DE60034789T2

DE60034789T2 - Apparat für wanderfeld-dielektrophoresis und verfahren

Info

Publication number: DE60034789T2
Application number: DE60034789T
Authority: DE
Inventors: Gary Michael Lock; Ronald Lleyn Pethig
Original assignee: Bangor University
Current assignee: Bangor University
Priority date: 1999-07-20
Filing date: 2000-07-20
Publication date: 2008-01-31
Anticipated expiration: 2020-07-21
Also published as: CA2379793A1; AU6004800A; EP1202812A1; JP2003504196A; DE60034789D1; EP1202812B1; WO2001005514A1; ATE361786T1; GB9916848D0

Description

Die Erfindung bezieht sich auf eine Vorrichtung und ein Verfahren zur Benutzung der Technik der Dielektrophorese und betrifft insbesondere eine Anordnung zum Konzentrieren oder Verdünnen oder Transportieren oder Trennen oder Erfassen oder Charakterisieren von Teilchen.
Die Technik der Dielektrophorese (DEP) wird in dem Buch "Nanotechnology in Medicine and the Biosciences", Herausgeber RRH Combs und D W Robinson, veröffentlicht von Gordon & Breach, Amsterdam, Kapitel 11 von Ronald Pethig, insbesondere Seiten 153 bis 168, beschrieben. Die Dielektrophorese ist die Bewegung von Teilchen in uneinheitlichen elektrischen Feldern. Im Unterschied zur Elektrophorese sind Ladungen an den Teilchen selbst nicht erforderlich, damit die Wirkung eintritt, und es werden Wechselstromfelder anstelle von Gleichstromfeldern angewandt.
Wenn ein elektrisches Feld auf ein System einwirkt, das aus in einem flüssigen Medium suspendierten Teilchen besteht, wird normalerweise in jedem Teilchen ein Dipolmoment induziert, und zwar als Ergebnis der elektrischen Polarisationen, die an den Grenzflächen ihrer Struktur entstehen. Wenn ein elektrisches Feld eines Wechselstroms (AC) angelegt wird, ist das induzierte Dipolmoment im Allgemeinen gegenüber dem Feld phasenverschoben. Um dies zu beschreiben, wird das Dipolmoment als ein Vektor mit einer gleichphasigen (realen) und einer phasenverschobenen (imaginären) Komponente definiert. Wenn das Feld uneinheitlich ist, erfahren die Teilchen eine Translationskraft, die als dielektrophoretische Kraft bekannt ist, mit einer Größe und einer Polarität, die von den elektrischen Eigenschaften der Teilchen und ihres umgebenden Mediums abhängen. Diese Kraft ist auch eine Funktion der Größe und der Frequenz des angelegten elektrischen Felds. Die übliche DEP wird mit stationären Feldern benutzt, und die Teilchen erfahren eine gleichphasige (reale) DEP-Kraft.
In einer Veröffentlichung von Kaler et al., Biophys. J., Band 63, Juli 1992, Seiten 58 bis 69, werden Signale mit verschiedenen Frequenzen auf eine einzelne Stiftelektrode übertragen, so daß ein Teilchen gleichzeitig eine positive und eine negative DEP-Kraft erfährt. Eine solche Anordnung kann zum Charakterisieren von Teilchen, nicht aber zu deren Trennung benutzt werden.
Eine andere Anwendung der DEP-Technik wird in WO 98/04355 , British Technology Group, beschrieben. Dort läßt man eine teilchenhaltige Flüssigkeit über eine kammartige Anordnung von Elektroden strömen, denen Signale mit verschiedenen Frequenzen zugeführt werden. Teilchen mit verschiedenen Eigenschaften werden gezwungen, vorzugsweise zu verschiedenen DEP-Bereichen der Anordnung oder von diesen weg zu wandern, so daß die Teilchen charakterisiert werden können. Es werden eine strömende Flüssigkeit und eine übliche DEP mit einem statischen Feld benutzt.
Die Technik der DEP mit Wanderwelle wird auch von Pethig, Kapitel 11, Seiten 161 bis 165, beschrieben. Signale mit verschiedenen Phasen werden auf eine Anordnung aus in Abständen positionierte Elektroden übertragen, um ein elektrisches Wanderfeld zu erzeugen. Mit entsprechender Bezugnahme auf Arbeiten anderer Autoren auf diesem Gebiet, insbesondere von Y. Huang et al., "Electrokinetic behaviour of colloidal particles in travelling electric fields: studies using yeast", J. Phys. D: Apply. Phys., 26, Seiten 1528 bis 1535, 1993, wird von Pethig erklärt, daß zur Ausbildung einer DEP mit Wanderwelle (TWD) in einem Wanderfeld das Teilchen eine Negative Realkomponente der DEP-Kraft erfahren muß, die es von den Elektroden abstößt und so über ihnen schweben läßt. Es muß auch eine imaginäre Komponente zu der DEP-Kraft vorliegen, damit eine TWD eintritt, so daß das Teilchen in dem Feld eine Translationsbewegung erfährt. Die imaginäre Komponente der DEP-Kraft in einem statischen elektrischen Wechselstromfeld äußert sich als ein Drehmoment über ein Teilchen, und die Frequenzveränderung dieser Komponente kann dadurch erhalten werden, daß das Teilchen einem elektrischen Drehfeld unterworfen und sein Ansprechen bezüglich der Elektrorotation gemessen wird. Der Frequenzbereich, über den die TWD möglich ist, wird als TW in 1 angegeben, die das Prinzip der üblichen TWD bei einer einzigen Frequenz an einem einzigen Teilchentyp erläutert. Die TW kann als ein Wanderwellenfenster für das Teilchen betrachtet werden. Innerhalb dieses Fensters wandert das Teilchen mit verschiedenen Geschwindigkeiten in Abhängigkeit von der Größe der imaginären Komponente der Kraft I und der Schwebungshöhe des Teilchens, die sich aus dem realen Teil der Kraft R ergibt. Das Profil der Wandergeschwindigkeit eines Teilchens innerhalb des Wanderwellenfensters wird als. "Hülle" der Wanderwelle bezeichnet.
