KR102011496B1 - 자성입자를 이용한 핵산 정제용 멀티-웰 자성입자 파이펫터 - Google Patents

자성입자를 이용한 핵산 정제용 멀티-웰 자성입자 파이펫터 Download PDF

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Abstract

본 발명은 8개에서 96개의 자성체를 포함하는 파이펫 형태의 자성입자 분리장치에 관한 것이다. 상기와 같은 본 발명에 따르면, 8-스트립 PCR 튜브(8-strip PCR tube) 또는 96 웰 PCR 플레이트 (96-well PCR plate)를 탈 부착 하여, 자성체와 자성입자가 직접적으로 결합을 방지하도록 제작된 파이펫 형태의 자성입자 분리장치 이다. 상기 자성입자 분리장치를 이용하여, 8개에서 96개의 시료로부터 핵산 및 단백질을 자성입자를 이용하여 동시에 분리 정제할 수 있어 대량의 시료에서 효과적으로 유전체 물질을 매우 용이하게 분리 정제할 수 있다.

Description

자성입자를 이용한 핵산 정제용 멀티-웰 자성입자 파이펫터{multi-well magnetic bead pipettor for nucleic acids purification by using magnetic nanoparticle}
본 발명은 자성입자를 이용한 핵산 정제용 멀티-웰 자성입자 파이펫터에 관한 것이다.
자성입자를 이용한 시료의 정제의 목적은 다량의 시료를 효율적인 고속 처리 (high throughput)방법에 있으며, 핵산 및 단백질 정제, 시료 농축 및 검출등 다양한 분야에 많이 이용되고 있다. 대부분의 자성입자를 이용한 핵산 정제에서 적은 수량의 시료에 대해서는 Thermo fisher사의 DynaMag™-2 Magnet과 Qiagne 사의 12-Tube Magnet과 같은 magnetic stand 형태의 제품으을 이용하여 핵산정제를 수행하고 있으며, 대량의 시료에 대해서는 Thermo fisher사의 MagMAX™ Express Particle Processor 장비, KingFisher Purification System 자동화 장비, 또는 Promega 사의 maxwell® 16 series, Biomek® FX series등과 같은 고가의 자동화 장비를 이용한 정제 방법 등을 제공하고 있다.
한편, 대한민국 등록특허 제10-1655233호 (발명의명칭: 멀티 타입의 자성 입자 분리 스탠드)에서 개시하고 있는 자성입자 분리장치의 경우, 고속 처리 (high throughput)방법으로 핵산 및 단백질 정제작업에 제한이 있다. 이와 같이 현재 개발된 자성입자 분리장치는 대부분 스탠드 형태로 제공되고 있어 대량 처리에 한계를 가지며, 자동화 장비를 이용한 분리장치는 가격적인 부담뿐만 아니라, 현장진단과 같이 운반이 용이하고 비전력(非電力) 상태의 핵산 검출이 요구되어 부피, 무게 및 전력공급과 같은 제약을 가진다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 종래의 자성입자 분리 과정에 대량처리공정에 대한 한계를 개선하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 8 채널에서 96채널을 가지는 파이펫 성입자 분리 장치인 멀티 웰 (multi well) 자성입자 파이펫터(multi well magnetic bead pipettor)을 개발하여 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 멀티웰 자성입자 파이펫터(multi-well magnetic bead pipettor)를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 구성을 포함하며, 자성입자(magnetic bead)를 이용하여 멀티웰(multi-well) 플레이트로부터 핵산 또는 단백질을 추출하는 멀티웰 자성입자 파이펫터(multi-well magnetic bead pipettor)를 제공한다:
(a) 상판(300)과 결합가능하고, 하판 조작 스위치 (120) 및 하판 조작 스프링(130)을 포함하며, 상기 하판 조작 스위치 (120) 및 하판 조작 스프링을 이용하여 하판(200)의 상하이동을 조작하는 손잡이 부분(H);
(b) 손잡이 부분(H) 및 하판 (200)의 상부와 결합가능한 상판 (300);
(c) 상판 (300)의 하부 및 자성체 고정봉(400)의 상부와 결합가능한 하판 (200); 및
(d) 하판의 하부와 결합가능하고, (i) 복수 개의 자성체(100), 및 (ii) 상기 자성체(100)가 결합되는 복수 개의 자성체 고정봉(500) 을 포함하는 파이펫 팁 부분(I);
을 포함하는 피펫(pipette) 형태의 자성입자 분리장치로서,
상기 자성체 고정봉(500)은 하단에 튜브 홈 마찰부(520)를 포함하고, 상기 튜브 홈 마찰부(520)에는 8-스트립 PCR 튜브(8-strip PCR tube) 또는 96 웰 PCR 플레이트 (96-well PCR plate)가 부착 및 탈착 가능하다.
