DE19859460A1 - Verfahren und Vorrichtung zur elektro-optischen Einzelpartikelspektroskopie - Google Patents

Abstract

Zur dielektrischen Spektroskopie an mindestens einem suspendierten Teilchen in einem Mikrosystem wird das Teilchen in einer Elektrodenanordnung hochfrequenten elektrischen rotierenden Feldern ausgesetzt und im Fokus einer optischen Falle gehalten.

Description

Die Erfindung betrifft Verfahren zur dielektrischen Einzelparti­ kelspektroskopie in Mikrosystemen und Vorrichtungen zu deren Im­ plementierung.

Zur Vermessung der passiven elektrischen Eigenschaften von in Flüssigkeiten suspendierten Teilchen oder Mikroobjekten (wie La­ texpartikeln, lebende Zellen etc.) werden seit langem über elek­ trische Rotationsfelder induzierte Drehbewegungen genutzt [Über­ sicht in ZIMMERMANN, U. et al., Electromanipulation of Cells, CRC Press Inc., 1996]. Es kann sich dabei um eine Rotationsbewegung in oder entgegengesetzt zur Felddrehrichtung handeln. Aus der Drehgeschwindigkeit des Objektes als Funktion der Winkelgeschwin­ digkeit des Feldes (sogenannte Rotationsspektren) kann auf passi­ ve elektrische Eigenschaften geschlossen werden. In der Regel liegen die Rotationsgeschwindigkeiten der Objekte im Bereich von 100 Umdrehungen pro Sekunde bis zu 1 Umdrehung pro Minute, typi­ scherweise langsamer als 1 Umdrehung pro Sekunde.

Insbesondere für biologisch-medizinische Fragestellungen hat sich dieses Verfahren als der Impedanzmessung vergleichbar und hoch­ auflösend erwiesen. Die Rotation des Objektes verhält sich dabei proportional zum Imaginärteil des Clausius-Mosotti-Faktors, [vgl. auch JONES, T. B., Electromechanics of Particles, Cambridge Uni­ versity Press, Cambridge, 1995].

Nachteilig ist jedoch, daß zusätzlich zu dem induzierten Drehmo­ ment immer eine zu den Elektroden hin oder von diesen weg gerich­ tete Kraft, die sogenannte Dielektrophorese, auftritt. Dadurch dejustiert sich das Partikel bzw. verkürzt sich die Meßzeit un­ kontrolliert. Beides steht einer automatischen Messung entgegen.

Versuche die Rotationsmessung automatisch zu erfassen, sind mehr­ fäch beschrieben worden [DE 33 25 843 DD WP 281223 (1986)]. Da­ bei handelt es sich um die alternierende Applikation zweier Anre­ gungsfelder unterschiedlicher Drehrichtung, bei denen die Anschaltzeiten elektronisch verändert werden können. Diese werden so lange variiert, bis der Stillstand des Objektes eintritt. Der Stillstand des Objektes wurde bislang jedoch ebenfalls aus­ schließlich über visuelle Beobachtung bestimmt.

Desweiteren ist bekannt, die Bewegung komplex strukturierter Ob­ jekte über Bildverarbeitungssysteme zu erfassen. Dazu wird das mikroskopisch erzeugte Bild zu verschiedenen Zeitpunkten elektro­ nisch aufgenommen, gespeichert und versucht, über eine entspre­ chende Raumtransformation einer Vielzahl von Bildpunkten die er­ folgte Bewegung zu rekonstruieren. Diese Verfahren haben den Nachteil hoher Informationsverarbeitungsdichte und damit langwie­ riger und aufwendiger Rechnerverarbeitung. Besonders große Schwierigkeiten treten bei Veränderungen der Objektstruktur wäh­ rend der Messung auf, z. B. bei Verlagerung in der Fokusebene, und bei schwach kontrastierten Objekten.

Automatisch kann die Zellbewegung auch über Verfahren der dynami­ schen Lichtstreuung ermittelt werden [GIMSA, J., PRÜGER, B., EPPMANN, P. and DONATH, E., Electrorotation of particles measured by dynamic light scattering - a new dielectric spectroscopy technique, Colloids and Surfaces A: 98, 243-249, 1995]. Dieses Verfahren kann allerdings nicht an einzelnen Objekten eingesetzt werden, sondern liefert Mittelwerte über alle Partikel, die sich im Laserstrahl befinden. In der Regel einige Hundert oder mehr.

