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Hintergrund
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Die wissenschaftliche Charakterisierung der Zellfunktion erfolgt oft durch Annäherung der Untersuchung einer Aggregatstruktur von Zellen oder der kleinsten noch funktionalen multizellulären Präparate, welche die Funktion des untersuchten Gesamtorgans erhält. Die Technologie zur Quantifizierung von Spannung oder Belastung einzelner Zellen ist begrenzt, wenn es um die tatsächliche Messung von Belastung oder Spannung auf einem solch niedrigen Kraftniveau geht. Sie ist eingeschränkt hinsichtlich der Fähigkeit, Spannung oder Belastung beispielsweise in Form einer Längenveränderung (Dehnung) aufzubringen oder umgekehrt die Antwort zu forcieren und dann zu quantifizieren. Sie ist aufgrund des fragilen Charakters der Zelle eingeschränkt hinsichtlich der Fähigkeit, anzuhaften und auf einer einzelnen Zelle zu halten. Und sie ist eingeschränkt hinsichtlich der Fähigkeit, die Einzelzelle zu manipulieren und positionieren, damit sie mit einem Messgerät ausgerichtet werden kann. Am besten lässt sich dies am Beispiel von Muskelzellen veranschaulichen. Die Muskelfunktion wird in der Regel an multizellulären intakten Gewebepräparaten durchgeführt. In bekannten Versuchen erfolgen Messungen der isometrischen Kraft, der Kontraktibilität unter externer Kraftbeanspruchung oder Dehnung (häufig als „Belastung” bezeichnet) mit oder ohne elektrische Stimulation und die zeitliche Bestimmung des Membranpotentials und/oder der inneren Calciumkonzentration in einem streng kontrollierten Umfeld. Nachteile der Ausrüstung des derzeitigen Standes der Technik zur Durchführung von Messungen an einzelnen (individuellen) Muskelzellen sind u. a.:
- 1. Da in Gewebepräparaten kein Blutkreislauf vorhanden ist, besteht die Möglichkeit eines Sauerstoffmangels, wenn sich der Experimentator dem inneren Teil der Muskelprobe nähert. Die mangelnde Durchblutung in isolierten Geweben führt zu einem potentiellen Sauerstoffmangel, weil der Bedarf größer ist als die Versorgung, was zu Hypoxie mit unbekannten aber in der Regel negativen Auswirkungen auf die Gewebefunktion führt. Dies steht direkt mit der begrenzten Diffusion in größeren intakten multizellulären Geweben und ganzen Organen in Zusammenhang und lässt sich mit hoher Sauerstoffspannung in den umgebenden Flüssigkeiten nicht vollständig überwinden.
- 2. Bei den meisten bekannten Techniken sind Puffer und experimentelle Reagenzien erforderlich, die nur langsam zur Mitte der Muskelprobe diffundieren. Durch den Perfusionsmangel können experimentelle Substanzen, Salzen und Ionen, die zur Untersuchung der Gewebefunktion verwendet werden, nicht alle Zellen in größeren Geweben und Organen problemlos erreichen, was potentiell zu unzuverlässigen Ergebnissen und Daten führt.
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Die mikroskopische Analyse von intakten Muskelpräparaten ist häufig sehr schwierig. Obwohl optische Techniken zur Beobachtung von Zellen in der Außenschicht eines Gewebes verwendet werden können, sind dies auch die Zellen, die in der Nähe der Verletzungszone liegen, wo die Gewebeprobe von der größeren Einheit oder dem Organ abgetrennt wurde. Darüber hinaus können mit optischen Techniken nicht die Reaktionen von tiefer gelegenen Zellen beobachtet werden.
- 3. Bei der Anwendung von In-vivo-Versuchstechniken sind intakte Organe und Gewebe inhärent multizellulär, was zur Unsicherheit führt, dass beobachtete Verhalten und Reaktionen teilweise auf komplexe Wirkungen durch den Beitrag unterschiedlicher Zellen und Strukturen in selben Geweben zurückzuführen sein können. Mit anderen Worten ist die gemessene Reaktion eine Summe der Wirkungen aller Zellen und unterstützenden Strukturen in der Probe. Im Fall von Muskeln enthalten diese auch Zellen wie z. B. Fibroblasten, Nervenzellen und Zellen des Blutversorgungssystems in der Wand von kleinen Arterien und Kapillaren. Ferner ist eine erhebliche Menge an Bindegewebe zwischen den Zellen (Matrix) vorhanden, das einen großen Einfluss auf die passiven mechanischen Eigenschaften eines Gewebes hat.
