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Gebiet der
Erfindung
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Die
Erfindung liegt auf dem Gebiet der optischen Mikroskopie und deren
Anwendung bei der Untersuchung von Zellen.
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Hintergrund
der Erfindung
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Die
Zelle stellt die grundlegende Einheit von lebenden Organismen, d.
h. von Tieren oder Pflanzen, dar. Die Untersuchung ihrer Struktur
sowie der Zusammensetzung und der Funktion ihrer verschiedenen Bestandteile
führt zu
wertvollen Erkenntnissen über
die komplizierten Vorgänge,
die in integrierten biologischen Systemen ablaufen. Dazu sind Techniken
erforderlich, die die Durchführung
von Untersuchungen an Zellproben in Echtzeit, in nicht-invasiver Weise
und in Lösungen,
die die physiologischen Bedingungen nachahmen, ermöglichen,
so dass die Funktionsfähigkeit
der Zelle erhalten bleibt.
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Die
optische Mikroskopie (unter Verwendung von sichtbarem Licht) wurde
in breitem Umfang zur Untersuchung von lebenden Zellen herangezogen. Jedoch
ist die Auflösung
durch Beugung auf etwa 200–250
nm begrenzt. Für
genauere Untersuchungen besteht ein üblicherweise eingesetztes Verfahren
in der Elektronenmikroskopie, wo es möglich ist, Bilder mit einer
Auflösung
von 10 nm zu erhalten, wobei aber die Probe vor der Abbildung fixiert
werden muss. Somit ist es nicht möglich, ein Elektronenmikroskop
zur Untersuchung von lebenden Zellen zu verwenden.
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Eine
weitere Technik mit hoher Auflösung
beruht auf der Anwendung einer Rastersondenmikroskopie (SPM), bei
der eine scharte Sondenspitze in unmittelbarer Nähe zu der zu untersuchenden
Probe abgetastet wird. Die sich daraus ergebenen Wechselwirkungen
und somit die chemisch/physikalischen Eigenschaften der Probe lassen
sich als Funktion der Spitzenposition bezüglich zur Probe auftragen,
wodurch man ein Profil dieser gemessenen Wechselwirkung erzeugt.
Mitglieder der SPM-Familie,
die üblicherweise
zum biologischen Abbilden herangezogen werden, sind die atomfreie
Mikroskopie (AFM), die Rasterionen-Konduktanzmikroskopie (SICM)
und die optische Raster-Nahfeld-Mikroskopie (SNOM).
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Bei
der SNOM wird Licht in senkrechter Richtung in einer faseroptischen
Sonde mit einer Auslassöffnung
von Subwellenlängen-Abmessungen
nach unten gekuppelt, wobei die Sonde oberhalb der Probenoberfläche abgetastet
wird. Wechselwirkungskräfte
zwischen der Spitze und der Probe werden dazu herangezogen, deren
Trennabstand auf einem Wert unter den Subwellenlängen-Abmessungen der Apertur zu halten. Diese
Anordnung ermöglich
eine gleichzeitige Erzeugung von optischen und topographischen Bildern,
deren Auflösung
von der Größe der Auslassöffnung bzw.
von der Größe der Spitze
abhängt.
Wie bei der optischen Weitfeld-Mikroskopie stehen bei SNOM sämtliche
Kontrastmechanismen zur Verfügung
und insbesondere ist eine chemische Abbildung unter Verwendung von
fluoreszierenden Markierungen möglich.
Obgleich es jedoch unkompliziert ist, Sonden mit kleineren Öffnungen
herzustellen, ist die Bereitstellung von geringeren Trennabständen zwischen
Spitze und Probe in einer Flüssigkeit
(<60 nm) schwierig,
und zwar aufgrund der Probleme bei der Bereitstellung eines zuverlässigen Verfahrens
zur Steuerung des Sonden-Proben-Abstands. Dies ist auf eine Dämpfung von
Schwingungen der Sonde, die im Feedback-Mechanismus verwendet wird,
zurückzuführen.
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Bei
der SICM wird eine mit Elektrolyt gefüllte Glas-Mikropipette über der
Oberfläche
einer Probe, die sich in einem Bad aus einer Elektrolytlösung befindet,
abgetastet (vergl. Hansma et al., Science, Bd. 243 (1989), S. 641–643). Der
Trennabstand der Pipette von der Probe wird auf einem konstanten
Wert gehalten, indem man den Ionenstrom, der durch die Pipettenöffnung fließt, steuert.
Der Strom fließt
zwischen zwei Elektroden: eine innerhalb der Pipette und die andere
außerhalb
der Elektrolytlösung.