In der vorliegenden Beschreibung wird der Ausdruck "Teilchen" in dem Sinne benutzt, daß er z. B. biologische Zellen, Bakterien, Viren, parasitische Mikroorganismen, DNA, Proteine, Biopolymere, nichtbiologische Teilchen oder irgendwelche andere Teilchen, die in einer Flüssigkeit suspendiert sein können, entweder als einzelne Einheit oder als Kombinationseinheit, in der eine dielektrophoretische Kraft induziert werden kann, beinhaltet. Der Ausdruck bezieht sich auch auf in einer Flüssigkeit gelöste oder suspendierte chemische Verbindungen oder Gase, in denen eine dielektrophoretische Kraft induziert werden kann.
Gemäß der Erfindung ist ein DEP-Verfahren zum Trennen von Teilchen mehreren Typs durch die im Hauptanspruch angegebenen Merkmale gekennzeichnet.
Bei einer Anordnung wird die zweite Frequenz derart gewählt, daß der Bereich der Frequenzen, die das Wanderwellenfenster (wie oben definiert) der Teilchen abgrenzen, enger oder weiter gemacht wird. Die zweite Frequenz kann derart gewählt werden, daß ein stationäres DEP-Feld, das entweder positiv oder negativ ist, ein TWD-Feld mit dem imaginären Teil der Kraft, die im Wesentlichen gleich Null ist oder ein TWD-Feld, bei dem der reale Teil der Kraft im wesentlichen gleich Null ist, erzeugt wird.
Alternativ wird die zweite Frequenz derart gewählt, daß die Schwebungshöhe der Teilchen über den Elektroden, welche die dielektrophoretische Kraft ausüben, unterschiedlich ist. Die zweite Frequenz kann so gewählt werden, daß ein stationäres DEP-Feld, das entweder positiv oder negativ ist, oder ein TWD-Feld, bei dem der imaginäre Teil der Kraft im wesentlichen gleich Null ist, erzeugt wird.
Bei einer anderen Anordnung wird die zweite Frequenz derart gewählt, daß zwei Teilchentypen gleichzeitig wandern, wobei diese derart ausgebildet sind, daß nur ein Typ beim Anlegen der ersten Frequenz wandert.
Bei einer anderen Anordnung wird die zweite Frequenz derart gewählt, daß von zwei Teilchentypen ein Typ durch die Elektroden festgehalten wird, während der andere Typ wandert, wobei die Teilchentypen derart ausgebildet sind, daß beide beim Anlegen der ersten Frequenz wandern.
Bei einer anderen Anordnung wird die zweite Frequenz derart gewählt, daß die relativen Wandergeschwindigkeiten der zwei verschiedenen Teilchentypen erhöht werden, üblicherweise durch Anwenden einer zweiten Frequenz derart, daß ein Teilchentyp eine deutliche imaginäre Komponente der TWD-Kraft erfährt.
Gegebenenfalls kann eine dritte Frequenz angewandt werden, um die nötige Wirkung zu erzielen, wobei die dritte Frequenz auch derart gewählt wird, daß ein statisches Feld oder ein TWD-Feld erzeugt wird.
Bei einer anderen Anordnung wird die zweite Frequenz derart gewählt, daß die Teilchentypen in entgegengesetzten Richtungen wandern und bei der Anwendung nur der ersten Frequenz in der gleichen Richtung wandern würden. Die zweite Frequenz erzeugt vorzugsweise ein TWD-Feld mit einer starken realen und einer starken imaginären Komponente, und es ist sehr wahrscheinlich, daß eine dritte Frequenz angewandt wird, um das nötige Ergebnis zu erzielen.
Bei allen Anwendungen können ein dritter oder mehr Teilchentypen anwesend sein, und es können eine dritte oder mehr Frequenzen angewandt werden.
Arnold und Zimmermann beschreiben im US Patent 4801543 "Verfahren und Vorrichtung für die Differenzierung von Teilchen in einem Medium", eine Technik, bei der zwei gegeneinander rotierende elektrische Felder auf eine Teilchensuspension einwirken. Dies führt zu dem Ergebnis, daß verschiedene Teilchentypen unterschiedliche Drehgeschwindigkeiten um ihre Drehachsen zeigen. Gemäß der vorliegenden Erfindung werden stationäre elektrische Felder und elektrische Wanderfelder überlagert, um die Translationsbewegung der Teilchen in der Suspension zu ändern.
Die WO 91/11262 beschreibt ein Verfahren zum Manipulieren von Teilchen dadurch, daß sie zwei oder mehr Dielektrophoresekräften, die entweder zusammen oder getrennt wirken, unterworfen werden. Die Druckschrift lehrt nicht das durch die vorliegende Erfindung offenbarte Verfahren des Manipulierens von Teilchen unter Anwendung von elektrischen Wanderfeldern oder des Änderns der dielektrophoretischen Reaktion der Teilchen durch Überlagerung einer zweiten Dielektrophoresekraft oder einer Wanderfeldkraft mit einer Kraft eines elektrischen Wanderfelds.
Die US-A-5489506 beschreibt ein Verfahren und eine Vorrichtung, bei denen eine Reihe von Elektroden in einer Kammer getrennt und der Reihe nach bei verschiedenen elektrischen Frequenzen mit Energie versorgt wird. Der Zweck besteht darin, Zellen abzulenken, wenn sie an den Elektroden vorbeiströmen, um verschiedene Zelltypen in getrennte Strömungswege physikalisch aufzutrennen. Jede Elektrode erzeugt eine stationäre dielektrophoretische Kraft auf die Zellen, und weil die Elektroden über den Strömungsweg voneinander beabstandet sind, tritt eine Überlagerung der verschiedenen dielektrophoretischen Kräfte nicht ein. Die US 5489506 lehrt kein Verfahren, wie es in der vorliegenden Erfindung beschrieben ist, zum Ändern der Wanderwellenelektrophorese der Teilchen durch gleichzeitiges Überlagern eines zweiten Dielektrophoresekraftsignals auf die gleichen Elektroden.
