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Die
vorliegende Erfindung betrifft Nukleinsäure-bindende Chips zur Überwachung
von Bioprozessen unter spezieller Ausrichtung auf die Detektion
von Stickstoffmangelzuständen
sowie die Verwendung entsprechender Gensonden, insbesondere auf
solchen Chips, beziehungsweise Verfahren und Verwendungsmöglichkeiten,
die auf derartigen Sonden und Chips beruhen.
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Bei
der technischen Nutzung biologischer Prozesse stellt sich das sehr
grundlegende Problem, deren Verlauf zu überwachen, um zum gewünschten
Ergebnis zu gelangen, um Ressourcen zu schonen und/oder um in einer
gegebenen Zeit ein optimales Ergebnis zu erzielen. Unter biologischen
Prozessen sind beispielsweise die Kultur von Mikroorganismen auf
einer Agarplatte oder in Schüttelkultur
zu verstehen, insbesondere aber deren Fermentation, beziehungsweise
die Gewinnung von Rohstoffen über
die Fermentation von Mikroorganismen. Hierzu gibt es einen reichhaltigen
Stand der Technik, sowohl was einzellige Eukaryonten wie Hefen oder
Streptomyceten, als auch was gramnegative oder grampositive Bakterien
angeht.
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Die Überwachung
derartiger Prozesse (Monitoring) geschieht einerseits durch die
Beobachtung der sich im Laufe des Prozesses wandelnden Eigenschaften
und Anforderungen der betrachteten Organismen, was sich beispielsweise
in der optischen Dichte und Viskosität des Mediums, in aufgenommenen
oder abgegebenen Gasen, in Änderungen
des pH-Werts oder sich wandelnden Nährstoffbedürfnissen niederschlägt. Hierzu
kann man auch die Messung enzymatischer Aktivitäten über geeignete Assays rechnen,
beispielsweise den Nachweis interessierender Aktivitäten im Kulturüberstand.
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Andererseits
sind in den letzten Jahren verschiedene Techniken entwickelt worden,
um die Stoffwechselprozesse der betreffenden Organismen auf der
Ebene der Genexpression zu verfolgen. Eine gängige Methode hierfür ist die
Verwendung von Genen für
leicht nachzuweisende Proteine als Indikatoren für die Aktivität der Promotoren
für die eigentlich
interessierenden Gene (Promotor-Analyse, Genexpressions-Analyse).
Hierfür
sind auch entsprechende Apparaturen (sogenannte (Bio-)Sensoren)
entwickelt worden.
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Andere
Techniken befassen sich mit dem Nachweis der interessierenden Proteine
beziehungsweise der für
diese Proteine codierenden mRNA. Hierzu gehören (1.) die Proteom-Analyse,
das heißt
die Betrachtung der Veränderung
der Ausstattung der betreffenden Zellen mit Proteinen, welche zumeist über 2-dimensionale
Gelelektrophorese der Zellysate erfolgt, (2.) die Analyse der gebildeten
mRNA (Transkriptom) über
ein in analoger Weise erstelltes „genomisches DNA-Array" und (3.) die Chip-Technologie.
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Letztere
befindet sich in einem vergleichsweise frühen Entwicklungsstadium. Während die
beiden zuerst genannten Methoden letztlich auf quantitativen Isolierungen
und zeitaufwendingen Analysen der betreffenden Makromoleküle beruhen,
liegt der Chip-Technologie das Prinzip zugrunde, auf physikalisch
auslesbaren Trägern
(Chips) Sonden für
Proteine oder für
Nukleinsäuren
anzubringen, die unmittelbar auf das Vorhandensein der betreffenden
Proteine, beziehungsweise Nukleinsäuren ansprechen. Gegenüber den
beiden zuerst genannten Technologien verspricht man sich von derartigen
Chips eine zum betrachteten Prozeß zeitnahe Analyse (At line-Analyse).
Ein weiterer Vorteil ist der Bedarf an vergleichsweise kleinen Probenmengen.
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Das
Prinzip von Chip-basierten Messungen wird beispielsweise in dem
Artikel „Real-time
electrochemical monitoring: toward green analytical chemistry" von J. Wang (Acc.
Chem. Res.; ISSN 0001-4842; Rec. Sept. 12, 2001, Seiten A–F) schematisch
in 2 vorgestellt. Demnach wird die
zu analysierende Probe mit einer Erkennungsschicht (biorecognition
layer) in Kontakt gebracht, bei der es sich beispielsweise um Enzym, Antikörper, Rezeptor
oder DNA handeln kann; das hierüber
empfangene Signal wird über
einen Umwandler (Transducer), beispielsweise eine amperometrische
oder potentiometrische Elektrode, über einen Verstärker (amplification/processing)
als elektrische Spannung oder als elektrisches Potential ausgegeben.
In der betreffenden Arbeit werden auch optische Systeme angesprochen,
denen gegenüber
die elektronisch auswertbaren Systeme hinsichtlich der Miniaturisierbarkeit
und anderer Vorteile dem Autor günstiger
erschienen.
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Aufgrund
der vorliegenden Erfindung können
die Protein-spezifischen Chips außer Betracht bleiben. mRNA
erkennende Chips sind in der Regel mit komplementären DNA-Molekülen oder
DNA-Analoga dotiert. Deren Herstellung und Nutzung zu sehr detaillierten Fragestellungen
wie beispielsweise der Differenzierung von Punktmutationen wird
beispielsweise in der Anmeldung WO 95/11995 A1 beschrieben. Unter
den DNA-Chip-Analysen
gibt es solche mit einer PCR-Amplifikation der Zielsequenz und solche
ohne Amplifikation. Ferner gibt es solche mit optischer Auswertung
der auf die Erkennung zurückzuführenden
Signale und solche mit elektrischer Auswertung.
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Die
optischen Detektionsmethoden erfordern zum Teil einen Verstärkungsmechanismus
der Signale. Hierfür
werden zum Beispiel Fluorophore, Acridiniumester oder eine indirekte
Detektion über
sekundäre
Bindungsvorgänge,
zum Beispiel über
Biotin, Avidin/Streptavidin oder Digoxigenin beschrieben. Im letzteren
Falle werden zum optischen Nachweis Digoxigenin-spezifische Antikörper eingesetzt,
die mit einem Enzym markiert werden. Dabei wird die Enzymaktivität entweder
kolorimetrisch oder über
Lumineszenz nachgewiesen. Nach Westin et al. (2000), Nature Biotechnol.,
18, S. 199–204,
kann die Hybridisierung mit einer PCR auf dem DNA-Chip gekoppelt
werden, um so die gesamte Nachweisreaktion auf einem Chip durchführen zu
können („Lab-on-a-Chip-Konzept").
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Weitere
Arbeiten beschreiben die Entwicklung von DNA-Chips, die das Prinzip
der Kapillarelektrophorese zur DNA-Sequenzierung, beziehungsweise
Trennung miniaturisieren (Woolley und Mathies (1994), Proc. Natl.
Acad. Sci., 91, S. 11348–11352;
Liu et al. (2000), Proc. Natl. Acad. Sci., 97, S. 5369–5374).
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Elektrisch
auslesbare DNA-Chips sind in einigen Publikationen prinzipiell bereits
vorgestellt worden (Hoheisel (1999), DECHEMA Jahresbericht 1999.,
S. 8–11;
Hintsche et al. (1997), EXS, 80, S. 267–283). Wright et al. (2000;
Anal. Biochem., 282, S. 70–79)
nutzten einen „Ion-Channel-Sensor" (ICS) zur DNA-Detektion,
wie er erstmalig von Cornell et al. (1997; Nature, 387, S. 580–583) beschrieben
wurde. Dabei handelt es sich um ein Verfahren, bei dem die Leitfähigkeit
molekularer Ionenkanäle
durch eine Bindungsreaktion detektiert wird. Im wesentlichen stellt
der Sensor ein Impedanz-Element dar. Cheng et al. (1998; Nat. Biotechnol., 16,
S. 541–546)
zufolge können
elektrische Impulse zu einer Verstärkung der Hybridisierungsreaktion
auf optischen DNA-Chips genutzt werden. Fritsche et al. (2002; Laborwelt
II) schlugen ein elektrisches Chip-System vor, das mit metallischen
Nanopartikeln arbeitet, die zum Beispiel an Oligonukleotide gebunden
sind. Bei diesem System wird durch eine sogenannte „metallische
Verstärkung" während der
Hybridisierungsreaktion ein Abfall des elektrischen Widerstandes
an der Elektrode ausgelöst,
der dann als Signal meßbar
ist.
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Ein
weiterer Ansatz basiert auf einem elektrischen Detektionsprinzip,
in dem DNA-Sonden verwendet werden, die durch die Markierung mit
einem geeigneten Enzym (zum Beispiel alkalische Phosphatase) nach der
Hybridisierung zu einem elektrisch aktiven Substrat führen, das
dann durch eine Redox-Reaktion an der Elektrode detektierbar ist
(Hintsche et al. (1997), EXS, 80, S. 267–283).
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Wenn
man sich hinsichtlich des prinzipiellen Aufbaus und des Auswertungssystems
für einen
bestimmten Nukleinsäure-erkennenden
Chip-Typus entschieden hat, stellt sich das konkretere Problem,
welche Genaktivitäten
beobachtet werden sollen. Dabei ist zu bedenken, daß in der
Zahl der mit einem Nukleinsäure-Chip-Typ
gleichzeitig analysierbaren Gene technisch bedingte Grenzen bestehen.
So sind optisch auslesbare Chips, was die Zahl der Sonden, die auf
dem Chip aufgebracht werden können,
den elektrisch auswertbaren derzeit überlegen. Deren Grenzen werden
durch die Miniaturisierbarkeit der elektronischen Meßeinheiten
gesetzt.
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Es
stellt sich somit das biologische Problem, welche Auswahl von Genaktivitäten den
betrachteten Prozeß in
geeigneter Weise abbilden. Hierzu gehört auch die Überwachung
der Produktbildung, wenn es sich beispielsweise um eine fermentative
Produktherstellung handelt. Gleichzeitig können auch Kontrollgene eingeschlossen
werden, die anzeigen, wenn der Prozeß sich in eine Richtung entwickelt,
die nicht beabsichtigt ist. Im Zuge dieses Monitoring sollte aus
Praktikabilitätsgründen eine
nicht zu hohe Zahl an verschiedenen Genen beobachtet werden.
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Von
besonderem technischen Interesse sind biotechnologische Prozesse
mit grampositiven Bakterien. Denn diese werden besonders aufgrund
ihrer Fähigkeit
zur Sekretion zur industriellen Herstellung von Wertstoffen eingesetzt.
Hierunter haben solche der Gattung Bacillus und hierunter wiederum
die Spezies B. subtilis, B. amyloliquefaciens, B. agaradherens,
B. licheniformis, B. lentus und B. globigii derzeit die wirtschaftlich
größte Bedeutung.
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Mit
der simultanen Beobachtung der Aktivität mehrerer Gene in Bakterien
(multiparametrische Erfassung) befassen sich beispielsweise die
im folgenden vorgestellten Arbeiten. In dem Artikel „Monitoring
of genes that respond to process-related stress in large-scale bioprocesses" von Schweder et
al. (1999), Biotech. Bioeng., 65, S. 151–159, wird die Veränderung
der mRNA-Spiegel verschiedener durch Streß-Faktoren induzierbarer Gene,
nämlich
clpB, dnaK (induziert bei Hitzeschock), uspA (Glucose-Mangel), proU (osmotischer Streß), pfl
und frd (O2-Mangel) und ackA (Glucose-Überschuß) im Verlauf einer Fermentation
von E. coli und in der nachfolgenden Konzentrierungsphase beschrieben.
Sie wurden über
eine PCR-basierte, auf herkömmliche
Weise durchgeführte
Methode erfaßt.
Hierbei wurden unterschiedliche Expressionsraten bereits an verschiedenen
Stellen des Reaktors und sekundenschnelle Reaktionen auf veränderte Bedingungen
festgestellt.
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Eine
weitere Fermentation von E. coli wird in der Arbeit „Monitoring
of genes that respond to overproduction of an insoluble recombinant
protein in Escherichia coli glucose-limited fed-batch fermentations" von Jürgen et
al. (2000), Biotech. Bioeng., 70, S. 217–224, beschrieben. Hierin wird
die Expression der Gene Ion, dnaK, ibpB, htrA, ppiB, groEL, tig,
s6, l9 und dps, teilweise auf mRNA-, teilweise auf Proteinebene,
teilweise auf beiden Ebenen betrachtet. Dabei erfolgte die Untersuchung über 2D-PAGE,
beziehungsweise die DNA-array-Technik. Angesichts der Ergebnisse
wird vorgeschlagen, rekombinante Bioprozesse wie die heterologe Protein-Herstellung über (unmittelbar)
Prozeß-relevante
Proteine und Reporter-Gene wie ibpB zu verfolgen.
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Mit
einer weiteren Beobachtung des Fermentationsverlaufs bei Expression
eines rekombinanten Proteins durch E. coli befaßt sich die Arbeit „Genomic
analysis of highcell-density recombinant Escherichia coli fermentation
and "cell conditioning" for improved recombinant
protein yield" von
R.T.Gill et al. (2001; Biotech. Bioeng., 72, S. 85–95). Hierin
wird beschrieben, daß die
Streß-Gene
degP, uvrB, alpA, mltB, recA, ftsH, ibpA, aceA und groEL unter den
genannten Bedingungen bei hoher Zelldichte gegenüber niedriger Zelldichte verstärkt exprimiert
werden. Der Stärke
der Reaktion nach gruppierten sie sich untereinander zu gewissen
Clustern. Dies wurde über
einen auf RT-PCR und DNA-Microarray
beruhenden und durch Dot-blot-Analyse ergänzten Ansatz ermittelt, der
auf Proben von zwei Zeitpunkten der Fermentation angewendet wurde,
eben zu Beginn bei niedriger Zelldichte und gegen Ende bei hoher
Zelldichte. Hieraus wurden „Cell
Conditioning"-Ansätze entwickelt,
um die Streß-Antwort
der Zellen herabzusetzen.
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Grundsätzliche
Unterschiede in den Expressionsmustern grampositiver Organismen
gegenüber
denen von gramnegativen Bakterien werden mit der Arbeit „Proteome
and transcriptome based analysis of Bacillus subtilis cells overproducing
an insoluble heterologous protein" von Jürgen et al. (2001), Appl. Microbiol. Biotechnol.,
55, S. 326–332
aufgedeckt. Darin wird die Expression unter anderem der Gene dnaK,
groEL, grpE, clpP, clpC, clpX, rpsB und rplJ in B. subtilis beschrieben,
wie sie über
die DNA-macroarray-Technik, beziehungsweise über zweidimensionale Polyacrylgelelektrophorese
ermittelt werden können.
Hiernach werden in grampositiven zur Überexpression eingesetzten
Bakterien die Gene für
die Purin- und die Pyrimidin-Synthese sowie die bestimmter ribosomaler
Proteine stärker
exprimiert, als aufgrund der Erkenntnisse an gramnegativen Bakterien
zu erwarten war. Ein weiterer Unterschied betrifft die Proteasen
Lon und Clp.
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Einzelne
dieser Gene oder sogar Nukleinsäure-bindende
Chips mit einzelnen dieser Gene werden inzwischen in mehreren Publikationen
offenbart oder zumindest die Möglichkeit
ihrer Herstellung aufgezeigt. So offenbaren beispielsweise die beiden
Patentanmeldungen
DE
10136987 A1 und
DE
10108841 A1 jeweils ein Gen aus Corynebacterium glutamicum,
nämlich
clpC beziehungsweise citB. Beide Gene werden als relevant für den Aminosäure-Stoffwechsel
beschrieben, weshalb eine kommerziell interessante Nutzung dieser
Gene darin bestehen soll, sie zu inaktivieren oder zumindest abzuschwächen, um
die fermentative Herstellung von Aminosäuren durch diesen Mikroorganismus
zu optimieren. Weitere Anwendungsmöglichkeiten können nach diesen
Anmeldungen darin bestehen, Sonden für die betreffenden Gen-Produkte
auf Nukleinsäure-bindenden Chips
vorzulegen.
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Auf
der anderen Seite werden zunehmend mehr Genomdaten verschiedener
Organismen publiziert, die eine solche Fülle von Sequenzdaten enthalten,
daß hieraus
eine repräsentative
Auswahl wünschenswert erscheint.
So offenbart die Patentanmeldung WO 02/055655 A2 mehr als 1.800
DNA-Sequenzen, die durch die vollständige Sequenzierung des Genoms
des Mikroorganismus Methylococcus capsulatus ermittelt worden sind.
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Inzwischen
ist beispielsweise auch das komplette Genom des grampositiven Bacillus
licheniformis sequenziert worden. Es wird in der Publikation „The Complete
Genome Sequence of Bacillus licheniformis DSM13, an Organism with
Great Industrial Potential" (2004)
von B. Veith et al. in J. Mol. Microbiol. Biotechnol., Band 7 (4),
Seiten 204 bis 211, beschrieben und ist zusätzlich unter dem Eintrag AE017333
(Basen 1 bis 4.222.645) in der Datenbank GenBank (National Center
for Biotechnology Information NCBI, National Institutes of Health,
Bethesda, MD, USA; http://www.ncbi.nlm.nih.gov; Stand 2.12.2004)
zugänglich.
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Unter
Verwendung der Technik optisch auswertbarer Chips ist es inzwischen
sogar möglich,
Nukleinsäure-bindende
Chips herzustellen, die ein nahezu vollständiges Genom beziehungsweise
das zugehörige Transkriptom
abdecken (genomische DNA-Chips).
