DE19745807C2 - Magnetkugel-Mikrorheometer - Google Patents
Magnetkugel-MikrorheometerInfo
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Description
Die Erfindung beschreibt ein Magnetkugel-Mikrorheometer, das die Bestimmung
viskoelastischer Parameter von Stoffen auf mikroskopischer Skala ermöglicht. Zusätzlich
werden Anwendungen sowie ein Verfahren beschrieben, mit denen Veränderungen des Zell-
Zytoskeletts festgestellt werden können. Als beschreibende Meßgröße wird dabei das
viskoelastische Verhalten des Zytoskeletts verwendet.
Zur Verfügung stehende Apparaturen zur Messung viskoelastischer Parameter bedienen sich
i. d. R. des folgenden Prinzips: Ein gewisses Volumen des zu untersuchenden Stoffs wird
zwischen zwei Flächen (die unterschiedlich geformt sein können) gebracht und durch
Bewegung einer dieser Flächen einer Scherspannung ausgesetzt (z. B. R18 Cone and Plate
Weissenberg Rheogoniometer, Fa. Sangamo Controls, England). Hierbei gibt es im
wesentlichen zwei Betriebsarten, die sich im zeitlichen Verlauf der Scherspannung
unterscheiden: Im einfachsten Fall wird der Stoff einer konstanten Scherspannung
ausgesetzt. Bei solchen sog. Kriechmessungen kann die Kriechkomplianz J des Stoffs
gemessen werden. In einem anderen Modus wirkt eine oszillierende, d. h. sinusförmige
Scherspannung auf den Stoff. Dies ermöglicht die frequenzabhängige Messung der
viskoelastischen Moduln G' (Speichermodul) und G" (Verlustmodul).
Auch wenn den gängigen rheologischen Verfahren unterschiedliche Prinzipien zugrundelie
gen können, so sind doch alle diese Verfahren dadurch gekennzeichnet, daß stets gemittelte
viskoelastische Parameter eines makroskopischen Probenvolumens bestimmt werden.
Eine Untersuchung von mikroskopischen Probenvolumina, die etwa denen einer einzelnen
lebenden Zelle enstprechen, ist nur möglich, wenn man zur Ermittlung der viskoelastischen
Eigenschaften des Volumens Sonden einsetzt, die ebenfalls mikroskopische Abmessungen
besitzen. In letzter Zeit werden dazu beispielsweise kugelförmige paramagnetische Partikel
mit einem Durchmesser im Mikrometerbereich verwendet. Diese Partikel werden in
mechanischen Kontakt mit dem zu untersuchenden Stoff gebracht. Bei Anlegen eines
externen Magnetfelds (mit geeignetem zeitlichem Verlauf) übertragen die Sonden die auf sie
ausgeübte magnetische Kraft auf den Stoff; aus der resultierenden Bewegung der
magnetischen Sondenpartikel kann dann auf die viskoelastischen Eigenschaften des Stoffes
geschlossen werden (Ziemann et al., 1994; Amblard et al., 1996). Im Falle von Kriech
messungen kann der Zeitverlauf der Kriechkomplianz J mit der Beziehung
aus dem gemessenen zeitlichen Verlauf der Partikelposition x (bei konstanter Magnetkraft
F0) bestimmt werden, wobei der Faktor g von der experimentellen Geometrie abhängt und
sich z. B. für vollständig in den untersuchten Stoff eingebettete sphärische Partikel mit dem
Radius R zu
g = 6πR
ergibt. Bei frequenzabhängigen Messungen (d. h. oszillierender Kraft F(t) = F0 . sinωt, ω:
Kreisfrequenz der Schwingung) wird aus dem zeitlichen Verlauf der Partikelposition die
frequenzabhängige Schwingungsamplitude der Antwortbewegung des Partikels, x0(ω),
ermittelt. Zusätzlich wird die Phasenverschiebung zwischen Partikelbewegung und
anregender Kraft, ϕ(ω), gemessen. Aus diesen Meßgrößen können die viskoelastischen
Moduln G' und G" mit den Beziehungen
berechnet werden, wobei wiederum der oben genannte Geometriefaktor g Verwendung
findet (Ziemann et al., 1994).
