收率,然而,由于非恶性来源的上皮细胞也会表达EpCAM,并且有些肿瘤细胞中EpCAM表达缺失,则会导致一定的假阳性和假阴性。基于物理性质的细胞分离法则主要根据细胞大小、变形性、力学特性以及电学性能等的不同进行分离。基于细胞尺寸的微流控分选技术由于方法简便不受标记物限制,并且能够保持细胞的高活性,便于后续研究,引起很多研究者的兴趣。
专利文献CN106076441A公开了一种基于尺寸检测循环肿瘤细胞的微流控装置及方法,该装置在15mL/h的流速下对肿瘤细胞的捕获率能达到94%。该专利所述的微流控芯片检测原理是通过限制过滤通道的高度筛选肿瘤细胞,芯片通道有两个高度,包括主管道和侧管道的第一高度以及过滤通道的第二高度,因此其微流控芯片硅片模具的制备工艺较复杂,需要经过两次光刻及两次深反应离子刻蚀,而第二次光刻要在前一次光刻图案上进一步光刻,需要对准,一旦出现偏差则芯片报废,因此具有一定的技术难度。此外,该专利文献中所述的团块过滤区域虽能拦截细胞团块,但细胞溶液流经其中的六边形柱子时会产生大量气泡,影响流速。
专利文献CN106190774A公开了一种用于捕获循环肿瘤细胞的微流控芯片及其捕获和鉴定方法,该微流控芯片通过四级分流结构可将样品细胞溶液进行多级分流,最后每条分流支管连通一条细胞捕获通道,这样逐级分流虽然能减少单细胞溶液的堵塞,但如果溶液中有细胞团,则容易造成前面二级或三级分流通道的堵塞,进而导致后边部分细胞捕获通道利用率不高。另外,该文献中所用细胞栅栏结构由正六棱柱或正三棱柱微柱排列而成,在微流控芯片流体运动中这种微柱的角会对运动中的细胞造成破坏或损伤,不利于后续对捕获细胞的分析;而且这种带有角的微柱在加工过程中不容易脱模,芯片制作难度较大。
专利文献CN109351370A公开了一种微流控芯片和细胞筛选方法,该装置设置了多排不同高度的空间物理捕获单元,根据每排微柱高度梯度减小,依次捕获到尺寸逐渐减少的目标物,所以该装置内溶液的流动方向是从第一排到最后一排。一旦细胞密度大,第一排空间捕获单元内捕获的细胞簇过多,则容易造成堵塞,溶液很难流到后面几排,无法继续使用,因此该装置仅适用于低密度的细胞溶液,且捕获率未知,而对于肿瘤患者血液样本中循环肿瘤细胞的捕获,则有一定的难度,因为正常人1mL血液中约有5×1010个红细胞、7×106个白细胞和2.95×106个血小板,血液中的细胞密度远远超过该专利实施例2中所测试的5×104cells/mL。
实用新型内容
本实用新型的目的是提供一种用于分离和检测循环肿瘤细胞的简易型微流控芯片,从而解决现有技术中存在的耗时长、灵敏度低、拦截的肿瘤细胞活性差等的问题。
为了解决上述技术问题,本实用新型采用以下技术方案:
提供一种用于分离和检测循环肿瘤细胞的简易型微流控芯片,所述微流控芯片由基底层和芯片层键合而成,所述芯片层包括依次连接的:进样口;分流区,包括一级分流区和二级分流区,所述一级分流区包括与所述进样口连接的两根分流支管,所述二级分流区连接于所述两根分流支管的末端;细胞拦截区,包括彼此平行间隔延伸的若干进样管道和出样管道,所述进样管道的前端敞开供溶液进入,所述进样管道的后端设置过滤通道;所述出样管道的前端封闭,所述出样管道的后端敞开;所述进样管道与出样管道之间通过微柱列间隔,所述微柱列包括彼此保持一定间隔的若干微柱,所述微柱具有椭圆形横截面形状;集流区,包括一级集流区和二级集流区,所述一级集流区与每条出样管道的后端相通,所述二级集流区包括两根集流支管,用于汇集来自一级集流区的溶液;以及出样口,所述两根集流支管在所述出样口之前汇聚;其中,所述二级分流区与每条进样管道的前端相通,当溶液充满所述二级分流区后,均匀流入各所述进样管道。
优选地,每条所述出样管道的前端由一根拱形柱子组成,所述拱形柱子用于封闭该出样管道的前端,所述拱形柱子的两端分别与微柱列连接,并与所述微柱列中最近的微柱保持5~12μm的间隔。
优选地,每条所述进样管道后端的过滤通道由保持一定间隔并排列成拱形的若干微柱组成,所述过滤通道的微柱间的间隔为5~12μm。