Die Erfindung wird nun nur beispielhaft unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen erläutert, worin
2 fünf mögliche zusätzliche zweite Frequenzen erläutert;
3 die Wirkung der zunehmenden Größenordnungen einer ausgewählten zweiten Frequenz F2 auf einen einzelnen Teilchentyp erläutert;
4 die prinzipielle Trennung von zwei Teilchentypen durch eine übliche TWD bei einer einzigen Frequenz erläutert, wobei diese Figur eine Bezugsfigur ist;
5 die Wirkung des Hinzufügens eines zweiten Signals bei der Frequenz F6 auf die Anordnung gemäß 4 erläutert;
6 eine Bezugsfigur ähnlich 4 ist;
7 die Wirkung des Hinzufügens einer zweiten Frequenz F8 bei der Anordnung gemäß 6 erläutert;
8 die Wirkung des Hinzufügens eines dritten Signals bei der Anordnung gemäß 6 erläutert;
9 schematisch eine TWD-Vorrichtung zeigt;
10 experimentelle Daten der Elektrorotation ROT und der Dielektrophorese DEP für Hefezellen zeigt;
11 das Aussehen der Elektrodenanordnung zeigt, die benutzt wurde, um Spektren der Wanderwellendielektrophorese (TWD) zu erhalten, wobei ein Satz paralleler geradliniger Elektroden benutzt wurde;
12 experimentelle TWD-Daten für Hefezellen zeigt, und zwar für Fälle, in denen auf das TWD-Signal kein zusätzliches zweites Signal angewandt wird (A) und in denen ein stationäres DEP-Feld bei 2 kHz überlagert wird (B). Die Zellen zeigen ein fundamental instabiles (FUN) Verhalten im Frequenzbereich X;
13 experimentelle TWD-Daten für Hefezellen zeigt, und zwar für den Fall, daß (A) kein zusätzliches zweites Signal angewandt wird, und für die Fälle, in denen ein zusätzliches stationäres DEP-Feld bei 400 kHz (B) oder 10 MHz (C) angewandt wird.
In den 1 bis 8 wird die erwartete dielektrophoretische Reaktion der Teilchen dargestellt, wobei diese in einem Medium mit einer Leitfähigkeit von 2 mS/cm suspendiert sind.
In 1 wird aus dem Stand der Technik die Wirkung der Anwendung eines dielektrophoretischen Felds auf Teilchen roter Blutzellen (rbc) über einen weiten Frequenzbereich dargestellt. Die reale Komponente R und die imaginäre Komponente I der DEP-Kraft sind mit einem willkürlichen Maßstab gegen den Logarithmus der Frequenz aufgetragen.
Es ist gut bekannt, daß die Anwendung eines stationären Felds als übliche DEP angesehen wird und nur die reale Komponente der DEP-Kraft ausgenutzt wird. Mit der TWD wird sowohl die reale als auch die imaginäre Komponente der Kraft ausgenutzt.
Es wird nun die Wirkung der Anwendung eines zusätzlichen Signals bei einer zweiten Frequenz betrachtet. In 2 werden die Frequenzen von fünf möglichen zusätzlichen Signalen durch die Pfeile auf dem allgemeinen Dielektrophoresespektrum dargestellt. Die Figur ist eine Bezugsfigur. Keine der Frequenzen F0 bis F4 wird auf das Spektrum angewandt.
Bei der Frequenz F0 liegen ein hoher negativer realer Teil und kein imaginärer Teil vor.
Bei der Frequenz F1 liegen kein realer Teil und ein hoher negativer imaginärer Teil vor.
Bei der Frequenz F2 liegen ein hoher positiver realer Teil und kein imaginärer Teil vor.
Bei der Frequenz F3 liegen kein realer Teil und ein hoher positiver imaginärer Teil vor.
Bei der Frequenz F4 liegen ein negativer realer Teil und kein imaginärer Teil vor.
Die Wirkung der Anwendung eines zusätzlichen Signals bei der Frequenz F2 auf das Spektrum der roten Blutzellen (rbc) wird in 3 dargestellt. Das Signal wird nun durch eine Linie angezeigt, um die aktuelle Anwendung darzustellen. Der imaginäre Teil I, punktiert gezeichnet, ist unverändert, weil bei der Frequenz F2 keine imaginäre Komponente (I = 0) vorliegt. Jedoch verursacht das zusätzliche Signal den realen Teil R, der bei der Frequenz F2 positiv ist, und wird mehr positiv entsprechend der Amplitude des Signals F2, wie durch die punktierten Linien R', R'', R''', usw. dargestellt ist. Die Zunahme des Werts ist proportional zum Quadrat der Spannung des angewandten Signals F2.
Wenn die Amplitude des Signals F2 zunimmt, wird der reale Teil R der Netto-DEP-Kraft positiver (R', R'', R'''). Das Wanderwellenfenster wird enger, wie durch den Pfeil TW'' entsprechend dem realen Teil R2'' dargestellt wird. Deshalb wandern die Teilchen über engere Bereiche der angewandten Frequenz, was zu einer erhöhten Selektivität und Empfindlichkeit bei der Kontrolle und der Charakterisierung der Teilchen führt.
Alternativ kann durch Auswählen der geeigneten Bedingungen das TW-Fenster erweitert werden, um die Empfindlichkeit herabzusetzen. Unter Bezugnahme auf 2 kann dies durch Anwenden eines zweiten Signals bei der Frequenz F0 erreicht werden.
Bei einer anderen Variante kann die Schwebungshöhe der Teilchen über den DEP-Elektroden verändert werden. Ein Weg, um dies zu erreichen, besteht darin (siehe 2), ein Wanderfeldsignal der Frequenz F0 oder F2, d.h. ein Signal, bei dem der reale Teil der DEP-Kraft entweder positiv oder negativ und der imaginäre Teil null ist, anzuwenden, wobei die Schwebungshöhe der Teilchen über den DEP-Elektroden variiert werden kann.
Alternativ kann ein stationäres DEP-Feld benutzt werden, d.h. ein Feld, das nur eine reale und keine imaginäre DEP-Komponente induziert. Wiederum gemäß 2 bewirkt irgend eine Frequenz unterhalb F1 eine negative DEP-Kraft und steigert somit die Schwebungshöhe der Teilchen über den Elektroden. In ähnlicher Weise bewirkt irgend eine Frequenz zwischen zwischen F1 und F3 eine positive DEP-Kraft und verringert somit die Schwebungshöhe der Teilchen.
Als eine weitere Variante zum Einstellen der Schwebungshöhe der Teilchen kann irgend eine Frequenz benutzt werden, die eine reale positive oder negative Komponente und zusätzlich eine imaginäre Komponente aufweist. Jedoch führt eine solche Frequenz zu einer Änderung der imaginären Komponenten mit einer direkten Wirkung auf die Wandergeschwindigkeit der Teilchen, weshalb dies im allgemeinen nicht bevorzugt ist. Stationäre DEP-Felder sind zum Variieren der Schwebungshöhe der Teilchen über den DEP-Elektroden bevorzugt.