Weitere Informationen über das viskoelastische Verhalten kann man dadurch gewinnen, daß
man das durch das magnetische Partikel erzeugte Deformationsfeld betrachtet. Dies geschieht
duch die Beobachtung von unmagnetischen Sonden, die ebenfalls in Kontakt mit dem zu
untersuchenden Stoff stehen (Schmidt et al., 1996)
Mit den bereits existierenden Apparaturen dieser Art können jedoch auf die magnetischen
Sondenpartikel lediglich Kräfte ausgeübt werden, die nicht ausreichen, um Auslenkungen
der Partikel in oder an lebenden Zellen zu erzielen, was eine Verwendung der beschriebenen
Apparaturen für die Bestimmung viskoelastischer Eigenschaften von Zellen unmöglich
macht: erreichbare Kräfte auf typische magnetische Sondenpartikel (Dynabeads® der Firma
Dynal mit Durchmessern von 2.8 µm und 4.5 µm) liegen im Subnanonewton-Bereich.
Gerade die letztgenannte Anwendung ist jedoch aus folgendem Grund von Interesse: Verän
derungen des Zell-Zytoskeletts, die u. a. krankheitsbedingt aufgrund von Veränderungen im
genetischen Material auftreten können, können zum einen das mechanische, d. h. das
elastische bzw. viskose Verhalten der Zelle so beeinflussen, daß die Zelle Kräften, die von
außen auf sie einwirken, nicht mehr in ausreichender Weise standhalten kann (z. B. bei der
Duchenneschen Muskel-Dystrophie). Andererseits ist ein intaktes Zytoskelett auch Voraus
setzung für den korrekten Ablauf von Signaltransduktionsvorgängen über die Zellmembran -
die Signalübertragung kann durch Deformationen des Zytoskeletts stattfinden (z. B. bei
mechanosensitiven Ionenkanälen in der Membran). Weiterhin werden Defekte im Zytoskelett
für die Metastisierung von Tumoren verantwortlich gemacht.
Es gibt bereits seit einiger Zeit Versuche zur Durchführung viskoelastischer Messungen an
Zellen unter Zuhilfenahme magnetischer Partikel, die in eine Zelle eingebracht werden und
durch Ausüben einer magnetischen Kraft lateral ausgelenkt werden; die Messung der Stärke
der Auslenkung bei bekannter Kraft auf die Partikel ermöglicht eine Bestimmung elastischer
Eigenschaften (Hiramoto, 1969 I & II; Sato et al., 1984). Ein Hauptproblem ist dabei die
Erzeugung von Kräften, die zur Auslenkung der Partikel in der Zelle ausreichen. Bei
sämtlichen bekannten Ansätzen wurden deshalb unphysiologisch große Partikel (mit
Durchmessern von 5 bis 100 µm) verwendet. Ein weiteres Problem liegt in der genauen
Bestimmung der Kraft, die auf die Partikel ausgeübt wird. Sie konnte bisher gar nicht oder
nur einzeln, d. h. für genau das im jeweiligen Experiment betrachtete Partikel, unter
beträchtlichem Aufwand bestimmt werden.
Neben Verfahren, bei denen magnetische Partikel lateral ausgelenkt werden, gibt es eine
Methode, die auf der Verdrehung ferromagnetischer Partikel basiert (Wang et al., 1993, US
Patent-Nr.: 5,486,457). Das dabei verwendete Prinzip beruht auf der Messung der Verände
rung des Gesamt-Magnetfelds, das durch eine große Anzahl magnetisierbarer Partikel
erzeugt wird, die infolge eines kurzen Magnetisierungspulses gleichsinnig magnetisiert
wurden. Mit dieser Methode wurden viskoelastische Messungen sowohl an Plasma
membranen als auch im Inneren der Zelle (Zytosol) durchgeführt. Bei dieser Meßmethode
kann jedoch nur ein Signal beobachtet werden, das über ca. 104-106 Kugeln gemittelt wird.
Die Betrachtung der Eigenschaften von einzelnen Zellen und lokaler Eigenschaften ist nicht
möglich. Desweiteren kann die Verfälschung des Meßsignals durch falsch gebundene
Kugeln beträchtlich sein.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine Vorrichtung zu schaffen, die es ermöglicht,
über die laterale Auslenkung magnetischer Partikel viskoelastische Eigenschaften von
Stoffen zu messen, wobei die Vorrichtung insbesondere der Anforderung genügen muß, daß
mit ihr auf magnetische Partikel mit sehr kleinem Durchmesser (≦ 5 µm) Kräfte ausgeübt
werden können, die ausreichen, Zellen detektierbar zu verformen.
Diese der Erfindung zugrundeliegende Aufgabe wird durch die Merkmale des Patent
anspruchs 1 gelöst.