Für eine
angelegte Vorspannung zwischen den Elektroden hängt das Ionen-Stromsignal von
einer Kombination des Widerstands der Mikropipette (RP)
und dem Zugangswiderstand (RAC) ab, bei
dem es sich um den Widerstand entlang der konvergierenden Wege vom
Bad zur Mikropipettenöffnung
handelt. RP hängt vom Spitzendurchmesser
und vom Konuswinkel der Mikropipette ab, während RAC in
komplizierter Weise von den elektrochemischen Eigenschaften der Probe,
der Geometrie und dem Trennabstand von der Sonde abhängt. Der
RAC-Wert
macht den Ionenstrom empfindlich gegenüber dem Pipetten-Proben-Trennabstand und
ermöglicht
eine Aufrechterhaltung des Abstands, so dass es nicht zu einem Kontakt
kommt.
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Der
optimale Spitzen-Proben-Trennabstand, der die Einführung von
SICM als ein kontaktfreies Profilierungsverfahren für ausgearbeitete
Oberflächen
ermöglichte,
entspricht der Hälfte
des Spitzendurchmessers; vergl. Korchev et al., J. Microsc., Bd. 188
(1997), S. 17–23,
sowie J. Biophys., Bd. 73, S. 653–658. Der Spitzenausgang wird
im allgemeinen zur Erzeugung von topographischen Merkmalen und/oder
Bildern des lokalen Flusses von Ionenströmen durch Poren an der Probenoberfläche herangezogen.
Die räumliche
Trennung, die unter Anwendung von SICM erreichbar ist, hängt von
der Größe der Spitzenöffnung ab.
Diese beträgt
typischerweise 50 nm bis 1,5 μm.
Dies führt
zu einer entsprechenden Auflösung.
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Zusammenfassende Darstellung
der Erfindung
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Um
die angestrebte hohe Auflösung
bei der mikroskopischen Untersuchung von lebenden und nicht-fixierten
Zellen zu erreichen, wurde ein hybrides Raster-Ionenkonduktanz- und optisches Raster-Nahfeld-Mikroskop
entwickelt. Das Mikroskop ist in Anspruch 1 definiert. Gemäß einem
Aspekt der Erfindung umfasst die Vorrichtung eine Sonde, über die eine
Testkomponente abgegeben werden kann; einen Sensor zum Erfassen
eines Ionenstroms; und eine Einrichtung zur Steuerung der Position
der Sonde relativ zum Objekt in Reaktion auf den Ionenstrom. Gemäß einem
weiteren Aspekt bedient sich ein Verfahren zur Abbildung eines Gegenstands
in einer flüssigen
Umgebung durch Raster-Ionenkonduktanzmikroskopie einer Sonde, deren
Abstand vom Gegenstand in Reaktion auf den Ionenstrom in der Flüssigkeit
aufrechterhalten wird, wobei die Sonde eine Einrichtung zur Abgabe
einer Testkomponente auf den Gegenstand umfasst.
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Die
vorliegende Erfindung beruht zum Teil auf der Erkenntnis, dass SICM-
und SNOM-Techniken komplementär
sind (SICM als ein kontaktfreies Profilierungsverfahren und SNOM
als eine Technik, die es ermöglicht,
optische und chemische Informationen über eine Probe zu erhalten)
und dass sie in vorteilhafter Weise in einer einzigen experimentellen Anordnung
eingesetzt werden können.
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Die
Anwendung der neuartigen Vorrichtung ermöglicht eine quantitative Charakterisierung
der Zelloberfläche
mit hoher Auflösung
und die gleichzeitige Aufzeichnung von topographischen und optischen
Bildern. Ein spezielles Merkmal des Verfahrens besteht in einem
zuverlässigen
Mechanismus zur Steuerung des Abstands zwischen der Sonde und der
Probe in der Flüssigkeit,
z. B. einem physiologischen Puffer.
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Das
neuartige Verfahren wurde erstmals durch Aufzeichnung von Nahfeld-Bildern von lebenden
Zellen (Herzmyozyten) dargelegt. Unkomplizierte Modifikationen an
dem Instrument ermöglichen eine
Fluoreszenzabbildung und eine höhere
Auflösung.
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Die
Erfindung ermöglicht
eine funktionelle Kartierung von Zellen. Beispielsweise ermöglicht sie eine
Ionenkanal-Kartierung.
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Durch
die Erfindung ist es möglich,
die Zelloberfläche
in einer einzigen Abtastung abzubilden, indem man die Sonde dazu
heranzieht, die Zelloberfläche
im konfokalen Volumen des Mikroskops zu halten. Für eine biologische
Abbildung von lebenden Zellen kann die Belichtung begrenzt werden,
wodurch Schädigungen
auf ein Minimum beschränkt und
die Schwierigkeiten von intensiven Nahfeld-Lichtquellen, die bei SNOM verwendet
werden, überwunden
werden. Obgleich die Zelle ihre Gestalt verändern kann, stellt dies bei
diesem konfokalen Oberflächenmodus
kein Problem dar, da die Abbildung immer an der Oberfläche erfolgt.
