DE202013004928U1

DE202013004928U1 - Mittel zur schnellen quantitativen und qualitativen Bestimmung von Schimmelpilzen und Hefen

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Publication number: DE202013004928U1
Application number: DE201320004928
Authority: DE
Original assignee: Biotec GmbH Umwelt Analytik Beratung Service
Current assignee: Biotec GmbH Umwelt Analytik Beratung Service
Priority date: 2012-05-29
Filing date: 2013-05-28
Publication date: 2013-06-27
Anticipated expiration: 2023-05-29
Also published as: DE202012005258U1; DE202012005258U8

Abstract

Ein Lysepuffer zur Lyse von Schimmelpilzen und/oder Hefen, wobei der Lysepuffer geeignet ist, die Zellwände taxonomisch weit entfernter Schimmelpilze und Hefen zu lysieren.

Description

Gebiet der Technik
Die vorliegende Erfindung liegt auf dem Gebiet der Bioanalytik. Genauer betrifft die Erfindung den Nachweis und die Quantifizierung von Pilzen mittels PCR und DNA-Hybridisierung.
Hintergrund
Der taxonomische Nachweis von Schimmelpilzen und Hefen ist grundsätzlich mit Schwierigkeiten verbunden. Klassisch erfolgte die Taxonomie über Färbung und Mikroskopie anhand von Koloniemorphologie und -farbe, da niedere Pilze einen unterschiedlichen Habitus auf verschiedenen Medien zeigen. Die Form dieser Taxonomie ist jedoch unzureichend.
Moderne DNA-basierende Methoden machen die Zuordnung eindeutig. Mit dieser Methodik lässt sich im Bereich Analytik erheblich Zeit einsparen, da die Pilze auf Nährmedien nicht mehr bis zur visuellen Koloniegröße heranwachsen müssen. Dies kann bei der Diagnostik im medizinischen Bereich und bei der Auswahl der nachfolgenden Therapie von erheblicher Bedeutung sein.
Der Zellwandaufschluss der betreffenden Pilze jedoch stellt eine Schwierigkeit dar, da diese von Pilz zu Pilz variiert. Ursprünglich wurde die Zellwandlyse von Pilzen daher jeweils an die zu untersuchende Spezies adaptiert. Die Untersuchung von Proben mit unbekannten Pilzen oder ihren Sporen ließ den Wunsch nach einer universellen Kombination von Enzymen für die Lyse von Zellwänden entstehen. Erste Ansätze gab es hier im Bereich der Kochlyse, die jedoch nicht in jedem Fall zur Lyse der Pilzzellwand führt. Daher besteht nach wie vor ein Bedarf an Lysepuffern und -verfahren, die es ermöglichen, taxonomisch entfernte Schimmelpilze und/oder Hefen zuverlässig in einem Arbeitsschritt zu lysieren und für die taxonomische Untersuchung vorzubereiten.
Kurze Beschreibung der Erfindung
Daher umfasst die Erfindung in einer ersten Ausführungsform einen Lysepuffer zur Lyse von Schimmelpilzen und/oder Hefen, wobei der Lysepuffer geeignet ist, die Zellwände taxonomisch weit entfernter Schimmelpilze und Hefen zu lysieren. Bevorzugt umfasst der Lysepuffer Chitinase, wobei die Chitinase optional in einer Konzentration von 0,1 μg/ml bis 3,0 μg/ml im Lysepuffer vorliegt, und wobei die Chitinase vorzugsweise in einer Konzentration von etwa 0,44 μg/ml im Lysepuffer vorliegt. Der Lysepuffer kann weiter umfassen 5 mM bis 200 mM Tris/HCl, 10 mM bis 250 mM NaCl und 2 mM bis 50 mM MgCl₂, wobei der Lysepuffer einen pH von 4,5 bis 7,5 aufweisen kann.
In einer weiteren Ausführungsform umfasst die Erfindung einen Kit zum Nachweis von Schimmelpilzen und/oder Hefen, der Kit umfassend einen ersten Lysepuffer wie vorstehend beschrieben; einen zweiten Lysepuffer, wobei der zweite Lysepuffer Lyticase umfasst, wobei die Lyticase optional in einer Konzentration von 300 bis 2000 U/ml im zweiten Lysepuffer vorliegt und wobei die Lyticase vorzugsweise in einer Konzentration von etwa 700 U/ml im zweiten Lysepuffer vorliegt; und mindestens ein Reaktionsgefäß, wobei an der Innenseite des mindestens einen Reaktionsgefäßes mindestens eine Art Nukleinsäuresonde gebunden ist, wobei jede Art Nukleinsäuresonde für einen Schimmelpilz oder eine Hefe spezifisch ist und eine Bindungssequenz umfasst, die komplementär ist zu einer genomischen Sequenz oder der Komplementärsequenz einer genomischen Sequenz des Schimmelpilzes oder der Hefe, die in einem DNA-Bereich umfassend die ITS1, die 5,8S rDNA und die ITS2 liegt.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Kits umfasst der zweite Lysepuffer weiter 10 mM bis 250 mM Tris/HCl, 2 mM bis 50 mM EDTA und 5 mM bis 100 mM β-Mercaptoethanol, wobei der zweite Lysepuffer einen pH von 6,0 bis 9,0 aufweist.