Die exakte Positionierung an einem Punkt im elektrischen Rotati­ onsfeld wurde durch die Verwendung 3-dimensionaler Elektrodenan­ ordnungen, sogenannter Feldkäfige, und die alternierende Applika­ tion eines Zentrierfeldes und eines Rotationsfeldes gelöst. Es zeigt sich allerdings, daß dadurch die Rotation der Objekte auf 1/10 bis 1/40 verlangsamt wird, was eine Auswertung erschwert und die Meßzeiten verlängert (DE 196 53 659 C1, sowie Schnel­ le, Th., Glasser, H., Fuhr, G., An opto-electronic technique for au­ tomatic detection of electrorotational spectra of single cells, in "Cellular Engineering" 2, 33-41, 1997).

Es sind ferner optische Feldfallen, auch "optical tweezers", "La­ ser-Pinzetten" oder "optical traps" genannt, bekannt, die seit etwa zwei Jahrzehnten auf den Gebieten der Biotechnologie, Medi­ zin und Molekularbiologie sowie auf anderen technischen Gebieten zur Positionierung und Manipulation mikrometergroßer und submi­ krometergroßer Partikel eingesetzt [G. Weber et al. in "Int. Rev. Cytol." Bd. 131, 1992, S. 1; S. M. Block in "Noninvasive Techniques in Cell Biology", Wiley-Liss., New York 1990, S. 375] werden. Die Entwicklung der Laser-Pinzette geht vor allem auf A. Ashkin zurück [A. Ashkin in "Phys. Rev. Lett.", Bd. 24, 1970, S. 156]. Das Prinzip des Partikeleinfangs durch optisch in­ duzierte Kräfte beruht darauf, daß neben dem Lichtdruck, der stets ein Teilchen von der Lichtquelle wegdrückt, Gradientenkräf­ te auftreten, die dazu führen, daß ein Teilchen in einen Fokus gelangt bzw. stabil in diesem gehalten oder mit diesem bewegt wird. Voraussetzung ist, daß die Absorption und Reflexion des Teilchens gering ist, während der Unterschied im Brechungsindex zur Umgebungslösung möglichst groß sein sollte.

Laser-Pinzetten haben in den letzten Jahren vor allem deshalb ei­ ne größere Verbreitung erlangt, weil bei gleicher, stets starker Fokussierung des Lichtstrahls sowohl Teilchen, die größer als die Wellenlänge (sogenannte Mie-Teilchen), als auch Teilchen, die kleiner als die Wellenlänge sind (sogenannte Rayleigh-Teilchen), gefangen werden können. Das sind vor allem biologische Objekte wie Zellen, Organellen und andere Zellbe­ standteile als auch große Moleküle (wie DNA) und künstliche Mi­ kropartikel [S. M. Block et al. in "Nature", 1990, S. 348; E. M. Bonder et al. in "J. Cell Biol.", Bd. 11, 1990, S. 421].

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, neue Verfahren zur die­ lektrischen Einzelpartikelspektroskopie in Mikrosystemen und Vor­ richtungen zu deren Implementierung anzugeben, mit denen die o. a. Probleme gelöst werden können und insbesondere die Teilchen in einem Rotationsfeld unabhängig davon, ob anziehende oder absto­ ßende dielektrophoretische Kräfte auftreten, freischwebend in ei­ ner Lösung an einem beliebigen Punkt mit einer Genauigkeit unter­ halb des Partikelradiuses im Rotationsfeld zu haltern, ohne daß die Rotationsgeschwindigkeit vermindert wird.

Diese Aufgabe wird durch die Kombination eines optischen Fang­ strahl ("optische Pinzette") und einem oder mehreren rotierenden elektrischen Feldern variabler Winkelgeschwindigkeit mit den Merkmalen der Ansprüche 1 bzw. 3 gelöst. Vorteilhafte Ausfüh­ rungsformen und Anwendungen der Erfindung ergeben sich aus den abhängigen Ansprüchen.