본 발명은 손잡이부분(H), 상판(300), 하판(200) 파이펫 팁부분(I)로 이루어진 파이펫 형태의 자성입자 분리장치이다. 본 발명에서 손잡이 부분(H)은 상판(300)과 결합되며, 손잡이 내부의 하판조작 스프링(130)과 연동되는 하판조작 스위치(120)를 이용하여 하판을 상하로 움직일 수 있으며, 이에 따라 파이펫 팁 부분(I)의 자성체 고정봉(500) 하부에 위치하는 튜브홀 마찰부(520)와 마찰력에 의해 결합된 PCR 튜브 및 플레이트를 분리시킬 수 있도록 고안되었다. 자성체 고정봉의 튜브홀 마찰부 자성체 고정홈(510)에 자성체(100)가 결합된다. PCR 튜브 및 플레이트를 장착 후 자성입자와 결합되도록 하여, PCR 튜브 및 플레이트 외벽에 자성입자가 결합되며, 하판 조작 스위치를 이용하여 PCR 튜브 및 플레이트가 탈착될 경우 외벽에 붙어있던 자성입자는 분리된다. 본 발병은 자성입자의 부착 및 분리를 이용한 파이펫 형태의 자성입자 분리장치로서, 자성입자(magnetic bead)를 이용하여 멀티웰(multi-well) 플레이트로부터 핵산 또는 단백질을 추출하는 멀티웰 자성입자 파이펫터(multi-well magnetic bead pipettor)를 제공한다.
본 발명자들은 종래의 자성입자 분리 과정에 대량처리공정에 대한 한계를 개선하고자 예의 연구 노력한 결과, 본 발명자들은 8개에서96개의 유도자석 고정부를 가지는 피펫형태의 자성입자 분리 장치인 멀티 웰 (multi-well) 자성입자 파이펫터(multi- well magnetic bead pipettor)을 개발하였다.
이하, 본 발명의 구성에 대하여 상세히 설명한다:
구성 (a): 손잡이 부분(H)
손잡이 부분(H)은 막대 형상으로서 예컨대 원기둥 또는 사각기둥 형상일 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 손잡이 부분(H)은 상판(300)과 결합가능하다. 손잡이 부분은 구체적으로 지지관(110), 하판 조작 스위치(120), 하판 조작 스프링(130) 및 지지관 고정부(140)로 구성된다(도 1. 참조) 손잡이 부분은 지지관 고정부(140)를 통하여 상판에 고정될 수 있으며, 지지관 고정부(140)는 고정나사 (T1)로 상판에 고정된다(도 3 참조). 상기 하판 조작 스위치 (120) 및 하판 조작 스프링을 이용하여 하판(200)의 상하이동을 조작한다.
고정캡(1)은 하판 조작 스위치 고정 캡이고, 플라스틱, 철재, 스테인리스, 알루미늄 등의 재질로 이루어질 수 있다.
손잡이 부분에서 지지관(100)의 재질은 플라스틱, 철재, 스테인리스, 알루미늄일 수 있고, 바람직하게는 알루미늄 재질로 이루어지는 것일 수 있다.
구성 (b): 상판(300)
상판(300)은 손잡이 부분(H) 및 하판을 고정 및 연결하는 지지체 역할을 한다. 상판에는 상술한 지지관 고정부(140) 및 고정나사 (T1)가 결합될 수 있도록 고정나사 (T1) 결합 홈(t1)이 형성되어 있으며, 하판이 결합될 수 있도록 고정나사 (T2) 결합 홈(t2/220)이 형성되어 있다(도 3 및 도 5 참조).
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 상판(300) 및 하판(200)은 평행하게 구비되는 것을 특징으로 하며, 상판은 손잡이 부분(H)의 하부 및 하판 (200)의 상부와 결합가능하다.
한편, 상판에는 상판과 하판이 결합될 수 있도록 고정나사 (T2) 결합 홈(t2/220)이 형성되어 있다(도 3 및 도 5 참조).
본 발명의 멀티웰 자성입자 파이펫터는 상기 구성 이외에, 상판(300)과 하판(200) 사이에 위치하고, 상기 하판에 부착가능하며, 복수 개의 자성체 고정봉이 배열 및 결합되는 파이펫 팁 고정판 (400)을 추가적으로 포함할 수 있다. 파이펫 팁 고정판 (400)은 고정나사 (T3)를 통하여 하판에 고정될 수 있다(도 5 참조). 파이펫 팁 고정판에는 고정나사 (T3)를 통하여 자성체를 결합시킬 수 있는 파이펫 팁 고정 홈(410)이 형성되어 있다(도 5a 참조).
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 파이펫 팁 고정판 (400)은 상판에 장착된 막대자석(3)에 자기적으로 탈부착가능하다
본 발명에서 상판은 전체적으로 플레이트 형상이지만, 2열의 PCR 튜브가 결합되는 파이펫터인 경우, 도 1에서와 같이 H 형상으로 제작될 수 있다.