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Ein
Merkmal der Erfindung besteht in ihrer Einfachheit. Beispielsweise
können
vorhandene konfokale Mikroskope leicht mit einer Pipette und einer entsprechenden
Computersteuerung nachgerüstet werden.
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Beschreibung der Zeichnung
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Eine
Mikropipette des Typs, der erfindungsgemäß verwendet werden kann, ist
in 1 der beigefügten
Zeichnung dargestellt. Die 2A und 2C erläutern, in
welcher Weise ein nicht-modulierter Ionenstrom zur Steuerung der
Sondenposition über
einer Probe verwendet werden kann. Die 2B und 2C erläutern, wie
eine Feedback-Steuerung gemäß einer
bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung verwendet werden kann. 3 zeigt
eine weitere Anordnung von Komponenten, die sich zur erfindungsgemäßen Anwendung eignet. 4 zeigt die Ergebnisse des Nachweises von
einzelnen KATP-Kanälen in Ratten-Kardiomyozyten-Sarkolemm.
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Beschreibung der Erfindung
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Der
Ausdruck "Testkomponente" wird hier zur Beschreibung
beliebiger chemischer oder physikalischer Einheiten herangezogen,
die am Beobachtungsort abgegeben werden können und die entweder als solche
beobachtbar sind oder eine beobachtbare Reaktion erzeugen können. Beispielsweise kann
es sich bei der Testkomponente um Licht handeln; es kann ein Laser
bereitgestellt werden, so dass beispielsweise kohärentes Licht über die
Sonde auf eine Zelloberfläche
gerichtet werden kann. Alternativ kann möglicherweise in Kombination
mit einer Laser-Quelle die Sonde an ihrer Spitze ein Material, z.
B. einen durch Licht aktivierbaren Farbstoff, enthalten, der in
situ Licht erzeugen kann. Die äußere Oberfläche der
Sonde kann beschichtet sein, z. B. mit einer Metallschicht, um ein
Austreten von Licht zu verhindern.
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Eine
geeignete Mikropipette ist schematisch in 1 dargestellt.
Sie umfasst einen Pipettenkörper 10 mit
der Metallbeschichtung 11 an ihrer Spitze. Laser-Licht
aus einer Quelle (nicht abgebildet) wird in einer Faseroptik nach
unten geführt.
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Dabei
ist beispielsweise eine Mikropipette mit einem oder mehreren Fluorophoren
gefüllt
und wird mit einem Laser angeregt. In einem Fall kommt der Laser
im Mikroskopobjektiv nach oben. Dies erzeugt eine lokale Lichtquelle,
da der Laser auf die Pipettenspitze fokussiert ist. Ferner ist der
Farbstoff konzentriert, so dass die Eindringtiefe des Laser-Lichts
in die Lösung
sehr gering ist. Der Farbstoff steht unter Druck und tritt somit
langsam aus der Pipette aus, wobei Schwierigkeiten mit einer Photobleichung
vermieden werden. Diese Vorgehensweise kann zur Abbildung im Nahfeld
herangezogen werden. Eine Metallbeschichtung ist nicht erforderlich.
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Gemäß einer
weiteren Ausführungsform handelt
es sich bei der Testkomponente um ein chemisches Reagenz. Dieses
Reagenz kann direkt oder indirekt wirken. Beispiele für Reagenzien,
die eine direkte Wirkung ausüben,
sind Reagenzien, die Fluoreszenz, Biolumineszenz oder Chemilumineszenz hervorrufen.
Somit kann beispielsweise eine Mikropipette zur Abgabe von Luciferin
geeignet sein, auf das durch Luciferase in Gegenwart von ATP und
Magnesiumionen unter Erzeugung von Licht mit einem Peak bei 568
nm eingewirkt wird. Magnesium kann in der Lösung bereitgestellt werden
und sämtliche übrigen Reagenzien
in der Pipette, so dass Licht lokal durch die Umsetzung erzeugt
wird. Keine Beschichtung ist erforderlich, um die Nahfeld-Lichtquelle
zu erzeugen. Eine rasche Verdünnung
von Reagenzien, nachdem diese aus der Pipette ausgetreten sind,
bedeutet, dass Licht an der Spitze erzeugt wird und die Auflösung durch
die Öffnung
der Pipette festgelegt wird.
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Zu
weiteren geeigneten Reagenzien gehören Moleküle, die ihre Fluoreszenz mit
der Variation eines speziellen Parameters, z. B. des pH-Werts, der Konzentration,
beispielsweise von Ca, oder des Potentials verändern. Eine lokale Anwendung
von geeigneten Reagenzien und eine Anregung des Fluorophors ermöglicht eine
lokale Erfassung dieses Parameters, z. B. die Kartierung von Kanälen oder
Protonenpumpen.
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Beispiele
für Reagenzien,
die indirekt wirken, sind solche, die bei Abgabe auf die Zelle im
Innern der Zelle als Folge einer Transduktion eine Veränderung
hervorrufen. Diese Änderung
wird nachgewiesen. Dieser Effekt kann natürlicherweise durch die Signalkaskade
verstärkt
werden.