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Mit
der Anmeldung WO 2004/027092 A2 wird ein repräsentativer Querschnitt mit
einer überschaubaren
Anzahl von Genen zur Verfügung
gestellt, um verschiedene physiologische Zustände, die ein beobachteter Mikroorganismus
im Laufe der Kultivierung durchlaufen kann, zu identifizieren. Hierzu
gehörten
beispielsweise Hungerzustände
gegenüber
verschiedenen Nährstoffen
oder Streßsituationen
wie beispielsweise Hitze- oder Kälteschock,
Scherstreß,
oxidativer Streß oder
Sauerstofflimitierung. Es handelt sich dabei um die folgenden Gene:
acoA, ahpC, ahpF, citB, clpC, clpP, codY, cspA, cspB, des, dnaK,
eno, glnR, groEL, groL, gsiB, ibpA, ibpB, katA, katE, lctP, ldh,
opuAB, phoA, phoD, pstS, purC, purN, pyrB, pyrP, sigB, tnrA, trxA
und ydjF. Aus dieser Anmeldung gehen auch die zugehörigen DNA-Sequenzen
aus B. subtilis, E. coli und/oder B. licheniformis hervor. Dadurch
ist es möglich
geworden, auch entsprechende Nukleinsäure-bindende Chips herzustellen, die
bei der Überwachung
eines auf Mikroorganismen, insbesondere grampositiven oder gramnegativen
Bakterien beruhenden Bioprozesses Änderungen der diesen Prozeß kennzeichnenden
Stoffwechselaktivitäten
anzeigen.
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Nukleinsäure-bindende
Chips, die auf dieser Auswahl von Genen beruhen, liefern einen gewissen, insgesamt
aber eher nur groben Überblick über die
jeweilige Stoffwechselsituation. Sie vermögen in der Regel nicht, ein
einzelnes Teilproblem besonders zu beleuchten; allerdings kann sich
ein einzelnes positives Signal aus verschiedenen Situationen heraus
ergeben oder auch nur falsch-positiv sein, weshalb es oft – und insbesondere
in einer solchen unklaren Situation – sinnvoll ist, einen ausgewählten Stoffwechselaspekt
separat zu analysieren. Andererseits ist gerade bei elektrisch auslesbaren
Nukleinsäure-bindenden
Chips, welche den Vorteil einer zeitnahen Analyse besitzen, die
Zahl der gleichzeitig belegbaren Plätze begrenzt, so daß zur Erfassung
zusätzlicher,
spezieller Stoffwechselsituationen nicht einfach zusätzliche
Gensonden aufgebracht werden können.
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Aus
den nicht vorveröffentlichten
Anmeldungen
DE 10 2004
061 664.7 und
DE
10 2005 022 145.9 gehen Nukleinsäure-bindende Chips zur Überwachung
von Bioprozessen unter spezieller Ausrichtung auf die Detektion
von Phosphatmangelzuständen
beziehungsweise Glucosemangelzuständen hervor. Sie tragen jeweils
eine begrenzte Anzahl von Sonden, um diese speziellen Streßsituationen
anzuzeigen.
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Eine
Stoffwechselsituation, die für
Mikroorganismen kritisch und somit für einen entsprechenden Bioprozeß limitierend
sein kann, ist die des Stickstoffmangels. Denn Stickstoff ist ein
wesentliches Element für
Nukleinsäuren
und für
Aminosäuren
und damit für
Proteine, welche ihrerseits die Hauptfunktionsträger und Baustoffe biologischer
Organismen darstellen. Stickstoffmangel steht also für eine mangelhafte
Baustoffversorgung und kann rasch zum Absterben der Zellen führen oder
zumindest das Erreichen höherer
Zelldichten verhindern. Insbesondere bei der fermentativen Herstellung
von Proteinen, wie beispielsweise technischen Enzymen, wirkt sich
ein Stickstoffmangel auch auf die Produktbildungsrate aus. Somit
besteht ein besonderer Bedarf, diesbezüglich eine Chip-basierte, zeitnahe
Analyse durchzuführen
und aufgrund des hierdurch rasch zu erhaltenden Ergebnisses punktuell
und damit noch zielgerichteter in den laufenden Bioprozeß eingreifen
zu können.
Dadurch wird einem Verlust an Ausbeute vorgesorgt, der sich durch
einen nicht oder zu spät
erkannten Stickstoff-Engpaß ergeben
würde.
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Es
stellte sich somit die Aufgabe, Gene zu identifizieren, die bei
Organismen, insbesondere Mikroorganismen möglichst eindeutig mit dem Streß-Signal
des Stickstoffmangels in Verbindung gebracht werden können. Ziel
war es, Sonden für
diese Gene zu entwickeln, um sie für die Überwachung entsprechender Bioprozesse
einsetzen zu können.
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Damit
sollte es möglich
sein, Nukleinsäure-bindende
Chips mit Gensonden für
einzelne oder mehrere dieser Gene zu belegen und hierdurch zu Nukleinsäure-bindenden
Chips zu gelangen, die im Verlaufe eines überwachten Bioprozesses zuverlässig das
Signal „Stickstoffmangel" anzeigen (Stickstoffmangel-Sensoren). Diese
Aufgabe stellte sich insbesondere für solche Nukleinsäure-bindenden
Chips, deren Anzahl an belegbaren Plätzen aufgrund ihrer Bauart
vergleichsweise gering ist, insbesondere die elektrisch auswertbaren.
Denn diese weisen andererseits die Vorteile einer raschen Auslesbarkeit
auf und ermöglichen
damit eine At-line-Analyse. Dies gewährleistet ein gegebenenfalls
frühzeitiges
Eingreifen, um den betreffenden Bioprozeß hinsichtlich der Baustoffversorgung
zu optimieren.
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Solch
ein DNA-bindender Chip sollte für
mehrere miteinander vergleichbare Prozesse einsetzbar und mit vergleichsweise
geringfügigen
Variationen an spezifische Einsatzmöglichkeiten anzupassen sein.
Vorzugsweise sollte er auf Bioprozesse auf der Grundlage von Bacillus-Spezies,
insbesondere B. subtilis, B. amyloliquefaciens, B. lentus, B. globigii,
und ganz besonders auf B. licheniformis ausgerichtet sein. Unter
Bioprozessen standen Fermentationen, insbesondere die technische
Herstellung von Produkten, ganz besonders von überexprimierten Proteinen im
Vordergrund.
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Ferner
sollte solch ein Stickstoffmangel-Sensor entsprechende Verfahren
zur Messung des physiologischen Zustands der betrachteten Zellen
sowie entsprechende Verwendungsmöglichkeiten
zur Überwachung der
betrachteten biologischen Prozesse ermöglichen.
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Zur
Lösung
dieser Aufgabe wurde eine Vielzahl von Genen aus dem biotechnologisch
wichtigen Bakterium B. licheniformis hinsichtlich ihrer Aktivierbarkeit
durch den Übergang
der betreffenden Kultur in einen Stickstoffmangelzustand untersucht
(Beispiel 1). Dabei wurde überraschenderweise
festgestellt, daß bei
weitem nicht alle Gene, die am Stickstoffstoffwechsel beteiligt
sind, ein diesbezüglich
eindeutiges Signal liefern. Zusätzlich
wurde – ebenso überraschend – eine Aktivierung
von solchen Genen beobachtet, die zuvor nicht ohne weiteres mit
dem Stickstoffstoffwechsel in Verbindung gebracht worden sind, beispielsweise
das Gen für eine
putative Malatsynthase, oder solche, die für Proteine mit noch unbekannter
Funktion codieren. Ferner waren davon diejenigen Gene abzuziehen,
die eindeutig auf mehr als nur dieses eine Streß-Signal ansprechen. Die auf
diese Weise identifizierten Gene sollen nun, gegebenenfalls unabhängig von
ihrer bislang bekannten Funktion, erfindungsgemäß als Stickstoffstoffwechselgene
angesehen werden. Dies belegt Beispiel 2 der vorliegenden Anmeldung.
Dabei wurden sehr unterschiedlich starke Induktionen beobachtet.
Der Lehre der vorliegenden Erfindung zufolge sollen Gene umso mehr
als Indikatoren geeignet sein, je stärker diese Antwort ausfällt. Erfindungsgemäß werden
deshalb solche Gene als Stickstoffmangel-Indikatoren ausgewählt, die
ein deutliches, signifikant über
einem bestimmten Schwellenwert liegendes Signal ergeben. Je weiter
das Ergebnis darüber
liegt, desto mehr sind sie als Teile der Lösungen der erfindungsgemäßen Aufgabe
anzusehen, womit sich eine entsprechende Staffelung der bevorzugten
Erfindungsapekte erklärt
(siehe unten).
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Tabelle
1 zeigt alle in Beispiel 1 ermittelten 210 Gene von Bacillus licheniformis
DSM13, deren Induzierung unter Stickstoffmangel beobachtet wurde,
wobei ein Faktor von mindestens drei als signifikant angesehen wurde.
Hiervon sind in Tabelle 2 alle 49 Gene zusammengestellt, deren Induzierung
durch Stickstoffmangel zu irgendeinem der gemessenen Zeitpunkte
mindestens den Faktor 8 betragen hat und bei denen aus parallelen,
hier nicht gezeigten Untersuchungen geschlossen werden konnte, daß sie vergleichsweise
spezifisch für
dieses Signal waren. Diese sind in Tabelle 3 noch einmal hinsichtlich
der Stärke
ihrer beobachteten maximalen Induktion aufgelistet. Ihre DNA- und
Aminosäuresequenzen
werden im Sequenzprotokoll zur vorliegenden Anmeldung aufgeführt, wobei
die ungeradzahligen Nummern für
DNA- und die nachfolgenden geradzahligen für die jeweils abgeleiteten
Aminosäuresequenzen
stehen. Auf diese Sequenzen verweisen auch die jeweiligen SEQ ID-Nummern
in den Tabellen 2 und 3. Dabei handelt es sich um folgende Gene,
in der Reihenfolge der Stärke
der durch Stickstoffmangel ausgelösten Induktion (vergleiche
Tabelle 2 und 3):
- – Für ein hypothetisches Protein
unbekannter Funktion codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO. 81,
82);
- – yrkC
(unbekannte Funktion – ähnlich zu
Proteinen unbekannter Funktion; SEQ ID NO. 83, 84);
- – nasF
(Uroporphyrin-III C-Methyltransferase; SEQ ID NO. 39, 40);
- – für ein putatives
Protein (putatives Stickstoff-Regulationsprotein P-II) codierendes
Gen (Homolog zu SEQ ID NO. 93, 94);
- – pckA
(Phosphoenolpyruvate-Carboxykinase; SEQ ID NO. 43, 44);
- – trpE
(Anthranilat-Synthase; SEQ ID NO. 67, 68);
- – nasB
(Electronen-Transfer-Untereinheit der assimilatorischen Nitratreductase;
SEQ ID NO. 33, 34);
- – für ein hypothetisches
Protein (enges Homolog zur Aldehyd-Dehydrogenase DhaS) codierendes
Gen (Homolog zu SEQ ID NO. 15, 16);
- – nasC
(katalytische Untereinheit der assimilatorischen Nitratreductase;
SEQ ID NO. 35, 36);
- – ycdH
(unbekannte Funktion – ähnlich zum
Bindungsprotein des ABC-Transporters; SEQ ID NO. 65, 66);
- – für ein putatives
Protein (putativer Ammonium-Transporter) codierendes Gen (Homolog
zu SEQ ID NO. 63, 64);
- – nasD
(Untereinheit der assimilatorischen Nitritreductase; SEQ ID NO.
37, 38);
- – für ein hypothetisches
Protein unbekannter Funktion codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID
NO. 95, 96);
- – für ein putatives
Protein (putative Na(+)-verbundene D-Alanine-Glycinpermease) codierendes
Gen (Homolog zu SEQ ID NO. 49, 50);
- – für ein putatives
Protein (putative Malatsynthase; EC 4.1.3.2) codierendes Gen (Homolog
zu SEQ ID NO. 45, 46);
- – für ein putatives
Protein (putative Glycosylhydrolase/Lysozym) codierendes Gen (Homolog
zu SEQ ID NO. 85, 86);
- – für ein putatives
Protein (putative Serinprotease) codierendes Gen (Homolog zu SEQ
ID NO. 9, 10);
- – für ein putatives
Protein (putativer Transkriptions-Regulator) codierendes Gen (Homolog
zu SEQ ID NO. 17, 18);
- – trpC
(Indol-3-Glycerinphosphat-Synthase; SEQ ID NO. 71, 72);
- – trpB
(Beta-Untereinheit der Tryptophansynthase; SEQ ID NO. 75, 76);
- – ycnK
(unbekannte Funktion – ähnlich zum
Transkriptions-Regulator der DeoR-Familie; SEQ ID NO. 31, 32);
- – für ein putatives
Protein (putatives Phagen-Capsid-Protein) codierendes Gen (Homolog
zu SEQ ID NO. 21, 22);
- – trpD
(Anthranilat-Phosphoribosyl-Transferase; SEQ ID NO. 69, 70);
- – ydfS
(unbekannte Funktion – ähnlich zu
Proteinen unbekannter Funktion; SEQ ID NO. 79, 80);
- – trpF
(Phosphoribosyl-Anthranilat-Isomerase; SEQ ID NO. 73, 74);
- – für ein putatives
Protein (putative Hydrolase) codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID
NO. 47, 48);
- – yvlB
(unbekannte Funktion – ähnlich zu
Proteinen unbekannter Funktion; SEQ ID NO. 89, 90);
- – yncE
(unbekannte Funktion; SEQ ID NO. 87, 88);
- – yvlA
(unbekannte Funktion; SEQ ID NO. 97, 98);
- – glnR
(Transkriptions-Repressor des Glutaminsynthetase-Gens; SEQ ID NO.
11, 12);
- – ycnJ
(unbekannte Funktion – ähnlich zum
Kupfer-Export-Protein; SEQ ID NO. 29, 30);
- – für ein putatives
Protein (ATP-Bindungsprotein eines putativen ABC-Transporters) codierendes
Gen (Homolog zu SEQ ID NO. 55, 56);
- – für ein konserviertes
hypothetisches Protein unbekannter Funktion codierendes Gen (Homolog
zu SEQ ID NO. 19, 20);
- – nrgB
(Stickstoffreguliertes PII-ähnliches
Protein; SEQ ID NO. 3, 4);
- – yvtA
(unbekannte Funktion – ähnlich zur
HtrA-ähnlichen
Serinprotease; SEQ ID NO. 23, 24);
- – yciC
(unbekannte Funktion – ähnlich zu
Proteinen unbekannter Funktion; SEQ ID NO. 57, 58);
- – nrgA
(Ammonium-Transporter; SEQ ID NO. 5, 6);
- – glnA
(Glutaminsynthetase; SEQ ID NO. 13, 14);
- – alsR
(Transkriptionsregulator des Alpha-Acetolactat-Operons; SEQ ID NO.
61, 62);
- – ggt
(gamma-Glutamyltranspeptidase; SEQ ID NO. 51, 52);
- – ygjN
(unbekannte Funktion – ähnlich zum
Aminosäure-Abbau;
SEQ ID NO. 1, 2);
- – yppF
(unbekannte Funktion; SEQ ID NO. 77, 78);
- – für ein hypothetisches
Protein unbekannter Funktion codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID
NO. 53, 54);
- – für ein hypothetisches
Protein unbekannter Funktion codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID
NO. 41, 42);
- – ycnI
(unbekannte Funktion – ähnlich zu
Proteinen unbekannter Funktion; SEQ ID NO. 27, 28);
- – htrA
(Serinprotease Do; Hitzeschockprotein; SEQ ID NO. 7, 8);
- – für ein putatives
Protein (putativer ABC-Transporter/Aminosäure-Permease) codierendes Gen
(Homolog zu SEQ ID NO. 91, 92);
- – citA
(Neben-Citratsynthase I; SEQ ID NO. 59, 60);
- – kdgR
(Transkriptionsrepressor des Pectin-Abbau-Operons; SEQ ID NO. 25,
26).
-
Eine
Lösung
der gestellten Aufgabe besteht somit in einem Nukleinsäure-bindenden
Chip, dotiert mit Sonden für
mindestens drei der folgenden 49 Gene:
kdgR, citA, für ein putatives
Protein (putativer ABC-Transporter/Aminosäure-Permease) codierendes Gen
(Homolog zu SEQ ID NO. 91), htrA, ycnI, für ein hypothetisches Protein
unbekannter Funktion codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO. 41),
für ein
hypothetisches Protein unbekannter Funktion codierendes Gen (Homolog
zu SEQ ID NO. 53), yppF, ygjN, ggt, alsR, glnA, nrgA, yciC, yvtA,
nrgB, für
ein konserviertes hypothetisches Protein unbekannter Funktion codierendes
Gen (Homolog zu SEQ ID NO. 19), für ein putatives Protein (ATP-Bindungsprotein
eines putativen ABC-Transporters)
codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO. 55), ycnJ, glnR, yvlA, yncE,
yvlB, für
ein putatives Protein (putative Hydrolase) codierendes Gen (Homolog
zu SEQ ID NO. 47), trpF, ydfS, trpD, für ein putatives Protein (putatives
Phagen-Capsid-Protein) codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO. 21),
ycnK, trpB, trpC, für
ein putatives Protein (putativer Transkriptions-Regulator) codierendes
Gen (Homolog zu SEQ ID NO. 17), für ein putatives Protein (putative
Serinprotease) codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO. 9), für ein putatives
Protein (putative Glycosylhydrolase/Lysozym) codierendes Gen (Homolog
zu SEQ ID NO. 85), für
ein putatives Protein (putative Malatsynthase, EC 4.1.3.2) codierendes Gen
(Homolog zu SEQ ID NO. 45), für
ein putatives Protein (putative Na(+)-verbundene D-Alanine-Glycinpermease)
codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO. 49), für ein hypothetisches Protein
unbekannter Funktion codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO. 95),
nasD, für
ein putatives Protein (putativer Ammonium-Transporter) codierendes
Gen (Homolog zu SEQ ID NO. 63), ycdH, nasC, für ein hypothetisches Protein
(enges Homolog zur Aldehyd-Dehydrogenase DhaS) codierendes Gen (Homolog
zu SEQ ID NO. 15), nasB, trpE, pckA, für ein putatives Protein (putatives
Stickstoff-Regulationsprotein
P-II) codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO. 93), nasF, yrkC, für ein hypothetisches
Protein unbekannter Funktion codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID
NO. 81),
wobei die Gesamtzahl aller für Stickstoffmangel spezifischen
unterschiedlichen Sonden nicht über
80 liegt.