Das Steuern der Schwebungshöhe der Teilchen in einem TWD-Feld bietet mehrere Vorteile. Wie von Hughes et al. in der Veröffentlichung "Dielectrophoretic forces an particles in travelling electric fields", J. Phys. D: Appl. Phys. 29, Seiten 474-482, 1996, gezeigt wird, verändert sich die in einem TWD-Feld auf ein Teilchen wirkende Translationskraft deutlich als Funktion der Höhe der Teilchen über der Elektrodenebene. Ferner kehrt sich diese Kraft unter dem Einfluß von elektrischen Phasenverzerrungseffekten in der Richtung um, und zwar für Höhen, die sich sehr nahe an der Elektrodenebene befinden, und erzeugt fundamental instabile (FUN) elektrokinetische Effekte, wie zuerst von Huang et al. in J. Phys., D: Appl. Phys., 26, Seiten 1528-1535, 1993, beschrieben worden ist. Diese von der Schwebungshöhe abhängigen Effekte wurden von Wang et al., Biophysical Journal 72, Seiten 1887-1899, 1997, weiter untersucht. Wenn man in der Lage ist, die Teilchenhöhe innerhalb eines Wanderfelds zu steuern, führt dies zu einem neuen Mittel für die Charakterisierung und Trennung von Teilchen. Ohne die Anwendung der vorliegenden Erfindung ist ein solches Steuern der Teilchen nicht möglich.
Die erfindungsgemäße Technik findet eine praktische Anwendung bei der Teilchentrennung. 4 zeigt den realen und den imaginären Teil des DEP-Spektrums von roten Blutzellen und E-coli-Bakterien. Eine Überprüfung zeigt, daß das Wanderwellenfenster für beide Teilchen bei etwa 20 bis 600 kHz ähnlich ist. Bei einer üblichen Anordnung zum Trennen dieser zwei Teilchentypen würde die TWD bei einer Frequenz von etwa 200 kHz angewandt werden. In 4 ist eine Linie F5 bei dieser Frequenz dargestellt. Bei 200 kHz erfahren die E-coli-Zellen eine Schwebungskraft (einen negativen realen Teil R) und eine Translationskraft (einen imaginären Teil I) in viel stärkerem Maße als die roten Blutzellen und würden deshalb veranlaßt werden, sich in dem TWD-Feld relativ rasch zu bewegen, während die Blutzellen sich relativ langsam bewegen würden. Jedoch wäre für eine wirksame Trennung eine sehr lange TWD-Elektrodenanordnung nötig, insbesondere beim Einsatz von hohen Teilchenkonzentrationen.
Im Gegensatz dazu wird angenommen, daß die Differenz in den DEP-Eigenschaften der zwei Teilchentypen vergrößert wird. Dies kann durch die Anwendung einer zweiten Frequenz erreicht werden, und die Bezugsfigur 4 zeigt durch den Pfeil F6 den möglichen Wert dieser Signalfrequenz. 5 zeigt die Wirkung auf die Spektren beim Anwenden eines zusätzlichen Signals bei der Frequenz F6. Die reale Komponente der Blutzellen und die imaginären Komponenten beider Zelltypen sind bei dieser Frequenz positiv und wurden deshalb nach oben verschoben, während die reale Komponente der Blutzellen bei dieser Frequenz negativ ist und nach unten verschoben wurde. Die Wirkung des Anwendens einer zweiten TWD-Frequenz F5 besteht darin, daß die Blutzellen nun eine kleine positive DEP-Kraft erfahren sowie von den Elektroden angezogen werden und nicht schweben. Die Blutzellen wandern deshalb nicht in dem TWD-Feld. Die E-coli-Zellen erfahren eine negative DEP-Kraft sowie eine imaginäre Komponente der Kraft und wandern deshalb in dem TWD-Feld. Somit ist eine wirksame Teilchentrennung möglich, weil nur ein Teilchentyp wandert.
Die Frequenz F5 ist ein übliches Wanderfeldsignal, das bei verschiedenen Phasen, z. B. 0°, 90°, 180° und 270° sowie bei willkürlichen gleichen Amplituden angewandt wird. Die zweite Frequenz F6 ist in ähnlicher Weise ein übliches Wanderwellensignal.
Bei einer Variante kann das zweite Frequenzsignal als ein stationäres Feld, z. B. bei den Phasen von 0° und 180°, angewandt werden, was die reale Komponente des DEP-Spektrums beeinträchtigt, während die imaginäre Komponente unverändert bleibt.
Bei einer wichtigen Variante kann das zweite Signal als ein Wanderfeld mit ungekehrter Polarität angewandt werden, wodurch die Polarität der imaginären Komponente des DEP-Spektrums geändert wird, wobei die reale Komponente unverändert bleibt.
6 ist eine Bezugsfigur ähnlich 4. Eine genaue Überprüfung zeigt, daß die Frequenz F7 in 6 einen etwas geringeren Wert als F5 in 4 hat, und die Frequenz F8 ist in ihrem Wert etwas höher als F6 in 4.
Wenn das Signal bei der Frequenz F8 angewandt wird, um eine DEP-Kraft der zweifachen Einheitenhöhe zu erreichen, unter Bezugnahme auf das in 6 dargestellte Spektrum, ist das Ergebnis so wie es in 7 gezeigt wird. Bei der Frequenz F8 sind die imaginären Komponenten für sowohl Blut als auch E-coli positiv, auch die reale Komponente für Blut ist positiv. Deshalb erhöht sich bei allen der Wert. Die reale Komponente von E-coli ist negativ und im Wert vermindert. Wie 7 zeigt, besteht bei der Frequenz F7, der TWD-Frequenz, die Wirkung darin, daß die imaginäre Komponente für die Blutzellen von einem negativen zu einem positiven Wert geändert wurde, jedoch die reale Komponente für Blut nicht länger negativ ist, so daß die Blutzellen nicht schweben und die TWD nicht möglich ist.