Mit der Erfindung werden dabei verschiedene Vorteile erzielt. Die Erfindung ermöglicht die
Ausübung vergleichsweise sehr großer und exakt definierter Kräfte auf mikroskopische
magnetische Sondenpartikel, die in mechanischen Kontakt mit der Meßprobe gebracht
werden, d. h. beispielsweise an die Plasmamembran von Zellen angekoppelt oder aber in das
Zytosol von Zellen eingebettet werden. Die Antwortbewegung der Sondenpartikel auf die
externen magnetischen Kräfte erlaubt Rückschlüsse auf das viskoelastische Verhalten der
untersuchten Zellen. Dies ermöglicht einen Einsatz sowohl bei der Erforschung von
Zytoskelettdefekten und deren Behebung als auch bei der Erforschung von Signalketten.
Eine Besonderheit und Neuheit der in Patentanspruch 1 beschriebenen Apparatur ist dabei,
daß die magnetischen Sondenpartikel innerhalb der Fokalebene eines zur Beobachtung der
Auslenkung der Sondenpartikel eingesetzten Mikroskops verschoben werden (d. h. keine
oder nur vernachlässigbare Verschiebungskomponente senkrecht zu dieser Ebene) und daß
zusätzlich alle Partikel in dieser Ebene parallel zueinander ausgelenkt werden.
Diese Apparatur hat außerdem den Vorteil, daß der die Kraft erzeugende magnetische
Feldgradient auf Linien gleichen Abstandes zum Polschuh denselben Wert besitzt. Bei
Verwendung von gleichartigen Sondenpartikeln erfahren infolgedessen auf diesen Linien alle
Partikel dieselbe Kraft. Die Kraftkalibration der Apparatur wird dadurch besonders einfach.
Möglichkeiten einer für verschiedene Zwecke angepaßten Ausgestaltung der Apparatur sind
in den Patentansprüchen 2 bis 17 angegeben.
Die Vorrichtung kann insbesondere zur Messung viskoelastischer Parameter von Zellen oder
anderen biologischen Materialien (z. B. Biopolymernetzwerken) eingesetzt werden, da
einerseits die mikroskopischen Abmessungen der Sondenpartikel eine lokale Messung
viskoelastischer Parameter auf mikroskopischer Skala ermöglichen, und andererseits der für
die Untersuchung biologischer Proben erforderliche Kraftbereich von dieser Methode
abgedeckt wird. Aufgrund der Eigenschaften der Vorrichtung nach Patentanspruch 1 können
mehrere Zellen innerhalb einer Probe untersucht werden, ohne daß für jede Zelle eine
gesonderte Kalibration durchgeführt werden muß.
Die typischen Lateralabmessungen von einzelnen Zellen (beispielsweise von menschlichen
Fibroblasten oder Muskelzellen) liegen im Bereich von einigen zehn Mikrometern, was den
Einsatz von Sondenpartikeln mit deutlich kleineren Abmessungen erforderlich macht. Die
Erfindung ermöglicht erstmals die Verwendung von kugelförmigen Sondenpartikeln mit
Durchmessern von unterhalb fünf Mikrometern für Messungen an Zellen, zu deren
Deformation Kräfte im Nanonewton-Bereich nötig sind.
Der magnetische Polschuh der Vorrichtung besitzt die Form einer unter spitzem Winkel
zulaufenden geraden Kante, was den Vorteil hat, daß die auf gleichartige Sondenpartikel
ausgeübte Kraft nur von ihrem Abstand zu dieser Kante abhängt (d. h. in der
Beobachtungsebene keine Abhängigkeit senkrecht zur Kraftrichtung). Dadurch wird die
Kraftkalibrierung der Methode, die die Grundlage für die quantitative Ermittlung von
viskoelastischen Parametern bildet, erheblich vereinfacht, da insbesondere bei Verwendung
magnetischer Sonden mit einheitlichem, definiertem Durchmesser (sog. monodisperser
Sonden) nur eine Abhängigkeit vom Polschuhabstand zu berücksichtigen ist.
Die typischen Auslenkungen der Sondenpartikel als Antwort auf die magnetischen Kräfte
liegen im Mikrometerbereich und darunter. Zur Beobachtung dieser Antwortbewegungen ist
deshalb ein handelsübliches Mikroskop besonders geeignet. Die Apparatur kann so
ausgeführt werden, daß sie mit geringem Aufwand auf einem derartigen Mikroskop montiert
werden kann, so daß dadurch die Methode allen gängigen lichtmikroskopischen Unter
suchungsmethoden (z. B. Durchlicht-, Phasenkontrast- oder Fluoreszenzmikroskopie)
zugänglich gemacht werden kann.
Bei Einsatz derartiger mikroskopischer Beobachtungstechniken kann die Antwortbewegung
der Sondenpartikel mit Hilfe von Bildverarbeitungstechniken quantifiziert werden. Die
Verschiebung der Partikel in videomikroskopischen Bildsequenzen kann hierbei automatisch
mit einer Partikelverfolgungs-Software bestimmt werden, wobei die Genauigkeit der
relativen Positionsbestimmung im Bereich weniger Nanometer liegen kann.