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Insbesondere
kann die Pipette einen Liganden oder einen Arzneistoff enthalten.
Dieses Produkt wirkt auf einen Rezeptor an der Zelloberfläche ein oder
bindet an diesen. Im Innern der Zelle erfolgt als Ergebnis der Signal-Transduktionskaskade
eine Veränderung
in der Konzentration eines zweiten Messengers, z. B. der Calciumkonzentration
in der Zelle. Es erfolgt eine Amplifikation des Bindungsereignisses
durch die Kaskade, wobei ein Enzym angeschaltet wird, das zahlreiche
Produktmoleküle
erzeugt, die wiederum auf zahlreiche andere Enzyme und dergl. einwirken,
so dass ein Bindungsereignis zu einer großen Veränderung führt. Dieses in natürlicher
Weise verstärkte
Signal wird nachgewiesen, z. B. durch eine Fluoreszenzfärbung, wie
Fluor-3, das Calcium in der Zelle bindet, und kann zur Messung der
Calciumkonzentration herangezogen werden. Eine große Veränderung
in Bezug auf Calcium ist ersichtlich, wenn sich die Pipette über dem
Rezeptor befindet. Da Calcium den gebräuchlichsten Messenger, der
von der Zelle verwendet wird, darstellt, stellt dies ein allgemeines
Verfahren dar. Das Verfahren bedient sich nicht der Verwendung von
fluoreszierend markierten Antikörpern,
um nachzuweisen, wo sich ein Rezeptor befindet. Antikörper, insbesondere
monoklonale Antikörper,
lassen sich schwer erzeugen und können insofern Schwierigkeiten
bereiten, als sie in der Zelle interniert werden. Weitere Fluoreszenzmarker
können
für andere übliche Messenger
in der Zelle verwendet werden, z. B. cAMP.
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Die
vorliegende Erfindung lässt
sich durch eine Modifikation eines existierenden SICM-Systems erläutern, und
zwar um eine gleichzeitige Erzeugung von SICM- und SNOM-Bildern
von lebenden Herz-Myozytenzellen zu ermöglichen. Um die Eignung einer
derartigen Vorrichtung zu erläutern,
wurden Herz- Myozytenzellen
hauptsächlich
aus zwei Gründen
ausgewählt.
Erstens sind sie aus hellen und dunklen Banden von Materialien/Streifen
zusammengesetzt, die periodisch alle 2,1 μm auftreten, was ihnen ein eindeutiges
Erscheinungsbild verleiht und sie zu einem guten Modellsystem für Untersuchungen macht.
Zweitens (was noch wichtiger ist) stellen sie Herzmuskelkammern
dar, die sich in synchroner Weise zusammenziehen, um die entscheidende
Pumpwirkung zur Zirkulation des Bluts in den restlichen Körper zu
erzeugen. Diese Zellen wurden bisher unter Anwendung von SICM untersucht
(Korchev et al., a.a.O.).
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Die
hier vorgelegten Experimente liefern die ersten Bilder von lebenden
Zellen, die durch optische Raster-Nahfeld-Mikroskopie aufgenommen
worden sind und die zeigen, dass die Raster-Ionenkonduktanzmikroskopie
einen zuverlässigen
Kontrollmechanismus für
die SNOM-Abbildung von lebenden Zellen darstellt. Die Abbildungen
von Kardiomyozyten weisen die weitgehend anerkannten Strukturen
und Abmessungen auf, die beispielsweise mit den Ergebnissen der
Elektronenmikroskopie vergleichbar sind. Im Vergleich dazu besteht
ein wichtiger Vorteil der Erfindung darin, dass die Zellen nicht
fixiert und lebend sind.
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Obgleich
ein einfaches hybrides SICM-SNOM-Instrument sich bereits als leistungsfähiges Untersuchungswerkzeug
eignet, lassen sich unkomplizierte Modifikationen vornehmen, um
dessen Empfindlichkeit und Auflösung
zu verbessern. Zunächst
können
kleinere beschichtete Pipetten sowohl die SICM- als auch SNOM-Auflösung verbessern
und die Stärke
der optischen Signale erhöhen, indem
man die Nahfeld-Sonde näher
an die Probe bringt. Beispielsweise lassen sich hochauflösende SNOM-Sonden
herstellen, indem man eine Mikropipette zur Abbildung in Luft unter
Anwendung von Kraftkontrolle zuspitzt und beschichtet (Harootunian et
al., 1986). Es wurde eine optische Auflösung von weniger als 100 nm
erzielt. Dies bedeutet, dass die Herstellung von Nahfeld-Sonden
mit höherer
Auflösung
für SICM-SNOM
möglich
ist. Unter Verwendung eines Objektivs mit höherer numerischer Apertur zum Sammeln
von Licht lässt
sich eine weitere Verstärkung
des optischen Signals erreichen. Diese Verbesserungen ermöglichen
eine Fluoreszenzabbildung und beschränken Schwierigkeiten in Bezug
auf Photobleichung und Photoschädigung
durch Arbeiten mit einer minimalen Laser-Intensität auf ein Minimum. Die Photoschädigung von
lebenden Zellen erfolgt leichter als die von fixierten Zellen, so
dass eine Verringerung der erforderlichen Laser-Intensität wichtig ist, um mehrfache
Abtastvorgänge
im Laufe der Zeit durchführen
zu können.