Es wird nun die Anwendung eines dritten Signals bei einer Einheitsamplitude und der Frequenz F9 betrachtet (siehe 6). Das Ergebnis wird in 8 dargestellt. Bei der Frequenz F7 besteht die Wirkung der Anwendung der drei Frequenzen F7, F8 und F9 darin, daß der reale Teil der Netto-DEP-Kraft für beide Teilchen negativ ist und beide Teilchen eine imaginäre Komponente zu ihrer DEP-Kraft aufweisen. Die Blutzellen haben eine kleine negative imaginäre Komponente, während bei E-coli eine positive imaginäre Komponente vorliegt. Die TWD-Bedingungen sind deshalb für beide Teilchentypen erfüllt. Jedoch wandern die Blutzellen und E-coli in entgegengesetzte Richtungen, weil ihre imaginären Komponenten unterschiedliche Vorzeichen haben. Deshalb ergibt sich eine verbesserte Trennung der zwei Teilchentypen.
Als eine Variante kann bei den Beispielen in den 5 bis 8 ein Wanderfeldsignal mit Gegenphase benutzt werden. Ein Wanderfeldsignal mit Gegenphase wird z. B. durch Vertauschen der bei 90° und 270° liegenden relativen Phasen des Quadraturphasensignals erreicht. Die Wirkung der Anwendung eines solchen Signals besteht darin, den imaginären Teil der dielektrophoretischen Kraft umzukehren (d. h. die Polarität umzukehren, aber bei gleicher Größenordnung), während der reale Teil der Kraft unverändert bleibt. Die aus den zwei Feldern resultierenden translatorischen TWD-Kräfte sind nun entgegengesetzt gerichtet.
Unter erneuter Bezugnahme auf 4 wird angenommen, daß die Frequenz F6 in der Gegenphase angewandt wird. Die translatorische TWD-Kraft, welche sich aus dem imaginären Teil I für die Kräfte der roten Blutzellen (rbc) und der E-coli ergibt, würde nun umgekehrt werden, während der reale Teil der Kraft für E-coli negativ und für rbc positiv bleibt. Durch Anwenden von Kombinationen von Wanderfeldern mit vorwärts und rückwärts gerichteter Phase und von stationären Feldern kann sich eine verbesserte Teilchenmanipulation und -trennung ergeben.
Bei einer anderen Variante kann unter gewissen Bedingungen die Anwendung eines Wanderfelds eine deutliche hydrodynamische Flüssigkeitsbewegung induzieren, was bekannt ist. Es wurde gefunden, daß durch Anwenden eines zweiten Frequenzsignals zum Induzieren einer derartigen hydrodynamischen Flüssigkeitsbewegung in Verbindung mit einem ersten Frequenz-TWD-Signal eine verbesserte Teilchentrennung erreicht werden kann.
Beispielsweise wird angenommen, daß zwei Teilchentypen getrennt werden sollen, von denen der eine Typ eine starke und der andere eine relativ schwache translatorische TWD-Bewegung erfährt. Ein Beispiel ist E-coli und rbcs, wie in 4 dargestellt ist. Es werden die Frequenz F5 und zusätzlich ein zweites (üblicherweise niedrigeres) Frequenzsignal angewandt, um eine hydrodynamische Flüssigkeitsbewegung in umgekehrter Richtung und mit einer spezifischen Größenordnung zu induzieren, derart, daß die roten Blutzellen hauptsächlich durch die Flüssigkeitsströmung bewegt werden können, während die E-coli durch die TWD-Kräfte in entgegengesetzter Richtung wandern. Es kann ein Wanderfeld von 10 kHz benutzt werden, um eine solche Flüssigkeitsbewegung zu induzieren. Das Wanderfeldsignal der zweiten Frequenz ändert die Größenordnung der realen und/oder der imaginären Komponente der TWD-Kräfte auf die Teilchen und induziert zusätzlich die hydrodynamische Flüssigkeitsbewegung.
Deshalb kann die Anwendung von Wanderfeldern mit zwei oder mehr Frequenzen benutzt werden, um Teilchen durch eine Kombination aus hydrodynamischen Kräften und TWD-Kräften zu trennen. Dabei wird das erste Frequenzsignal gewählt, um die gewünschten TWD-Kräfte auf die Teilchen zu induzieren, und das zweite Frequenzsignal wird gewählt, um eine deutliche hydrodynamische Flüssigkeitsbewegung zu induzieren. Vorzugsweise werden die Wanderfeldsignale zum Induzieren der Kombination aus der hydrodynamischen Kraft und der TWD-Kraft auf die gleichen TWD-Elektroden angewandt.
In 9 ist eine allgemeine Vorrichtung für die TWD erläutert. Ein Glassubstrat 20 weist auf seiner oberen Oberfläche eine Anordnung 22 aus parallelen Elektroden auf, von denen jede mit Hilfe eines Mehrfachverbinders 24 mit einem Signalgenerator 26 verbunden ist. Das Substrat 20 kann mit einer Schutzabdeckung 28 (zweckmäßigerweise mit einem zweiten Glassubstrat) abgedeckt sein, wobei die Substrate durch einen (nicht gezeigten) Abstandshalter von einander getrennt sind, um eine dünne Zelle zu bilden. Ein geeigneter Abstandshalter ist ein Kunststoffstreifen.
Die Zelle wird von unten mit einer Lichtquelle 30 beleuchtet und von oben durch ein optisches Mikroskop oder einen Videorecorder 32 betrachtet, der mit einem Bildschirm 36 verbunden ist.
Beim Gebrauch wird eine Suspension der Teilchen in einer Flüssigkeit in die Zelle eingespritzt oder die Suspension kann direkt auf das Substrat 20 aufgebracht und die Abdeckung 28 an ihrer Stelle angeordnet werden. Der Signalgenerator 26 ist dazu eingerichtet, Signale mit verschiedenen Phasen an die Elektroden in der Anordnung 22 zu geben. Beispielsweise kann der Signalgenerator 26 ein Vierphasen-Sinussignalgenerator sein, der aufeinanderfolgende Elektroden mit Signalen der relativen Phasen 0°, 90°, 180° und 270° verbindet und dann den Zyklus über die gesamte Anordnung 22 wiederholt. Wie gut bekannt ist, erzeugt eine derartige Anordnung die DEP-Bedingungen einer Wanderwelle.
Die Zelle wird durch die Lichtquelle 30 beleuchtet und auf dem Bildschirm 36 betrachtet. Bei der Übertragung werden Teilchen als deutliche Bereiche erkannt, und ihre Bewegung ist auf dem Bildschirm klar zu sehen.