구성 (c): 하판(200)
하판(200)은 파이펫 팁 부분(I)을 고정하는 부분으로서, 상판 (300)의 하부, 및 파이펫 팁 부분(I) 중 자성체 고정봉(500)의 상부와 결합가능하다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 하판(200)은 자성체 고정봉(500)이 결합할 수 있도록 자성체 고정봉 통과 홈(210)이 형성된다. 자성체 고정봉(500)은 고정나사 (T3)를 통하여 하판에 직접적으로 결합될 수 있다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 하판(200)은 파이펫 팁 고정판 (400)을 이용하여 자성체 고정봉(500)과 결합될 수 있다. 이 경우, 자성체 고정봉(500)에는 고정나사 (T3)가 결합될 수 있도록 고정나사 (T3) 결합 홈(t3)이 형성되어 있다. 파이펫 팁 고정판 (400)에 자성체 고정봉(500)이 결합된 상태로, 자성체 고정봉 통과 홈(210)을 통하여 하판에 장착된다(도 5 참조).
구성 (d): 파이펫 팁 부분(I)
파이펫 팁 부분(I)은 (i) 복수 개의 자성체(100), 및 (ii) 상기 자성체(100)가 결합되는 복수 개의 자성체 고정봉(500)을 포함한다.
본 발명에서 자성체(100)는 복수 개일 수 있으며, 예컨대, 8개 내지 100개 또는 8개 내지 96개 일 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 자성체(100)는 유도자석이다.
본 발명에서 자성체 고정봉(500)은 복수 개일 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 자성체 고정봉(500)의 개수는 8개 (1열) 내지 96개 (12열); 또는 12개(1행) 내지 96개 (8 행)이다. 예컨대, 자성체 고정봉의 개수를 1열만을 장착하여 8개의 자성입자 분리에 유도될 수 있으며; 2개 열을 장착하여 16개의 자성입자 분리장치에 유도될 수 있으며; 1개 행의 자성체 고정봉을 장착하여 12개의 자성입자 분리 장치에 유도될 수 있으며; 2개 행의 자성체 고정봉을 장착하여 24개의 자성입자 분리 장치에 유도될 수 있어; 1개부터 96개의 자성체 고정봉의 개수에 따라 변형이 가능하다.
본 발명에서 자성체(100) 및 자성체 고정봉(500)은 기둥 형상으로서, 원기둥 또는 다각형 기둥형상일 수 있다. 자성체 고정봉(500)의 하단에는 자성체가 결합 가능한 자성체 고정 홈(510)이 형성되어 있다.
한편, 자성체 고정봉(500)의 하단은 PCR 튜브가 끼움 결합될 수 있도록 튜브 홀 마찰부(520)가 형성되어 있으며, 자성체 고정봉 상단부 보다 작은 직경으로 이루어져 있다. 본 발명에서 자성체 고정봉(500) 하단의 튜브홀 마찰부(520)는 8-스트립 또는 12-스트립 PCR튜브(8 strip or 12 strip PCR tube)나 96웰 PCR 플레이트 (96 well PCR plate)와 마찰력에 의해 부착(끼움결합)되도록 고안되었다. 자성체 고정봉(500) 하단의 튜브홀 마찰부(520)는 금형가공에 의해 제작되며, 8-스트립/12-스트립 PCR튜브의 내부, 또는 96웰/튜브 플레이트의 웰/튜브 내부와 끼움 결합된다.
본 발명에서 마그네틱 파이펫터의 파이펫 팁 부분(I)의 자성체 고정봉의 길이, 형태 크기, 개수는 한정되지 않으며, 정제 시료의 용기 형태와 정제 방식에 따라 달리 고안하여 사용될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 8-스트립 또는 12-스트립 PCR튜브(8 strip or 12 strip PCR tube)를 이용하여 다량의 시료에 대해 핵산을 추출할 수 있도록 하기 위하여, 하판(200)에 8개 또는 12개 기둥형태의 자성체 고정봉(500)을 2열 형태로 결합하였으며, 자성체 고정봉에는 자성체(100)가 결합되는 자성체 고정 홈(510)을 두어 자성체와 결합시켰다(도 5 참조).
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 기존 96웰 (96- well) 형태의 플레이트에서 다량의 시료에 대해 핵산을 추출할 수 있도록 하기 위하여, 상판 (300)에 96개 기둥형태의 자성체 고정봉(500)을 8행 12열 형태로 결합하였으며, 자성체 고정봉에는 자성체(100)가 결합되는 자성체 고정 홈(510)을 두어 자성체와 결합시켰다.
특히, 시료의 정제 과정에서 자성체와 자성입자가 흡착및 탈착 할 수 있도록하기 위하여 96웰 PCR 플레이트를 자성체 고정봉에 장착 및 탈착할 수 있도록 고안되었다. 이에 자성체 고정봉에 있는 튜브 홀 마찰부(520)의 마찰력을 이용하여 96웰 PCR 플레이트가 하판의 아래에 장착될 수 있게 고안되었으며, 하판조작 스위치(120)을 이용하여 하판(200)을 아래로 밀어내어 96웰 PCR 플레이트를 탈착시킬 수 있다(도 11 참조). 즉, 본 발명의 파이펫터는 상기 하판 조작 스위치를 이용하여, 8-스트립 PCR 튜브 (8-strip PCR tube) 또는 96 웰 PCR 플레이트 (96-well PCR plate)를 탈착할 수 있다.