Zur Messung viskoelastischer Parameter an bestimmten Orten innerhalb des Proben
volumens (also beispielsweise an einer bestimmten Zelle) kann der magnetische Polschuh
mittels einer Mikrometerschraube auf einen bestimmten Abstand zum untersuchten Partikel
justiert werden. Dadurch kann der Polschuh einerseits so nahe an das Partikel herangebracht
werden, daß ausreichend hohe Kräfte erzeugt werden können, und andererseits kann ein
Abstand eingestellt werden, für den eine Kalibrierung bereits erfolgt ist. Die Messung dieses
Abstands kann hierbei mit bildverarbeitungstechnischen Methoden erfolgen, da Sonden
partikel und Polschuh gleichzeitig im Mikroskopbild sichtbar sein können.
Die Apparatur kann mit einer mikromanipulatorischen Methode (beispielsweise der sog.
Mikropipetten-Technik) kombiniert werden, wodurch man über die bei auf einem Substrat
adhärierten Zellen möglichen Scherdeformationen hinaus nahezu beliebige Kraftrichtungen in
bezug auf die Zelle erzeugen kann, da eine mit Hilfe dieser Technik festgehaltene Zelle
bezüglich der Kraftrichtung nahezu beliebig orientiert werden kann. Solche mikromani
pulatorischen Verfahren können überdies dazu verwendet werden, die Sondenpartikel gezielt
auf bestimmten Stellen der Zelloberfläche zu plazieren.
Eine Erweiterung der Methode kann durch den zusätzlichen Einsatz unmagnetischer
Sondenpartikel erreicht werden. Befinden sich auf einer Zelle ein magnetisches und weitere
unmagnetische Partikel, so kann aus der Verschiebung der unmagnetischen Partikel bei
Ausübung einer Kraft auf das magnetische Partikel der Effekt der punktuellen Deformation
auf die gesamte Zelle, d. h. also das Deformationsfeld, untersucht werden. Außerdem kann
aus der Verschiebung der unmagnetischen Partikel auf viskoelastische Parameter an den
Positionen dieser Partikel geschlossen werden. Damit ist die Erfassung derartiger Parameter
an unterschiedlichen Orten der Zelle gleichzeitig möglich; dies kann nicht durch mehrere
magnetische Partikel geschehen, da die durch sie erzeugten lokalen Magnetfelder und
Deformationen sich gegenseitig beeinflussen können.
Eine Verunreinigung des untersuchten Stoffs durch das Material des Polschuhs (beispiels
weise eine Kontamination der Zellen durch für sie toxisches Eisen) kann auf einfache Weise
dadurch verhindert werden, daß der Polschuh entweder in geeigneter Weise beschichtet wird
(z. B. durch Aufbringen eines nichttoxischen Zweikomponentenlacks) oder mit einem
geeigneten Material überzogen wird (z. B. einer Latexschicht).
Alternativ zur Detektion der Antwortbewegung mittels digitaler Bildverarbeitungsmethoden
kann die Verschiebung der magnetischen Sondenpartikel über die Messung eines in einer
Meßspule induzierten elektrischen Stroms detektiert werden. In diesem Fall kann auf eine
Beobachtung mit mikroskopischen Techniken verzichtet werden.
Patentanspruch 14 beschreibt eine Probenkammer, die mit der Apparatur nach Patent
anspruch 1 verwendet werden kann. Ihre Verwendung verhindert Verunreinigungen des
untersuchten Stoffes durch den Polschuh des Magneten, da Polschuh und Stoff durch eine
flexible oder feste Behälterwand getrennt sind und der Polschuh dadurch nicht in direkten
Kontakt mit dem Stoff kommt. Ihre Verwendung ist vorteilhaft bei Untersuchungen an
Zellen, die in diesem Behälter vor der Messung kultiviert werden können (sog.
Zellkulturbehälter). Der Behälter kann wie andere handelsübliche Zellkulturbehälter mit
gängigen Verfahren sterilisiert werden (z. B. durch Autoklavieren). Zur Messung können die
Zellen im Behälter belassen werden und eine Kontamination der Zellen durch den Polschuh
des Magneten wird verhindert.
Die Patentansprüche 18-21 beschreiben Verwendungen der in Patentanspruch 1
beschriebenen Apparatur, die Rückschlüsse auf den pathologischen Zustand einzelner Zellen
oder lokaler Bereiche einzelner Zellen zulassen. Gängige Methoden erlauben dagegen
lediglich die Bestimmung von Mittelwerten (d. h. aus der Bewegung mehrerer magnetischer
Sondenpartikel resultierenden Werten) der viskoelastischen Parameter.