Alle mehrphasigen Signale der zwei oder drei verschiedenen Frequenzen werden elektrisch in der gewünschten Phase summiert und dann auf die Elektrodenanordnung 22 gegeben.
Um das gewünschte TWD-Feld anzuwenden, können die Elektroden irgend eine Form aufweisen. Die Elektroden können auf einem oder mehreren Substraten, auf den Innen- oder Außenwänden einer Dielektrophoresezelle oder auf gegenüberliegenden Seiten einer Dielektrophoresezelle ausgebildet sein. Die Elektrodenanordnungen können die Form von Drähten aufweisen, die zwischen den Substraten hindurchgeführt sind. Die TWD-Elektrodenanordnungen aus drei oder mehr Elektroden können in Verbindung mit einer zusätzlichen Elektrode oder Elektrodenanordnung benutzt werden, um eine statische DEP-Kraft oder eine elektrostatische Kraft anzuwenden. Die zwei Sätze der Elektroden können in der gleichen Ebene oder derart montiert sein, daß die erzeugte statische DEP-Kraft oder elektrostatische Kraft in einer Ebene erzeugt wird, die von jener des Wanderfelds verschieden ist. Ferner können in Verbindung mit dem TWD-Feld weitere Kräfte angewandt werden, z. B. eine Flüssigkeitsströmung, optische Kräfte, magnetische Kräfte, Zentrifugalkräfte, einschließlich einer mechanischen oder physikalischen Bewegung der Dielektrophoresezelle, oder irgend eine andere Kraft, die eine Trennung oder Charakterisierung von einem oder mehreren Teilchen unterstützt.
Bei einem weiteren Beispiel können zwei TWD-Anordnungen in einem Winkel zueinander angeordnet sein. Auf diese Anordnungen können die gleichen oder verschiedene Frequenzen angewandt werden. Wenn verschiedene Frequenzen benutzt werden, können sie derart gewählt werden, daß sie ver schiedene Teile des dielektrophoretischen Spektrums anregen. Somit werden verschiedene Teilchen unterschiedlich beeinflußt. Da verschiedene Kräfte unter verschiedenen Winkeln relativ zueinander angewandt werden, wandern verschiedene Teilchen in verschiedene Richtungen und unter verschiedenen Winkeln relativ zu einem Bezugspunkt. Der Winkel, unter dem die Teilchen wandern, ist das Ergebnis der kombinierten Kräfte. Dies erlaubt eine extrem empfindliche Charakterisierung oder Trennung von Teilchen, wobei die Teilchen durch sich überschneidende Wanderfelder manipuliert werden.
Um die Teilchentrennung weiter zu unterstützen, gibt es beispielsweise ein weiteres Mittel, bei dem die Teilchen selbst z. B. durch folgende Maßnahmen verändert werden: Das Belasten oder Zerstören eines oder mehrerer Teilchentypen, z. B. das Auflösen oder Belasten von roten Blutzellen, das Verändern der Temperatur zum selektiven Belasten der Teilchen, chemische Stoffe oder Proteine, die der Lösung zugegeben werden, Leitfähigkeit, Permittivität, pH-Wert oder ein anderer physiologischer Gehalt des geänderten suspendierenden Mediums, zusätzliche Teilchen, die an den genannten Teilchen angebracht werden. All dies erlaubt eine erhöhte Differenzierung von Teilchen durch Ändern ihrer Dielektrophoresespektren und ermöglicht eine verbesserte Charakterisierung, Manipulierung und/oder Erfassung mit Hilfe der Erfindung.
Es wird nun ein Beispiel für die praktische Anwendung des Ausweitens eines TWD-Fensters gegeben, wie es unter Bezugnahme auf die 2 und 3 beschrieben wurde.
Gegenwärtig kann ohne Anwendung der erfindungsgemäßen Anordnung die TWD nur über einen relativ engen Frequenzbereich oder ein relativ enges Fenster des zuständigen Spektrums benutzt werden. Ein Dielektrophoresespektrum für ein spezielles Teilchen kann derart betrachtet werden, daß eine Anzahl verschiedener Bereiche vorliegt, die speziellen Eigenschaften des Teilchens entsprechen. Verschiedene Teilchen zeigen verschiedene Dielektrophoresespektren, und es ist deshalb ein klarer Vorteil, den Frequenzbereich, in dem die TWD benutzt werden kann, auszudehnen.
Als ein Anfangsbeispiel werden Versuche an Hefezellen (Saccharomyces cerevisiae, Stamm RXII) durchgeführt, weil ihre elektrokinetischen Eigenschaften von verschiedenen Labors gründlich untersucht worden sind. Die Zellen wurden 19 Stunden in einem Medium mit pH 5, bestehend aus 5% Saccharose (Oxoid), 0,5% Hefeextrakt (Oxoid) und 0,5% Peptone (Oxoid), bei 30°C in einem Inkubatorschüttler, der bei 200 U/min arbeitete, gezüchtet. Beim Ernten wurden die Zellen bei 100 g während 5 min zentrifugiert und in 280 mM Mannit gewaschen. Dieser Vorgang wurde zweimal wiederholt, bevor die endgültige Suspension in 280 mM Mannit hergestellt wurde. Die Leitfähigkeiten der Zellsuspensionsmedien wurden durch Zugabe von NaCl eingestellt, wie durch Einsatz eines Whatman-Leitfähigkeitsmessers (Modell CDM 4010) bestimmt worden ist.