-
Detaillierte
Informationen zu diesen Genen gehen aus den Beispielen 1 bis 3 und
den Tabellen 1 bis 3 der vorliegenden Anmeldung hervor. Im Sequenzprotokoll
werden diese Gene offenbart, wie sie aus B. licheniformis DSM 13
erhältlich
sind. Die meisten davon sind auch aus anderen Spezies beschrieben
(siehe unten). Bei einigen handelt es sich jedoch um putative (angenommene)
Gene oder um Gene, die für
putative (angenommene) Enzyme codieren. Diese werden erfindungsgemäß soweit
wie möglich
aufgrund von Datenbankvergleichen als solche mit einer putativen
(angenommenen) Funktion und zusätzlich
als Homologe zu den gefundenen B. licheniformis-Genen definiert.
Hierzu muß zweierlei
erläutert
werden:
- – Zum
einen könnte
sich bei dem einen oder anderen durch eine biochemische Analyse
herausstellen, daß diese
putative Funktion nicht mit der wirklichen Funktion übereinstimmt.
Dann wird nicht an der putativen Funktion festgehalten. Vielmehr
stellen diese Erkenntnisse die Erfindung insofern nicht in Frage,
als es erfindungsgemäß lediglich
auf die Beobachtung der verstärkten
Transkription im Zusammenhang mit dem Stickstoffmangel ankommt,
so daß die
betreffende Genaktivität
unabhängig
von der letztlich ausgeübten Enzymaktivität durchaus
als Indikator für
Stickstoffmangel dienen kann.
- – Zum
anderen ließ sich
für diese
in Ermangelung eines Gennamens keine passendere Definition als die über das
Gen selbst finden. Deshalb wird von Homologen gesprochen. So ist
anzunehmen, daß in
anderen Spezies als B. licheniformis unter Stickstoffmangel die
homologen Gene aktiviert werden. Sollte sich herausstellen, daß in einer
betrachteten Spezies zu einem dieser Gene mehrere Homologe existieren,
die in vivo zur Transkriptbildung befähigt sind, so bezieht sich
die Angabe „Homolog
zu SEQ ID NO. ..." auf
das jeweils nächstähnliche
dieser verschiedenen in Frage kommenden Gene.
-
Erfindungsgemäß werden
mindestens drei dieser Gene ausgewählt, um eine möglichst
zuverlässige Aussage
zu erhalten, das heißt
um ein einzelnes, auf nur einen Sondentyp zurückzuführendes falsch-positives Signal
auszuschließen.
-
Unter
einem Nukleinsäure-bindenden
Chip sind erfindungsgemäß alle Gegenstände zu verstehen,
die mit Nukleinsäure-spezifischen
Sonden versehen sind und bei Bindung einer oder mehrerer spezifisch
erkannter Nukleinsäuren
jeweils ein auswertbares Signal liefern.
-
Aus
dem einleitend dargestellten Stand der Technik ist die Gestaltung
von Chips bekannt, die mit Nukleinsäuren als Sonden dotiert sind.
Prinzipiell können
sie alle für
Ausführungsformen
der vorliegenden Erfindung genutzt werden. Sie basieren auf dem
Prinzip der Nukleinsäure-Hybridisierung
der zu detektierenden mRNA (oder einem hiervon abgeleiteten Molekül) mit der
auf dem Chip vorgelegten Sonde. Je nach System zur Auswertung des
durch die Hybridisierung ausgelösten
Signals wird zwischen Chips mit einem optischen und mit einem elektrischen
Analysesystem unterschieden. Erfindungsgemäß sind prinzipiell beide Systeme anwendbar.
-
Solche
Chips werden folgendermaßen
zur Kontrolle (Monitoring) des jeweils betrachteten Bioprozesses
eingesetzt: Aus dem Prozeß wird
zu einem bestimmten Zeitpunkt eine Probe mit dem zu analysierenden biologischem
Material entnommen. Aus diesem wird nach an sich bekannten Methoden,
beispielsweise unter Zellaufschluß und Verwendung eines denaturierenden
Puffers RNA, insbesondere mRNA isoliert. Diese wird selbst markiert
oder als Ausgangsmolekül
für ein
in die Messung eingebrachtes Molekül eingesetzt (zum Beispiel
durch reverse Transkription erhaltene cDNA) und die erhaltenen Moleküle vorteilhafterweise
in einem Puffer über/durch
den Chip geleitet. Bei Hybridisierung (Sandwich-Markierung) einer
präparierten
RNA beziehungsweise deren Derivat mit der homologen (das heißt hinsichtlich
ihrer Sequenz kongruenten) auf dem Chip bereitgestellten Sonde (Target-Nukleinsäure, beispielsweise
Target-DNA oder Target-Nukleinsäureanalog)
ergibt sich ein entsprechendes optisch oder elektronisch auswertbares
Signal. Dieses beruht beispielsweise auf der Markierung der bindenden mRNA
oder einem Transkript davon mit einem Farb- oder Fluoreszenzmarker, einer
Hybridisierung mit einer zweiten Sonde oder auf einer sekundären Nachweisreaktion,
etwa über
eine RT-PCR.
-
Da
von derselben Sonde in der Regel jeweils mehrere Moleküle an den
Chip gebunden sind, ist die Stärke
des Hybridisierungssignal über
einen gewissen – im
Einzelfall gegebenenfalls zu optimierenden – Bereich proportional zur
Zahl der zum Zeitpunkt der Probennahme in der Probe vorhandenen
spezifischen mRNA. Auf diese Weise ist die Stärke des Signals ein direktes
Maß für die Aktivität des betreffenden
Gens zu dem Zeitpunkt der Probennahme.
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Die
Zeitspanne zwischen Probennahme und Messung sollte dabei so kurz
wie möglich
gehalten werden, beispielsweise über
eine weitgehend automatisierte Probennahme, deren Aufarbeitung und
Leitung über/durch
den Sensor.
-
Als
mithilfe eines erfindungsgemäßen Chips
betrachtete (monitorierte) Organismen kommen prinzipiell alle Pflanzen,
Tiere und Mikroorganismen in Frage, insbesondere solche, die kommerziell
genutzt werden. So geht beispielsweise aus der Anmeldung
DE 19860313 A1 mit
dem Titel „Verfahren
zur Erkennung und Charakterisierung von Wirkstoffen gegen Pflanzen-Pathogene" hervor, daß es in
Pflanzen, insbesondere Nutzpflanzen Stoffwechselsituationen gibt,
die beobachtet werden müssen.
Ebenso können
beispielsweise Nutztiere oder Labortiere beobachtet werden. Von
nicht geringem kommerziellen Interesse sind eukaryontische Zellkulturen,
etwa bei der Herstellung monoklonaler Antikörper, und insbesondere die
fermentative Herstellung von Lebensmitteln, etwa über die
von Hefen betriebene alkoholische Gärung. Bakterien werden insbesondere zur
technischen Herstellung von Proteinen oder niedermolekularen Wertstoffen
(Biotransformation), etwa von Vitaminen oder Antibiotika genutzt.
-
Unter
Sonden sind erfindungsgemäß alle Moleküle zu verstehen,
die in der Lage sind, mit Nukleinsäuren eine jeweils weitgehend
spezifische Wechselwirkung einzugehen (sie zu binden). Diese Wechselwirkung wird
erfindungsgemäß ausgenutzt,
um im Rahmen einer entsprechenden Anordnung (Chip) ein weitgehend eindeutig
zuzuordnendes, auswertbares Signal zu erhalten.
-
Chemisch
gesehen handelt es sich bei einer erfindungsgemäßen Sonde zumeist um eine Verbindung, die
in der Lage ist, über
Wasserstoffbrückenbindungen
mRNA-Moleküle
oder hiervon abgeleitete Nukleinsäuren zu binden, so wie dies
beispielsweise auch bei der Wechselwirkung der beiden Stränge einer
DNA oder der DNA-RNA-Wechselwirkung erfolgt. Dies kann beispielsweise
eine DNA sein, welche gegenüber
Hydrolyse stabiler ist als RNA.
-
Im
Stand der Technik sind darüber
hinaus weitere Moleküle
bekannt, insbesondere chemisch synthetisierte, die biomimetisch
dieselbe Wechselwirkung ermöglichen,
aber stabiler als DNA sind, beispielsweise dadurch, daß die Phophatester-Bindungen
des Rückgrats
gegen weniger hydrolyseempfindliche Bindungen ausgetauscht worden
sind. Solche Nukleinsäure-Analogon-Sonden
kennzeichnen bevorzugte Ausführungsformen
der vorliegenden Anmeldung (siehe unten). Die betreffenden spezifischen
Sonden wären,
etwa nach dem Vorbild des mit dieser Anmeldung verbundenen Sequenzprotokolls
entsprechend zu synthetisieren. Dies kommt dem Aspekt entgegen,
daß erfindungsgemäße Chips
vorteilhafterweise mehrmals verwendbar sein sollten, insbesondere
während
eines einzelnen beobachteten Prozesses, in dessen Verlauf eine ständige Überwachung
erstrebenswert ist.
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Limitierend
für die
Brauchbarkeit einer Sonde ist jeweils das Maß der Homologie zwischen der
bereitgestellten Sonde und der mRNA oder der davon abgeleiteten
Nukleinsäure,
die über
Hybridisierung erkannt werden soll. Letztlich entscheidet das Maß an Hybridisierung
der Sonde mit der zu detektierenden mRNA (siehe oben) über deren
Brauchbarkeit als Sonde und muß im
Einzelfall experimentell optimiert und/oder über Anpassung der Signalauswertung
berücksichtigt
werden. Es muß unter
den durch den Aufbau der Meßapparatur, und
sonstigen Einflüssen
vorgegebenen Bedingungen eine Hybridisierung erfolgen, die spezifisch
nur auf das interessierende Gen zurückgeführt werden kann, ausreichend
stark ist, um ein positives Signal zu ergeben, und andererseits
nicht zu stark ist, als daß das
erkannte Molekül
nach Erzeugung des Signals wieder abdiffundiert, um die Bindungsstelle
für das
nächste
Molekül
freizumachen, beziehungsweise ein Abklingen des Signals zu ermöglichen;
letzteres gegebenenfalls über
einen entsprechenden Waschschritt.
-
Allerdings
ist es nötig,
vor Verwendung erfindungsgemäßer Chips
für einen
interessierenden Organismus das Maß der Homologie zwischen den
betreffenden Genen abzuschätzen,
bei nicht ausreichender Affinität
der zu detektierenden mRNAs zu den vorgelegten Sonden solche über dieselben
erfindungsgemäßen Gene
aus näher
verwandten Spezies auf dem Chip zu verankern und Kalibrierungsmessungen durchzuführen, um
verläßliche Aussagen
darüber
zu erhalten, welche Signalstärke
welcher Konzentration an spezieller mRNA entspricht.
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Die
Identifizierung der für
die vorliegende Erfindung wesentlichen 49 Gene ist in den Beispielen
zur vorliegenden Anmeldung beschrieben. Deren aus Bacillus licheniformis
erhältlichen
Sequenzen sind im Sequenzprotokoll der vorliegenden Anmeldung angegeben
(SEQ ID NO. 1 bis 98), wobei es sich bei den Sequenzen mit ungeradzahligen
Nummern um DNA-Sequenzen und bei den jeweils um einen Zahlwert höheren Sequenzen
um die jeweils davon abgeleiteten Aminosäuresequenzen handelt. Während die
DNA-Sequenzen unmittelbar für
die Herstellung von Sonden genutzt werden können (siehe oben), dienen die
Aminosäuresequenzen
beispielsweise über
Sequenzdatenbank-Vergleiche
der Überprüfung der
Genfunktion und können
ferner dazu dienen, um etwa über
Rück-Übersetzung
des genetischen Codes ähnliche
Nukleinsäuren-erkennende Sonden
zu generieren.
-
Wie
in Beispiel 1 dargestellt ist, wurden zahlreiche verschiedene Gentranskripte,
das heißt
mRNA-Moleküle
untersucht, insbesondere solche, von denen eine Beteiligung am Stickstoffstoffwechsel
allgemein bekannt war. Diese mRNA-Moleküle wurden zu verschiedenen
Zeitpunkten während
des Übergangs
von B. licheniformis DSM 13 in einen Stickstoffmangelzustand isoliert.
In Beispiel 1 wird ebenfalls beschrieben, wie der Konzentrationsanstieg
dieser mRNA im Zellinneren von B. licheniformis experimentell ermittelt
wurde. Alternative Bestimmungsmöglichkeiten
hierzu mögen
im Stand der Technik etabliert sein; entscheidend für das Verständis der
vorliegenden Erfindung ist die Zusammenstellung in Tabelle 1 (Beispiel
2). Sie zeigt die mit dem Übergang
verbundenen Konzentrationsänderungen
für insgesamt
210 mRNAs. Dabei wurden folgende Schwellenwerte für das Verhältnis der
RNA Menge des jeweiligen Gens gegenüber dem Kontrollwert als signifikant
angesehen: Als induziert gelten erfindungsgemäß die Gene, deren RNA ein Verhältnis > 3 (das heißt mindestens
eine Verdreifachung) aufweist; eine deutliche Induktion liegt bei
einem Verhältnis
von > 10 vor; deutlich
reprimiert sind Gene mit einem RNA-Verhältnis < 0,3 (das heißt einem Absenken auf weniger
als 30%). Bei den in Tabelle 1 aufgeführten 210 Genen wurde zu irgendeinem
der betrachteten Zeitpunkte mindestens eine Verdreifachung beobachtet.
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Unter
diesen 210 Genen befinden sich, wie Beispiel 3 belegt, 67 Gene mit
einer mindestens 8fachen Induktion zu irgendeinem der beobachteten
Zeitpunkte unter den Bedingungen des in Beispiel 1 beschriebenen
Stickstoffmangels. Hiervon können
18 als nicht besonders spezifisch angesehen werden, so daß überraschenderweise
lediglich die in Tabelle 2 aufgeführten 49 Gene als speziell
unter Stickstoffmangel deutlich induzierte Gene verbleiben. Diese
49 Gene werden erfindungsgemäß als repräsentative
Indikatoren eines Stickstoffmangelzustands angesehen. Weitere Angaben
zu diesen Genen, beispielsweise über
deren Funktion oder abweichende Start-Codons sind den Tabellen 2
und 3 und dem Sequenzprotokoll zu entnehmen; die jeweiligen deutschsprachigen
Bezeichnungen für
die zugehörigen
Proteine sind bereits oben, in der Reihenfolge der Angaben in Tabelle
3 aufgeführt
worden.
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All
diese Gene sind jeweils für
sich im Stand der Technik beschrieben. Sie können für die verschiedenen Organismen
aus allgemein zugänglichen
Datenbanken entnommen werden. Wie oben erwähnt sind die im Sequenzprotokoll
für B.
licheniformis DSM 13 angegebenen Sequenzen aus diesem Mikroorganismus
ermittelt worden und stimmen praktisch mit den in der Publikation „The Complete
Genome Sequence of Bacillus licheniformis DSM13, an Organism with
Great Industrial Potential" (2004)
von B. Veith et al. in J. Mol. Microbiol. Biotechnol., Band 7 (4),
Seiten 204 bis 211, beschriebenen und zusätzlich unter dem Eintrag AE017333
(Basen 1 bis 4.222.645) in der Datenbank GenBank (siehe oben) zugänglichen
Angaben überein.
Der Stamm B. licheniformis DSM 13 ist über die Deutsche Sammlung von
Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, 38124
Braunschweig (http://www.dsmz.de) allgemein erhältlich. Er trägt bei der
American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas,
VA 20110-2209, USA (http://www.atcc.org) die Hinterlegungsnummer
ATCC 14580.
-
Die
zu den genannten 49 Genen entsprechenden Gene aus anderen Organismen
sind zu einem Großteil
ebenfalls in allgemein zugänglichen
Datenbanken hinterlegt, beispielsweise für die gut charakterisierten Spezies
B. subtilis und E. coli, die allgemein als Modellorganismen der
grampositiven, beziehungsweise gramnegativen Bakterien angesehen
werden. Die entsprechenden Sequenzen können beispielsweise den Datenbanken
des Institut Pasteur, 25,28 rue du Docteur Roux, 75724 Paris CEDEX
15, Frankreich, entnommen werden, welche über die Internet-Adressen http://genolist.pasteur.fr/Colibri/
(für E.
coli), beziehungsweise http://genolist.pasteur.fr/SubtiList/ (für B. subtilis)
zugänglich
sind (Stand: 2.12.2004). Weitere hierfür geeignete Datenbanken sind
die des EMBL-European Bioinformatics Institute (EBI) in Cambridge,
Großbritannien (http://www.ebi.ac.uk),
Swiss-Prot (Geneva Bioinformatics (GeneBio) S.A., Genf, Schweiz;
http://www.genebio.com/sprot.html) oder GenBank (National Center
for Biotechnology Information NCBI, National Institutes of Health,
Bethesda, MD, USA).