Die Patentansprüche 22 und 23 beschreiben ein spezielles Verfahren unter Verwendung der
in Patentanspruch 1 beschriebenen Apparatur, das auf einer Kombination der Apparatur mit
zusätzlichen unmagnetischen Partikeln beruht. Dieses Verfahren eignet sich speziell zur
Detektion von Defekten des Zell-Zytoskeletts, die aufgrund von Störungen der durch die
Auslenkung eines magnetischen Partikels induzierten Mitbewegung der unmagnetischen
Partikel besonders einfach diagnostiziert werden können.
Entsprechend der in Patentanspruch 1 beschriebenen Apparatur werden die magnetischen
Sondenpartikel in mechanischen Kontakt mit den zu untersuchenden Zellen gebracht. Dies
kann beispielsweise über spezifische Antikörperbindung, chemische Wechselwirkung oder
Physisorption geschehen. Alternativ können die magnetischen Sondenpartikel durch
Phagozytose (d. h. selbsttätige Aufnahme durch die Zelle), Mikroinjektion (Injektion der
Partikel in das Innere der Zellen mit Hilfe von Mikrokanülen, die die Zellmembran
penetrieren), Elektroporation (spontane Bildung von Öffnungen in der Zellmembran durch
Anlegen elektrischer Felder), Scrap loading (Porenbildung durch Ausübung starker
Scherkräfte auf die Zellmembran), Lipidfusion (Verschmelzen von Lipidvesikeln, die die
Sondenpartikel enthalten, mit der Zellmembran) oder spezifische Beschichtung (z. B.
Adenovirusbeschichtung) in das Zytosol gebracht werden. Die derart in die Zelle
eingebrachten Sondenpartikel können dann entweder spezifisch oder unspezifisch an
bestimmte Bereiche innerhalb der Zelle angebunden werden.
Mit Hilfe dieses Verfahrens können krankhafte Veränderungen von Zellen, die Auswir
kungen auf die viskoelastischen Eigenschaften der Zelle haben, diagnostiziert werden.
Darüberhinaus kann der Erfolg therapeutischer Maßnahmen zur Behebung solcher
Veränderungen überprüft werden. Zu Krankheiten, die derartige Veränderungen hervorrufen
können, gehören beispielsweise die Duchennesche Muskel-Dystrophie und verschiedene
Formen krebsartiger Erkrankungen. Darüberhinaus können mit diesem Verfahren auch
krankhafte Veränderungen des extrazellulären Bindegewebes diagnostiziert werden.
Wenn ein Zusammenhang zwischen dem pathologischen Zustand der Zelle und ihrem
viskoelastischen Verhalten besteht, so können auch, wie bereits oben beschrieben, zusätzlich
zu den magnetischen unmagnetische Partikel eingesetzt werden, aus deren Verhalten bei
Auslenkung der magnetischen Partikel sich ebenfalls viskoelastische Parameter ableiten
lassen. In diesem Fall muß nicht notwendig eine Berechnung viskoelastischer Parameter
erfolgen, da auf eine Intaktheit der Zelle auch direkt aus der Stärke der Auslenkung
nichtmagnetischen Partikel bei gegebener Auslenkung eines magnetischen Partikels
geschlossen werden kann.
Amblard, F., B. Yurke, A. Pargellis, and S. Leibler. 1996. A magnetic manipulator for
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Ziemann, F., J. Rädler, and E. Sackmann. 1994. Local Measurements of Viscoelastic Moduli of Entangled Actin Networks Using an Oscillating Magnetic Bead Micro- Rheometer. Biophys. J. 66: 2210-2216.
Ausführungsbeispiele der Erfindung sind in den Abbildungen dargestellt und werden im
folgenden näher beschrieben.
Fig. 1 zeigt eine maßstäbliche schematische Übersicht über die Apparatur und eine
Detailvergrößerung des Probenbehälters sowie des probenseitigen Polschuhendes.
Fig. 2 zeigt typische Kalibrierungskurven (Abhängigkeit der auf die Sondenpartikel
wirkenden Kraft vom Abstand zwischen Sondenpartikel und Polschuh) für monodisperse
sphärische Magnetpartikel mit dem Durchmesser 4.5 µm und einem Eisengehalt von ca. 20%
(Dynal Dynabeads® M-450) bei verschiedenen Spulenströmen im Bereich von 250 mA bis
2500 mA.
Fig. 3 zeigt die schematische Darstellung einer Möglichkeit zur Kombination von
Magnetkugel-Mikrorheometer und Mikropipetten-Technik.