Die Messungen der Elektrorotation (ROT) und der Dielektrophorese (DEP) wurden für die Hefezellen unter Anwendung der Methode erhalten, die von Huang et al., Phys. Med. Biol. 37, Seiten 1499-1517, 1992, beschrieben worden ist. Ein typisches Elektrorotationsspektrum für ein Medium mit einer Leitfähigkeit von 10,1 mS/m ist in 10 dargestellt, zusammen mit der Dielektrophorese-Reaktion (DEP) über den engen Frequenzbereich, in dem die DEP-Kraft vom Negativen zum Positiven wechselt. Unter Anwendung der in 11 gezeigten Elektrodenanordnung wurden die Messungen der TWD-Geschwindigkeit an den Hefezellen durchgeführt. Die parallelen Elektroden waren gleich in Breite und Abstand (20 Mikron). Die elektrischen Wanderfelder wurden durch schrittweises Ansteuern der Elektroden mit Sinusspannungen der Phasentrennung 0°, 90°, 180° und 270° erzeugt. Ein typisches TWD-Spektrum für eine Mediumleitfähigkeit von 10,1 mS/m, ohne ein zusätzliches Signal an die Elektroden zu geben, ist in 12 dargestellt. Es wurden Phasenverschiebungsspannungen von 0,6 Vrms zwischen 20 kHz und 20 MHz angewandt. Unterhalb von 40 kHz bewegten sich die Zellen als Ergebnis einer durch einen elektrohydrodynamischen Effekt verursachten Flüssigkeitsbewegung über die Elektroden mit einer Geschwindigkeit von etwa 5 Mikron/s in der gleichen Richtung wie das Wanderfeld. Eine wahre TWD-Bewegung wurde zwischen 50 und 100 kHz beobachtet, wobei sich die Zellen in der entgegengesetzten Richtung zum Wanderfeld bewegten. Zwischen 200 und 400 kHz wurde das Phänomen der Zelldrehung und der regellosen, raschen und der mit dem Feld gleichsinnigen Bewegung beobachtet, die den sogenannten FUN-Betriebszustand charakterisiert. Oberhalb 400 kHz wurden die Zellen an den Elektroden eingefangen und zeigten keine TWD. Die Richtung der TWD-Bewegung, wie in 12 dargestellt ist, spiegelt das Elektrorotationsspektrum gemäß 10 wieder, wobei die obere Frequenz des TW-Fensters mit dem Wert zusammenfällt, bei dem die DEP-Kraft sich vom Negativen zum Positiven ändert, so daß die Zellen schweben, und zu einem Einfangen der Zellen führt.
Dann wurde die Wirkung des Zuführens eines statischen DEP-Signals zu dem Wanderwellenfeld untersucht. Dies wurde so durchgeführt, daß benachbarten Elektrodenpaaren sinusartige Signale von 1,2 Vrms in der Phasenopposition (0° und 180°) bei einer Frequenz von 2 kHz zugeführt wurden. Unter Bezugnahme auf 2 entspricht dies dem Zuführen eines Signals bei einer Frequenz "Freq 0", um eine zusätzliche negative DEP-Kraft zu erzeugen, damit die Schwebungshöhe der Zellen vergrößert wird, aber mit geringer oder keiner Wirkung auf die imaginäre Kraftkomponente. Der Effekt des Steigerns der Schwebungshöhe durch diese Maßnahme wird in 12 gezeigt. Das TWD-Fenster ist vergrößert und deckt den vollen untersuchten Frequenzbereich ab, wobei die Richtung und die Größenordnung der Zellbewegung das in 10 dargestellte Elektrorotationsspektrum widerspiegelt.
Um zu zeigen, daß das TW-Fenster im Frequenzbereich vergrößert oder verkleinert werden kann, werden in 13 für Hefezellen, die in einem Medium mit der Leitfähigkeit von 40,18 mS/m suspendiert waren, weitere Ergebnisse aufgeführt. Die Wanderwelle wurde unter Benutzung von Phasenquadratursignalen von 1,2 Vrms und ohne zusätzlich zugeführtes Signal erzeugt, wobei das TW-Fenster von 30 auf 90 kHz ausgedehnt wurde und der FUN-Betriebszustand sowie das nachfolgende Einfangen der Zellen bei etwa 1 MHz begannen. Wie in 13 dargestellt ist, wurde das TW-Fenster bei der Anwendung eines DEP-Signals von 10 MHz bei 0,6 Vrms (äquivalent zur Zuführung der Frequenz "Freq 2" in 2) auf den Bereich von 30 bis 60 kHz verengt. Dagegen wurde beim Zuführen eines DEP-Signals bei 1,2 Vrms und 400 kHz das TW-Fenster bis zu 20 MHz ausgedehnt. Eine Umkehr der TWD-Geschwindigkeit trat nicht ein, weil durch die Anwendung eines zusätzlichen Signals bei 400 kHz (äquivalent zu einer Frequenz "Freq 0" und "Freq 1" in 2) die Zellen eine gesonderte negative imaginäre Kraftkomponente erfuhren.
Durch Benutzen der erfindungsgemäßen Technik des Anwendens einer TWD-Kraft und eines zweiten Signals bei einer Frequenz, welche die TWD-Kraft modifiziert, können mehrere vorteilhafte Ergebnisse erzielt werden, z. B.:

a) Trennen von Zellen mit hoher Spezifität zur Identifikation und Abzählung;
b) Abtrennen von seltenen Zielzellen aus heterogenen Proben, wobei ein Verlust von Zellen vermieden wird, mit einer Methode, die nur eine Verfahrensweise benutzt;
c) Verarbeiten von Proben mit hohen Zellsortierungsgeschwindigkeiten;
d) Abtrennen von Zellen ohne die Notwendigkeit einer biochemischen Markierung oder Modifizierung;
e) Isolieren von lebensfähigen, züchtbaren Zellen, mit keiner oder geringer biologischer Schädigung;
f) Durch Vergrößern des Frequenzfensters der Wanderwellendielektrophorese können die Eigenschaften eines Teilchens durch Bestimmen seiner Translationsbewegung als Funktion der Frequenz des elektrischen Feldes charakterisiert oder beobachtet werden. Es kann die gleiche Information wie jene, die sich durch Elektrorotationsversuche ergibt, erhalten werden, jedoch ist die genaue Messung der Teilchenrotation schwieriger als die Bestimmung der Translationsbewegung.