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Unter
diesen „entsprechenden
Genen" sind diejenigen
zu verstehen, die jeweils für
die Proteine codieren, die im betrachteten Organismus dieselbe chemische
Reaktion katalysieren oder an demselben physiologischen Vorgang
wie die genannten 49 Proteine in B. licheniformis DSM 13 beteiligt
sind. Die meisten davon tragen für
andere Organismen ähnliche
Namen und Abkürzungen
wie die, die in den Tabellen 1, 2 und 3 für B. licheniformis angegeben
sind, weil diese Namen für
die jeweilige Funktion stehen. Im Zweifelsfall geben sie sich über ihre
Sequenz zu erkennen, welche aus dem betreffenden Organismus die
zu den hier genannten jeweils nächstähnliche
(am stärksten
homologe) ist. Bei der Funktionszuordnung kommt es vor allem auf
die Ähnlichkeit
der Aminosäuresequenzen
zueinander an, weil die Aminosäuren
die Funktionsträger
des Proteins darstellen und aufgrund der Degeneriertheit des genetischen
Codes verschiedene Nukleotidsequenzen für dieselbe Aminosäuresequenz
codieren können.
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Besonders
hohe Verwandtschaftsgrade bestehen zwischen nahe verwandten Spezies.
So kann prinzipiell davon ausgegangen werden, daß sich zu den meisten der genannten
49 Gene Homologe in allen Spezies finden lassen, auch in Cyanobakterien,
in eukaryontischen Zellen wie etwa Pilzen, oder gramnegativen Spezies
wie E. coli oder Klebsiella. Noch höher ist diese Wahrscheinlichkeit
für grampositive
Bakterien, insbesondere der Gattung Bacillus, weil es sich bei B.
licheniformis DSM 13, von dem die im Sequenzprotokoll aufgeführten Sequenzen
stammen, um ein solches grampositives Bakterium handelt. Zudem ist
davon auszugehen, daß in
zunehmend verwandten Organismen die homologen Gene auch zunehmend
denselben oder gleichwirkenden Regulationsmechanismen unterworfen
sind; somit sollten diese Homologen auch dieselbe Stoffwechselsituation,
insbesondere einen Stickstoffmangel anzeigen. Insofern ist B. licheniformis
ein glücklich gewählter Beispielorganismus,
weil die kommerziell ebenfalls besonders wichtigen Spezies B. subtilis,
B. amyloliquefaciens, B. lentus, B. globigii ebenfalls Bacilli und
damit grampositiv sind. Damit wird dem diesbezüglichen Aspekt der gestellten
Aufgabe entsprochen.
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Es
sei angemerkt, daß zum
Nacharbeiten der Erfindung für
eine bestimmte Spezies nicht alle genannten 49 Gene bekannt sein
müssen,
sondern lediglich einige davon (siehe unten) ausreichen, um den
Glucosestoffwechsel abzubilden und insbesondere den Übergang
in einen Stickstoffmangelzustand detektieren zu können. Gleichwohl
steigt mit zunehmender Zahl von Sonden die Verläßlichkeit der Aussage über den
Glucose-Versorgungsszustand.
Sind mehrere prinzipiell aufgrund der vorliegenden Offenbarung geeignet
erscheinende Gene bekannt, empfiehlt es sich, vor Herstellung eines
entsprechenden Chips eine Expressionsstudie durchzuführen, um ähnlich der
Darstellung in Beispiel 1 oder auch über eine Northern-Analyse zu überprüfen, ob
die betreffenden Gene tatsächlich
signifikante Aussagen erlauben. Je weniger die betrachtete Spezies
mit B. licheniformis verwandt ist, desto eher mögen sich Verschiebungen hinsichtlich
des durch Stickstoffmangel hervorgerufenen Expressionsnieaus ergeben,
so daß sich
(gegebenenfalls andere als die unten zusammengestellten) Unterguppen
dieser 49 Gene als besonders geeignet und damit als bevorzugt herausstellen.
-
Bei
der Herstellung eines erfindungsgemäßen Nukleinsäure-bindenden
Chips für
einen hier nicht genannten Organismus müssen also zu zumindest einzelnen
der für
B. licheniformis genannten Gene die zugehörigen homologen Gene identifiziert
werden, beispielsweise durch einen Vergleich der für den betreffenden Organismus
bekannten DNA-Sequenzen mit den hier angegebenen Sequenzen. Diese
oder Teile davon (siehe unten) können
sodann an sich als Sonden oder als Vorlage zur Synthese entsprechender
Sonden dienen, welche nach an sich bekannten Methoden auf einen
Nukleinsäurebindenden
Chip aufgebracht werden.
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Sollten
einzelne homologe Sequenzen nicht in Datenbanken hinterlegt sein,
ist es dem Fachmann möglich,
anhand der im Sequenzprotokoll zur vorliegenden Anmeldung offenbarten
Sequenzen jeweilige Sonden zu synthetisieren, um mit deren Hilfe
eine für
den gewünschten
Organismus erstellte Genbank (genomisch oder vorzugsweise auf der
Basis der cDNA) nach allgemein üblichen
Methoden nach dem betreffenden Homolog zu durchsuchen. Alternativ
hierzu ist es auch möglich,
anhand der im Sequenzprotokoll angegebenen DNA-Sequenzen Oligonukleotide
zu synthetisieren, die als PCR-Primer dienen, um die betreffenden
Gene oder als Sonden brauchbare Teile davon aus einer gesamtgenomischen
DNA-Präparation
oder einer cDNA-Präparation
des interessierenden Organismus herauszuamplifizieren. Diese oder
Teile davon (siehe unten) können
als Sonden auf erfindungsgemäßen Nukleinsäure-spezifischen
Chips eingesetzt werden.
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Ein
wesentliches Merkmal der vorliegenden Erfindung besteht darin, daß die Gesamtzahl
aller Stickstoffstoffwechsel-spezifischen unterschiedlichen Sonden
nicht über
80 liegt. Dieses Merkmal korreliert mit der gestellten Aufgabe,
wonach sie schwerpunktmäßig auf
solche Nukleinsäure-bindenden
Chips ausgerichtet sein sollte, deren Anzahl an belegbaren Plätzen aufgrund
ihrer Bauart vergleichsweise gering ist. Dies sind insbesondere
die elektrisch auswertbaren Chips.
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Unter
den weiteren Stickstoffstoffwechsel-spezifischen Sonden können beispielsweise
solche sein, die durch einen Stickstoffüberschuß induziert werden, evtl. auch
weitere, die mit dem Stickstoffstoffwechsel scheinbar in keinem
direkten Zusammenhang stehen, aufgrund dieser Induzierbarkeit aber
als solche definiert werden können.
Damit ergibt solch ein Chip auch eine auswertbare und im betrachteten
Prozeß brauchbare Information,
wenn der Stickstoffmangel, beispielsweise durch Ergreifen entsprechender
Gegenmaßnahmen überwunden
worden ist.
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Ferner
handelt es sich bei Nukleinsäure-spezifischen
Sonden in der Regel jeweils nur um Fragmente der kompletten Gene
(siehe unten). In Einzelfällen,
beispielsweise bei einer Regulation über Spleißen oder großen, mehrfachfunktionellen
Polypeptiden kann es deshalb sinnvoll sein, ein und dasselbe Gen
mit zwei oder mehr verschiedenen Sonden zu detektieren. Somit sind
entsprechende Ausführungsformen
gegebenenfalls durch mehr als 49 Sonden gekennzeichnet, die jedoch
auf nicht mehr als diese 49 Gene ansprechen.
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Je
nach zu beobachtendem Prozeß können auf
erfindungsgemäßen Chips
auch Sonden für
weitere Gene beziehungsweise Genprodukte enthalten sein (siehe unten).
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Zum
anderen besteht der Kern der Erfindung gerade in der Spezifität des betreffenden
Chips, mit dem eine spezielle Stoffwechselsituation erfaßt werden
sollte. Die Herstellung eines Chips mit mehr als 80 auf verschiedene
Gene ansprechenden Sonden oder sogar eines Chips, der einen Großteil des
Genoms eines Organismus abbildet, ist bei einer solch spezifischen
Fragestellung wegen des damit verbundenen Aufwands nicht Teil der
hier beschriebenen Erfindung. Vielmehr können beide Arten von Chips
in einem beobachteten Bioprozeß sinnvoll
nebeneinander eingesetzt werden: So können die Chips mit zahlreichen
verschiedenen Gensonden oder mit einem repräsentativen Querschnitt verschiedener
möglicherweise
relevanter Situationen, wie sie mit der Anmeldung WO 2004/027092
A2 zur Verfügung
gestellt werden, einen groben Überblick über den
Zustand des betreffenden Organismus liefern, während ein erfindungsgemäßer Chip
zur Kontrolle hinzugezogen wird, wenn Anlaß zur Sorge besteht, die betreffenden
Zellen könnten
in einen Stickstoffmangelzustand eintreten.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
handelt es sich um einen erfindungsgemäßen Nukleinsäure-bindenden
Chip, der zunehmend bevorzugt mit den oben angegebenen Sonden in
der dort angegebenen Reihenfolge dotiert ist.
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Hiermit
sind die in Tabelle 3 aufgeführten
Gene in umgekehrter Reihenfolge gemeint. Demnach sind Chips mit
Sonden zum Gen kdgR (Transkriptionsrepressor des Pectin-Abbau-Operons; SEQ
ID NO. 25, 26) unter den erfindungsgemäßen Chips hinsichtlich der
Genauswahl zur Bildung von Sonden noch am wenigsten bevorzugt, weil
dieses unter den 49 genannten, durch Stickstoffmangel signifikant
verstärkt
transkribierten Genen am schwächsten
induziert worden ist. Demgegenüber
sind solche mit einer Sonde für
das für
ein hypothetisches Protein unbekannter Funktion codierende Gen (Homolog
zu SEQ ID NO. 81, 82) hinsichtlich der Genauswahl am stärksten bevorzugt.
Denn dieses zeigte gegenüber
dem Ausgangsniveau eine mehr als 146fache Induktion und damit die
stärkste
von allen gemessenen Genen. Das hiermit verbundene Signal sollte
also von allen untersuchten Genen am besten dazu geeignet sein,
die Stoffwechselsituation „Stickstoffmangel" anzuzeigen.
-
In
einer bevorzugten Ausführungsform
handelt es sich um einen erfindungsgemäßen Nukleinsäure-bindenden
Chip, wobei mindestens eine, zunehmend bevorzugt zwei oder drei
der Sonden aus den folgenden 33 Genen ausgewählt ist/sind:
für ein konserviertes
hypothetisches Protein unbekannter Funktion codierendes Gen (Homolog
zu SEQ ID NO. 19), für
ein putatives Protein (ATP-Bindungsprotein eines putativen ABC-Transporters)
codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO. 55), ycnJ, glnR, yvlA, yncE,
yvlB, für
ein putatives Protein (putative Hydrolase) codierendes Gen (Homolog
zu SEQ ID NO. 47), trpF, ydfS, trpD, für ein putatives Protein (putatives
Phagen-Capsid-Protein)
codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO. 21), ycnK, trpB, trpC, für ein putatives
Protein (putativer Transkriptions-Regulator) codierendes Gen (Homolog
zu SEQ ID NO. 17), für
ein putatives Protein (putative Serinprotease) codierendes Gen (Homolog
zu SEQ ID NO. 9), für
ein putatives Protein (putative Glycosylhydrolase/Lysozym) codierendes
Gen (Homolog zu SEQ ID NO. 85), für ein putatives Protein (putative
Malatsynthase, EC 4.1.3.2) codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO.
45), für
ein putatives Protein (putative Na(+)-verbundene D-Alanine-Glycinpermease)
codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO. 49), für ein hypothetisches Protein
unbekannter Funktion codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO. 95),
nasD, für
ein putatives Protein (putativer Ammonium-Transporter) codierendes
Gen (Homolog zu SEQ ID NO. 63), ycdH, nasC, für ein hypothetisches Protein
(enges Homolog zur Aldehyd-Dehydrogenase DhaS) codierendes Gen (Homolog
zu SEQ ID NO. 15), nasB, trpE, pckA, für ein putatives Protein (putatives
Stickstoff-Regulationsprotein P-II) codierendes Gen (Homolog zu
SEQ ID NO. 93), nasF, yrkC, für
ein hypothetisches Protein unbekannter Funktion codierendes Gen
(Homolog zu SEQ ID NO. 81).
-
Denn
diese Gene zeigten bei den in den Beispielen anhand von B. licheniformis
DSM 13 durchgeführten,
in den Beispielen 1 bis 3 dargestellten Untersuchungen Geninduktionen,
die mindestens um den Faktor 10 erhöht waren. Entsprechend bevorzugte
Ausführungsformen
sind also durch die ersten 33 der in Tabelle 3 aufgeführten Gene
gekennzeichnet.
-
Weiterhin
bevorzugt sind solche erfindungsgemäßen Nukleinsäure-bindenden
Chips, wobei mindestens eine, zunehmend bevorzugt zwei oder drei
der Sonden aus den folgenden 19 Genen ausgewählt ist/sind:
trpC, für ein putatives
Protein (putativer Transkriptions-Regulator) codierendes Gen (Homolog
zu SEQ ID NO. 17), für
ein putatives Protein (putative Serinprotease) codierendes Gen (Homolog
zu SEQ ID NO. 9), für
ein putatives Protein (putative Glycosylhydrolase/Lysozym) codierendes
Gen (Homolog zu SEQ ID NO. 85), für ein putatives Protein (putative
Malatsynthase, EC 4.1.3.2) codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO.
45), für ein
putatives Protein (putative Na(+)-verbundene D-Alanine-Glycinpermease) codierendes
Gen (Homolog zu SEQ ID NO. 49), für ein hypothetisches Protein
unbekannter Funktion codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO. 95),
nasD, für
ein putatives Protein (putativer Ammonium-Transporter) codierendes
Gen (Homolog zu SEQ ID NO. 63), ycdH, nasC, für ein hypothetisches Protein
(enges Homolog zur Aldehyd-Dehydrogenase DhaS) codierendes Gen (Homolog
zu SEQ ID NO. 15), nasB, trpE, pckA, für ein putatives Protein (putatives Stickstoff-Regulationsprotein
P-II) codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO. 93), nasF, yrkC, für ein hypothetisches
Protein unbekannter Funktion codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID
NO. 81).
-
Denn
diese Gene zeigten bei den in den Beispielen anhand von B. licheniformis
DSM 13 durchgeführten,
in den Beispielen 1 bis 3 dargestellten Untersuchungen Geninduktionen,
die mindestens um den Faktor 15 erhöht waren.
-
Weiterhin
bevorzugt sind solche erfindungsgemäßen Nukleinsäure-bindenden
Chips, wobei mindestens eine, zunehmend bevorzugt zwei oder drei
der Sonden aus den folgenden 12 Genen ausgewählt ist/sind:
nasD, für ein putatives
Protein (putativer Ammonium-Transporter) codierendes Gen (Homolog
zu SEQ ID NO. 63), ycdH, nasC, für
ein hypothetisches Protein (enges Homolog zur Aldehyd-Dehydrogenase
DhaS) codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO. 15), nasB, trpE, pckA,
für ein
putatives Protein (putatives Stickstoff-Regulationsprotein P-II) codierendes
Gen (Homolog zu SEQ ID NO. 93), nasF, yrkC, für ein hypothetisches Protein
unbekannter Funktion codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO. 81).
-
Denn
diese Gene zeigten bei den in den Beispielen anhand von B. licheniformis
DSM 13 durchgeführten,
in den Beispielen 1 bis 3 dargestellten Untersuchungen Geninduktionen,
die mindestens um den Faktor 20 erhöht waren.
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Weiterhin
bevorzugt sind solche erfindungsgemäßen Nukleinsäure-bindenden
Chips, wobei mindestens eine, zunehmend bevorzugt zwei oder drei
der Sonden aus den folgenden 4 Genen ausgewählt ist/sind:
für ein putatives
Protein (putatives Stickstoff-Regulationsprotein P-II) codierendes
Gen (Homolog zu SEQ ID NO. 93), nasF, yrkC, für ein hypothetisches Protein
unbekannter Funktion codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO. 81).
-
Denn
diese zeigten bei den in den Beispielen anhand von B. licheniformis
DSM 13 durchgeführten,
in den Beispielen 1 bis 3 dargestellten Untersuchungen Geninduktionen,
die mindestens um den Faktor 30, im Fall von yrkC um mehr als 60
und im zuletztgenannten Fall sogar um deutlich mehr als den Faktor
100 erhöht waren.
-
In
bevorzugten Ausführungsformen
sind erfindungsgemäße Nukleinsäure-bindende
Chips mit mindestens 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22,
24, 26 28, 30, 35, 40, 45 oder 49 der für die vorliegende Erfindung
kennzeichnenden, das heißt
in diesem Sinne genannten Sonden dotiert.