Fig. 4 zeigt eine Schemazeichnung eines Probenbehälters für die Zellkultur, der aufgrund der
mit einer elastischen Latexschicht verschlossenen Öffnung in der Seitenwand zur
Verwendung in Verbindung mit dem Magnetkugel-Mikrorheometer geeignet ist.
Fig. 5 zeigt den typischen zeitlichen Verlauf der Partikelposition bei einer Kriechmessung an
der Plasmamembran einer Fibroblastenzelle (obere Kurve). Der Zeitverlauf der auf das
Partikel wirkenden Kraft ist in der unteren Kurve wiedergegeben.
Fig. 6 zeigt den typischen zeitlichen Verlauf von Partikelposition (Symbol: O) und Kraft auf
das Partikel (Symbol: +) bei einer oszillatorischen Messung in einem Biopolymernetzwerk.
Wie in Fig. 1 gezeigt, wird ein Elektromagnet (1) mit Weicheisenkern (2), eine Mikrometer
schraube (3) zur Positionierung des Magneten und eine Probenkammer (4) auf dem
verschiebbaren Objekttisch eines handelsüblichen invertierten Mikroskops montiert. Die
Probenkammer (4) besitzt seitlich eine Öffnung, durch die das Ende des Eisenkerns (2)
eingeführt werden kann. Der Weicheisenkern (2) ist an seinem probenseitigen Ende so
geformt, daß er in einer geraden Kante unter spitzem Winkel (z. B. 60°) zuläuft. Die
Unterseite des Kerns (2) ist eine ebene Fläche, die parallel zu der durch das Deckglas (5)
definierten Ebene ist. Die Kernunterseite befindet sich so nahe wie möglich oberhalb dieses
Deckglases (etwa 20 bis 50 µm). Die probenseitige Stirnseite des Eisenkerns (2) ist ebenfalls
eine ebene Fläche (Stirnseite und Unterseite laufen unter einem spitzen Winkel in der Kante
zusammen). Unterhalb der durch das Deckglas (5) abgeschlossenen Probenkammer befindet
sich das Objektiv (6) eines invertierten Mikroskops. Mit Hilfe einer Mikrometerschraube (3)
kann die Position des Magneten (1) so verändert werden, daß im Gesichtsfeld des Mikro
skops das zu beobachtende Sondenpartikel (7) und die Kante des Eisenkerns (2) gleichzeitig
sichtbar sind. Dies ermöglicht eine genaue Bestimmung des Abstands zwischen Sonden
partikel und Kante mit Bildverarbeitungstechniken. Dieser Abstand wird benötigt, um eine
genaue Aussage über die auf das Sondenpartikel ausgeübte Kraft machen zu können.
Eine Kalibrierung des Magnetkugel-Mikrorheometers, die erforderlich ist, um die auf die
magnetischen Sondenpartikel ausgeübten Kräfte zu ermitteln, kann folgendermaßen
durchgeführt werden: Die Sondenpartikel werden bei definierter Stromstärke I im
Elektromagneten durch eine Newtonsche Flüssigkeit mit bekannter Viskosität η gezogen.
Bestimmt man die Geschwindigkeit v der Sondenpartikel, so kann man bei bekanntem
Radius R der Partikel die Kraft F auf die Partikel durch Zuhilfenahme des Stokesschen
Gesetzes
F = 6πηRv
berechnen. Das Ergebnis einer derartigen Kalibrierung einer Apparatur nach Fig. 1 zeigt Fig.
2. Aus Fig. 2 wird ersichtlich, daß die auf die Sondenpartikel ausgeübte Kraft einerseits
stark vom Abstand zwischen Polschuhkante (2) und Sondenpartikel (7) und andererseits von
der Stärke des den Elektromagneten (1) durchfließenden Stromes abhängt. Ferner zeigt Fig.
2, daß mit Hilfe der Apparatur nach Fig. 1 Kräfte von bis zu ca. 10 nN auf paramagnetische
Sondenpartikel des Typs Dynabeads® M-450 (Durchmesser 4.5 µm) ausgeübt werden
können.
Ein Beispiel für die Kombination des Magnetkugel-Mikrorheometers mit einer mikromani
pulatorischen Technik, hier der Mikropipetten-Technik, zeigt Fig. 3. Eine mit einer
Mikromanipulatoreinheit (8) verbundene Glas-Mikropipette (9) wird durch eine weitere, dem
Magnetspulenkern (10) gegenüberliegende Öffnung in die Probenkammer (11) eingeführt.
Die Mikropipette (9) kann z. B. dazu verwendet werden, Zellen durch Erzeugung eines
Unterdruckes in der Pipette anzusaugen und mit einer beliebigen Orientierung bezüglich des
Spulenkerns (10) festzuhalten.