优选地,所述二级分流区与一级集流区均包括若干用于支撑该区域的圆柱形柱子。
优选地,所述进样管道和出样管道长度为2~4cm。
优选地,所述微柱列的微柱间的间隔为5~12μm,高度为25-50μm。
优选地,所述进样管道和出样管道各为50~60条。
优选地,所述基底层和/或芯片层由玻璃、PDMS、PMMA、PC、PP中的任意一种材料制成。
所述微流控芯片还包括动力系统。
优选地,所述动力系统为正压动力系统或负压动力系统,所述正压动力系统包括高精度移液泵、蠕动泵或注射器,所述负压动力系统包括蠕动泵或注射器,所述动力系统的流速为1~10mL/h。
根据本实用新型提供的一种用于分离和检测循环肿瘤细胞的简易型微流控芯片,具有以下优点:
其一,该微流控芯片的二级分流区与每条进样管道的前端相通,当溶液充满该二级分流区后,将均匀流入进样管道,当不含循环肿瘤细胞的溶液自过滤通道和出样管道流出后进入一级集流区,直至溶液充满后进入二级集流区,最后自出样口流出,既有效避免了堵塞,又能保证细胞拦截区中各进样管道的高利用率;
其二,该微流控芯片内进样管道与出样管道通过微柱列间隔,进样管道的前端开放,终端有过滤通道,出样管道的前端封闭,终端开放,这样,溶液通过进样口端的分流区进入进样管道后,在蠕动泵提供的负压或正压下,溶液会通过各微柱间的夹缝,进入出样管道,或者直接从进样管道终端的过滤通道流出,进样管道和出样管道分开,各司其职,利于溶液流通,防止堵塞;微柱列的微柱均具有椭圆形横截面形状,以完好保留循环肿瘤细胞的活性,避免循环肿瘤细胞在该分离和筛选过程中受到损伤,影响检测结果的准确性;尺寸较小的白细胞会随着溶液从微柱间夹缝或者过滤通道流出,而尺寸较大的循环肿瘤细胞则会卡在微柱列的夹缝口或夹缝中,通过控制夹缝的宽度、长度以及高度,达到快速有效地、高灵敏度分离和筛选,肿瘤细胞拦截率可达到98%以上,并且该微流控芯片包括几十条进样管道和出样管道,通量大;
其三,该微流控芯片通过限制微柱间夹缝宽度筛选肿瘤细胞,而进样管道、出样管道和微柱均具有相同的高度,所以硅片模具的制备仅需要一次光刻和一次深反应离子刻蚀,避免了第二次光刻难对准的问题,因此该微流控芯片的制备工艺简单,缩短了制备流程并节省了生产成本;
其四,该微流控芯片是基于细胞尺寸进行循环肿瘤细胞分离,并利用多种抗体进行检测,并不涉及免疫亲和方法进行捕获,避免了由于肿瘤细胞异质性造成的假阳性和假阴性,提高了准确率。
总之,本实用新型提供了一种制备工艺简单、快速高效、灵敏度高、准确率高以及完好保留循环肿瘤细胞活性的简易型微流控芯片。
附图说明
图1是根据本实用新型的一个优选实施例的一种简易型微流控芯片的整体结构示意图;
图2是细胞拦截区前端的细节放大结构示意图;
图3是细胞拦截区后端的细节放大结构示意图;
图4是微柱间夹缝口拦截的循环肿瘤细胞团;
图5是微柱间夹缝口拦截的单个循环肿瘤细胞;
图6是微柱间夹缝间拦截的单个循环肿瘤细胞。
具体实施方式
以下结合具体实施例,对本实用新型做进一步说明。应理解,以下实施例仅用于说明本实用新型而非用于限制本实用新型的范围。
实施例1
如图1所示,是根据本实用新型的一个优选实施例的一种简易型微流控芯片100,该微流控芯片100由基底层和芯片层经过等离子处理后键合而成。其中,芯片层包括依次连接的:进样口1,分流区2,细胞拦截区3,集流区4,以及出样口5。
其中,分流区2,包括一级分流区21和二级分流区22,一级分流区21 包括与进样口连接的两根分流支管,可将自进样口1进入的溶液分流为两股,二级分流区22连接于两根分流支管的末端,用于将汇聚在此区域的溶液均匀分流到细胞拦截区3。既有效避免了堵塞,又能保证细胞拦截区3中各进样管道的高利用率。