- 4. Ein kranker Muskel weist ein komplexes Gemisch von (dys)funktionalen Muskelzellen und fibrotischem Gewebe (die Reste von toten Zellen) auf, so dass die Differenzierung zwischen nativen Muskeldefekten und sekundären vom Gewebe stammenden Effekten auf die Gesamtgewebekontraktilität, wie etwas Steifheit und Kontraktionsfunktion, zu einer Herausforderung macht.
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Eine bekannte Methode zur Zellkraftmessung mit Kraftaufnehmern ist in Addae-Mensch, K. A., Measurement Techniques for Cellular Biomechanics In Vitro, Minireview, Society for Experimental Biology and Medicine, S. 792–809, 2008 zu finden.
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Es wäre vorteilhaft, Instrumente und Verfahren zur Untersuchung der Kraft und Kontraktion in Einzelzellen statt in Zellgruppen bereitzustellen.
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Zeichnungen
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1A und 1B sind schematische Darstellungen des offenbarten Systems und der Mikrogreifer;
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1C ist eine vergrößerte schematische Darstellung einer Ausführungsform der offenbarten Mikrogreifer mit einem biegsamen Piezo-Aktuator;
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2 ist eine Längenreaktionsausgabe des Nanomotors des offenbarten Systems;
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3 ist eine schematische Darstellung einer Zelluntersuchungseinheit zur Verwendung in dem offenbarten System;
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4 zeigt eine Magnetanordnung zur Verwendung mit dem Kraftaufnehmer des offenbarten Systems;
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5 zeigt eine Krafttransiente der Brückenverstärkerausgabe des offenbarten Systems;
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6 zeigt den Kraftaufnehmer des offenbarten Systems, der auf einem Kalibrationsständer befestigt ist;
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7 zeigt eine Ausführungsform des Nanomotors des offenbarten Systems;
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8 zeigt eine bevorzugte Ausführungsform einer Küvetteneinheit im Eingriff mit dem offenbarten System;
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9 ist eine aufgerissene Ansicht der Küvetteneinheit aus 13; und
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10A und 10B zeigen eine Ausführungsform des offenbarten Systems, die Elektroden zur Stimulierung einer Muskelprobe verwendet.
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11 ist eine schematische Darstellung einer typischen Verdrahtung des offenbarten Systems.
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Beschreibung
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Das offenbarte Verfahren und die Instrumente ermöglichen die Auswertung der Funktion von einzelnen isolierten Zellen und bieten zahlreiche Vorteile gegenüber den derzeitig angewandten Verfahren und Instrumenten. Versuche an einzelnen isolierten Zellen (beispielsweise an Muskelzellpräparaten) beseitigen die oben aufgezählten Nachteile. Relevante Muskelkontraktionsparameter können generiert und direkt gemessen und ausgewertet werden. Dies ermöglicht die direkte Quantifizierung von Zellantworten einer einzelnen Zellart unabhängig von anderen Zellen, wodurch wesentlich zuverlässigere Daten erhalten werden. Die Instrumente ermöglichen die Kombination einer Reihe von Komponenten zur Erreichung dieses Ziels. Die erste Komponente ist ein sehr empfindlicher Kraftaufnehmer zur Quantifizierung von Kraft, Spannung oder Beanspruchung in einer Einzelzelle. Die zweite Komponente ist ein Piezo-Aktuator (Nanomotor) zur genauen Veränderung der Länge einer Zelle (Drücken oder Ziehen) oder zur Aufzwingung einer extern gesteuerten variablen Längenveränderung. Die dritte Komponente ist ein Küvettensystem zur Kontrolle der Umgebung der Zelle im Hinblick auf Gasdrücke, gelöste Substanzen und Nährstoffe, welche die Zellen eventuell braucht. Als Teil des experimentellen Paradigmas bietet das Küvettensystem die Möglichkeit, die Zelle zur Befestigung am Kraftaufnehmer und Nanomotor zu positionieren und auszurichten und gleichzeitig die Fähigkeit zur Verwendung von optischen Techniken, wie u. a. ohne Einschränkung Mikroskopie, für weitere gleichzeitige Messungen der Zellfunktion beizubehalten. Als Viertes wird ein Satz von miniaturisierten Mikrogreifern benötigt, die in das Ende des Kraftaufnehmers und Nanometers eingebaut sind, damit diese mit oder ohne Hilfe eines Zwischenhalters oder Verwendung eines biologischen Klebstoffes Zellen Ergreifen und Festhalten können. Die Miniaturisierung mit gleichzeitigem optischem Zugang zur Verbindung zwischen streng definierten Muskelkontraktionsbedingungen und gleichzeitig mikroskopisch bestimmten Messparametern eröffnet eine neue und bis jetzt noch unerforschte Dimension in der Zell- und Muskelforschung.