Diese Verbesserungen sollten es ermöglichen, gleichzeitig SICM-
und SNOM-Abbildungen von lebenden Zellen mit einer Auflösung, die
besser als 100 nm ist, zu erhalten.
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Insbesondere
ist es durch Verwendung des Ionenstroms zur Steuerung des Abstands
zwischen einer beschichteten Mikropipette und der Probe möglich, gleichzeitig
optische und SICM-Abbildungen zu erhalten. Die optischen Abbildungen
werden im Nahfeld erhalten. Dies scheint somit ein zuverlässiger Weg
zur Durchführung
von SNOM-Abbildungen von lebenden Zellen zu sein. Dies wurde zum
ersten Mal erreicht. Unkomplizierte Verbesserungen des Instruments
sollten eine Fluoreszenzabbildung ermöglichen und eine höhere Auflösung gestatten.
Eine Kombination mit einer Fluoreszenzabbildung kann die bildliche
Darstellung von Rezeptoren und Kanälen an der Oberfläche von
lebenden Zellen und die Verfolgung von Änderungen in Reaktion auf spezifische
Reize ermöglichen.
Das neuartige Verfahren der SICM-SNOM-Abbildung von lebenden Zellen weist
einen breiten Bereich von Anwendungsmöglichkeiten in der Biologie
auf.
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Gemäß einer
bevorzugten Ausführungsform der
Erfindung wird ein frequenzmoduliertes Abtastverfahren für ein Raster-Ionenkonduktanzmikroskop (SICM)
verwendet. Dies kann Mittel zur Vibration einer SICM-Sonde in vertikaler
Richtung (Z) und zur Modulation für eine Feedback-Kontrolle des
Mikroskops umfassen.
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2A und 2B zeigen
in schematischer Weise eine Mikropipette 20 (ferner in
punktierten Umrissen in 2B) in
einem Elektrolyt 21 innerhalb eines Gefäßes 22 mit einer Probe 23 auf
dessen Boden. Elektroden 24 und 25 sind über eine
Schaltung verbunden, die ein Messgerät 26 zur Bereitstellung einer
Feedback-Kontrolle
(durch den Pfeil dargestellt) umfasst. 2C zeigt
den Strom der Spitze als Funktion des Trennabstands von Probe und
Spitze.
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Bei
herkömmlichen
SICM-Mikroskopen wird ein nicht-modulierter Ionenstrom (IDC) (2A und 2C)
verwendet, um die Sondenposition über der Probe zu steuern. In
diesem Fall rufen beliebige Änderungen
im durch die Mikropipettenspitze fließenden Ionenstrom, die nicht
durch Sonden/Proben-Wechselwirkungen hervorgerufen worden sind (Veränderungen
der Ionenkonzentration, Wechselwirkung der Mikropipettenspitze mit
Verunreinigungsteilchen in wässrigen
Lösungen,
Drift des Elektrodenpotentials und dergl.), Artefakte hervor oder
bewirken eine Zerstörung
der Probe und der Mikropipette. Beim frequenzmodulierten Modus des
SICM-Betriebs erzeugt die Bewegung der Mikroskopspitze (ΔZ) einen
modulierten Strom (IMOD). Dieser IMOD wird nur erzeugt, wenn die Sonde die
Probe erfasst, und wird zur Feedback-Kontrolle des Mikroskops verwendet;
vergl. die 2B und 2C (Insert).
Die Feedback-Kontrolle bedient sich beispielsweise hauptsächlich des
frequenzmodulierten Abtastverfahrens, da dieses eine Reihe von zusätzlichen
Vorteilen gegenüber
einem nicht-modulierten Modus bietet: höheres Signal-Rausch-Verhältnis; höhere Stabilität (Fähigkeit
zum Betrieb in einem starken Gradienten des Elektrolyten und mit
hohen IDC-Drift); höhere Abtastgeschwindigkeit;
Erhöhung
der seitlichen Empfindlichkeit.
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Ein
typisches SICM-System umfasst Komponenten, die in allen SPMs auftreten,
nämlich
eine Abtastsonde, piezoelektrisch betätigte Abtastelemente, Steuerelektronik
und einen Rechner. Diese Komponenten können in ein umgekehrtes Mikroskop
ein- oder angebaut werden, z. B. Diaphot 200 (Nikon Corporation,
Tokio, Japan).