结合图2、图3所示,细胞拦截区3包括彼此平行间隔延伸的若干进样管道31和出样管道32,进样管道31的前端敞开供溶液进入,进样管道31的后端设置过滤通道33;出样管道32的前端封闭,出样管道32的后端敞开供溶液流出;进样管道31与出样管道32之间通过微柱列34间隔,微柱列34包括彼此保持一定间隔的若干微柱,该微柱列34的微柱均优选具有椭圆形横截面形状,以完好保留循环肿瘤细胞的活性,避免循环肿瘤细胞在该分离和筛选过程中受到损伤,影响检测结果的准确性。根据该细胞拦截区3的构造,溶液自进样管道31流入,由于循环肿瘤细胞尺寸大于夹缝宽度,因此循环肿瘤细胞会留在微柱间的夹缝中或者过滤通道中,除了循环肿瘤细胞之外的溶液则或者从两侧微柱列34的夹缝中流出进入出样管道32,或者从后端的过滤管道33 流出直接进入集流区4,直至从出样口5流出。
类似于分流区2,集流区4包括一级集流区41和二级集流区42,一级集流区41与每条出样管道32的后端相通,二级集流区42包括两根集流支管,用于汇集来自一级集流区41的溶液,两根集流支管在出样口5之前汇聚。
根据该优选实施例,每条出样管道32的前端由一根拱形柱子321组成,用于封闭该出样管道32的前端,拱形柱子321的两端分别与微柱列34连接,并与微柱列34中最近的微柱保持5~12μm的间隔。
根据该优选实施例,每条进样管道31后端的过滤通道33由保持一定间隔并排列成拱形的若干微柱组成,该过滤通道33的微柱间的间隔同样为5~12 μm。
根据该优选实施例,二级分流区22与一级集流区41均包括若干用于支撑该区域的圆柱形柱子221、411。
根据该优选实施例,进样管道31的长度为3.9cm,宽度为100μm,共有60条;出样管道32的长度为3.9cm,宽度为70μm,共有59条;微柱列 34的微柱间的间隔,即夹缝宽度为5~12μm,高度为30μm,该微柱的长度尺寸为30μm。
根据该优选实施例,基底层由玻璃制成,芯片层由聚二甲基硅氧烷制成。但是应当理解的是,基底层和/或芯片层均可由玻璃、PDMS、PMMA、PC、 PP中的任意一种材料制成。
根据该优选实施例,该简易型微流控芯片还包括动力系统。动力系统为蠕动泵,蠕动泵的流速为1~10mL/h。
实施例2
根据实施例1提供的一种简易型微流控芯片,其加工和制备方法如下:
2.1硅模具的制备:
根据图形制作掩膜板;在四寸单晶硅片上旋涂一层正性光刻胶,并在掩膜板的保护下进行光刻;显影硬烘后,进行深反应离子刻蚀;最后得到具有微结构的硅片模具。
2.2PDMS芯片制备:
利用氟硅烷对硅模具进行硅烷化处理;将配置好的PDMS(PDMS基体与固化剂按照质量比10:1配置)抽真空,去除气泡,并浇注在处理好的硅模具上,静置,然后80℃加热1h;PDMS固化后,将其从硅模具中剥离下来;最后将PDMS和玻璃片进行等离子清洗处理,取出后迅速居中贴合在一起,这样PDMS芯片就制作完成。
实施例3
根据实施例1提供的一种简易型微流控芯片,其使用方法如下:
使用淋巴细胞分离液对血液样本进行预处理,最后将获得的细胞用1%的多聚甲醛溶液固定10min,离心,用PBS重悬后,置于4℃中备用;
将微流控芯片置于真空泵中抽真空处理,然后将芯片的出样口端与蠕动泵连接,用1mL枪头吸取预处理好的血液样本,并将枪头插在进样口端,利用蠕动泵提供的负压或正压使枪头内的样本流入微流控芯片中;
样本进样结束后,进样口端加入Triton X-100和BSA混合液,利用负压或正压使溶液充满整个芯片,室温孵育8min;
将芯片中的混合液抽干,进样口端加入免疫荧光抗体混合液(包括识别循环肿瘤细胞的抗体,识别白细胞的CD45,染细胞核的DAPI),芯片充满抗体后,置于37℃中孵育30-45min;
抗体孵育结束后,将芯片内溶液抽出,进样口端加入洗液(PBS中加入 0.05%的Tween 20)冲洗芯片,将未反应的抗体洗掉;
用荧光显微镜观察微流控芯片。
实施例4
微流控芯片肿瘤细胞捕获率测试:
按照实施例3中提供的处理血样样本的方法处理正常人血液,在获得的正常人细胞中加入一定量的H1975肺癌细胞,用来模拟肺癌患者血液样本;
使用实施例1获得的微流控芯片,按照实施例3提供的使用方法进行进样;
在免疫荧光抗体孵育步骤中使用的抗体为识别肺腺癌细胞的抗体 CK18,识别白细胞的CD45,以及染细胞核的DAPI;