Wichtige Gesichtspunkte der Erfindung bestehen insbesondere dar­ in, daß ein suspendiertes Teilchen, das künstlich oder auch bio­ logischer Natur sein kann, in einem stark fokussierten Laser­ strahl gefangen wird, wie es von optischen Pinzetten bekannt ist. Der Fangpunkt des Lasers mit dem darin befindlichen Teilchen wird nun zwischen Mikroelektroden, die in der Regel planar auf ein glattes Substrat aufgebracht sind, geführt, bis sich das Teilchen im Bereich des sich in der Lösung ausbreitenden elektrischen Fel­ des befindet, sofern die Elektroden mit hochfrequenten, in ge­ eigneter Weise phasenverschobenen Wechselspannungssignalen beauf­ schlagt werden. Zweckmäßigerweise positioniert man den Laserfokus auf einer Linie die senkrecht auf dem Punkt steht, der das Feld­ minimum zwischen den Elektroden bezeichnet. Selbst wenn Kräfte durch das elektrische Rotationsfeld entwickelt werden, die das Teilchen an die Elektroden ziehen wollen, wirken diese an diesem Ort in alle Elektrodenrichtungen ziemlich gleichmäßig, so daß es erfindungsgemäß nur sehr geringer Kräfte bedarf, das Teilchen trotz der feldinduzierten Anziehungskräfte stabil im Laserfokus zu halten. Andererseits muß die Intensität des Lasers so hoch gewählt werden, daß das Teilchen angehoben wird. Sollte das Teil­ chen über die elektrisch induzierten Polarisationskräfte von den Elektroden abgestoßen werden, so sind die Kräfte des optischen Feldes noch geringer wählbar, da sich das Teilchen selbst auf der bezeichneten Symmetrielinie zentriert. Hier wird es jedoch ange­ hoben und aus dem Elektrodenbereich gedrängt. Diese Kraft muß wiederum über die Wahl der Intensität des Laserstrahl kompensiert werden. Dieses auf optisch induziertem Wege sehr stabil in freier Lösung gefangene Teilchen erfährt durch das elektrische Drehfeld ein Drehmoment und kann frequenzabhängig in der bekannten Art in langsame Drehung versetzt werden.

Es handelt sich somit um ein Verfahren und eine elektro-optischen Vorrichtung zur automatischen Rotationsmessung an einzelnen Mi­ kropartikeln, insbesondere zur Messung der Rotationsgeschwindig­ keit von lebenden Zellen als Funktion der Rotationsfrequenz eines elektrischen Feldes, wobei die Halterung des Meßobjektes im Rota­ tionsfeld in einem Laserfokus erfolgt.

Ein besonderer Vorteil dieses Verfahrens besteht darin, daß beide Kräfte (optisch und elektrische) sich nahezu wechselwirkungsfrei ergänzen und wechselweise optimiert verringert werden können. Das optische Fangfeld ist zudem von der Leitfähigkeit der Suspensi­ onslösung unabhängig, so daß in unbegrenzter Weise in leitfähigen bis wenig leitfähigen Lösungen gearbeitet werden kann, was bisher nicht möglich war. Ein weiterer Vorteil besteht darin, daß erfin­ dungsgemäß sehr eng stehende Elektroden verwendet und damit an­ wendungsabhängig mit geringeren Amplituden gemessen werden kann. Ferner lassen sich neue Elektrodenformen zur Erzeugung von Feld­ gradienten einsetzen, was bisher ausgeschlossen war. Damit wird der Einsatzbereich der dielektrischen Spektroskopie erheblich er­ weitert.

Durch die überaus präzise (auf einen Mikrometer und weniger) ge­ naue Positionierung der Teilchen lassen sich nunmehr in sehr ein­ facher Weise automatische Meßverfahren, z. B. der Bilderkennung und der Streulichtmessung etc. zur automatischen Erfassung der Rotationsspektren der Partikeln adaptieren. Dies geschieht in bekannter Weise, z. B. über eine mikroskopische Beobachtung.

Im folgenden sind die wesentlichen Merkmale der Erfindung an in den Zeichnungen dargestellten Ausführungsbeispielen erläutert. Es zeigen:

Fig. 1 eine Übersichtsdarstellung zur erfindungsgemäßen Halte­ rung eines Teilchens in einer Quadrupolanordnung zur dielektri­ schen Spektroskopie mit einer Laser-Pinzette;

Fig. 2 eine Kurvendarstellung der Abhängigkeit des Drehmomen­ tes bzw. der an- oder abstoßenden Kräfte von der Frequenz f des Rotationsfeldes (ω = 2π f); und

Fig. 3 eine Übersichtsdarstellung zur erfindungsgemäßen Kombi­ nation eines Mikrosystems zur dielektrischen Spektroskopie mit einer Mikroskopanordnung.