Claims

DEP-Verfahren zum Abtrennen von Teilchen mehreren Typs, mit der Stufe des Erzeugens eines ersten Signals, das ein twDEP-Signal ist, welches eine Mehrzahl von Signalen beinhaltet, von denen jedes bei einer ersten Frequenz liegt und dazwischen eine vorgegebene Phasenbeziehung aufweist, für das Einwirken auf eine Teilchensuspension durch eine Elektrodeneinrichtung und für das Ausüben einer ersten fiktiven DEP-Kraft auf die Teilchen, die einen realen Teil, der negativ ist, und einen imaginären Teil aufweisen, wobei das Verfahren ferner die Stufen des Erzeugens eines zweiten Signals bei einer zweiten Frequenz für das Einwirken auf die Teilchensuspension durch eine Elektrodeneinrichtung zum Ausüben einer zweiten fiktiven Kraft, die von der ersten fiktiven Kraft verschieden ist, und des gleichzeitigen Einwirkens des twDEP-Signals und des zweiten Signals durch eine Elektrodeneinrichtung auf die Teilchensuspension umfast, um auf die Teilchen mit einem realen Teil und einem imaginären Teil eine kombinierte DEP-Kraft auszuüben, die von jener der ersten fiktiven Kraft verschieden ist.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem innerhalb eines Bereichs von ersten Frequenzen, die ein dielektrophoretisches Fenster einer Wanderwelle darstellen, die Teilchen eine dielektrophoretische Kraft einer Wanderwelle erfahren, wovon ein realer Teil, der negativ ist, und auch ein imaginärer Teil vorliegen, und worin die Anwendung des zweiten Signals den Frequenzbereich des Fensters veranlaßt, in der Breite zu variieren.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Frequenz des zweiten Signals derart gewählt wird, daß die Schwebungshöhe der Teilchen über den Elektroden, welche die Signale anwenden, variiert.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, bei dem in der Suspension zwei Arten von Teilchen vorliegen und die zweite Frequenz derart gewählt wird, daß die Wandergeschwindigkeit mindestens einer Teilchenart variiert.
Verfahren nach Anspruch 4, worin die zweite Frequenz derart gewählt wird, daß die relative Wandergeschwindigkeit der zwei Teilchenarten erhöht wird.
Verfahren nach Anspruch 5, worin die eine Teilchenart wandert und die andere nicht.
Verfahren nach Anspruch 4, worin die zweite Frequenz derart gewählt wird, daß die relative Wandergeschwindigkeit der zwei Teilchenarten vermindert wird.
Verfahren nach Anspruch 4, worin die zweite Frequenz derart gewählt wird, daß beide Teilchenarten gleichzeitig wandern.
Verfahren nach Anspruch 4, worin die zweite Frequenz derart gewählt wird, daß die zwei Teilchenarten in entgegengesetzte Richtungen wandern.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, worin das zweite Signal ein statisches DEP-Feld erzeugt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, worin das zweite Signal ein zweites dielektrophoretisches Feld einer Wanderwelle erzeugt.
Verfahren nach Anspruch 11, worin das erste und das zweite Wanderwellenfeld derart angeordnet sind, daß sich die Teilchen in verschiedene Richtungen bewegen.
Verfahren nach Anspruch 1, worin das zweite Signal bei einer Frequenz angewandt wird, bei welcher der genannte reale Teil oder der genannte imaginäre Teil null und der andere Teil positiv ist, so daß der Wert des anderen Teils entsprechend der Stärke des zweiten Signals zunimmt.
Verfahren nach Anspruch 1, worin das zweite Signal bei einer Frequenz angewandt wird, bei welcher der reale Teil oder der imaginäre Teil der Kraft im wesentlichen null und der andere Teil negativ ist, so daß der Wert des anderen Teils entsprechend der Stärke des zweiten Signals abnimmt.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, das ferner die Anwendung eines dritten Signals bei einer dritten Frequenz beinhaltet, wodurch die Größe entweder des realen Teils oder des imaginären Teils der dielektrophoretischen Kraft der Wanderwelle auf die Teilchen in seiner Größe geändert wird.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, zum Abtrennen unerwünschter Teilchen von Körperflüssig keitsteilchen, wobei die Teilchensuspension sowohl unerwünschte Teilchen als auch Körperflüssigkeitsteilchen enthält, worin die Geschwindigkeit oder die Wanderrichtung einer Teilchenart geändert wird.
Verfahren nach Anspruch 16, worin die unerwünschten Teilchen Krebszellen und die Körperflüssigkeitsteilchen Blutzellen sind.
Verfahren nach Anspruch 16, bei dem die unerwünschten Teilchen Bakterien und die Körperflüssigkeitsteilchen Blutzellen sind.
Verfahren nach Anspruch 18, worin die Bakterien E-coli und die Blutzellen rote Blutzellen sind sowie die erste und die zweite Frequenz derart gewählt werden, daß E-coli in dem TWD-Feld wandert und die roten Blutzellen nicht wandern.
Verfahren nach Anspruch 18, worin die Bakterien E-coli und die Blutzellen rote Blutzellen sind, wobei ferner ein drittes elektrisches Signal bei einer dritten Frequenz angewandt wird sowie die erste, die zweite und die dritte Frequenz derart gewählt werden, daß E-coli in dem TWD-Feld in der einen Richtung und die roten Blutzellen in die entgegengesetzte Richtung wandern.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, worin das zweite Signal derart gewählt wird, daß eine hydrodynamische Flüssigkeitsbewegung der Suspension induziert wird.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, worin die Suspension eine Suspension menschlicher Blutzellen enthält, wobei das erste Signal ein twDEP-Signal bei einer Frequenz von 55 kHz und das zweite Signal ein statisches DEP-Signal bei einer Frequenz von 55 kHz ist sowie das twDEP-Fenster sich zwischen 10 kHz und 18 MHz erstreckt.
Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 22, mit einer ersten Einrichtung zum Erzeugen eines DEP-Signals zum Erzeugen einer Mehrzahl von Signalen bei einer ersten Frequenz mit einer vorgegebenen Phasenbeziehung, einer zweiten Einrichtung zum Erzeugen eines Signals, um mindestens ein Signal zu erzeugen, und mit einer Elektrodeneinrichtung zum gleichzeitigen Einwirken der genannten Mehrzahl von Signalen und des genannten mindestens einen Signals auf eine DEP-Kammer.
Vorrichtung nach Anspruch 23, mit einer Elektrodenanordnung auf einem Substrat, einer Frequenzsteuereinrichtung, einer Frequenzsignalerzeugungseinrichtung sowie einer Einrichtung zum elektrischen Summieren der zwei Signale von solchen Einrichtungen und zum Einwirken der summierten Signale auf die Elektrodenanordnung.
Vorrichtung nach Anspruch 23 oder 24, mit mindestens einer dritten Einrichtung zum Erzeugen eines Signals zum Einwirken mindestens eines dritten Signals auf die Elektroden.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 23 bis 25, in der das Substrat transparent ist und die Vorrichtung ferner eine Beleuchtungseinrichtung zum Beleuchten des Substrats und eine Betrachtungseinrichtung zum Betrachten irgendwelcher Teilchen auf dem Substrat aufweist.