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Kraftmessungen an einzelnen Muskelzellen verwenden vorzugsweise einen ultrasensitiven Kraftaufnehmer, der zuverlässig kalibriert werden kann. Der Kraftaufnehmer sollte ausreichend starr sein, um Veränderungen der Zelllänge durch Kontraktion zu verhindern, und/oder er sollte durch Zellaktion während des Messverfahrens nicht signifikant verformt werden und eine schnelle Ansprechzeit aufweisen, um den Zellantworten genau folgen zu können. Ein geeigneter Kraftaufnehmer ist der optische Kraftaufnehmer KG-7 von Scientific Instruments GmbH, der in einer Ausführungsform des offenbarten Instruments verwendet wurde.
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Ein Aktuator mit hochpräziser axialer Bewegung wird zur Untersuchung der Zellkontraktion unter Belastung, wiederum ohne dass er sich selbst erheblich verformt, bevorzugt. Die Fähigkeit zur Generierung von schnellen Längenveränderungen ist zur Nachahmung von tatsächlichen Muskelaktivitätssituationen ebenfalls bevorzugt. Diese Bedingungen ermöglichen die kontrollierte Veränderung der Zelllänge und somit kontrollierte quantitative mechanische Kontraktionsmessungen.
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Die Kombination aus dem oben erwähnten hoch isometrischen Kraftaufnehmer und einem schnellen präzisen Aktuator ermöglicht genaue Messungen und Analysen. Die Kombination der beiden Vorrichtungen ermöglicht zahlreiche experimentelle Modalitäten, die für die Muskelfunktion relevant: isometrische Kontraktion, wobei die Zelle eine Kraft aufbringt, während sie in einer bestimmten Länge gehalten wird, isotonische Kontraktion, wobei die Zelle sich unter einer konstanten Spannung oder Belastung verkürzen darf, und exzentrische Kontraktion, wobei der Muskel eine Kraft erzeugt, während er durch eine externe Kraft in der entgegengesetzten Richtung zu seiner normalen Verkürzung aktiv verlängert wird. In einer Ausführungsform werden ein piezometrischer Nanomotor und ein optischer isometrischer Kraftaufnehmer KG7 von Scientific Instruments GmbH verwendet. Diese Messungen sind mit den bekannten Techniken unmöglich. Die am engsten verwandte Technik ist das Kohlenfaserverfahren. Im Kohlenfaserverfahren wird die spontane Adhäsion von porösen flexiblen dünnen Kohlenstofffasern zur Anheftung an eine Zelle genutzt. Nach chemischer oder elektrischer Stimulation, die zu Veränderungen der Zelllänge, wie beispielsweise Kontraktion oder Entspannung, oder zu aktiver Bewegung einer der Fasern zur Dehnung der Zelle führt, verformen sich die Fasern und die Verformung der Faser wird zurück gerechnet, wenn der Modul des Fasermaterials bekannt ist oder experimentell ermittelt wurde. Erzeugung und Messung von Muskelkraft fallen direkt mit den Muskelkontraktionen, bei denen sich die Kohlenstofffasern verformen, zusammen. Folglich können Muskelkraft- und Muskelkontraktionsmessungen nicht unabhängig ausgewertet werden und sind von begrenztem Wert.
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Bekannte Techniken liefern keine einfache zuverlässige und reversible Möglichkeit zur direkten Befestigung eines Kraftaufnehmers und/oder Aktuators an einer einzelnen Zelle, wobei die Befestigungskraft die Fähigkeit der Zelle zur Ablösung durch ihre eigene Krafterzeugungsfähigkeit überschreitet, was für solche Messungen bevorzugt wird. In der offenbarten Vorrichtung ermöglichen die Architektur von Kraftaufnehmer und Aktuator-Körper (der oben erwähnte KG7) die Integration einer Mikrogreifervorrichtung im Kraftaufnehmer und im Aktuator, so dass sich eine einzigartige Kombination von Möglichkeiten ergibt. Diese einzigartige Kombination ermöglicht die Durchführung dieser Messungen an Einzelzellen und ergibt eine neue flexible Plattform zur Quantifizierung der Zellfunktion in Bezug auf Bewegung und Kraftentwicklung. Im offenbarten Instrument kommen zwei optionale Befestigungsmethoden zur Anwendung:
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1. Befestigung von Zellenden mit mechanischen Mikrogreifern:
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Hierin wird eine Ausführungsform eines Mikrogreifers offenbart, der die direkte Befestigung an den Enden von Muskelzellen ermöglicht. Vorzugweise ist der erfindungsgemäße Mikrogreifer so konfiguriert, dass er sich über eine Fernsteuerung öffnet und schließt, ohne eine zusätzliche Bewegung zu verursachen, welche die Messungen stören kann. In der offenbarten Vorrichtung wird diese Konfiguration durch Verwendung eines Öffnungs- und Schließmechanismus in der Nähe der Mitte des Mikrogreifers realisiert. In einer bevorzugten Ausführungsform wird diese Wirkung durch einen piezoelektrischen Mechanismus erzeugt, der die Bedienung der Greifer ohne manuellen Kontakt mit dem Kraftaufnehmer oder Nanomotor ermöglicht. Ein weiteres Merkmal des Mikrogreifers ist, dass er ausreichend empfindlich ist, um die Muskelzellenden bei der Befestigung nicht zu verletzen oder traumatisieren. Eine Verletzung des Muskelzellendes würde jeden Versuch effektiv beenden. Der piezoelektrische Mechanismus im offenbarten Mikrogreifer ermöglicht eine kontinuierliche und stetige Bewegung der Greifer und ergibt einen feinen und präzisen Greifvorgang, der jederzeit unterbrochen werden kann. Dadurch kann die Klemmkraft effizient gesteuert werden. Da Ausführungsformen der Greifer üblicherweise aus Metall bestehen, lässt sich eine gelegentliche Schädigung der Muskelmembran in Anwesenheit von elektrischen Feldern, die häufig zur Auslösung von Kontraktion benötigt werden, nicht vermeiden. Eine nichtleitende Beschichtung kann zur Minimierung dieses Vorkommnisses optional auf den Greifern angebracht werden. Im Fall einer schwachen Reibung zwischen einer Muskelzelle und einem Mikrogreifer kann die Zelle ferner dazu neigen, in Kontraktionsversuchen vom Greifermechanismus zu gleiten. Eine optionale zweite Beschichtung oder eine klebstoffartige Substanz kann zur Verbesserung der Adhäsion der Zelle am Greifer auf den Armen des Mikrogreifers aufgebracht werden.
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2. Befestigung von Muskelzellen an mit Klebstoff beschichteten Glasstäbchen:
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Direktes Ergreifen von sehr kurzen Muskelzellen, wie z. B. Kardiomyozyten, mit den erfindungsgemäßen Mikrogreifern kann sich schwierig gestalten. Es wurde aber gefunden, dass diese Arten von Zellen an Glasfasern, die mit einem geeigneten biokompatiblen Klebstoff beschichtet sind, anhaften. Die erzeugte Adhäsion reicht für Kardiomyozyten aus, weil die von ihnen erzeugten Kräfte etwas schwach sind, damit sie nicht zur Ablösung von den Glasstäbchen führen. Eine ähnliche Methodik wurde wie oben erwähnt bereits früher mit Adhäsion von Zellen an Kohlenstofffaser-Stäbchen verwendet. Diese Adhäsion war häufig zu schwach und führte deshalb bei der Kontraktion der Zellen zur spontanen Ablösung während des Versuchs. Die Adhäsion an den offenbarten beschichteten Glasstäbchen ist bedeutend stärker bis zu dem Punkt, an dem die Ablösung bei der Zellkontraktion bedeutend reduziert oder sogar verhindert wird. In dieser Ausführungsform wird das Glasstäbchen (statt des Endes der Muskelzelle) mit einem Mikrogreifer wie dem oben besprochenen ergriffen. Das Verfahren vereinfacht die Zellbefestigung am Kraftaufnehmer und Nanomotor erheblich.
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Die offenbarten Instrumente und Verfahren zur Untersuchung der mechanischen Eigenschaften von einzelnen Muskelfasern ermöglichen die Validierung von wissenschaftlichen Daten, die aus Gewebeprobe gesammelt wurden. Sie ermöglichen auch die Kombination von Muskelkontraktions-Experimenten mit Experimenten, die nur an einzelnen Zellen möglich sind. Dies führt zu einer bedeutenden Verbreiterung der Möglichkeiten in der Muskel- und Zellforschung.
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1 ist eine allgemeine schematische Darstellung des offenbarten Kombinationsinstruments 10. Wie gezeigt ist das Instrument (10) sowohl zur direkten Befestigung des Mikrogreifers (12A und 12B) an einer Zelle als auch zur Befestigung über eine Zwischenkomponente konfiguriert.
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1B zeigt eine Ausführungsform der erfindungsgemäßen Mikrogreifer (12A und 12B) zur direkten Befestigung mit einer einzelnen Muskelzelle. 1B zeigt ein Paar von Mikrogreifern (12A und 12B), die an gegenüberliegenden Enden einer einzelnen enthäuteten Skelettmuskelzelle 11B über jeweils unbeschichtete Greiferspitzen (14) befestigt sind. Eine spezielle Beschichtung kann optional auf den Spitzen (14) aufgebracht werden, wenn das für ein bestimmtes Experiment bevorzugt wird.