-
Denn
je mehr dieser Sonden auf ein entsprechendes Signal ansprechen,
desto zuverlässiger
ist die hiermit verbundene Aussage über die augenblickliche Stickstoffversorgung
beziehungsweise -Unterversorgung. So ist es auch sinnvoll, die besonders
aussagekräftigen
und somit bevorzugte Ausführungsformen
kennzeichnenden Sonden mit scheinbar weniger aussagekräftigen zu
kombinieren, um falsch-positive Signale ausschließen zu können. Ferner
ist es vorteilhaft, entsprechend den Angaben in Tabelle 2 solche
Sonden miteinander zu kombinieren, die zu unterschiedlichen der
dort angegebenen Zeitpunkte unterschiedlich starke Signale ergeben.
So kann man zu einer Abschätzung
darüber
gelangen, wie lange vor Probennahme der Eintritt des Stickstoffmangels
zurückliegt
und ob er – unter
Protokollierung der Kultivierungsbedingungen – möglicherweise auf einen bestimmten
Umwelteinfluß zurückzuführen ist.
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Hinsichtlich
ihrer konkreten Sequenzen verschiedene Sonden, die aber auf dieselbe
mRNA ansprechen, beispielsweise Fragmente, die mit unterschiedlichen
Bereichen derselben mRNA hybridisieren (siehe unten), werden im
Sinne dieses Erfindungsaspekts nur einmal gezählt, weil sie im besten Fall
gleichstark auf dasselbe Signal ansprechen und prinzipiell gegeneinander
austauschbar wären.
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In
bevorzugten Ausführungsformen
erfindungsgemäßer Nukleinsäure-bindender
Chips liegt die Gesamtzahl aller unterschiedlichen Sonden zunehmend
bevorzugt nicht über
75, 70, 65, 60, 55, 50, 40, 30, 20 oder 10.
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Dies
entspricht dem oben ausgeführten
Erfindungsgedanken, wonach mit den hier beschriebenen Chips ein
spezieller Stoffwechselaspekt monitoriert werden soll, so daß eine größere Zahl
von Sonden als zum Erfassen dieser Situation notwendig nicht auf
den betreffenden Chips aufgebracht zu werden braucht. Davon bleibt
die Situation unberührt,
daß es
in Einzelfällen
sinnvoll sein kann, mehr als eine Sonde zur Detektion derselben
mRNA einzusetzen und/oder einzelne Sonden aufzubringen, die mit
der Herstellung eines interessierenden Wertstoffs in Verbindung
stehen. Insgesamt bewegt sich die vorliegende Erfindung in dem genannten Rahmen,
um Chips mit technisch bedingt nur wenigen Bindungsstellen in den
Schutzbereich einschließen
zu können.
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In
bevorzugten Ausführungsformen
erfindungsgemäßer Nukleinsäure-bindender
Chips handelt es sich bei den als erfindungsrelevant genannten Sonden
um solche, die auf die betreffenden, beziehungsweise höchsthomologen,
in vivo transkribierbaren Gene aus dem für den Bioprozeß gewählten Organismus
ansprechen, vorzugsweise solche, die von den betreffenden, beziehungsweise
höchsthomologen,
in vivo transkribierbaren Genen eben dieses Organismus abgeleitet
sind.
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Hierzu
ist bereits oben ausgeführt
worden, daß die
in der vorliegenden Anmeldung offenbarten Sequenzen aus B. licheniformis
erhalten worden sind und sich aufgrund der allgemein bekannten Verwandtschaftsverhältnisse
insbesondere zum Überwachen
von verwandten Spezies, insbesondere solchen der Gattung Bacillus
eignen sollten. Dies gilt sowohl für die identifizierten Gene,
denen aufgrund von Datenbankvergleichen konkrete Funktionen zugewiesen
werden konnten und die in anderen Spezies prinzipiell für dieselbe Funktion
codieren sollten, als auch für
diejenigen, die nur über
ihre Sequenzen definiert worden sind. Hierzu werden erfindungsgemäß die im
betrachteten Organismus nächstverwandten
Gene zur Ableitung entsprechender Sonden verwendet. Dabei ist jedoch
darauf zu achten, daß keine
Sonden zu Pseudogenen erzeugt werden, sondern zu solchen, die tatsächlich unter
In-vivo-Bedingungen in mRNA umgeschrieben werden, das heißt die zu
einem im Cytoplasma meßbaren
Nukleinsäure-Signal
führen.
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Statistisch
gesehen sollte solch ein Chip jedoch umso erfolgreicher einsetzbar
sein, je besser die gewählten
Sonden mit den zu messenden Nukleinsäuren interagieren. Somit steigt
vor allem bei abnehmendem Verwandtschaftsgrad zu B. licheniformis
die Notwendigkeit, sich bei dieser Hybridisierung nicht auf die
angegebenen Sequenzen zu verlassen sondern – sofern Sequenzunterschiede
bestehen – die
für die
homologen Gene aus den betreffenden Spezies einzusetzen. Wie erläutert können diese über an sich
bekannte Verfahren, insbesondere Genbank-Screening oder PCR mit
Primern, die an den hier offenbarten Sequenzen orientiert sind (gegebenenfalls
in Form sogenannter Mismatch-Primer mit gewissen, statistischen
Sequenzvariationen), erhalten werden.
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In
bevorzugten Ausführungsformen
erfindungsgemäßer Nukleinsäure-bindender
Chips handelt es sich bei dem für
den Bioprozeß ausgewählten Organismus
um einen Vertreter einzelliger Eukaryonten, grampositiver oder gramnegativer
Bakterien.
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Denn
in diese Gruppen fallen die kommerziell am stärksten eingesetzen Organismen,
insbesondere wenn es sich bei dem zu beobachteten Bioprozeß um eine
Fermentation handelt. Hierzu zählen
beispielsweise Gärprozesse,
etwa zur Herstellung von Wein oder Bier, oder die biotechnologische
Herstellung von Wertstoffen wie Proteinen oder niedermolekularen
Verbindungen.
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Abhängig von
der Art des gewünschten
Produkts werden für
ein biotechnologisches Verfahren verschiedene Organismen gewählt. Hierunter
sind im Sinne der Erfindung nicht allein die Produktionsstämme zu verstehen
sondern auch alle dem Produktionsprozeß vorgeschalteten Organismen,
beispielsweise zur Klonierung entsprechender Gene oder zur Auswahl
geeigneter Expressionsvektoren. Der Bedarf, eine Glucoselimitation
zu erfassen, besteht dabei prinzipell während jedes Teilprozesses.
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In
bevorzugten Ausführungsformen
erfindungsgemäßer Nukleinsäure-bindender
Chips handelt es sich bei den einzelligen Eukaryonten um Protozoen
oder um Pilze, hierunter insbesondere Hefe, ganz besonders Sacharomyces
oder Schizosaccharomyces.
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Denn
diese werden neben der Herstellung alkoholischer Getränke und
weiterer durch Gärung
erhaltener Lebensmittel intensiv als Wirtszellen insbesondere für die Genprodukte
von Eukaryonten eingesetzt. Letzteres ist dann besonders vorteilhaft,
wenn diese Genprodukte spezielle, nur durch diese Stämme durchführbare Modifikationen
erfahren sollen, wie beispielsweise Glykosylierungen von Proteinen.
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Unter
diesen Gegenstand fallen auch erfindungsgemäße Chips, die auf die Überwachung
des Verlaufs, insbesondere des Wachstums von Zellkulturen höherer Eukaryonten,
etwa von Nagetieren oder von Menschen ausgerichtet sind. Sie können in
gewisser Hinsicht ebenfalls als, zumindest weitgehend einzellige Eukaryonten
verstanden werden, die insbesondere in der Immunologie eine erhebliche
kommerzielle Bedeutung besitzen, beispielsweise für die Herstellung
monoklonaler Antikörper.
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In
bevorzugten Ausführungsformen
erfindungsgemäßer Nukleinsäure-bindender
Chips handelt es sich bei den grampositiven Bakterien um Coryneforme
Bakterien oder solche der Gattungen Staphylococcus, Corynebakterien
oder Bacillus, insbesondere der Spezies Staphylococcus carnosus,
Corynebacterium glutamicum, Bacillus subtilis, B. licheniformis,
B. amyloliquefaciens, B. agaradherens, B. stearothermophilus, B.
globigii oder B. lentus, und ganz besonders um B. licheniformis.
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Denn
dies sind technisch besonders wichtige Produktionsstämme. Sie
werden insbesondere zur Produktion niedermolekularer chemischer
Verbindungen, etwa von Vitaminen oder von Antibiotika oder zur Produktion
von Proteinen, insbesondere Enzymen eingesetzt. Hierbei sind besonders
Amylasen, Cellulasen, Lipasen, Oxidoreduktasen und Proteasen besonders
hervorzuheben. Die besondere Ausrichtung auf B. licheniformis erklärt sich
daraus, daß die
im Sequenzprotokoll angegebenen Sequenzen aus dieser Spezies erhalten worden
sind und wie in den Beispielen 2 und 3 beschrieben nachweislich
mit dem Übergang
in einen Stickstoffmangel in Verbindung gebracht werden konnten.
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In
nicht minder bevorzugten Ausführungsformen
erfindungsgemäßer Nukleinsäurebindender
Chips handelt es sich bei den gramnegativen Bakterien um solche
der Gattungen E. coli oder Klebsiella, insbesondere um Derivate
von Escherichia coli K12, von Escherichia coli B oder Klebsiella
planticola, und ganz besonders um Derivate der Stämme Escherichia
coli BL21 (DE3), E. coli RV308, E. coli DH5α, E.coli JM109, E. coli XL-1
oder Klebsiella planticola (Rf).
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Denn
diese dienen sowohl im Labormaßstab
beispielsweise der Klonierung und Expressionsanalyse als auch im
großtechnischen
Maßstab
der Herstellung biologischer Wertstoffe.
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In
bevorzugten Ausführungsformen
erfindungsgemäßer Nukleinsäure-bindender
Chips ist/sind mindestens eine, zunehmend bevorzugt mehrere der
im Zusammenhang mit der hier beschriebenen Erfindung genannten Sonden
von den Sequenzen abgeleitet, die im Sequenzprotokoll unter den
Nummern SEQ ID NO. 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25,
27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57,
59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89,
91, 93, 95 und 97 aufgeführt
sind.
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Denn
diese Gene konnten, wie in den Beispielen 2 und 3 beschrieben, bei
B. licheniformis nachweislich mit dem Übergang in einen Stickstoffmangel
in Verbindung gebracht werden. Insbesondere wenn B. licheniformis
oder andere, vor allem verwandte Bacillus-Spezies überwacht werden sollen, sollte
deshalb auf diese Sequenzen zurückgegriffen
werden.
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In
bevorzugten Ausführungsformen
erfindungsgemäßer Nukleinsäure-bindender
Chips handelt es sich um solche, die zusätzlich mit mindestens einer
Sonde für
ein zusätzliches
Gen dotiert sind, insbesonderen einem solchen, das in einem Stoffwechsel-bedingten
Zusammenhang zu dem oder den prozeßbedingt zusätzlich exprimierten
Gen(en) steht, ganz besonders für
eines von diesen oder dieses selbst.
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Wie
oben ausgeführt
dienen die beobachteten Prozesse einem technischen Interesse, das
oft mit weiteren spezifischen Genen verbunden ist. Hierbei handelt
es sich beispielsweise in dem Fall, daß ein Protein hergestellt werden
soll, um das Gen für
dieses Protein und in dem Fall, daß eine niedermolekulare Verbindung hergestellt
werden soll, um ein oder mehrere Genprodukte, die auf dem Syntheseweg
der betreffenden Verbindung liegen oder diesen regulieren. Es können auch
andere zelleigene Gene betroffen sein, etwa Stoffwechselgene, die
im Zuge der Produktherstellung verstärkt gebildet werden müssen, beispielsweise
eine zelleigene Oxidoreduktase, wenn das Produkt aus einem Edukt
oder einem Zwischenprodukt über
Oxidation oder Reduktion erhalten werden soll.
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Zudem
werden für
bestimmte biologische Prozesse, insbesondere die Bildung gewerblich
relevanter Verbindungen durch Mikroorganismen in der Regel nicht
die Wildtyp-Stämme
eingesetzt, sondern solche, die auf den betreffenden Prozeß ausgerichtet
sind. Hierzu gehört
neben der Transformation mit den für die eigentliche Produktherstellung
verantwortlichen Genen das Versehen mit Selektionsmarkern oder weitere
Anpassungen des Stoffwechsels, bis hin zu Auxotrophien. Derartige
Stämme
besitzen ein besonderes Anforderungsprofil an die Wachstumsbedingungen
und besitzen zum Teil Stoffwechselgene, die gegenüber den
Wildtypgenen mutiert sind. Da erfindungsgemäße Chips vorteilhafterweise
auf eben diese Stämme,
ganz besonders den betrachteten Bioprozeß ausgerichtet sein sollen,
sollten diese Stamm-spezifischen Eigenheiten berücksichtigt werden und können sich
in der Wahl der betreffenden Sonden widerspiegeln.
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In
bevorzugten Ausführungsformen
derartiger erfindungsgemäßer Nukleinsäurebindender
Chips handelt es sich bei dem prozeßbedingt zusätzlich exprimierten
Gen um das für
ein gewerblich einsetzbares Protein, insbesondere um eine Amylase,
Cellulase, Lipase, Oxidoreduktase, eine Hemicellulase oder Protease, oder
um eines, das auf einem Syntheseweg für eine niedermolekulare chemische
Verbindung liegt oder diesen wenigstens zum Teil reguliert.
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Diese
sind dann besonders auf diejenigen Bioprozesse, vor allem Fermentationen
ausgerichtet, in denen die genannten Proteine hergestellt werden.
Bei diesen handelt es sich um kommerziell besonders wichtige Enzyme,
die beispielsweise in der Lebensmittelindustrie oder der Waschmittelindustrie
Verwendung finden. Im zuletztgenannten Fall insbesondere zur Entfernung
von Anschmutzungen, die von Amylasen, Cellulasen, Lipasen, Hemicellulasen
und/oder Proteasen hydrolysierbar sind, zur Behandlung der betreffenden
Materialien, insbesondere durch Cellulasen beziehungsweise zur Bereitstellung
eines auf einer Oxidoreduktase beruhenden enzymatischen Bleichsystems.
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Die
zuletzt genannte Variante fällt
in den Bereich der Biotransformation, wonach bestimmte, gegebenenfalls
zusätzlich
eingeführte
Stoffwechselaktivitäten
von Mikroorganismen zur Synthese chemischer Verbindungen ausgenutzt
werden.
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In
bevorzugten Ausführungsformen
erfindungsgemäßer Nukleinsäure-bindender
Chips wird/werden eine, bevorzugt mehrere der im Zusammenhang mit
der hier beschriebenen Erfindung genannten Sonden einzelsträngig, in
Form des codogenen Strangs bereitgestellt.
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Diese
Ausführungsform
verfolgt das Ziel, die Hybridisierung zwischen der Sonde und der
zu detektierenden Probe zu verbessern. Dies gilt insbesondere für den Fall,
daß aus
der Probe tatsächlich
der Gehalt an der relevanten mRNA bestimmt wird. Da diese einzelsträngig ist
und in ihrer Sequenz mit dem codierenden Strang der DNA übereinstimmt,
sollte eine optimale Hybridisierung mit dem komplementären, das
heißt
dem codogenen Strang erfolgen.
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In
bevorzugten Ausführungsformen
erfindungsgemäßer Nukleinsäure-bindender
Chips wird/werden eine, bevorzugt mehrere der als erfindungsrelevant
genannten Sonden in Form einer DNA oder eines Nukleinsäureanalogs,
vorzugsweise eines Nukleinsäureanalogs
zur Verfügung
gestellt.
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Diese
Ausführungsform
verfolgt das Ziel, die Haltbarkeit und mehrmalige Verwendbarkeit
der erfindungsgemäßen Chips
zu verbessern. Dieses Bedürfnis
ergibt sich insbesondere während
eines einzelnen beobachteten Prozesses, in dessen Verlauf eine ständige Überwachung
erstrebenswert ist. Die Haltbarkeit erfindungsgemäßer Chips,
insbesondere gegenüber
Nukleinsäure-hydrolysierenden
Enzymen wird bereits durch die Bereitstellung der Sonden in Form
einer DNA erhöht,
da diese an sich weniger hydrolyseempfindlich als etwa eine RNA
ist. Noch haltbarer sind Nukleinsäureanaloga, in denen beispielsweise
das Phosphat des Zucker-Phosphatsrückgrats gegen einen chemisch
anderen Baustein ersetzt ist, welcher beispielsweise durch natürliche Nukleasen
nicht hydrolysierbar ist. Derartige Verbindungen sind prinzipiell
im Stand der Technik bekannt und werden für gewünschte, jeweils anzugebende
Sequenzen von hierauf spezialisierten Firmen auf Wunsch kommerziell
synthetisiert. Die betreffenden Sonden sind etwa nach dem Vorbild
der im Sequenzprotokoll angegebenen Sequenzen zu synthetisieren.
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In
bevorzugten Ausführungsformen
erfindungsgemäßer Nukleinsäure-bindender
Chips umfaßt/umfassen
eine, bevorzugt mehrere der als erfindungsrelevant genannten Sonden
Genbereiche, die von dem zu untersuchenden Organismus in mRNA umgeschrieben
werden, insbesondere die Genbereiche, die nahe dem 5'-Ende der mRNA liegen.