본 발명의 멀티 웰 자성입자의 파이펫터에서 시료의 개수와 핵산 및 단백질의 정제 방식에 따라, 96웰 형태의 경우 자성체 고정봉(500)의 배열이 다음과 같이 세분화 될 수 있다.
8열 x 1행 = 8개 자성체 고정봉,
8열 x 2행 = 16개 자성체 고정봉,
8열 x 3행 = 24개 자성체 고정봉,
8열 x 4행 = 32개 자성체 고정봉,
…
8열 x 11행 = 88개 자성체 고정봉,
8열 x 12행 = 96개 자성체 고정봉.
또는
12열 x 1행 = 12개 자성체 고정봉,
12열 x 2행 = 24개 자성체 고정봉,
12열 x 3행 = 36개 자성체 고정봉,
12열 x 4행 = 48개 자성체 고정봉,
...
12열 x 7행 = 84개 자성체 고정봉,
12열 x 8행 = 96개 자성체 고정봉.
96웰 형태의 경우 자성체 고정봉의 배열 및 형태는 상기와 같이 배열될 수 있고, 자성체와 자성입자 결합을 8-스트립 PCR 튜브, 12-스트립 PCR 튜브, 96 웰 PCR 플레이트를 이용하여 직접 결합을 못하게 마스킹(masking) 하고있으나, 금형을 이용하여 여러 형태로 마스킹 튜브를 제작할 경우 자성체 고정봉의 크기, 길이 배열형태가 96웰 형태에 한정되지 않는다.
자성체 고정봉의 배열을 결정하는 파이펫 팁 부분(I)은, (i) 상판에 장착된 “막대자석(3)”과 (ii) 자성체 고정 봉(500)을 하판(200) 또는 파이펫 팁 고정 판(400)에 고정하는 “고정나사 (T3)”가 자기적으로 부착 및 탈착 가능하도록 제작될 수 있다(도 4 및 도 5 참조). 즉, 상기 파이펫 팁 부분(I)은 상판(300)에 장착된 막대자석의 자기력에 의해 상판에 탈착 및 부착이 가능하다
본 발명에 따른 도 10의 자성입자 파이펫터는 96개의 자성체 고정봉(500)에 자성체(100)를 장착시킨 멀티 피펫 형태의 자성입자 분리장치로, 96 웰 플레이트에 접합할 수 있는 튜브 홀 마찰부(520)를 포함하고 있으며, 플레이트를 탈착할 수 있는 하판(200), 하판을 움직이는 스위치(120), 스위치 복원 스프링 (130), 스위치와 스프링을 지지하는 지지관 (110), 지지관과 상판을 고정하는 지지관 고정부(140)와 고정나사 (T1, T2)으로 이루어진 파이펫 형태의 자성입자 분리장치이다. 지지관 고정부는 링(ring) 형상으로서, 고정나사홈(t1)이 형성되어 있다. 도 10의 자성입자 파이펫터 구성의 기본적인 결합관계는 도 3의 파이펫터와 동일하다.
본 발명에서 멀티 웰 자성입자 파이펫터의 구성부분인 손잡이부분(H), 상판(300), 하판(200) 및 파이펫 팁부분(I)의 재질은 플라스틱, 금속 (예컨대 철재, 스테인리스, 알루미늄 등)일 수 있고, 바람직하게는 알루미늄 재질로 이루어지는 것일 수 있다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명은 핵산 또는 단백질을 추출하는 멀티웰 자성입자 파이펫터(multi-well magnetic bead pipettor)에 관한 것이다.
(b) 본 발명의 파이펫터는 멀티웰 플레이트(예컨대, 96 웰 플레이트) 및 자성입자와 간접적으로 결합하는 복수 개의 자성체/자성체 고정봉을 이용하여 시료로부터 핵산 또는 단백질을 분리하는 장치이다.
(c) 본 발명의 장치는 기존 고가의 장비 및 기기를 대체하여 대량 시료에서 핵산 정제 및 분석에 매우 용이하게 수행 할 수 있을 뿐만 아니라, 다양한 시료의 형태에 따라서 조성변경이 용이하고 공간 및 전력적 한계가 있는 현장진단용에 효율적으로 이용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 멀티 웰 (multi-well) 자성입자 파이펫터(multi-well magnetic bead pipettor)중 16 채널 (16-channel) 형태의 완성도 이다.
도 2는 본 발명의 멀티 웰 (multi-well) 자성입자 파이펫터(multi-well magnetic bead pipettor)의 구성도 이다.
도 3은 본 발명의 멀티 웰 (multi-well) 자성입자 파이펫터(multi-well magnetic bead pipettor)의 개괄 분해도면 이다.