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Im Gegensatz zu Skelettzellen kann eine einzelne Herzmuskelzelle nicht zuverlässig direkt mit den Greifern ergriffen werden. Wie in 1A gezeigt können die Mikrogreifer (12A und 12B) in die gegenüberliegenden Enden der Muskelzelle (11A) über dazwischen liegende Glasstäbchen (16) eingreifen. Die Glasstäbchen (16) sind in der Regel mit einem Material beschichtet, dass die Haftung an der Muskelzelle (11A) verbessert oder beeinflusst. In einer Ausführungsform ist die Muskelzelle (11A) ungefähr flach an einer Oberfläche positioniert und die Mikrogreifer (10) sind in Winkeln von ca. 90° relativ zu der jeweiligen Zelle (11A) und der Oberfläche positioniert. Diese bevorzugte Konfiguration wirkt mit beiden Befestigungsmethoden (1A oder 1B).
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Die in 1A und 1B gezeigten Mikrogreifer (12) werden in der Regel über eine Fernbedienung betätigt, um eine unerwünschte Bewegung während des Öffnungs- und Schließvorgangs zu vermeiden. Die Greifer (12) können allmählich geöffnet und geschlossen werden und die Druckkraft auf die Zelle kann je nach experimentellen Anforderungen automatisch angepasst werden.
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Wie angemerkt wird ein Kraftaufnehmer (20) im offenbarten System in Wirkverbindung mit den Mikrogreifern (12) verwendet. Ein bevorzugter Kraftaufnehmer (20) zur Verwendung im offenbarten System weist eine Resonanzfrequenz von ca. 150 Hz auf. Die Kräfteauflösung des Aufnehmers beträgt 0,3 μN und die Zeitauflösung der Kraftmessung beträgt 7 ms mit einem Antioszillationsfilter.
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Analog dem Kraftaufnehmer (20) steht ein Nanomotor (30) mit den Mikrogreifern (12B) in Eingriff und kann analog bedient werden. Der Nanomotor (30) ermöglicht und initiiert Längenveränderungen an der jeweiligen Probenzelle, an der er befestigt ist. In einer bevorzugten Ausführungsform beträgt die räumliche Auflösung des Motors 20 nm and der maximale Bereich liegt bei 80 μm. 2 zeigt ein Beispiel des Längenantwortausgangs des Nanomotors (30) auf rechteckige Eingangssignale. Die Position des Nanomotors (30) ist feedback-gesteuert, was zur Vermeidung von langsamen Drifts nach einer Positionsveränderung beiträgt.
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In einer bevorzugten Ausführungsform ist eine elektrische Steuereinheit in einer Zelluntersuchungseinheit integriert und weist Folgendes auf: Einen Brückenverstärker für den Kraftaufnehmer, einen Antioszillationskreislauf zur Ableitung der Resonanzoszillation aus dem Kraftsignal und eine Feedbacksteuerung für den Nanomotor.
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3 zeigt eine Ausführungsform der Zelluntersuchungseinheit (40). Ein typischer Betrieb der Einheit umfasst die folgenden Schritte: Drücken der ”Null”-Taste (42) setzt den Brückenverstärker auf einen Ausgang von Null Volt. Durch Drehen des Potentiometers (44) werden die Mikrogreifer (12A) des Kraftaufnehmers geöffnet und geschlossen. Zur Kalibrierung des Kraftsignals kann ein mit einem Schraubenzieher bedientes Potentiometer (46) verwendet werden. Der Kraftsignalausgang wird als Bezugsziffer 48 angezeigt. Das Kraftsignal durchläuft einen Antioszillationsfilter, der in die Einheit integriert ist. Wenn sich der Potentiometerschalter (44) in Position X1 befindet, entspricht ein Ausgang von 1 Volt 100 μN und wenn sich der Schalter (44) in der Position X10 befindet, entspricht ein Ausgang von 1 Vol 10 μN. Der Schalter (50) wird zum Hin- und Herschalten der Amplifizierung des „korrigierten” Ausgangs des Kraftsignals von X10 zu X1 verwendet. Der Schalter ist in der Regel deaktiviert, wenn das System mit dem MUSCLEDATA oder MDAC Softwareprogramm (für automatischen Betrieb) betrieben wird, das zur Steuerung der Motorposition über einen analogen Spannungsbefehlseingang (60) verwendet wird. Das Verbindungsglied (52) für die Magnetanordnung wird ausführlicher besprochen. Die Frequenzeinstellung des Oszillators, der die Magnetanordnung antreibt, ist als Bezugsziffer (54) angezeigt. Die Einheit (40) weist auch einen Masseverbinder (36) für den Stimulator auf. Die Amplitude der Oszillationsfrequenz, welche die Magnetanordnung antreibt, ist als Bezugsziffer 58 angezeigt. Der Nanomotor folgt einem elektrischen Signal, das dem Eingang 60 zugeführt wird. Hier entspricht ein Eingang von 1 Volt der Verschiebung von 10 μm. Ein Verbindungsglied für die Schnittstelle zur Verwendung der Betriebssoftware MUSCLEDATA oder MDAC ist als Bezugsziffer 62 gezeigt. Die Verschiebung des Motors wird am Ausgang 64 abgelesen. 1 Volt entspricht einer Verschiebung um 10 μm. Der Potentiometer (66) steuert den Motor für die Mikrogreifer (12B). Der Kraftaufnehmer (20) ist in der Regel über das Verbindungsglied (68) mit der Einheit (40) verbunden. Die Photodiodenreihe (70) zeigt die Amplitude der Oszillation des Kraftaufnehmers an. Schließlich kann der Nanomotor über das Verbindungsglied (72) mit der Einheit (20) verbunden werden.