整个过程结束后,荧光显微镜下观察芯片,并对芯片中拦截的H1975 细胞计数,计算肿瘤细胞拦截率;
该微流控芯片在使用5μm宽度夹缝条件下得到的肿瘤细胞拦截率为 98%以上,如图4~图6所示,H1975肺癌细胞团以及单个H1975肺癌细胞被拦截在微柱的夹缝口和夹缝间。
实施例5
对肺癌患者血液中循环肿瘤细胞进行分离和检测:
使用实施例2中制备的芯片,根据实施例3提供的使用方法,对肺癌患者血液样本进行检测和分析;
芯片使用结束后,置于荧光显微镜下,统计芯片中CTCs的数量。
以上所述的,仅为本实用新型的较佳实施例,并非用以限定本实用新型的范围,本实用新型的上述实施例还可以做出各种变化。凡是依据本实用新型申请的权利要求书及说明书内容所作的简单、等效变化与修饰,皆落入本实用新型专利的权利要求保护范围。本实用新型未详尽描述的均为常规技术内容。
Claims (10)
1.一种用于分离和检测循环肿瘤细胞的简易型微流控芯片,所述微流控芯片由基底层和芯片层键合而成,其特征在于,所述芯片层包括依次连接的:
进样口;
分流区,包括一级分流区和二级分流区,所述一级分流区包括与所述进样口连接的两根分流支管,所述二级分流区连接于所述两根分流支管的末端;
细胞拦截区,包括彼此平行间隔延伸的若干进样管道和出样管道,所述进样管道的前端敞开供溶液进入,所述进样管道的后端设置过滤通道;所述出样管道的前端封闭,所述出样管道的后端敞开;所述进样管道与出样管道之间通过微柱列间隔,所述微柱列包括彼此保持一定间隔的若干微柱,所述微柱具有椭圆形横截面形状;
集流区,包括一级集流区和二级集流区,所述一级集流区与每条出样管道的后端相通,所述二级集流区包括两根集流支管,用于汇集来自一级集流区的溶液;以及
出样口,所述两根集流支管在所述出样口之前汇聚;
其中,所述二级分流区与每条进样管道的前端相通,当溶液充满所述二级分流区后,均匀流入各所述进样管道。
2.根据权利要求1所述的简易型微流控芯片,其特征在于,每条所述出样管道的前端由一根拱形柱子组成,所述拱形柱子用于封闭该出样管道的前端,所述拱形柱子的两端分别与所述微柱列连接,并与所述微柱列中最近的微柱保持5~12μm的间隔。
3.根据权利要求1所述的简易型微流控芯片,其特征在于,每条所述进样管道后端的过滤通道由保持一定间隔并排列成拱形的若干微柱组成,所述过滤通道的微柱间的间隔为5~12μm。
4.根据权利要求1所述的简易型微流控芯片,其特征在于,所述二级分流区与一级集流区均包括若干用于支撑该区域的圆柱形柱子。
5.根据权利要求1所述的简易型微流控芯片,其特征在于,所述进样管道和出样管道的长度为2~4cm。
6.根据权利要求1所述的简易型微流控芯片,其特征在于,所述微柱列的微柱间的间隔为5~12μm,高度为25-50μm。
7.根据权利要求1所述的简易型微流控芯片,其特征在于,所述进样管道和出样管道各为50~60条。
8.根据权利要求1所述的简易型微流控芯片,其特征在于,所述基底层和/或芯片层由玻璃、PDMS、PMMA、PC、PP中的任意一种材料制成。
9.根据权利要求1所述的简易型微流控芯片,其特征在于,所述微流控芯片还包括动力系统。
10.根据权利要求9所述的简易型微流控芯片,其特征在于,所述动力系统为正压动力系统或负压动力系统,所述正压动力系统包括高精度移液泵、蠕动泵或注射器,所述负压动力系统包括蠕动泵或注射器,所述动力系统的流速为1~10mL/h。
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Date | Code | Title | Description |
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GR01 | Patent grant | ||
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