도 4는 본 발명의 멀티 웰 (multi-well) 자성입자 파이펫터(multi-well magnetic bead pipettor) 상판(300)의 상세 분해도면이다. 본 발명의 멀티 웰 자성입자의 파이펫터에서 자성체 고정봉의 배열 형태를 결정하는 파이펫 팁 부분(I)은, (i) 상판에 장착된 “막대자석(3)”과 (ii) 자성체 고정 봉(500)을 파이펫 팁 고정 판(400)에 고정하는 “고정나사 (T3)”가 자기적으로 부착 및 탈착 가능하도록 제작될 수 있다(도 4 및 도 5 참조). 파이펫 팁 고정 판(400)은 파이펫 팁 결합 홈(320)에 결합될 수 있다. 이 때, 파이펫 팁 고정 판(400)에 결합된 고정나사 (T3)와 상판의 막대자석이 자기적으로 탈착된다.
도 5(a)는 본 발명의 멀티 웰 (multi-well) 자성입자 파이펫터(multi-well magnetic bead pipettor) 파이펫 팁부분 (I)의 상세 분해도면이며, 도5(b)는 파이펫 팁부분 (I)부분과 하판(200)과의 조립도 이다.
도 6는 본 발명의 멀티 웰 (multi-well) 자성입자 파이펫터(multi-well magnetic bead pipettor)중 16 채널 (16-channel) 형태의 자성입자 파이펫터에 8-스트립 PCR 튜브를 장착[도 6(a)] 및 탈착[도 6(b)]을 나타낸 모식도이다.
도 7은 본 발명의 멀티 웰 (multi-well) 자성입자 파이펫터(multi-well magnetic bead pipettor)중 16 채널 (16-channel) 형태 자성입자 파이펫터를 이용하여 96 딥 웰 플레이트 (96-deep well plate) 상에서 16가지의 시료를 정제하는 모식도를 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명의 16 채널 (16-channel) 형태 자성입자 파이펫터를 이용하여 96 딥 웰 플레이트 (96-deep well plate) 상에서 PCR 산물을 정제한 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 본 발명의 16 채널 (16-channel) 형태 자성입자 파이펫터를 이용하여 96 딥 웰 플레이트 (96-deep well plate) 상에서 박테리아 게놈 DNA (bacterial genomic DNA)을 정제한 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 본 발명의 멀티 웰 (multi-well) 자성입자 파이펫터(multi-well magnetic bead pipettor)중 96 채널 (96-channel) 형태의 자성입자 파이펫터 완성도 이다.
도 11은 본 발명의 96 채널 (96-channel) 형태의 자성입자 파이펫터 96웰 PCR 플레이트와 장착 및 탈착된 모식도 이다.
도 12는 본 발명의 96 채널 (96-channel) 형태의 자성입자 파이펫터를 이용한 PCR 산물 정제과정에 대한 모식도 이다.
도 13은 PCR 산물 정제 결과에 대한 실시예를 나타낸 것이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명하다.
실시예
[도 1] 및 [도 2]는 본 발명의 실시예에 따른 멀티 웰 (multi-well) 자성입자 파이펫터 완성도와 구성도이고, [도 3]은 본 발명의 멀티 웰 (multi-well) 자성입자 파이펫터의 총괄적인 분해도를 나타낸다.
도 1, 2 및 3을 참조하면, 본 발명의 멀티 웰 자성입자 분리 피펫은 멀티웰 플레이트에서 다량의 시료에 대해 핵산을 추출을 목적으로, 상판 (300)에 8개에서96개 의 기둥형태의 자성체 고정봉(500)을 8행 X 12열 형태로 결합하였으며, 자성체 고정봉에는 자성체(100)가 결합되는 자성체 고정 홈(510)을 두어 자성체와 결합시켜 두었다. 자성체 고정봉은 원통형의 알루미늄 재질이며, 자성체는 상용화 된2∮x6mm의 원통형 네오디움 자석 [구입처 : 대화공단 대전자석]을 사용하였다.
시료의 정제 과정에서 자성체와 자성입자가 수시로 흡착 탈착 되도록 하기 위하여 자성체(100)과 자성입자가 직접적으로 결합하지 못하도록 하기 위하여 파이펫터의 형태에 따라 8-스트립 PCR 튜브 (8-strip PCR tube) 또는96웰 PCR 플레이트를 이용하였으며, PCR 튜브 또는 PCR 플레이트와 결합된 형태에서 자성입자와 결합되도록 고안되었다. 멀티웰 자성입차 파이펫터와 플레이트의 부착은 추가적인 고정장치 없이 자성체 고정봉(500)을 튜브 내부에 맞게 가공한 부분인 튜브홀 마찰부(520) 부위와 마찰력에 의해 결합되는 형태로 고안되었다.
플레이트의 탈착은 하판조작 스위치(120)와 스위치 복원 스프링(130)을 이용하여 하판(200)을 아래로 밀어내어 튜브홀 마찰부(520)에 결합된 PCR 튜브 또는 PCR 플레이트를 분리시키는 과정으로 이루어진다. 즉 96웰 PCR 플레이트를 해리시키면 자성체와 자성입자가 분리되는 형태의 멀티 피펫 형태이다.