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Die Einstellung des Antioszillationsfilters des Kraftaufnehmers (20) erfolgt in der Regel durch Anregung der Resonanzoszillation des Aufnehmers (20). Zu diesem Zweck ist der Kraftaufnehmer mit einer Magnetanordnung wie in 4 gezeigt verbunden. Der Magnet (74) wird über die Schraube (76) arretiert. Der Kraftaufnehmerstift (78) sollte sich in der Regel bewegen (d. h. oszillieren) können.
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Frequenzeinstellung: In einem bevorzugten Verfahren zur Bedienung des offenbarten Systems 10 wird das Instrument zunächst auf die höchstmögliche Frequenz gesetzt (d. h. der Potentiometer ”Frequ.” (54) wird so weit wie möglich nach rechts gedreht). Die Amplitude und die Stromversorgung werden ebenfall auf hoch gestellt (Potentiometer „Ampl.”). Die Amplitude und die Stromversorgung werden dann langsam reduziert, in dieser Ausführungsform indem ein Anwender die jeweiligen Potentiometer gegen den Uhrzeigersinn dreht. Sobald die Oszillatorfrequenz die Resonanzfrequenz des Kraftaufnehmers verschmälert, beginnt der Kraftaufnehmer zu oszillieren. Die Oszillationen werden auf der LED-Reihe (70) als Flackern sichtbar. Bei Annäherung der Resonanzfrequenz des Kraftaufnehmers nimmt das Oszillationsniveau zu, so dass die LED-Reihe vollständig oder fast vollständig aufleuchtet. Die Amplitude kann dann mit dem Potentiometer ”Ampl.” (58) auf Werte unterhalb der LED-Sättigung reduziert werden.
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Das oben beschriebene Verfahren zur Frequenzeinstellung wird in der Regel wiederholt, bis eine klare maximale Oszillation bei einer bestimmten Einstellung des Potentiometers „Frequ.” (54) erkannt wird. Der Potentiometer (54) wird dann in der oben erwähnten Position mit maximaler Oszillation arretiert. Je genauer die Frequenz der Antioszillationseinheit an die Resonanzfrequenz des Kraftaufnehmers (20) angepasst wird, desto besser ist das aus dem Kraftsignal abgeleitete Klingelphänomen des Kraftaufnehmers, was genauere Ergebnisse ergibt.
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Zusätzlich wird die Resonanzoszillation des Aufnehmers (20) evoziert, wenn die eingestellte Frequenz der Antioszillationseinheit auf die Hälfte der Resonanzfrequenz des Kraftaufnehmers (20) gesetzt wird. Der Filter arbeitet auch ausreichend mit der halben Resonanzfrequenz, aber die zeitliche Auflösung der Kraftmessung wird um die Hälfte verringert. Die höchste Frequenz wird bevorzugt, die Resonanzoszillation evoziert.
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5 zeigt eine Krafttransiente, die direkt aus dem Ausgang des Brückenverstärkers (obere Ableitung) erhalten wurde und nach Durchlaufen der „Antioszillations” einheit (untere Ableitung). In der oberen Ableitung ist eine stetige Resonanzfrequenz auf die tatsächliche Krafttransiente aufgesetzt. Nach Durchlaufen des Antioszillationskreislaufs wird dieses Resonanzsignal entfernt. Zurück bleibt die von der Zelle erzeugte und vom Kraftaufnehmer gemessene Krafttransiente.