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Hiermit
wird dem Aspekt Rechnung getragen, daß vielfach auch die regulatorischen
DNA-Abschnitte einem
speziellen Gen zugeordnet werden. In der Tat soll der erfindungsgemäße Chip
jedoch dem Nachweis der in den beobachteten Zellen tatsächlich vorhandenen
mRNA eingesetzt werden, so daß für den hier
betrachteten Zweck erst der Genabschnitt von Bedeutung ist, der
tatsächlich
in mRNA übersetzt
wird. Zum anderen ist zu berücksichtigen,
daß insbesondere
bei Eukaryonten Introns auftreten, das heißt der codierende Bereich von
Abschnitten unterbrochen ist, die nicht in mRNA übersetzt werden. Sonden, die
Introns enthalten, dürften
deshalb nicht oder nur schlecht auf die betreffenden mRNA ansprechen.
Zur Realisierung dieses Aspekts ist es ratsam, nicht auf genomische
DNA-Sequenzen sondern auf cDNA-Segenzen zurückzugreifen, das heißt auf solche,
die anhand der tatsächlichen
mRNA erhalten worden sind.
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Des
weiteren ist zum Nachweis einer mRNA oft keine Hybridisierung über die
ganze Seqzuenzlänge erforderlich.
Die spezifischen Sonden brauchen deshalb in der Regel nur einen
kleineren des in mRNA umgeschriebenen Gens zu umfassen. Vorteilhaft
ist hierfür
eine Auswahl eines Bereichs, der nahe dem 5'-Ende der mRNA liegt, da dieser zuerst
in mRNA transkribiert wird und somit nach Aktivierung des Gens als
erstes nachweisbar ist. Dies kommt einem zeitnahen Nachweis entgegen.
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In
bevorzugten Ausführungsformen
erfindungsgemäßer Nukleinsäure-bindender
Chips spricht/sprechen eine, bevorzugt mehrere der als erfindungsrelevant
genannten Sonden auf Fragmente der betreffenden Nukleinsäuren an,
insbesondere auf solche, die in der betreffenden mRNA, bezogen auf
die jeweilige Gesamt-mRNA ein geringes Maß an Sekundärfaltung aufweisen.
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Dies
ist ein weiterer Aspekt, um die Hybridisierung zwischen den Sonden
und den zu detektierenden mRNA zu optimieren. Denn mRNA-Moleküle liegen
oft in einer Sekundärstruktur
vor, die auf Hybridisierung einzelner mRNA-Bereiche mit eigenen,
anderen Bereichen beruht. So kommt es beispielsweise zu Loop- oder Stem-loop-Strukturen. Solche
Bereiche hybridisieren in der Regel jedoch weniger leicht mit anderen
Nukleinsäuremolekülen, auch
wenn diese homolog sind. Derartige Bereiche können recht genau von hierauf
ausgerichteten Computerprogrammen (siehe unten) errechnet werden.
Zur Realisierung dieses Aspekts sollte man also das Gen, dessen
Aktivität
man für
einem interessierenden Organismus bestimmen möchte, von solch einem Programm
analysieren lassen und zur Gewinnung einer geeigneten – in der
Regel nur einen Teilbereich umfassenden (siehe unten) – Sonde
auf Abschnitte zurückgreifen,
für die
ein nur geringes Maß an
mRNA-Sekundärstrukturen
vorhergesagt wird.
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In
bevorzugten Ausführungsformen
erfindungsgemäßer Nukleinsäure-bindender
Chips weist/weisen eine, bevorzugt mehrere der als erfindungsrelevant
genannten Sonden eine Länge
von zunehmend bevorzugt weniger als 200, 150, 125 oder 100 Nukleotiden,
vorzugsweise von 20 bis 60 Nukleotiden, besonders bevorzugt von
45 bis 55 Nukleotiden auf.
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Denn
die für
die Nachweisreaktion eingesetzten Sonden brauchen nur Teile der
zu detektierenden mRNA zu umfassen, sofern das über sie erhältliche Signal noch spezifisch
genug ist. Diese Spezifität,
die Unterscheidbarkeit verschiedener mRNA setzt die untere Grenze
für die
Länge der
betreffenden Sonden und muß gegebenenfalls
in Vorversuchen experimentell ermittelt werden.
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Die
Identifizierung von geeigneten Sonden ist dem Fachmann an sich bekannt
und wird normalerweise unter Zuhilfenahme spezialisierter Software
durchgeführt.
Beispiele für
solche Software sind die Programme Array Designer der Fa. Premier
Biosoft International, USA, und Vector NTI® Suite,
V. 7, erhältlich
von der Firma InforMax, Inc., Bethesda, USA. Neben den schon erwähnten Sekundärstrukturen
berücksichtigen
diese Softwareprogramme beispielsweise auch vorgegebene Sondenlängen sowie
Schmelztemperaturen.
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In
bevorzugten Ausführungsformen
erfindungsgemäßer Nukleinsäure-bindender
Chips wird durch die Bindung der mRNA an die betreffende als erfindungsrelevant
genannte Sonde ein elektrisches Signal ausgelöst.
-
In
dem bereits erwähnten
Artikel J. Wang (Acc. Chem. Res.; ISSN 0001-4842; Rec. Sept. 12,
2001, S. A–F)
werden die Vorteile eines elektrisch auswertbaren Systems gegenüber einem
optischen System diskutiert. Ferner wird auf verschiedene im Stand
der Technik entwickelte Ausführungsformen
solcher Sensoren verwiesen.
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So
beträgt
zum gegenwärtigen
Zeitpunkt die Zeitspanne von der Probennahme bis zum Messen des Signals
für optisch
auswertbare Chips ungefähr
24 h. Mithilfe eines elektrischen Systems liegt der Zeitbedarf momentan
bei weniger als 2 h (vergleiche 1). Demgegenüber liegt
die Zahl der gleichzeitig analysierbaren Proben bei elektrisch auswertbaren
Chips derzeit im zweistelligen Bereich, wobei jedoch eine rasche
Entwicklung dafür
spricht, daß diese
Größenordnung
in Kürze überschritten
werden kann. Limitierend hierfür
sind die elektronischen Auswerte-Einheiten für die verschiedenen Signale.
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Eine
im Stand der Technik etablierte Methode zur mRNA-Quantifizierung
stellt beispielsweise die RT-PCT dar. Diese wird in dem Artikel „Quantification
of Bacterial mRNA by One-Step RT-PCR Using the LightCycler System" (2003) von S.Tobisch,
T.Koburger, B.Jürgen,
S.Leja, M.Hecker und T.Schweder in BIOCHEMICA, Band 3, Seiten 5
bis 8 beschrieben. Demgegenüber
besitzt die Detektion über
Elektro-Chips einen weiteren Vorteil, nämlich die höhere Zuverlässigkeit der Daten, da diese
gegenüber
der RT-PCR deutlich geringere Schwankungsbreiten aufweisen.
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Die
Herstellung entsprechender elektronisch auswertbarer Chips wird
beispielsweise in den Patentanmeldungen WO 00/62048 A2, WO 00/67026
A1 und WO 02/41992 beschrieben, deren Offenbarungsgehalt vollständig in
die vorliegende Anmeldung einbezogen wird.
-
Die
Funktionsweise elektrisch auslesbarer Chips einer besonders bevorzugten
Ausführungsform
kann wie folgt beschrieben werden: Die genspezifischen Sonden sind
auf an sich bekannte Weise kovalent an magnetische Träger (Beads)
gebunden, die sich in hierfür
vorgesehenen Kammern der Chips befinden. Die spezifische Hybridisierung
der entsprechenden mRNA an die jeweiligen Beads erfolgt in dieser
Hybridisierungskammer, die temperierbar ist und von den betreffenden
Lösungen
durchspült
werden kann. Die Beads werden in dieser Kammer durch einen Magneten
festgehalten. Nach der Hybridisierung der RNA-Proben an die Beads-gebundenen
DNA-Sonden erfolgt ein Waschschritt zur Beseitigung der nicht-gebundenen
RNA, so daß in der
Inkubationskammer nur noch spezifische Hybride vorhanden sind, und
zwar gebunden an den magetischen Beads.
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Nach
dem Waschen wird eine Detektionssonde in die Inkubationskammer eingeleitet,
die über
eine Biotin-Extravidin-gebundene alkalische Phosphatase markiert
ist. Diese Sonde bindet an eine zweite freie Region der hybridisierten
mRNA. Dieses Hybrid wird anschließend erneut gewaschen und mit
dem Substrat der alkalischen Phosphatase Para-Aminophenolphosphat
(pAPP) inkubiert. Die enzymatische Reaktion in der Inkubationskammer
führt zur
Freisetzung des redoxaktiven Produkts para-Aminophenol (pAP). Dieses
wird nun über
die Red/Ox-Elektrode auf dem elektrischen Chip geleitet und das
Signal zu einem Potentiostaten gesendet.
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Eine
System-spezifische Software (zum Beispiel MCDDE32) liest die erhaltenen
Daten, und die Ergebnisse können
mit Hilfe eines weiteren Programms (zum Beispiel Origin) auf einem
Computer ausgewertet und dargestellt werden.
-
Selbstverständlich ist
dieser Prozeß sowohl
hinsichtlich der technischen Gestaltung der Chips als auch der Auswertung
variierbar. So kann beispielsweise die Nachweisreaktion auch durch
eine andere, wegen des elektrischen Meßprinzips vorzugsweise jedoch
eine Redoxreaktion erfolgen.
-
Eine
Leistung der vorliegenden Erfindung besteht darin, Stickstoffstoffwechsel-spezifische
und insofern prozeßkritische
Gene identifiziert und der Analyse über entsprechend gestaltete
Biochips zugänglich
gemacht zu haben. Der Vorteil von Chips gegenüber konventionellen Nachweismethoden
besteht neben dem Zeitgewinn und der höheren Genauigkeit darin, daß mit der
Bereitstellung mehrerer Sonden auf einem Träger gleichzeitig in derselben
Probe die Aktivitäten
von mehreren verschiedenen Genen nachgewiesen werden können und
bei der hier beschriebenen Anwendung auf ein spezielles Problem
ein solideres und detaillierteres Bild ergeben können, beispielsweise hisichtlich
des Zeitpunkts, zu dem ein Stickstoffmangel eingetreten ist.
-
Ein
eigener Erfindungsgegenstand ist somit die gleichzeitige Verwendung
von Nukleinsäure-
oder Nukleinsäure-Analogon-Sonden
für mindestens
drei der folgenden 49 Gene:
kdgR, citA, für ein putatives Protein (putativer
ABC-Transporter/Aminosäure-Permease)
codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO. 91), htrA, ycnI, für ein hypothetisches
Protein unbekannter Funktion codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID
NO. 41), für
ein hypothetisches Protein unbekannter Funktion codierendes Gen
(Homolog zu SEQ ID NO. 53), yppF, ygjN, ggt, alsR, glnA, nrgA, yciC,
yvtA, nrgB, für
ein konserviertes hypothetisches Protein unbekannter Funktion codierendes
Gen (Homolog zu SEQ ID NO. 19), für ein putatives Protein (ATP-Bindungsprotein
eines putativen ABC-Transporters)
codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO. 55), ycnJ, glnR, yvlA, yncE,
yvlB, für
ein putatives Protein (putative Hydrolase) codierendes Gen (Homolog
zu SEQ ID NO. 47), trpF, ydfS, trpD, für ein putatives Protein (putatives
Phagen-Capsid-Protein) codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO. 21),
ycnK, trpB, trpC, für
ein putatives Protein (putativer Transkriptions-Regulator) codierendes
Gen (Homolog zu SEQ ID NO. 17), für ein putatives Protein (putative
Serinprotease) codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO. 9), für ein putatives
Protein (putative Glycosylhydrolase/Lysozym) codierendes Gen (Homolog
zu SEQ ID NO. 85), für
ein putatives Protein (putative Malatsynthase, EC 4.1.3.2) codierendes Gen
(Homolog zu SEQ ID NO. 45), für
ein putatives Protein (putative Na(+)-verbundene D-Alanine-Glycinpermease)
codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO. 49), für ein hypothetisches Protein
unbekannter Funktion codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO. 95),
nasD, für
ein putatives Protein (putativer Ammonium-Transporter) codierendes
Gen (Homolog zu SEQ ID NO. 63), ycdH, nasC, für ein hypothetisches Protein
(enges Homolog zur Aldehyd-Dehydrogenase DhaS) codierendes Gen (Homolog
zu SEQ ID NO. 15), nasB, trpE, pckA, für ein putatives Protein (putatives
Stickstoff-Regulationsprotein
P-II) codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO. 93), nasF, yrkC, für ein hypothetisches
Protein unbekannter Funktion codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID
NO. 81),
gebunden an einen Nukleinsäure-bindenden Chip, vorzugsweise
an denselben, zur Bestimmung des physiologischen Zustands eines
einen biologischen Prozeß durchlaufenden
Organismus.
-
Wie
oben erläutert,
sind diese 49 Gene so ausgewählt,
daß sie
ein Bild über
die Situation des Stickstoffstoffwechels des betrachteten Organismus
liefern, weil sie wie in den Beispielen 1 bis 3 beschrieben bei dem Übergang
des grampositiven Bakteriums B. licheniformis in den Stickstoffmangelzustand
signifikant induziert werden. Eine vergleichbare Aussage ist auch
für andere
Organismen zu erwarten, die über
die homologen Gene beziehungsweise Proteine mit im wesentlichen
denselben stoffwechelrelevanten Eigenschaften verfügen.
-
Wie
ebenfalls bereits ausführlich
beschrieben, können
derartige Genaktivitäten
prinzipiell auf verschiedene Arten bestimmt werden, beispielsweise
durch Northern-Hybridisierung. Die Analyse mithilfe eines Nukleinsäure-bindenden
Chip, insbesondere eines oben beschriebenen, eröffnet jedoch die Möglichkeit,
auf sehr effiziente Weise gleichzeitig mehrere Genaktivitäten zu bestimmen
und dies zudem sehr zeitnah. Dadurch können die Stoffwechselveränderungen
eines Organismus, der einen biologischen Prozeß durchläuft, zeitnah beobachtet und
gegebenenfalls regulatorisch eingegriffen werden.
-
Die
oben gemachten Ausführungen
zu Nukleinsäure-bindenden
Chips gelten für
die hier bezeichneten Verwendungen der betreffenden Sonden entsprechend.
-
Vorzugsweise
handelt es sich dabei dementsprechend um solche Verwendungen, wobei
die Gesamtzahl aller Stickstoffmangel-spezifischen unterschiedlichen
Sonden nicht über
80 liegt.
-
Weiterhin
bevorzugt handelt es sich dabei dementsprechend um solche Verwendungen,
wobei die zuvor als erfindungsgemäß angegebenen Sonden in der
zuvor als bevorzugt angegebenen Reihenfolge (umgekehrt zur Reihenfolge
in Tabelle 3) zunehmend bevorzugt eingesetzt werden.
-
Entsprechend
den oben gemachten Ausführungen
sind folgende der soeben bezeichneten Verwendungen von Nukleinsäure- oder
Nukleinsäure-Analogon-Sonden
zunehmend bevorzugt:
- – Verwendung, wobei mindestens
eine, zunehmend bevorzugt zwei oder drei der Nukleinsäure- oder
Nukleinsäure-Analogon-Sonden
für Gene
aus den folgenden 33 Genen spezifisch ist/sind:
für ein konserviertes
hypothetisches Protein unbekannter Funktion codierendes Gen (Homolog
zu SEQ ID NO. 19), für
ein putatives Protein (ATP-Bindungsprotein eines putativen ABC-Transporters)
codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO. 55), ycnJ, glnR, yvlA, yncE,
yvlB, für
ein putatives Protein (putative Hydrolase) codierendes Gen (Homolog
zu SEQ ID NO. 47), trpF, ydfS, trpD, für ein putatives Protein (putatives Phagen-Capsid-Protein) codierendes
Gen (Homolog zu SEQ ID NO. 21), ycnK, trpB, trpC, für ein putatives Protein
(putativer Transkriptions-Regulator) codierendes Gen (Homolog zu
SEQ ID NO. 17), für
ein putatives Protein (putative Serinprotease) codierendes Gen (Homolog
zu SEQ ID NO. 9), für
ein putatives Protein (putative Glycosylhydrolase/Lysozym) codierendes
Gen (Homolog zu SEQ ID NO. 85), für ein putatives Protein (putative
Malatsynthase, EC 4.1.3.2) codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO.
45), für
ein putatives Protein (putative Na(+)-verbundene D-Alanine-Glycinpermease)
codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO. 49), für ein hypothetisches Protein
unbekannter Funktion codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO. 95),
nasD, für
ein putatives Protein (putativer Ammonium-Transporter) codierendes
Gen (Homolog zu SEQ ID NO. 63), ycdH, nasC, für ein hypothetisches Protein
(enges Homolog zur Aldehyd-Dehydrogenase DhaS) codierendes Gen (Homolog
zu SEQ ID NO. 15), nasB, trpE, pckA, für ein putatives Protein (putatives Stickstoff-Regulationsprotein
P-II) codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO. 93), nasF, yrkC, für ein hypothetisches
Protein unbekannter Funktion codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID
NO. 81);
- – hierunter
vorzugsweise für
Gene aus den folgenden 19 Genen:
trpC, für ein putatives Protein (putativer
Transkriptions-Regulator) codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO.
17), für
ein putatives Protein (putative Serinprotease) codierendes Gen (Homolog
zu SEQ ID NO. 9), für
ein putatives Protein (putative Glycosylhydrolase/Lysozym) codierendes
Gen (Homolog zu SEQ ID NO. 85), für ein putatives Protein (putative
Malatsynthase, EC 4.1.3.2) codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO.