멀티 웰 자성입자의 파이펫터에서 자성체 고정봉의 형태를 결정하는 파이펫 팁 부분(I)은 상판에 결합된 막대자석 (3)과 자성체 고정 봉(500)을 파이펫 팁 고정 판(400)에 고정하는 고정나사 (T3)와 자기적으로 부착 및 탈착 가능하도록 제작되는 것을 특징으로 하며, 상판의 분해도와 파이펫 팁부분의 분해도를 [도 4]와 [도 5]에 나타내었다.
[도 6]은 멀티 웰 자성입자의 파이펫터중 16 채널 (16-channel)형태의 자성입자 파이펫터 형태의 대표도를 나타내며, 8 열 PCR 튜브와 장착 및 탈착 형태를 나타낸 도면이다.
[도 7]은 16 채널 (16-channel)형태의 자성입자 파이펫터를 이용하여 96 딥 웰 플레이트 (96-deep well plate)상에서 PCR 산물 정제과정에 대한 모식도이다. 자세하게는 16 채널 (16-channel) 자성입자 파이펫터의 파이펫 팁 위치는, 96웰 플레이트 상의 12열 중에서 1열과 7열에 위치하는 것을 이상적으로 하며, 이를 이용한 핵산의 정제과정을 상술하면 다음과 같다.
우선적으로 96 딥 웰 플레이트의 용액 아래와 같이 구성한다.
1열 및 7열 : 결합 버퍼 (binding buffer, B)
2열 및 8열 : 세척 버퍼 1번 (washing buffer, W1)
3열 및 9열: 세척 버퍼 2번 (washing buffer, W2)
4열 및 10열 : 세척 버퍼 3번 (washing buffer, W3)
5열 및 11열 : 용출 버퍼(elution buffer, E)
6열 및 12열: Blank
상기와 같이 96 딥 웰 플레이트에 용액을 준비한 후 핵산을 정제하는 과정은 다음과 같다:
1. 1열에 증폭된 PCR 산물과 자성입자를 혼합 하여 자성 입자에 핵산을 결합 시키는 단계
2. 16 채널 (16-channel)형태의 자성입자 파이펫터에 8-스트립 PCR 튜브를 장착 후 파이펫 팁 부분이 1열과 7열에 놓이게 하여 자성입자를 부착하는 단계
3. 자성입자 파이펫터에 부착된 자성입자를 2열 및 8열로 옮긴 다음 파이펫터의 하판 분리 스위치를 이용하여 8-스트립 PCR 튜브를 분리 시켜 자성입자가 2열 및 8열에 존재하는 세척 버퍼 1(washing bffer1) 용액에 분산 시키는 단계 (1분간 방치)
4. 세척버퍼 1에 분산된 자성입자를 자성입자 파이펫터를 8-스트립 PCR 튜브에 다시 장착하여 자성입자를 팁 부분에 모으는 단계 (1분간 방치)
5. 4번 과정에서 모인 자성입자는 파이펫터 팁을 3열과 9열로 이동시킨 후, 3번 과정과 같이 세척버퍼 2에 분산 및 4번 과정에서와 같이 모으는 단계
6. 5번 과정에서 모인 자성입자는 파이펫터 팁을 4열과 10열로 이동시킨 후, 3번 과정과 같이 세척버퍼 2에 분산 및 4번 과정에서와 같이 모으는 단계
7. 6번 과정에서 모인 자성입자를 상온에서 5분간 두어 용액을 증발시키는 단계
8. 7번과정에서 파이펫터에 부착된 말려진 자성입자를 5열과 10열로 옮겨 8-스트립 PCR 튜브를 분리시켜 용출 버퍼에 분산시켜 5분간 방치 후 다시 자성입자만 모으는 단계
로 구성될 수 있다.
상기 과정을 이용한 PCR 산물을 정제하기 위하여 (주)바이오팩트사의 HiGene™ PCR Purification Kit(Magnetic Bead Type) 를 이용하여 [도 7]에서 도식화 한 바와 같이 PCR 산물을 정제 수행하였다. PCR 산물을 정제를 수행하기 위하여, 대장균 균주인 DH5α 균주로 부터 미생물 동정에 이용되는 16S ribosomal DNA(16S rDNA) 증폭용 프라이머 (primer) 인 27F ( 5' - agagtttgatcctggctcag - 3') 프라이머 와 1492R ( 5' - tacggytaccttgttacgactt - 3') 프라이머를 이용하여 1275 bp의 PCR 산물을 얻었으며, (주)바이오팩트사의 HiGene™ PCR Purification Kit(Magnetic Bead Type)의 용액을 96 딥-웰 플레이트에 다음과 같이 분주하였다.