Fig. 1 zeigt einen perspektivischen Blick auf die Anordnung. Einzelheiten des Mikrosystems, die an sich bekannt sind, werden nicht dargestellt. Ein Partikel (11), suspendiert in einer Umge­ bungslösung (12), befindet sich im Strahlungsfeld eines stark fo­ kussierten Laserstrahls (13) und wird im Fokus (14) gefangen. Vier planar auf einem Substrat (15) befindliche, in der Regel planare Elektroden (16a bis 16d) werden über 90 Grad phasenver­ schobene Signale (Phasenlage 0°, 90°, 180°, 270°) gleicher Fre­ quenz (Amplituden z. B. etwa 1 bis 20 V) angesteuert, so daß ein Drehfeld in der x-y-Ebene entsteht. Entsprechend dreht das gefan­ gene Partikel durch die starken Reibungskräfte gegenüber der Sus­ pensionsflüssigkeit 12 wesentlich langsamer, als das Feld ro­ tiert. Die Rotationsgeschwindigkeit des Objektes als Funktion der Frequenz wird durch Vermessung oder Beobachtung des Teilchens er­ mittelt und liefert die gewünschten Rotationsspektren. Alternativ können auch 3 oder mehr Elektroden in einer Ebene, von stärkerer Dicke als auch in einer Mehrebenenanordnung verwendet werden.

Fig. 2 zeigt ein Rotationsspektrum (Kurve 21, das Spektrum ei­ ner lebenden Zelle beschreibend) und die dazugehörige dielektro­ phoretische Kraft (Kurve 22) an. Es zeigt sich, daß die Zelle oh­ ne das optische Fangfeld im Frequenzbereich (ω) zwischen 20 Hz und 1 GHz an die Elektroden gezogen würde. Bei den dargestellten Kurven handelt es sich um eine Messung an einer 20 µm großen Zel­ le in einer wässrigen Lösung mit einer Leitfähigkeit von 1 mS/m, wie sie für Algen typisch ist. Dadurch konnte bisher in diesem Frequenzbereich nicht oder nur mit verminderter Genauigkeit ge­ messen werden, wie dies oben erläutert wurde. Erfindungsgemäß wird mit der Laser-Pinzette die durch die Kurve 22 repräsentierte Kraftwirkung kompensiert. Entsprechend wird die Laser-Pinzette mit derartigen Betriebsparametern eingesetzt, daß eine genügend große Fangkraft auf das Teilchen ausgeübt wird.

Fig. 3 zeigt eine Vorrichtung, die mindestens einseitig transpa­ rent ist, mit weiteren Einzelheiten, mit der die Rotationsmessun­ gen durchgeführt werden können. Auf einem Substrat (31, z. B. Glas) werden mit den Mitteln der Halbleitertechnologie planare Elektroden 32a bis 32d prozessiert und über die Zuleitungen (33a bis 33d) mit Wechselspannungssignalen zur Rotationsfelderzeugung beaufschlagt. Durch die Seitenwände (34a und 34b) und die weniger als 250 µm dicke Deckplatte (35) wird ein Kanal gebildet, in den die Partikelsuspension eingespült werden kann (36, Pfeilrich­ tung). Die Kanaldecke besteht aus Glas, so daß ein Objektiv (37) hoher numerischer Apertur, z. B. auch als Ölimmersionsobjektiv (Öl (38)) einen stark fokussierten Laserfokus im Kanalinneren erzeu­ gen kann, in dem das Partikel (39) gefangen wird. Sinngemäß kön­ nen noch weitere Elektroden eingeführt werden und kann der Laser­ strahl oder der Kanal relativ zueinander verschoben werden. Das Gesamtsystem ist als Zusatz zu einem Mikroskop ausführbar.

Claims (5)

1. Verfahren zur dielektrischen Spektroskopie an mindestens einem suspendierten Teilchen in einem Mikrosystem, bei dem das Teilchen in einer Elektrodenanordnung hochfrequenten elektri­ schen rotierenden Feldern ausgesetzt und im Fokus einer opti­ schen Falle gehalten wird.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, bei mehrere optische Fallen verwendet werden, um mehrere Teilchen zu haltern und simultan oder seriell einer Rotationsmessung unterzogen zu werden.

3. Vorrichtung zur dielektrischen Spektroskopie an mindestens einem suspendierten Teilchen in einem Mikrosystem bestehend aus einer Elektrodenanordnung zur Ausbildung elektrischer Ro­ tationsfelder und einer Einrichtung zur Bildung mindestens ei­ ner optischen Falle im Wirkungsbereich der Elektrodenanordnung.

4. Vorrichtung gemäß Anspruch 3, bei der die optischen Fallen im Mikrosystem mit einer Mikroskopanordnung gebildet werden.

5. Verwendung einer optischen Falle (Laser-Pinzette) zur Hal­ terung von Teilchen in elektrischen Rotationsfeldern.