45), für
ein putatives Protein (putative Na(+)-verbundene D-Alanine-Glycinpermease) codierendes Gen
(Homolog zu SEQ ID NO. 49), für
ein hypothetisches Protein unbekannter Funktion codierendes Gen (Homolog
zu SEQ ID NO. 95), nasD, für
ein putatives Protein (putativer Ammonium-Transporter) codierendes
Gen (Homolog zu SEQ ID NO. 63), ycdH, nasC, für ein hypothetisches Protein
(enges Homolog zur Aldehyd-Dehydrogenase DhaS) codierendes Gen (Homolog
zu SEQ ID NO. 15), nasB, trpE, pckA, für ein putatives Protein (putatives
Stickstoff-Regulationsprotein P-II) codierendes Gen (Homolog zu
SEQ ID NO. 93), nasF, yrkC, für
ein hypothetisches Protein unbekannter Funktion codierendes Gen
(Homolog zu SEQ ID NO. 81);
- – hierunter
besonders bevorzugt für
Gene aus den folgenden 12 Genen:
nasD, für ein putatives Protein (putativer
Ammonium-Transporter) codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO. 63),
ycdH, nasC, für
ein hypothetisches Protein (enges Homolog zur Aldehyd-Dehydrogenase
DhaS) codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO. 15), nasB, trpE, pckA,
für ein
putatives Protein (putatives Stickstoff-Regulationsprotein P-II) codierendes
Gen (Homolog zu SEQ ID NO. 93), nasF, yrkC, für ein hypothetisches Protein
unbekannter Funktion codierendes Gen (Homolog zu SEQ ID NO. 81);
- – hierunter
ganz besonders bevorzugt für
Gene aus den folgenden 4 Genen:
für ein putatives Protein (putatives
Stickstoff-Regulationsprotein P-II) codierendes Gen (Homolog zu
SEQ ID NO. 93), nasF, yrkC, für
ein hypothetisches Protein unbekannter Funktion codierendes Gen
(Homolog zu SEQ ID NO. 81).
-
Entsprechend
dem oben Gesagten handelt es sich vorzugsweise um erfindungsgemäße Verwendungen
von gleichzeitig mindestens 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18,
20, 22, 24, 26 28, 30, 35, 40, 45 oder 49 der genannten Sonden.
-
Entsprechend
dem oben Gesagten handelt es sich vorzugsweise um erfindungsgemäße Verwendungen,
wobei die Gesamtzahl aller unterschiedlichen Sonden zunehmend bevorzugt
nicht über
75, 70, 65, 60, 55, 50, 40, 30, 20 oder 10 liegt.
-
Entsprechend
dem oben Gesagten handelt es sich weiterhin bevorzugt um erfindungsgemäße Verwendungen
zur Bestimmung einer Änderung
im Stickstoffstoffwechsel des den biologischen Prozeß durchlaufenden
Organismus, vorzugsweise zur Detektion eines Stickstoffmangelzustands.
-
Entsprechend
dem oben Gesagten handelt es sich weiterhin bevorzugt um erfindungsgemäße Verwendungen,
wobei mindestens eine, zunehmend bevorzugt mehrere der genannten
Sonden von den Sequenzen abgeleitet sind, die im Sequenzprotokoll
unter den Nummern SEQ ID NO. 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21,
23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53,
55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85,
87, 89, 91, 93, 95 und 97 aufgeführt
sind.
-
Einen
eigenen Erfindungsgegenstand bilden Verfahren der Bestimmung des
physiologischen Zustands eines einen biologischen Prozeß durchlaufenden
Organismus durch Einsatz eines erfindungsgemäßen Nukleinsäure-bindenden
Chips.
-
Diese
Verfahren sehen prinzipiell so aus, daß während des Prozesses und ohne
ihn zu unterbrechen, Proben des betrachteten Organismus entnommen
und daraus die mRNA isoliert werden. Diese oder gegebenenfalls hiervon
abgleitete Verbindungen wie beispielsweise cDNA werden über einen
oben beschriebenen Nukleinsäure-bindenden
Chip geleitet, welcher unter Berücksichtigung
der oben angegebenen Verfahrensschritte – wie etwa ausreichende Inkubationszeit
oder Abwaschen unspezifisch bindender Nukleinsäuren – behandelt und schließlich dem
Detektionsgerät
zugeführt
wird. Solch ein Verfahrensprotokoll ist anhand des Beispiels elektrisch
auswertbarer Chips prinzipiell in 1 dargestellt.
-
Die
oben gemachten Ausführungen
zu Nukleinsäure-bindenden
Chips gelten für
die hier bezeichneten Verfahren der Bestimmung des physiologischen
Zustands eines einen biologischen Prozeß durchlaufenden Organismus
entsprechend.
-
Vorzugsweise
handelt es sich um erfindungsgemäße Verfahren,
wobei eine Änderung
im Stickstoffstoffwechsel des den biologischen Prozeß durchlaufenden
Organismus bestimmt wird, vorzugsweise ein Stickstoffmangelzustand.
-
Denn
bezüglich
dieses Einsatzgebiets sind die in den Beispielen beschriebenen und
oben aufgeführten
Gene ausgewählt
worden. Ihre signifikante Induktion geht zumindest bei B. licheniformis
mit dem Eintreten eines Stickstoffmangelzustands einher, so daß diese
mit den genannten Verfahren besonders zuverlässig detektiert werden können, und
zwar nicht nur bei B. licheniformis sondern mit zunehmend besseren
Erfolgsaussichten auch bei zunehmend verwandten Spezies (siehe oben).
Zudem stellt diese Stoffwechselsituation im Lebenszyklus vieler
Mikroorganismen einen kritischen Zeitpunkt dar. So war in den untersuchten
Beispielen (siehe unten) mit dem jeweiligen Eintritt des Stickstoffmangels
immer auch ein Übergang
in die stationäre Wachstumsphase
verbunden. Verfahren, die diesen Zeitpunkt frühzeitig zu erkennen helfen,
dienen dazu, diesen Übergang
zu verzögern
und insbesondere bei großtechnisch
genutzten Fermentationen die Phase der Produktion eines Wertstoffs
zu verlängern,
insbesonderwe wenn es sich um einen stickstoffhaltigen Wertstoff wie
etwa ein Protein handelt.
-
Eine
weitere Möglichkeit
der Verfahrensführung
bei der Kultivierung von Mikroorganismen besteht darin, neben der
zuerst (und somit besser) genutzten N-Quelle eine weitere zur Verfügung zu
stellen. In der Phase des zuerst beobachteten Stickstoffmangels
stellen sich die betreffenden Zellen, sofern sie dazu in der Lage sind,
auf die Nutzung der zweiten, für
sie schlechter verwertbaren N-Quelle ein. Mit diesem Übergang
ist in der Regel eine Verzögerung
im Wachstum zu beobachten, welches frühzeitig über ein erfindungsgemäßes Verfahren
erkannt werden kann.
-
Entsprechend
dem oben Gesagten sind solche erfindungsgemäßen Verfahren bevorzugt, wobei
es sich bei dem für
den Bioprozeß ausgewählten Organismus
um einen Vertreter einzelliger Eukaryonten, grampositiver oder gramnegativer
Bakterien handelt.
-
Entsprechend
dem oben Gesagten sind hierunter solche erfindungsgemäßen Verfahren
bevorzugt, wobei es sich bei den einzelligen Eukaryonten um Protozoen
oder um Pilze handelt, hierunter insbesondere Hefe, ganz besonders
Sacharomyces oder Schizosaccharomyces.
-
Entsprechend
dem oben Gesagten sind darunter auch solche erfindungsgemäßen Verfahren
bevorzugt, wobei es sich bei den grampositiven Bakterien um Coryneforme
Bakterien oder solche der Gattungen Staphylococcus, Corynebakterien
oder Bacillus handelt, insbesondere der Spezies Staphylococcus carnosus, Corynebacterium
glutamicum, Bacillus subtilis, B. licheniformis, B. amyloliquefaciens,
B. agaradherens, B. stearothermophilus, B. globigii oder B. lentus,
und ganz besonders um B. licheniformis.
-
Entsprechend
dem oben Gesagten sind darunter auch solche erfindungsgemäßen Verfahren
nicht minder bevorzugt, wobei es sich bei den gramnegativen Bakterien
um solche der Gattungen E. coli oder Klebsiella handelt, insbesondere
um Derivate von Escherichia coli K12, von Escherichia coli B oder
Klebsiella planticola, und ganz besonders um Derivate der Stämme Escherichia
coli BL21 (DE3), E. coli RV308, E. coli DH5α, E.coli JM109, E. coli XL-1
oder Klebsiella planticola (Rf).
-
Entsprechend
dem oben Gesagten sind solche erfindungsgemäßen Verfahren bevorzugt, wobei
solche der genannten Sonden zum Einsatz kommen, die von den im Sequenzprotokoll
angegebenen SEQ ID NO. 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23,
25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55,
57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87,
89, 91, 93, 95 oder 97 abgeleitet sind.
-
Hierunter
sind wiederum diejenigen Verfahren bevorzugt, bei denen die hier
genannten Sonden für
die zuvor aufgeführten
grampositiven Bakterien, insbesondere B. licheniformis eingesetzt
werden, da diese Sequenzen aus eben diesem Organismus isoliert worden
sind und somit am erfolgreichsten auf diese Spezies angewendet werden
können.
-
Entsprechend
dem oben Gesagten sind solche erfindungsgemäßen Verfahren bevorzugt, wobei
die Bestimmung des physiologischen Zustands zu verschiedenen Zeitpunkten
desselben Prozesses durchgeführt wird,
vorzugsweise unter Einsatz mehrerer baugleicher Nukleinsäure-bindender
Chips, besonders bevorzugt desselben Nukleinsäure-bindenden Chips.
-
Entsprechend
dem oben Gesagten sind weiterhin solche erfindungsgemäßen Verfahren
bevorzugt, wobei es sich bei dem Prozeß um eine Fermentation, insbesondere
um die fermentative Herstellung eines gewerblich einsetzbaren Produkts,
besonders bevorzugt um die Herstellung eines Proteins oder einer
niedermolekularen chemischen Verbindung handelt.
-
Entsprechend
dem oben Gesagten sind hierunter solche erfindungsgemäßen Verfahren
bevorzugt, wobei es sich bei der niedermolekularen chemischen Verbindung
um einen Naturstoff, einen Nahrungsmittelergänzungsstoff oder um eine pharmazeutisch
relevante Verbindung handelt.
-
Entsprechend
dem oben Gesagten sind alternativ auch solche erfindungsgemäßen Verfahren
bevorzugt, wobei es sich bei dem Protein um ein Enzym handelt, insbesondere
eines aus der Gruppe der α-Amylasen,
Proteasen, Cellulasen, Lipasen, Oxidoreduktasen, Peroxidasen, Laccasen,
Oxidasen und Hemicellulasen.
-
Einen
eigenständigen
Erfindungsgegenstand stellen auch die Verwendungsmöglichkeiten
erfindungsgemäßer Nukleinsäure-bindender
Chips, wie sie oben eingehend beschrieben sind, zur Bestimmung des
physiologischen Zustands eines einen biologischen Prozeß durchlaufenden
Organismus dar.
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Die
oben gemachten Ausführungen
zu Nukleinsäure-bindenden
Chips gelten für
die hier bezeichneten Verwendungen der Bestimmung des physiologischen
Zustands eines einen biologischen Prozeß durchlaufenden Organismus
entsprechend.
-
Entsprechend
dem oben Gesagten sind solche erfindungsgemäßen Verwendungen bevorzugt,
wobei eine Änderung
im Stickstoffstoffwechsel des den biologischen Prozeß durchlaufenden
Organismus bestimmt wird, vorzugsweise ein Stickstoffmangelzustand.
-
Entsprechend
dem oben Gesagten sind weiterhin solche erfindungsgemäßen Verwendungen
bevorzugt, wobei es sich bei dem für den Bioprozeß ausgewählten Organismus
um einen Vertreter einzelliger Eukaryonten, grampositiver oder gramnegativer
Bakterien handelt.
-
Entsprechend
dem oben Gesagten sind hierunter solche erfindungsgemäßen Verwendungen
bevorzugt, wobei es sich bei den einzelligen Eukaryonten um Protozoen
oder um Pilze handelt, hierunter insbesondere Hefe, ganz besonders
Sacharomyces oder Schizosaccharomyces.
-
Entsprechend
dem oben Gesagten sind alternativ hierzu solche erfindungsgemäßen Verwendungen nicht
minder bevorzugt, wobei es sich bei den grampositiven Bakterien
um Coryneforme Bakterien oder solche der Gattungen Staphylococcus,
Corynebakterien oder Bacillus handelt, insbesondere der Spezies
Staphylococcus carnosus, Corynebacterium glutamicum, Bacillus subtilis,
B. licheniformis, B. amyloliquefaciens, B. agaradherens, B. stearothermophilus,
B. globigii oder B. lentus, und ganz besonders um B. licheniformis.
-
Entsprechend
dem oben Gesagten sind solche erfindungsgemäßen Verwendungen nicht minder
bevorzugt, wobei es sich bei den gramnegativen Bakterien um solche
der Gattungen E. coli oder Klebsiella handelt, insbesondere um Derivate
von Escherichia coli K12, von Escherichia coli B oder Klebsiella
planticola, und ganz besonders um Derivate der Stämme Escherichia
coli BL21 (DE3), E. coli RV308, E. coli DH5α, E.coli JM109, E. coli XL-1
oder Klebsiella planticola (Rf).
-
Entsprechend
dem oben Gesagten sind solche erfindungsgemäßen Verwendungen bevorzugt,
wobei solche der genannten Sonden zum Einsatz kommen, die von den
im Sequenzprotokoll angegebenen SEQ ID NO. 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13,
15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45,
47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77,
79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95 oder 97 abgeleitet sind.
-
Hierunter
sind wiederum aus dem bereits genannten Grund diejenigen Verwendungen
bevorzugt, bei denen die hier genannten Sonden für die zuvor aufgeführten grampositiven
Bakterien, insbesondere B. licheniformis eingesetzt werden.
-
Entsprechend
dem oben Gesagten sind solche erfindungsgemäßen Verwendungen bevorzugt,
wobei die Bestimmung des physiologischen Zustands zu verschiedenen
Zeitpunkten desselben Prozesses durchgeführt wird, vorzugsweise unter
Einsatz mehrerer baugleicher Nukleinsäure-bindender Chips, besonders
bevorzugt desselben Nukleinsäure-bindenden
Chips.
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Entsprechend
dem oben Gesagten sind weiterhin solche erfindungsgemäßen Verwendungen
bevorzugt, wobei es sich bei dem Prozeß um eine Fermentation, insbesondere
um die fermentative Herstellung eines gewerblich einsetzbaren Produkts,
besonders bevorzugt um die Herstellung eines Proteins oder einer
niedermolekularen chemischen Verbindung handelt.
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Entsprechend
dem oben Gesagten sind hierunter solche erfindungsgemäßen Verwendungen
bevorzugt, wobei es sich bei der niedermolekularen chemischen Verbindung
um einen Naturstoff, einen Nahrungsmittelergänzungsstoff oder um eine pharmazeutisch
relevante Verbindung handelt.
-
Entsprechend
dem oben Gesagten sind alternativ dazu solche erfindungsgemäßen Verwendungen bevorzugt,
wobei es sich bei dem Protein um ein Enzym handelt, insbesondere
eines aus der Gruppe der α-Amylasen,
Proteasen, Cellulasen, Lipasen, Oxidoreduktasen, Peroxidasen, Laccasen,
Oxidasen und Hemicellulasen.
-
Die
vorliegende Erfindung wird zusätzlich
durch die nachfolgenden Beispiele erläutert.
-
Beispiele
-
Alle
molekularbiologischen Arbeitsschritte folgen Standardmethoden, wie
sie beispielsweise in dem Handbuch von Fritsch, Sambrook und Maniatis „Molecular
cloning: a laboratory manual",
Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York, 1989, oder vergleichbaren
einschlägigen
Werken angegeben sind. Enzyme und Baukästen (Kits) werden nach den
Angaben der jeweiligen Hersteller eingesetzt.
-
Beispiel 1
-
Identifizierung der Gensonden
durch Chipanalysen
-
Kultivierung
von Bakterien und Probengewinnung Zellen des Stamms Bacillus licheniformis
DSM13 (erhältlich
von der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen
GmbH, Mascheroder Weg 1b, 38124 Braunschweig; http://www.dsmz.de)
wurden in Stickstoff-limitiertem, synthetischem Belitsky-Minimalmedium
(1 mM Endkonzentration) bei 37°C
unter konstantem Schütteln
bei 270 rpm kultiviert. Dieses Medium weist folgende Zusammensetzung
auf: (1.) Grundmedium (pH 7,5): 0,015 M (NH4)2SO4, 0,008 M MgSO4 × 7H2O, 0,027 M KCl, 0,007 M Na3Citrat × 2H2O, 0,050 M Tris-HCl und 0,009 M Glutaminsäure; (2.)
Supplemente: 0,2 M KH2PO4,
0,039 M L-Tryptophan-HCL, 1 M CaCl2 × 2H2O, 0,0005 M FeSO4 × 7H2O, 0,025 M MnSO4 × 4H2O und 20% (w/v) Glukose; und als (3.) Mediumsupplementierungsschema:
0,14 ml KH2PO4,
0,2 ml CaCl2, 0,2 ml FeSO4,
0,04 ml MnSO4, 1 ml Glukose. Alle Werte
sind beziehen sich auf 100 ml Grundmedium.