1열 및 7열 : 250ul 결합 버퍼 (binding buffer)
2열 및 8열 : 700ul 세척 버퍼 1(washing buffer)
3열 및 9열 : 700ul 세척 버퍼 1(washing buffer) - 2열 및 8열과 동일 용액 사용
4열 및 10열 : 700ul 세척 버퍼 2(washing buffer 2) - 100% 에탄올 사용
5열 및 11열 : 50ul 용출 버퍼 (elution buffer)
6열 및 12열: Blank
[도 8]은 대장균 균주인 DH5α 균주로부터 증폭된 상기 16S rDNA PCR 산물 50ul와 (주)바이오팩트사의 HiGene™ PCR Purification Kit(Magnetic Bead Type)에 포함된 자성입자 20ul를 1열 및 7열에 넣어 결합버퍼와 혼합한 다음, 16 채널 (16-channel)형태의 자성입자 파이펫터를 이용하여 위 과정에서 준비된 96 딥-웰 플레이트상에서 핵산을 정제 후 전기영동한 결과이다. 2열과 3열 또는 8열과 9열에 동일한 세척버퍼를 사용하여 같은 과정을 반복하는 것은 핵산 정제시 순도를 높이는 통상적인 방법이며, 4열과 10열의 세척 버퍼로 100% 에탄올을 사용한 것은 자성입자 표면상에 남아있는 에탄올을 빠르게 증발 시키기 위함이다.
상기 과정을 이용한 박테리아 게놈 DNA (bacterial genomic DNA)를 추출하기 위하여 (주)바이오팩트사의 多Bead™ Genomic DNA Pre Kit (Bacterium, cultured cell)를 이용하여 [도 7]에서 도식화 한 바와 같이 키트상의 용액을 96 딥-웰 플레이트에 웰(well) 당 다음과 같이 분주한 후 핵산 정제를 수행하였다.
1열 및 7열 : 600 μl 용해 및 결합 버퍼 (lysis and binding buffer) -> 키트상의 MC1(-)버퍼 200 μl, MC2버퍼 200 μl, 이소프로판올 200 μl을 혼합
2열 및 8열 : 700ul 세척 버퍼 1(washing buffer) -> 키트상의 MPW2 버퍼 700 μl
3열 및 9열 : 700 μl 세척 버퍼 1(washing buffer) -> 키트상의 MPW2 버퍼 700 μl
4열 및 10열 : 700 μl 세척 버퍼 2(washing buffer 2) - 100% 에탄올 사용
5열 및 11열 : 100 μl 용출 버퍼 (elution buffer)
[도 9]는 DH5α 균주를 LB 배양액에 16시간 배양 후 배양액 200ul를 용해 및 결합버퍼(lysis and binding buffer)가 있는 1열과 7열에 넣어 버퍼와 혼합한 후 16 채널 (16-channel)형태의 자성입자 파이펫터를 이용하여 박테리아 게놈 DNA를 정제한 다음 전기영동한 결과이다.
상기 형태에서는 20개 이하의 소량의 시료로부터 96 딥-웰 플레이트 상에서 멀티웰 자성입자 파이펫터를 이용한 핵산 정제과정을 나타낸 것이다. 본 발명에서는 멀티웰 자성입자 파이펫터는 대량의 시료에서도 핵산 및 단백질 정제에 적용 가능하며, 실예로 [도 10]과 같이 96 채널 (96-channel) 형태의 자성입자 파이펫터를 이용하여 다량의 시료로부터 핵산 및 단백질 정제가 가능하다. 상기 언급한 16채널 (16-channel) 형태의 자성입자 파이펫터의 경우 8-스트립 PCR 튜브 (8-striip PCR tube)를 이용하여 자성입자 파이펫터와 자성입자간의 결합 및 해리를 유도할 수 있는 바와 같이, 96 채널 (96-channel) 형태의 자성입자 파이펫터 또한 96웰 PCR 플레이트를 탈착 및 부착을 이용하여 자성입자와 파이펫터 간의 결합 및 해리를 유도할 수 있다. [도 11]
다량의 시료로부터 핵산을 정제하기 위하여 다음과 같은 형태의 용액준비가 필요하다.
1 번 플레이트 : 결합 버퍼(binding buffer)
2번 플레이트 : 세척 버퍼1 (washing buffer 1)
3번 플레이트 : 세척 버퍼2 (washing buffer 2)
4번 플레이트 : 세척 버퍼3 (washing buffer 3)
5번 플레이트 : 용출 버퍼 (elution buffer)
[도 12]는 96 채널 (96-channel) 형태의 자성입자 파이펫터를 이용하여 PCR 산물 정제 과정에 대한 모식도이다. 96 채널 (96-channel) 형태의 자성입자 파이펫터를 이용한 PCR 산물 정제를 수행하기 위하여 웰(well) 당 (주)바이오팩트사의 HiGene™ PCR Purification Kit(Magnetic Bead Type)의 버퍼를 다음과 같이 분주하였다.