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Die
folgenden Beispiele erläutern
die Erfindung. Weitere Nachweise für die Eignung der Erfindung
ergeben sich indirekt aus Lewis et al., Applied Physics Letters,
Bd. 75(17) (1999), S. 2689–2691. Dabei
wird AFM zur Steuerung der Chromätzung
verwendet.
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Beispiel 1
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SICM-Sonden
wurden durch Ausziehen von Borsilicatglas zu Mikrokapillaren mit
einem Außendurchmesser
von 1,0 mm und einem Innendurchmesser von 0,58 mm unter Verwendung
eines Mikropipetten-Ziehgeräts
auf Laser-Basis (Modell P-2000, Sutter Instrument Co., San Rafael,
CA, USA) hergestellt. Damit lassen sich in reproduzierbarer und
einfacher Weise Sonden mit Konuslängen und Spitzendurchmessern
von 200 nm, 400 nm bzw. 1,0 μm
herstellen.
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Eine
dreidimensionale und hochpräzise
Bewegung der Sonde relativ zur Probe wird unter Verwendung einer
piezoelektrischen Translationsstufe (Tritor 100, Piezosystem Jena,
Deutschland), auf der die SICM-Sonde befestigt ist, erreicht. Die
Stufe weist einen Bereich von 100 μm in den x-, y- und z-Richtungen
auf, so dass ein Abtasten über
biologischen Proben mit Merkmalen, die bis zu 30–50 μm reichen, ermöglicht wird.
Die für
die Deformation des piezokeramischen Materials erforderliche hohe Spannung,
die die Bewegung der Bühne
erleichtert, wird durch Hochspannungsverstärker (Piezosystem Jena, Deutschland)
bereitgestellt. Diese Verstärker reagieren
auf entsprechende Signale, die durch die Steuerelektronik erzeugt
werden, um die Piezo-Translationsbühne zu bewegen und die Bewegung
der Spitze relativ zur Probe zu erreichen. Zusätzlich zur Verbindung mit der
Hardware des Mikroskops ist die Steuerelektronik mit einem Rechner
verbunden, der die Sammlung von Daten und die Bildanalyse ermöglicht.
Die Hardware und Software für
die Steuerung und die Sammlung von Daten werden von der Fa. East
Coast Scientific (Cambridge, UK) hergestellt.
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Der
Pipetten-Proben-Trennabstand wird auf einem konstanten Wert gehalten,
indem man den Ionenstrom überwacht,
der zwischen Ag/AgCl-Elektroden in der Mikropipette und der Elektrolytlösung, in die
die Probe getaucht ist, fließt.
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung
(PBS-Lösung)
wird sowohl zum Füllen
der Mikropipette als auch als elektrophysiologisches Medium der
Herz-Myozyten verwendet, so dass sich Konzentrationszellpotentiale
und Flüssigkeitsverbindungspotentiale
nicht einstellen. Der Ionenstrom wird für Gleichstromspannungen von
50 mV, die an die Elektroden angelegt sind, gemessen.
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Er
wird durch einen Hochimpedanz-Betriebsverstärker (OPA 129, Bull Brown International,
USA) verstärkt
und über
einen Widerstand von 108 Ω in ein Spannungssignal
umgewandelt. Das Signal wird sodann in die Steuerelektronik eingegeben,
wo es für die
Feedback-Kontrolle und die Datenermittlung verwendet wird.
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Die
Mikropipette befindet sich in einem speziellen, kundenorientierten
Halter, der mit dem Stromverstärker
und der Piezo-Translationsbühne zur
Aufnahme des SICM-Kopfes zusammengebaut ist. Der SICM-Kopf ist am
Arm des z-Translators des umgekehrten Mikroskops befestigt, der
die grobe vertikale Positionierung der Mikropipette relativ zu der
unmittelbar darunter angeordneten Probe erleichtert. Die Probe ist
in einer Petri-Schale enthalten, die auf der Bühne des Mikroskops angeordnet
ist. Die Bewegung der Probe relativ zur Mikropipette wird durch
die x,y-Translationssteuerung
der Bühne
erreicht. Die Vorgänge
zur Überwachung
der vertikalen Position der Mikropipette relativ zu der Probe und
die Auswahl eines Bereiches der Probe von Interesse kann an einem
TV-Bildschirm über
eine Videokamera (JVC TK-1280E, Viktor Company, Japan) betrachtet werden.
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Es
wurden Modifikationen vorgenommen, um gleichzeitige SICM- und SNOM-Abbildungen zu ermöglichen.