Eine Möglichkeit zur Ausgestaltung des zur Zellkultur geeigneten Probenbehälters nach
Patentanspruch 18 und 19 zeigt Fig. 4. Die Wand des Probenbehälters (12) besitzt entweder
an einer Stelle eine Öffnung (13), die mit einem flexiblen Material verschlossen ist, oder ist
an einer Stelle so geformt, daß sie sich der Form des Weicheisenkerns (2) genau anpaßt.
Eine Möglichkeit zur Durchführung des Verfahrens zur Bestimmung der Kriechkomplianz J
besteht darin, an den Elektromagneten, nachdem die Kante seines Weicheisenkerns wie oben
beschrieben an das zu untersuchende kugelförmige Sondenpartikel herangeführt wurde, eine
konstante elektrische Spannung anzulegen. Damit wird eine konstante Kraft auf das
Sondenpartikel ausgeübt. J kann berechnet werden, wenn der Betrag der Kraft auf das
Sondenpartikel bekannt ist und die Auslenkung des Partikels in Abhängigkeit von der Zeit
bei Anlegen der Kraft gemessen wird. Fig. 4 zeigt eine typische Auslenkungs-Zeit-Kurve für
eine derartige Messung (obere Kurve). Zur weiteren Verdeutlichung ist in der unteren Kurve
der dazugehörige Zeitverlauf der Kraft wiedergegeben.
Eine Möglichkeit zur Durchführung des Verfahrens zur Bestimmung der viskoelastischen
Moduln G' und G" in Abhängigkeit von der Kreisfrequenz ω besteht darin, an den
Elektromagneten, nachdem die Kante seines Weicheisenkerns wie oben beschrieben an das
zu untersuchende Sondenpartikel herangeführt wurde, eine sinusförmige elektrische
Spannung der Form
anzulegen. Hierbei ist zu beachten, daß auf die Sondenpartikel nur anziehende Kräfte
ausgeübt werden können. Daher ist es erforderlich, an den Elektromagneten eine zwischen
Null und einem Maximalwert U0 oszillierende Spannung anzulegen. Dadurch oszilliert das
Sondenpartikel nicht um seine entspannte Ruhelage, sondern um eine einer bestimmten
konstanten Vorspannung entsprechenden Position. Fig. 6 zeigt den typischen zeitlichen
Verlauf von Partikelposition (Symbol: O) und Kraft auf das Partikel (Symbol: +) bei einer
solchen Messung. Aus derartigen Kurven können die zur Bestimmung der viskoelastischen
Moduln erforderlichen Meßgrößen (Schwingungsamplitude des Sondenpartikels und
Phasenverschiebung zwischen oszillierender Kraft und Antwortbewegung des Partikels)
abgeleitet werden.
Claims (23)
1. Vorrichtung zur Messung elastischer und viskoser Eigenschaften von Proben, bestehend
aus einer Probenkammer, einem Magneten, dessen Feldgradient am Ort der Probe
regulierbar ist, und magnetischen Sonden mit einer Größe von weniger als 5 µm, die durch
Anbinden oder Einbetten in direkten mechanischen Kontakt mit der Probe gebracht werden
und die mit Hilfe des regulierbaren Magneten, dessen Polschuh sich in mikroskopischer
Nähe der Sonden befindet, lateral aus ihrer Ruhelage ausgelenkt werden, wobei über diese
Auslenkung auf die elastischen und viskosen Eigenschaften des Stoffs geschlossen wird,
wobei
der Kern des regulierbaren Magneten so geformt ist, daß dessen probenseitige Stirnseite und
dessen Unterseite jeweils eben sind und unter spitzem Winkel in einer geraden Kante
zusammenlaufen und der Vektor der Magnetkraft in einer Fokalebene eines zur Beobachtung
der Sonden eingesetzten Mikroskops liegt.
2. Vorrichtung nach Patentanspruch 1,
dadurch gekennzeichnet,
daß es sich bei dem Stoff, dessen elastische und viskose Eigenschaften bestimmt werden,
um lebende Zellen handelt.
3. Vorrichtung nach Patentanspruch 1,
dadurch gekennzeichnet,
daß es sich bei den verwendeten magnetischen Sonden um kugelförmige Partikel handelt.
4. Vorrichtung nach Patentanspruch 1,
dadurch gekennzeichnet,
daß die magnetischen Sonden einen einheitlichen, definierten Durchmesser besitzen.
5. Vorrichtung nach Patentanspruch 1,
dadurch gekennzeichnet,
daß die Vorrichtung mit digitaler Bildverarbeitung kombiniert wird.