1번 플레이트 : 250 μl 결합 버퍼 (binding buffer)
2번 플레이트 : 700 μl 세척 버퍼 1(washing buffer)
3번 플레이트 : 700 μl 세척 버퍼 1(washing buffer) - 2열 및 8열과 동일 용액 사용
4번 플레이트 : 700 μl 세척 버퍼 2(washing buffer 2) - 100% 에탄올 사용
5번 플레이트 : 50 μl 용출 버퍼 (elution buffer)
[도 13]은 대장균 균주인 DH5α 균주로부터 증폭된 16S rDNA PCR 산물 50 μl와 (주)바이오팩트사의 HiGene™ PCR Purification Kit(Magnetic Bead Type)에 포함된 자성입자 20 μl를 1번 플레이트에 넣어 결합버퍼와 혼합한 다음, 96 채널 (96-channel)형태의 자성입자 파이펫터를 이용하여 위 과정에서 준비된 96웰 플레이트상에서 핵산을 정제 후 전기영동 결과이다.
H : 손잡이 부분
I : 파이펫 팁 부분
N : 너트
T1, T2, T3 : 고정나사
t1, t2, t3 : 나사 고정 홈
1 : 하판 조작 스위치 고정 캡
2 : 하판 고정 나사 홈
3 : 막대자석
100 : 자성체
110 : 지지관
120 : 하판 조작 스위치
130 : 하판 조작 스프링
140 : 지지 관 고정부
150 : 지지 관 고정 나사 홈
200 : 하판
210 : 자성체 고정봉 통과 홈
220 : 하판 조작 스위치 결합 홈
300 : 상판
310 : 막대자석 부착 홈
320 : 파이펫 팁 결합 홈
400 : 파이펫 팁 고정 판
410 : 파이펫 팁 고정 홈
500 : 자성체 고정 봉
510 : 자성체 고정홈
520 : 튜브 홀 마찰 부

Claims (10)

  1. 다음의 구성을 포함하며, 자성입자(magnetic bead)를 이용하여 멀티웰(multi-well) 플레이트로부터 핵산 또는 단백질을 추출하는 멀티웰 자성입자 파이펫터(multi-well magnetic bead pipettor):
    (a) 상판(300)과 결합가능하고, 하판 조작 스위치 (120) 및 하판 조작 스프링(130)을 포함하며, 상기 하판 조작 스위치 (120) 및 하판 조작 스프링을 이용하여 하판(200)의 상하이동을 조작하는 손잡이 부분(H);
    (b) 손잡이 부분(H) 및 하판 (200)의 상부와 결합가능한 상판 (300);
    (c) 상판 (300)의 하부 및 자성체 고정봉(500)의 상부와 결합가능한 하판 (200); 및
    (d) 하판의 하부와 결합가능하고, (i) 복수 개의 자성체(100), 및 (ii) 상기 자성체(100)가 결합되는 복수 개의 자성체 고정봉(500) 을 포함하는 파이펫 팁 부분(I)):
    상기 자성체 고정봉(500)은 하단에 튜브 홈 마찰부(520)를 포함하고, 상기 튜브 홈 마찰부(520)는 8-스트립 PCR 튜브 (8-strip PCR tube) 또는 96 웰 PCR 플레이트 (96-well PCR plate)와 결합 가능한 것인, 멀티웰 자성입자 파이펫터.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 멀티웰 자성입자 파이펫터는 상판(300)과 하판(200) 사이에 위치하고, 복수 개의 자성체 고정봉이 배열 및 결합되는 파이펫 팁 고정판 (400)을 추가적으로 포함하는 것인, 멀티웰 자성입자 파이펫터.
  3. 제 2 항에 있어서, 파이펫 팁 고정판 (400)은 상판에 장착된 막대자석(3)에 자기적으로 탈부착가능한 것인, 멀티웰 자성입자 파이펫터.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 자성체(100)는 8개 - 100개인 것인, 멀티웰 자성입자 파이펫터.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 자성체(100)는 유도자석인 것인, 멀티웰 자성입자 파이펫터.
  6. 제 1 항에 있어서, 상기 상판(300) 및 하판(200)은 평행하기 구비되며, 상기 하판에는 자성체 고정봉(500)이 결합 가능한 자성체 고정봉 통과 홈(210)이 형성된 것인, 멀티웰 자성입자 파이펫터.
  7. 제 1 항에 있어서, 상기 멀티웰 자성입자 파이펫터는 상기 하판 조작 스위치를 이용하여, 8-스트립 PCR 튜브 (8-strip PCR tube) 또는 96 웰 PCR 플레이트 (96-well PCR plate)를 탈착할 수 있는 것인, 멀티웰 자성입자 파이펫터.
  8. 제 1 항에 있어서, 상기 손잡이 부분(H), 상판(300), 하판(200) 또는 파이펫 팁 부분(I)은 금속 또는 플라스틱 재질인 것인, 멀티웰 자성입자 파이펫터.
  9. 제 1 항에 있어서, 상기 자성체 고정봉(500)의 개수는 8개 (1열) 내지 96개 (12열); 또는 12개(1행) 내지 96개 (8 행)인 것인, 멀티웰 자성입자 파이펫터.
  10. 제 1 항에 있어서, 상기 파이펫 팁 부분(I)은 상판(300)에 장착된 막대자석의 자기력에 의해 탈착 및 부착이 가능한 것인, 멀티웰 자성입자 파이펫터.
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