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Kalibrierung des Kraftaufnehmers: In einer typischen Kalibrierung des Kraftaufnehmers (20) wird die Zelluntersuchungseinheit (40) zunächst von anderen externen Signalaufzeichnungsvorrichtungen entfernt. Der Verstärkungsschalter (50) zum Hin- und Herschalten zwischen X1 und X10 auf dem vorderen Bedienfelds des Instruments wird in die X1-Position geschaltet. Der Aufnehmer (20) wird in der Regel auf einem Kalibrationsständer (80) wie in 6 gezeigt befestigt. Nachdem die Ausgangsstellung mit der ”Null”-Taste (42) auf Null gestellt wurde, wird ein Gewicht (82) mit einer vorbestimmte Masse (in einer Ausführungsform ca. 80 mg) an der Spitze des Aufnehmers (20) aufgehängt. Dies ist in 6 gezeigt. Der mittels Schraubenzieher bediente Potentiometer „Kal.” (46) wird so eingestellt, dass die Ausgangsspannung am BNC auskorrigiert die entsprechende Spannung zeigt (beispielsweise auf 8 V für 80 mg oder 800 μN eingestellt). Dieser Kalibriervorgang wird in der Regel angewendet, wenn die Kraft des Gewichts (82) senkrecht auf den Aufnehmerstift (78) einwirkt, wie in 6 zu sehen ist. Wenn der Winkel von 90° abweicht, kann das Ausgangssignal zur Korrektur des Winkels entsprechend eingestellt werden.
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Erneute Ausrichtung der mechanische Null-Position des Nanomotors: Bei eingeschränktem Verschiebungsbereich des Nanomotors (30) kann die mechanische Null-Position des Motors unangepasst bleiben. Zum Anpassen wird der Schalter ”Motoreins.” – ”normal” (in dieser Ausführungsform befindet er sich auf der Rückseite der Zelluntersuchungseinheit (40)) in die Position „Motoreins.” (nicht gezeigt) gebracht. Die Position des Motors (30) am BNC Stecker „Pos. aus” (64) wird in der Regel auf dem vorderen Bedienfeld der Einheit (40) gemessen. Wenn sich die Position erheblich von 0 Volt unterscheidet, kann die Schraube (84) (siehe 7) gedreht werden, um den Ausgang auf 0 Volt zu stellen. Durch Drücken des Schalters zum Hin- und Herschalten zwischen ”Motoreins.” und ”normal” zurück in die ”normale” Position wird das Instrument in den normalen (d. h. Feedback) gesteuerten Betriebsmodus zurückgesetzt.
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Punktstimulierung des Präparats: Die Mikrogreifer (12A) des Kraftaufnehmers (20) sind in der Regel elektrisch geerdet. Muskelzellen benötigen zur Einleitung der Kontraktion einen elektrischen Impuls oder eine Stimulation. Dies geschieht mittels eines Laborstimulators. In der Regel kann der Masse- oder (–)-Ausgang des Stimulators elektrisch mit dem Schutzkontaktstecker (56) auf dem vorderen Bedienfeld der Zelluntersuchungseinheit (40) verbunden werden. Hier werden die Mikrogreifer (12B) des Motors elektrisch mit dem Bananenstecker-„Stimulator” auf der Rückseite der Einheit (40) verbunden. Der andere Ausgang des Stimulators, in der Regel (+), kann mit diesem Bananenstecker verbunden werden. Zusammen ergibt dies einen elektrischen Kreislauf zur Stimulierung der Zelle.
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8 zeigt ein Küvettensystem (114) zur Verwendung mit dem offenbarten System (100). In dem gezeigten Küvettensystem zeigt der Pfeil A die X-Y-Z-Ausrichtung und der Pfeil B zeigt die vertikale Feineinstellung des Kraftaufnehmers (20). Die Pfeile C zeigen die X-Y-Z-Ausrichtung der Pfeil D zeigt die vertikale Feineinstellung des Nanomotors (30). Die beschriebene durch A, B, C und D gezeigte Einstellung bezieht sich auf das stationäre Mikroskop und ist unabhängig von der Positionierung des Küvettensystems (114). Somit werden der Kraftaufnehmer (20) und der Nanomotor (30) relativ zur optischen Achse des Mikroskops eingestellt. Die Pfeile E weisen auf die Einstellung des eigentlichen Küvettensystems hin. Im typischen Betrieb wird das Küvettensystem (114) zunächst mit der Mikroskopkonstruktion ausgerichtet, so dass die optischen Achsen miteinander fluchten. Wenn dann eine Zelle in der Mitte der Küvette positioniert wird, befindet sie sich auch automatisch in der Mitte der optischen Achse des Mikroskops. Diese Konfiguration ermöglicht eine Drehung des Tisches zur Einleitung der Rotation des beobachteten Präparats (d. h. Muskelprobe oder Zelle) um die optische Achse des Mikroskops unabhängig von der Position der Küvette (114). Dies ist eine sehr erfinderische Lösung zur richtigen Ausrichtung einer Zelle mit dem Instrument vor Befestigung am Kraftaufnehmer und Nanomotor.