6. Vorrichtung nach Patentanspruch 1,
dadurch gekennzeichnet,
daß die Vorrichtung mit einem Lichtmikroskop kombiniert wird.
7. Vorrichtung nach Patentanspruch 1,
dadurch gekennzeichnet,
daß die Vorrichtung mit Fluoreszenzmikroskopie kombiniert wird.
8. Vorrichtung nach Patentanspruch 1 und 2,
dadurch gekennzeichnet,
daß die Vorrichtung mit einer mikromanipulatorischen Methode kombiniert wird.
9. Vorrichtung nach Patentanspruch 1,
dadurch gekennzeichnet,
daß der Abstand zwischen magnetischem Polschuh und magnetischer Sonde einstellbar ist.
10. Vorrichtung nach Patentanspruch 1 und 2,
dadurch gekennzeichnet,
daß die Zellen auf einem Substrat aufgebracht sind, so daß durch das Magnetfeld eine
Scherkraft ausgeübt wird.
11. Vorrichtung nach Patentanspruch 1 und 2,
dadurch gekennzeichnet,
daß zusätzlich zu den magnetischen Sonden innerhalb der Vorrichtung unmagnetische
Sonden verwendet werden, die spezifisch an die Zelle binden oder durch sonstige
immunologische Methoden an die Zelle angebunden werden.
12. Vorrichtung nach Patentanspruch 1,
dadurch gekennzeichnet,
daß die Probe vom Polschuh des Magneten entweder durch Aufbringen einer geeigneten
Beschichtung auf den Polschuh oder durch Überziehen des Polschuhs mit einem dünnen,
flexiblen Material, z. B. einer Latexschicht, getrennt wird, so daß die Probe nicht verun
reinigt wird.
13. Vorrichtung nach Patentanspruch 1,
dadurch gekennzeichnet,
daß die Vorrichtung mit Induktionsspulen kombiniert wird, um die Verschiebung der
magnetischen Partikel anhand von Induktionsströmen zu detektieren.
14. Vorrichtung nach Patentanspruch 1,
dadurch gekennzeichnet,
daß die Wand der Probenkammer an einer Stelle eine Öffnung aufweist, die mit einem
flexiblen Material verschlossen ist, oder an einer Stelle so geformt ist, daß sie sich der Form
des Polschuhs genau anpaßt.
15. Vorrichtung nach Patentanspruch 1,
dadurch gekennzeichnet,
daß die magnetischen Sonden über spezifische Antikörper, chemisch oder durch
Physisorption an die Plasmamembran gebunden werden.
16. Vorrichtung nach Patentanspruch 1 und 2,
dadurch gekennzeichnet,
daß die magnetischen Sonden durch Phagozytose, Mikroinjektion, Elektroporation, Scrap
loading, Lipidfusion oder spezifische Beschichtung der Kugeln, wie z. B. Adenovirus
beschichtung, in das Zytosol gebracht werden.
17. Vorrichtung nach Patentanspruch 1 und 2,
dadurch gekennzeichnet,
daß die magnetischen Sonden entweder spezifisch oder unspezifisch im Zytosol der Zelle
gebunden werden.
18. Verwendung einer Vorrichtung nach einem der Patentansprüche 1-17 zur Untersuchung
des pathologischen Zustands einzelner Zellen.
19. Verwendung einer Vorrichtung nach einem der Patentansprüche 1-17 zur Ermittlung
des Erfolgs therapeutischer Maßnahmen gegen die Duchennesche Muskel-Dystrophie auf
zellulärer Basis.
20. Verwendung einer Vorrichtung nach einem der Patentansprüche 1-17 zur Ermittlung
des Erfolgs therapeutischer Maßnahmen gegen Krebs.
21. Verwendung einer Vorrichtung nach einem der Patentansprüche 1-17 zur Ermittlung
des Erfolgs therapeutischer Maßnahmen gegen Krankheiten, die auf einen fehlerhaften
Aufbau des extrazellulären Bindegewebes zurückzuführen sind.
22. Verfahren unter Verwendung einer Vorrichtung nach einem der Patentansprüche 1-17,
dadurch gekennzeichnet,
daß zusätzlich zu den magnetischen Sonden unmagnetische Sonden in Kontakt mit Zellen
gebracht werden und daß über die laterale Auslenkung der unmagnetischen Sonden infolge
der Auslenkung magnetischer Sonden auf den pathologischen Zustand der Zelle geschlossen
wird.
23. Verfahren nach Patentanspruch 22,
dadurch gekennzeichnet,
daß das durch die Auslenkung magnetischer Sonden auf oder in der Zelle hervorgerufene
Deformationsfeld anhand der unmagnetischen Sonden visualisiert wird.
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