Laser-Licht (Laser 2000 Ltd., UK) mit einer Wellenlänge von
532 nm wurde über
eine multimodale Faser (FG-200-UCR; 3M Specialty Optical Fibers,
West Haven, USA) mit der Mikropipette gekuppelt. Um das Licht der
Apertur zu begrenzen, wurden 100–150 nm Aluminium auf die Wände der
Pipette gedampft. Das gestreute Laser-Licht wurde über ein
x60-Langdistanz-Objektiv
gesammelt und über eine Übertragungsoptik
einer PMT-Vorrichtung (D-104-814,
Photon Technology International, Surbiton, England) zugeführt, um
das optische Signal aufzuzeichnen. Während der Raster-Abtastung
wurde dieses Signal über
ein ADC-Gerät,
das auch die z-Position der Probe aufzeichnete, an einem Daten-Empfangsrechner aufgezeichnet,
um gleichzeitig optische und topographische Abbildungen der Probe unter
Verwendung der Kontroll/Daten-Aufnahme-Hardware und -Software zu
erhalten.
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Myozyten
von erwachsenen Kaninchen wurden unter Verwendung einer Lösung mit
geringem Calciumgehalt (NaCl 120, KCl 5,4, MgSO4 5,
Pyruvat 5, Glucose 20, Taurin 20, HEPES 10 und Nitrotriessigsäure 5 (mmol/Liter)),
die einer vorherigen Sauerstoffbehandlung mit 100 % O2 unterzogen
worden war, und Collagenase- und Protease-Enzymen gemäß den Angaben
von Jones et al., Cardiovasc. Res., Bd. 24 (1990), S. 834–842, isoliert.
Zellen wurden auf einem gläsernen
Deckstreifen in einem Medium mit geringem Calciumgehalt bei Raumtemperatur
abgebildet.
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Optische
und SICM-Abbildungen wurden gleichzeitig aufgezeichnet. Die Aufzeichnung
von einem Satz von Abbildungen dauerte etwa 20 Minuten. Für die Mikropipette
wurde durch Messung des Ionenstroms der Innendurchmesser auf etwa
500 nm geschätzt.
Sie wurde während
der Abbildung etwa 250 nm über
der Oberfläche
gehalten. Der geschätzte
Außendurchmesser
betrug 1 000 nm und umfasste das Glas und die Metallbeschichtung.
Dies bedeutet, dass diese Abbildungen im Nahfeld aufgezeichnet wurden,
und zwar in einem Abstand von weniger als der Wellenlänge des
Lichts von der Probe mit einer Apertur mit einem Durchmesser, der
vergleichbar mit der Wellenlänge
des Lichts war.
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Eine
20 × 20 μm-Abtastung
der Oberfläche eines
lebenden Kaninchen-Herzmyozyten
ergab, dass die sarkomere Struktur klar sowohl in den SICM- als
auch den SNOM-Abbildungen erkennbar war. Die optische Abbildung
wurde offensichtlich nur an der Oberfläche der Zelle erzeugt, wie
bei Anwendung einer Abtastsondentechnik zu erwarten war. In einem
größeren Abtastbereich
ergab sich eine hervorragende Entsprechung zwischen den optischen und
den SICM-Abbildungen.
Die geschätzte
Auflösung
betrug etwa 500 nm.
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Beispiel 2
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Dieses
Beispiel erläutert
erneut die fokale, hochgradig lokalisierte Anwendung von Ionen,
Agonisten oder anderen Mitteln an einer Membran während einer
Abtastung über
die Mikroskop-Mikropipette. Eine Überwachung der elektrischen
Reaktion der Zelle wird mit einer Pflasterklemm-Mikropipette durchgeführt. Diese
Anordnung ist schematisch in 3 dargestellt.
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Im
einzelnen zeigt 3 in schematischer Weise eine
Abtast-Mikropipette 30, deren Spitze sich in der Nähe eines
Ionenkanals 31 in einer Zelle 32 befindet. Eine
Pflasterklemm-Mikropipette 33 gewährleistet eine Aufzeichnung
des Ionenkanalstroms.
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In
diesem Beispiel wird die Verteilung von ATP-geregelten K+-Kanälen
(KATP-Kanälen) im
Ratten-Kardiomyozyten-Sarkolemm untersucht. KATP-Kanäle spielen
eine wichtige Rolle bei der Relaxation und Aufrechterhaltung von
Kardiomyozyten während
metabolischer Stresssituationen, wie Hypoxie oder Ischämie. Über deren
Lokalisierung in der Zellmembran ist sehr wenig bekannt. Die experimentellen
Bedingungen wurden so gewählt,
dass intra- und extrazelluläre
Lösungen
keine K+-Ionen
enthalten, und die intrazelluläre
ATP-Konzentration wurde zur Gewährleistung
einer maximalen Aktivierung von KATP-Kanälen verringert.
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Vor
den Messungen wurde die Zelle perfundiert und intrazelluläres und
extrazelluläres
K+ wurde durch Cs+ bzw.
Na+ ersetzt. Die intrazelluläre Lösung enthielt
kein ATP. Die Zelle wurde auf 0 mV geklemmt. Vor der Kanalkartierung
wurde extrazelluläres
Na+ kurzzeitig durch K+ ersetzt,
um zu gewährleisten,
dass die intrazelluläre
ATP-Konzentration ausreichend nieder war, um einen starken, ATP-regulierten K+-Strom zu beobachten. Unter diesen Bedingungen,
jedoch in Gegenwart von ATP, wird dieser Strom nicht beobachtet.