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Ergreifen der Glasstäbchen: Wie bereits angemerkt zeigt 1A eine Ausführungsform der offenbarten Vorrichtung mit Glasstäbchen (16) oder dergleichen Elementen, die von den Mikrogreifern (12A und 12B) ergriffen werden und dann mit einem Klebstoff an einer Muskelzellprobe (16) befestigt werden. Eine typische Anordnung dieser Ausführungsform würde zunächst den Schritt der Manövrierung der Küvette (114) umfassen, so dass die Mikrogreifer (12A oder 12B) des Kraftaufnehmers (20) oder des Nanomotors (30) über dem jeweiligen Glasstäbchen (16) angeordnet sind. Die Positionierung des Glasstäbchens (16) kann durch Drehen des Drehtisches verändert werden. Die Mikrogreifer werden durch Fernbedienung des eingebetteten Motors geöffnet und können dann mit der Z-Steuerung des Nanomotors (oder des Kraftaufnehmers) abgesenkt werden, bis die Mikrogreifer (12A oder 12B) mit einem Deckglas in Berührung kommen, das unter dem Glasstäbchen (16) positioniert werden kann und in der Regel den Boden der Versuchskammer oder Küvette formt. Die Mikrogreifer können dann zum Ergreifen des Stäbchens (16) geschlossen und anschließend je nach Feineinstellung angehoben werden.
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9 zeigt eine isolierte Ansicht einer Küvette (114). Die Küvette (114) kann in der Regel gereinigt werden, indem zunächst der Motor (30) und der Kraftaufnehmer (20) aus dem Kombinationssystem entfernt werden, wie in 8 zu sehen ist. Die Küvettenabdeckung (116) wird dann abgeschraubt und entfernt, in der Regel über den Handgriff (118). Das Deckglas (120) und alle anderen Elemente können dann gereinigt oder ersetzt werden.
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Ein Verfahren zur Stimulierung einer Muskelprobe ist die direkte Stimulierung durch die Mikrogreifer (12A). Die Mikrogreifer (12A) werden mit dem Kraftaufnehmer (20) verbunden und elektrisch geerdet. In einer Ausführungsform weist das vordere Bedienfeld der Zelluntersuchungseinheit (40) einen Schutzkontaktstecker (56) zur Erdung der Mikrogreifer (12A) auf. Die Seiten der Mikrogreifer (12A), die mit dem Motor in Wirkverbindung stehen, sind über einen Bananenstecker auf der Rückseite der Zelluntersuchungseinheit (40) angeschlossen. Der Stecker steht mit dem anderen Ausgang des Stimulators in Wirkverbindung. Der Strom für die Stimulierung der Muskelprobe fließt durch die Mikrogreifer (12A).
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Zusätzlich ermöglicht das offenbarte System (10) die Stimulierung einer Muskelprobe über separate Elektroden. Eine bevorzugte Ausführungsform verwendet Platinelektroden. Bezugnehmend auf 10A und 10B werden die Elektroden (120) starr vom Halter (122) durch Eingriff einer Schraube (124 ”S”) gehalten. Ein Platindraht (126) wird wie gezeigt in den Halter (122) gesteckt. Die Ausrichtung der Elektroden (120) wird dann durch Manipulation des Platindrahts (126) erreicht. Die Elektrode sollte hinter den Mikrogreifern (12A und 12B) auf den Seiten des Kraftaufnehmer (20) und des Nanomotors (30) angeordnet sein, wie in der vergrößerten 10B zu erkennen ist.
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Eine schematische Darstellung einer typischen Verdrahtung für das offenbarte Instrument ist in 11 gezeigt.
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Zur Veranschaulichung wurde zwar eine bevorzugte Ausführungsform aufgeführt, aber die vorhergehende Beschreibung ist nicht als Einschränkung der Erfindung hierin zu sehen. Demnach sind für den Fachmann verschiedene Modifikationen, Adaptionen und Alternativen offensichtlich, ohne vom Geist der Erfindung und dem Umfang der Ansprüche abzuweichen.
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Nicht-Patentliteratur
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- K. A., Measurement Techniques for Cellular Biomechanics In Vitro, Minireview, Society for Experimental Biology and Medicine, S. 792–809, 2008 [0003]