-
Im
Verlauf der Wachstumskurve wurden bei einer optischen Dichte bei
500 nm (OD500) von 0,4 bis 0,5 die Kontrollprobe
und in der transienten Wachstumsphase bei einer OD500 von
0,8 bis 0,9 eine weitere Probe („Übergang") entnommen. Das oben angegebene Supplementierungsschema
für das
Belitzky-Minimalmedium ist so eingestellt, daß ab einer OD500 von
0,8 bis 1,0 Stickstoffmangel eintritt und somit die stationäre Phase eingeleitet
wird. Weitere Probennahmen erfolgten nach weiteren 30, 60, 90 und
120 min. Die Proben wurden nach Entnahme sofort mit demselben Volumen,
auf 0°C
gekühlten
Killing Puffer (20 mM NaN3; 20 mM Tris-HCl, pH
7,5; 5 mM MgCl2) versetzt. Nach sofortigem
Abzentrifugieren des Zellpellets für 5 min bei 4°C und 15.000 rpm
wurde der Überstand
verworfen und das Pellet entweder bei –80°C eingefroren oder sofort weiter
aufgearbeitet.
-
Zellaufschluß
-
Der
Zellaufschluß erfolgte
mit dem „Hybaid
RiboLyserTM Cell Disruptor" (Fa. Thermo Electron
Corporation, Dreieich, Deutschland). Diese Methode basiert auf der
mechanischen Zerstörung
der Zellwand und der Zellmembran mit Hilfe von ca. 0,1 mm kleinen
Glasperlen (Fa. Sartorius BBI, Melsungen, Deutschland). Die aufzuschließenden Zellen,
die zuvor in Lysis-Puffer II (3 mM EDTA; 200 mM NaCl) resuspendiert
worden waren, wurden zusammen mit den Glasperlen in ein Glas- (Stammhaltungs-)röhrchen gegeben.
Zusätzlich
wurde saures Phenol dazugegeben, um die Degradation der RNA durch
RNasen zu vermeiden. Dieses Röhrchen wurde
daraufhin in den RiboLyser eingespannt, wobei unter starkem Schütteln die
Glassperlen mit den Zellen kollidierten, was den Zellaufschluß bewirkte.
-
Gesamt-RNA-Isolierung
-
Nach
dem Zellaufschluß wird
die RNA-haltige wäßrige Phase
durch Zentrifugation von den Protein- und Zellfragmenten, der chromosomalen
DNA und den Glassperlen getrennt und daraus die RNA mit Hilfe des Geräts KingFisher
mL (Fa. Thermo Electron Corporation, Dreielch, Deutschland) unter
Verwendung des MagNA Pure LC RNA Isolation Kit I (Fa. Roche Diagnostics,
Penzberg, Deutschland) isoliert. Diese Aufreinigung basiert auf
der Bindung der RNA an magnetische Glaspartikel in der Gegenwart
von chaotropen Salzen, welche auch die Inaktivierung von RNasen
bewirken. Dabei dienen die magnetischen Partikel als Transportmittel der
RNA zwischen verschiedenen Reaktionsgefäßen, die mit Bindungs-, Wasch-
und Elutionspuffern befüllt sind.
Der hierfür
genutzte KingFisher mL ist eine Art Pipettierroboter, der mit Hilfe
von Magneten die Partikel mit der gebundenen RNA zwischen den Gefäßen hin-
und hertransportiert und auch zum Mischen der Proben genutzt wird.
Abschließend
wird die RNA von den magnetischen Partikeln gelöst und liegt gereinigt vor.
-
RNA-Qualitäts- und
-Quantitätskontrolle
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An
die Aufreinigung der RNA schließt
sich die Qualitäts-
und Quantitätskontrolle
an. Der hierfür
genutzte Apparat Agilent Bioanalyzer 2100 (Fa. Agilent Technologies,
Berlin, Deutschland) ermöglicht
die Analyse von RNA im Lab-on-a-Chip-Maßstab. Zusammen mit dem „RNA 6000
Nano Kit" von Agilent
wird die Gesamt-RNA gelelektrophoretisch aufgetrennt und bietet
somit die Möglichkeit
der Untersuchung der Qualität
in Hinblick auf Teilabbau und Verunreinigungen. Hierbei wird ribosomale
RNA (16 S- und 23 S-rRNA) detektiert. Stellen diese sich als klare
Banden dar, kann man davon ausgehen, daß die RNA im Verlauf der Bearbeitung nicht
abgebaut wurde und somit intakt ist und in die nachfolgenden Untersuchungen
eingebracht werden kann. Zusätzlich
wird dabei auch die genaue Konzentration bestimmt.
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Transkriptomanalysen
-
Die
Transkriptomanalysen wurden mit gesamtgenomischen B. licheniformis
DSM13-DNA-Microarrays durchgeführt, die
auf herkömmliche
Weise (beispielsweise gemäß WO 95/11995
A1) hergestellt worden waren und über ein optisches System auswertbar
sind. Auf diesen DNA Microarrays lag nahezu jedes Gen aus B. licheniformis
in doppelter Ausführung
vor, so daß zwei
Proben parallel auf demselben Chip analysiert und die erhaltenen
Werte gemittelt werden konnten.
-
Das
Prinzip der vorgenommenen Messung besteht darin, daß die jeweiligen
mRNA-Moleküle aus der entnommenen
Probe in vitro über
eine reverse Transkription in DNA umgeschrieben werden, wobei eines
der zugesetzten Desoxyribonukleotide einen Farbmarker trägt. Diese
markierten Moleküle
werden dann mit den bekannten, auf bekannten Stellen des Chip liegenden
Sonden hybridisiert und die jeweilige Stärke des an den betreffenden
Stellen auf den Fluoreszenzmarker zurückzuführenden Signals optisch erfaßt. Bei
Verwendung zweier verschiedener Fluoreszenzmarker für eine Kontrolle
und für
eine eigentlich zu untersuchende Probe, die gleichzeitig zur Hybridisierung
gebracht werden und somit um die Bindung an die vorgelegte Sonde
konkurrieren, gelangt man zu unterschiedlichen Farbwerten, die ein
Maß für das Verhältnis der
Konzentration der Kontrolle zur Konzentration der Probe liefern.
-
Für diese
Markierung wurde dUTP gewählt,
welches mit dem Fluoreszenzfarbstoff Cyanin 3 oder mit Cyanin 5
markiert war. So wurden jeweils 25 μg Gesamt-RNA der Kontrolle (OD500 0,4) mit dem Fluoreszenzfarbstoff Cyanin
3 (Fa. Amersham Biosciences Europe GmbH, Freiburg, Deutschland)
und 25 μg
Gesamt-RNA der jeweiligen Streßprobe
(transiente Phase, 30, 60, 90 und 120 min) mit dem Fluoreszenzfarbstoff
Cyanin 5 (Fa. GE Healthcare, Freiburg, Deutschland) markiert. Die
kompetitive Hybridisierung der beiden Proben auf dem herkömmlichen,
gesamtgenomischen B. licheniformis-DSM13-DNA-Microarray erfolgte für mindestens 16
Stunden bei 42°C.
-
Nach
dem Waschen der Arrays zur Entfernung unspezifischer Bindungen erfolgte
die optische Auslesung der Arrays mit Hilfe des ScanArray® Express
Laser Scanners (Fa. PerkinElmer Life and Analytical Sciences, Rodgau-Jügesheim,
Germany). Alle Hybridisierungen wurden wiederholt, wobei die Proben
mit dem jeweiligen anderen Farbstoff markiert wurden (Dye-Swap-Verfahren).
Die quantitative Auswertung der Arrays wurde unter Verwendung der
Software ScanArray® Express (erhältlich von
der Fa. PerkinElmer Life and Analytical Sciences Rodgau-Jügesheim,
Deutschland) nach Herstellerangaben und unter Standard-Parametern durchgeführt.
-
Unter
Zuhilfenahme der Kontrollen der Lucidea Score Card (Fa. GE Healthcare,
Freiburg, Deutschland) wurden die Arrays normalisiert und evaluiert.
Mit Hilfe dieser „Score
Card", welche zur
Kontrolle der Effizienz und Qualität der Hybridisierung dient,
waren entsprechend den Herstellerangaben bekannte Kontroll-DNA und
sogenannte Spikes in Form von Oligos auf das Array aufgebracht und
in der Hybridisierung mit komplementären Sequenzen versetzt worden.
Somit konnte man nach dem Scannen den Erfolg der Hybridisierung
und des Einbaus der Farbstoffe kontrollieren. Die Kontrollen sollten
in beiden Proben in gleicher Menge vorhanden sein und somit nach
dem Scannen gelb erscheinen beziehungsweise eine Ratio zwischen
beiden Kanälen
von 1 aufweisen. Die Spikes sind für die jeweilige Probe spezifisch,
und werden in verschiedenen Verdünnungen
aufgebracht, das heißt
sie erscheinen nach dem Scannen für die jeweilige Probe rot oder
grün.
-
Für die Expression
der Gene wurden Mittelwerte aus den zwei Hybridisierungen sowie
die jeweiligen Standardabweichungen errechnet. Für eine signifikante Induktion
oder eine signifikante Repression werden folgende Schwellenwerte
für das
Verhältnis
der RNA-Menge des
jeweiligen Gens gegenüber
dem Kontrollwert betrachtet: Als induziert gelten die Gene, deren
RNA ein Verhältnis > 3 (das heißt mindestens
eine Verdreifachung) aufweist; deutlich reprimiert sind Gene mit
einem RNA-Verhältnis < 0,3 (das heißt einem
Absenken auf weniger als 30%). Diese Resultate werden in Beispiel
2 aufgelistet.
-
Beispiel 2
-
Unter Stickstoffmangel
induzierte Gene
-
In
folgender Tabelle 1 sind alle in Beispiel 1 ermittelten 210 Gene
von Bacillus licheniformis DSM13 aufgeführt, deren (mindestens den
Faktor 3 betragende) Induzierung unter den Bedingungen des in Beispiel 1
beschriebenen Stickstoffmangels beobachtet wurde. In den ersten
beiden Spalten sind der jeweilige Name des abgeleiteten Proteins
beziehungsweise (soweit vorhanden) dessen Abkürzung abgegeben; die „BLi-Nummer" entspricht dem „locus_tag" des unter dem Eintrag
AE017333 (Basen 1 bis 4.222.645) in der Datenbank GenBank (National
Center for Biotechnology Information NCBI, National Institutes of
Health, Bethesda, MD, USA; httpa/www.ncbi.nlm.nih.gov; Stand 2.12.2004)
zugänglichen
Gesamtgenoms von B. licheniformis; anschließend folgen die zu den oben
angegebenen Zeitpunkten beobachteten Faktoren zur Steigerung der
Konzentration der jeweils zugehörigen
mRNAs.
-
Tabelle
1: Die in Beispiel 1 ermittelten 210 Gene von Bacillus licheniformis
DSM13, deren (mindestens den Faktor 3 betragende) Induzierung unter
Stickstoffmangel beobachtet wurde (Erläuterungen: siehe Text).
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Beispiel 3
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Speziell unter Stickstoffmangel
deutlich induzierte Gene
-
Wie
Tabelle 1 zeigt, sind unter den Bedingungen des in Beispiel 1 beschriebenen
Stickstoffmangels zu irgendeinem der gemessenen Zeitpunkte insgesamt
67 der in Beispiel 1 untersuchten Gene von Bacillus licheniformis
DSM13 um mindestens den Faktor 8 induziert worden. Hierunter waren
allerdings auch 18 Gene, die auch durch den Mangel an mindestens
einer anderen Verbindung induziert worden sind (Daten nicht gezeigt)
und deshalb nicht als spezifische Signale für einen Stickstoffmangel angesehen
werden können.
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Somit
verblieben 49 Gene, die zu irgendeinem der gemessenen Zeitpunkte
mindestens um den Faktor 8 induziert worden sind und die als vergleichsweise
spezifisch eingestuft werden können.
Sie sind in folgender Tabelle 2 zusammengestellt. Deren Spaltenbezeichnungen
sind dieselben wie im vorangegangenen Beispiel. Zusätzlich sind
in der ersten Spalte die Sequenznummern angegeben, die die jeweiligen
DNA-beziehungsweise
Aminosäuresequenzen
in dem zur vorliegenden Anmeldung gehörenden Sequenzprotokoll tragen.
Besonderheiten der jeweiligen Sequenzen, die im Sequenzprotokoll
als freier Text auftauchen, sind unter der Rubrik Genname/Genfunktion
ergänzt.
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Tabelle
2: Die in Beispiel 1 ermittelten 62 Gene von Bacillus licheniformis
DSM13, deren speziell durch Stickstoffmangel hervorgerufene Induzierung
zu irgendeinem der gemessenen Zeitpunkte mindestens den Faktor 8
betragen hat (Erläuterungen:
siehe Text).
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In
folgender Tabelle 3 sind dieselben 49 Gene noch einmal in der Reihenfolge
der beobachtenen Stärke
der Induktion aufgelistet. In dieser Reihenfolge werden im Beschreibungsteil
die zugehörigen
Bezeichnungen in deutscher Sprache angegeben. An der umgekehrten
Reihenfolge orientiert sich die Staffelung der Anspruchsgegenstände.
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Tabelle
3: Die in Beispiel 1 ermittelten 49 Gene von Bacillus licheniformis
DSM13, deren speziell durch Stickstoffmangel hervorgerufene Induzierung
zu irgendeinem der gemessenen Zeitpunkte mindestens den Faktor 8
betragen hat; in absteigender Reihenfolge des jeweils gemessenen
Maximalwerts (letzte Spalte).
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Beispiel 4
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Real-Time-RT-PCR-Quantifizierung
ausgewählter
Gene
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Mit
Hilfe der Real-Time-RT-PCR ist es möglich, die absoluten Molekülzahlen
von spezifischen Transkripten in einer Probe zu ermitteln. Es wurde
der LightCycler (Fa. Roche Diagnostics, Penzberg, Deutschland) in
Verbindung mit dem "SYBR
Green I" Kit (Fa.
Roche Diagnostics) genutzt. Diese Methode basiert auf der Detektion
der Bindung des fluoreszierenden Farbstoffs an doppelsträngige DNA.
Die Quantifizierung der spezifischen mRNA-Moleküle erfolgte wie in Tobisch
et al. (2003; Quantification of Bacterial mRNA by One-Step RT-PCR
Using the LightCycler System; BIOCHEMICA, Band 3, Seiten 5 bis 8)
beschrieben, wobei für
jede zu untersuchende mRNA eine externe Standardkurve erstellt wurde.
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Dazu
wurden Verdünnungen
bekannter Konzentrationen von In-vitro-Transkripten der in Beispiel
1 ermittelten und Beispiel 2 aufgelisteten mRNA mit Hilfe des LightCyclers
gemessen und dann unter Verwendung der gerätespezifischen Software die
Standardkurve erstellt. Dazu mußten
im Vorfeld für
jede zu untersuchende mRNA spezifische Primer ausgewählt werden
(mit Hilfe der Software „Array
Designer"; erhältlich von
der Firma PREMIER Biosoft International, Palo Alto, USA), die eine
Synthese von Invitro-Transkripten sowie die PCR-Amplifikation im
LightCycler ermöglichen.
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Nach
Herstellung der externen Standardkurve konnte mit der Messung im
LightCycler begonnen werden. Für
die Messungen wurden zwei unterschiedliche Verdünnungen für jede zu analysierende Probe
eingesetzt. Im LightCycler-Lauf wurde dann mit den jeweiligen Primern
das spezifische Transcript amplifiziert und die Einlagerung des
Farbstoffs gemessen.
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Unter
Verwendung der LightCycler-Software sowie des auf der Webseite http://molbiol.ru/ger/scripts/01_07.html
zugänglichen
Skripts (2.12.2004) konnte die genaue Molekülzahl für ausgewählte Transkripte ermittelt
werden. Mit den auf diese Weise erhaltenen Werten und deren Relationen
zueinander wurden für
die ausgewählten
Transkripte die in den Tabellen 1 und 2 angegebenen Induktionswerte
bestätigt.
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Beschreibung
der Figuren
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1:
Schematische Darstellung des At-line-Monitoring eines Bioprozesses
mit erfindungsgemäßen elektrischen
DNA-Chips
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Die
zeitnahe Überwachung
des Bioprozesses geschieht vorteilhafterweise über folgende Arbeitsschritte:
- 1. Probennahme, beispielsweise aus der Fermentation
eines Mikroorganismus;
- 2. Zellaufschluß über Routine-Methoden;
- 3. RNA-Isolierung über
Routine-Methoden;
- 4. Hybridisierung auf einem erfindungsgemäß mit Nukleinsäuren (beispielsweise
DNA) oder Nukleinsäure-Analoga
(beispielsweise schwer hydrolysierbaren, analog aufgebauten Verbindungen)
beladenen Chip;
- 5. Erfassung der elektrischen Signale eines entsprechend konstruierten
Elektro-Chips; alternativ
wäre auch die
Aufnahme optischer Signale von einem optischen DNA-Chip möglich;
- 6. Vorzugsweise Rechner-gestützte
Datenauswertung.
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Bei
Einsatz elektrischer Chips ergibt sich nach derzeitigem Entwicklungsstand
eine ungefähre
Gesamtanalysenzeit von weniger als 2 h, bei Einsatz konventioneller
optischer DNA-Chips von ca. 12 h.
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Es
folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25.
Dieses kann
von der amtlichen Veröffentlichungsplattform
des DPMA heruntergeladen werden.