Die Mikroskop- Mikropipetten-Sonde
enthält
durchgängige
Ionen-K+ (1 M) und liefert beim Abtasten
der Zelloberfläche
K+-Ionen an eine stark lokalisierte Fläche unter
der Mikropipettenspitze. Wenn die K+-Konzentration
in der Nähe
des aktiven Ionenkanals ansteigt, zeichnet die Pflasterklemmen-Mikropipette
einen erhöhten
K+-Strom
auf (4A). Die punktierte Linie gibt den Nullstrom wieder.
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Das
beobachtete Ionenstromprofil ist kugelförmig, wie aus der Verteilung
von K+-Ionen um die Mikropipettenspitze
zu erwarten war. Der Maximalwert des negativen Stroms entspricht
der Position der Abtast-Mikropipettenspitze, wenn sie sich genau über dem
Ionenkanal befindet und ist proportional zur K+-Konzentration
in der Mikropipette. Dieser Stromwert stimmt eng mit der Amplitude
eines einzelnen KATP-Kanalstroms überein,
der in unter ähnlichen
ionischen Bedingungen untersuchten äußeren Pflastern beobachtet
wurde (4B), wo die K+-Konzentration der
Konzentration entspricht, die durch die Abtast-Mikropipette bereitgestellt
wird.
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Diese
Vorgehensweisen ermöglichen
den gleichzeitigen Erhalt von zwei Abbildungen (dargestellt als
einzelne Profile quer über
eine Herzmyozyten-Oberfläche, 4C + 4D).
Eine Abbildung stellt die topographische Abbildung der Zelloberfläche dar
(4C). Bei der anderen Abbildung handelt es sich
um eine "Ionenstrom"-Abbildung (4D), wobei
jeder Punkt dem Wert des Ionenstroms, der durch die Pflasterklemmen-Pipette
gemessen worden ist, entspricht. Dieser Wert wird unter Verwendung
der Koordinaten der Mikroskop-Mikropipettenspitze an der Zelloberfläche zum
Zeitpunkt der Messung aufgetragen. Zwei direkt nach unten gerichtete Strompeaks,
die den Positionen der einzelnen Ionenkanäle entsprechen, sind in 4D klar
sichtbar. Die senkrechten Pfeile geben deren Positionen an der Herzmyozyten-Oberfläche an (4C).
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Aktive
Ionenkanäle
befinden sich zeitweise in geschlossenem Zustand und können während einer
kurzen Messperiode leicht unentdeckt bleiben. Um die Wahrscheinlichkeit
des Nachweises eines einzelnen Kanals zu erhöhen, wurde der Strom während mehrerer
Profilaufzeichnungen der Abtastung durch den gleichen einzelnen
Kanal aufgenommen.
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Eine
Analyse einer großen
Anzahl von Stromabbildungen ergab, dass die KATP-Kanäle ungleichmäßig verteilt
sind und sich in lokalisierten Regionen des Herzmyozyten-Sarkolemm
konzentrieren. Jede dieser Regionen oder "Cluster" sind durch Abstände von 2–6 μm voneinander getrennt und enthalten
bis zu 10 aktive Ionenkanäle.
Die Ionenkanäle innerhalb
der "Cluster" weisen einen Abstand
von 0,2–1 μm auf. Die
KATP-Kanäle
konnten an den gleichen Positionen im Sarkolemm während relativ
langer Beobachtungsperioden (mehr als 40 min) aufgezeichnet werden.
Ferner wurden die aktiven KATP-Kanäle nur in
den "Bogen"-artigen Regionen
des Sarkolemm beobachtet und nicht in den übrigen Teilen der Plasmamembran
(z. B. in den Regionen von zellulären Kontakten). Dies lässt darauf
schließen,
dass die KATP-Kanäle in spezifischen Regionen
des Sarkolemm vermutlich durch das Zytogerüst verankert sind und eine
sehr geringe seitliche Mobilität
aufweisen. Diese direkte Beobachtung steht in guter Übereinstimmung
mit veröffentlichten
Ergebnissen, die darauf hinweisen, dass eine gewisse Verknüpfung zwischen
dem F-Actin-Zytogerüst
und den KATP-Kanälen besteht; vergl. Yokoshiki
et al., Pflugers Arch., 434–203
(1997).
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Diese
Technik kann zur Untersuchung der Verteilung von anderen Typen von
Ionenkanälen
in Kardiomyozyten herangezogen werden. Ferner ist diese Vorgehensweise
allgemein bei der Untersuchung der funktionellen Lokalisierung von
Ionenkanälen
in intakten Zellmembranen unterschiedlicher Zelltypen anwendbar.