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung einen alternativen Lysepuffer bereit, der zusätzlich zu Chitinase auch Cellulase, Pectinase und Amylase umfasst, wobei Chitinase, Cellulase, Pectinase und Amylase vorzugsweise jeweils in einer Konzentration von 3–5 U/ml vorliegen. In einer weiteren Ausführungsform umfasst die Erfindung einen Kit zum Nachweis von Schimmelpilzen und/oder Hefen, der Kit umfassend einen alternativen Lysepuffer wie vorstehend beschrieben und mindestens ein Reaktionsgefäß, wobei an der Innenseite des mindestens einen Reaktionsgefäßes mindestens eine Art Nukleinsäuresonde gebunden ist, wobei jede Art Nukleinsäuresonde für einen Schimmelpilz oder eine Hefe spezifisch ist und eine Bindungssequenz umfasst, die komplementär ist zu einer genomischen Sequenz oder der Komplementärsequenz einer genomischen Sequenz des Schimmelpilzes oder der Hefe, die in einem DNA-Bereich umfassend die ITS1, die 5,8S rDNA und die ITS2 liegt.
In einer weiteren Ausführungsform können die Schimmelpilze und/oder Hefen ausgewählt sein aus der Gruppe bestehend aus den Zygomycetes, den Ascomycetes und den Deuteromycetes.
In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Kits ist an jedes der mindestens ein Reaktionsgefäße jeweils eine einzige Art Nukleinsäuresonde gebunden. In einer anderen Ausführungsform sind an mindestens ein Reaktionsgefäß mehrere Arten von Nukleinsäuresonden gebunden.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst der erfindungsgemäße Kit weiter eine Reaktionsmischung umfassend mindestens eine DNA-Polymerase, dNTPs, einen ersten Primer und einen zweiten Primer, wobei der erste Primer am 3'-Ende eine Sequenz enthält, die spezifisch an eine Zielsequenz eines Schimmelpilzes oder einer Hefe bindet, die in der 18S rDNA liegt, und wobei der zweite Primer am 3'-Ende eine Sequenz enthält, spezifisch an eine Zielsequenz des Schimmelpilzes oder der Hefe bindet, die in der 28S rDNA liegt. Die DNA-Polymerase kann ausgewählt sein aus der Gruppe bestehend aus Taq-Polymerase, Pfu-Polymerase und Tbr-Polymerase.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist an mindestens einen der beiden Primer eine Markierungsgruppe gebunden, wobei der Kit weiter umfasst: ein Enzym, an das eine Bindungsgruppe gebunden ist, die spezifisch die Markierungsgruppe des ersten und/oder zweiten Primers binden kann, wobei das Enzym geeignet ist, eine Reaktion zu katalysieren, deren Ablauf optisch nachweisbar ist; und ein Substrat, das von dem Enzym in der Reaktion umgesetzt werden kann. Die Markierungsgruppe kann Biotin und die Bindungsgruppe Streptavidin sein. Die Markierungsgruppe kann auch ein Antigen und die Bindungsgruppe ein für das Antigen spezifischer Antikörper sein. Das Enzym kann ausgewählt sein aus der Gruppe bestehend aus alkalischer Phosphatase, Meerrettichperoxidase und Firefly-Luciferase. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Enzym alkalische Phosphatase und das Substrat p-Nitrophenylphosphat (pNPP) oder eine Mischung von 5-Brom-4-chlor-3-indoxylphosphat mit Nitroblautetrazoliumchlorid (BCIP/NBT).
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst der Kit weiter: mindestens eine Zentrifugationssäule zur Festphasenextraktion von Nukleinsäuren; einen ersten Waschpuffer, der geeignet ist, andere Moleküle als Nukleinsäuren von der Zentrifugationssäule zu entfernen; und einen zweiten Waschpuffer, der geeignet ist, nicht an die Nukleinsäuresonden gebundene DNA aus einem Reaktionsgefäß zu entfernen. Der erste Waschpuffer kann 70–90% Ethanol und 2 mM bis 10 mM Kaliumphosphatpuffer bei einem pH von 7,5 bis 8,5 umfassen, vorzugsweise etwa 80% Ethanol und etwa 5 mM Kaliumphosphatpuffer bei einem pH von 8,0. Die mindestens eine Zentrifugationssäule kann eine feste Phase aus Siliciumdioxid umfassen. Der zweite Waschpuffer kann PBS mit 0,1–2,0 Vol.-% Tween 20 umfassen.
Beschreibung der Abbildungen
zeigt die Lage der intergenetischen Regionen ITS1 und ITS2 innerhalb der ribosomalen DNA von Pilzen.
stellt ein Flussschema eines Nachweisverfahrens dar, in dem erfindungsgemäße Lysepuffer oder Kits verwendet werden können.
Schematische Darstellung einer bevorzugten Nachweisreaktion in NucleoLink^TM Mikrotiterstreifen. 1: Ankopplung spezifischer Sonden an die Oberfläche von NucleoLink^TM Mikrotiterstreifen; 2: Hybridisierung der spezifischen Sonde mit dem biotinylierten Amplifikat; 3: Anbindung der Streptavidin-Alkaline-Phosphatase; 4. Spaltung von pNPP durch die alkalische Phosphatase, daraus resultierende Farbentwicklung
: Agarose-Gelelektrophorese der PCR nach Kochlyse im Vergleich Candida albicans (C1, C2), Penicillium chrysogenum (P1, P2), Aspergillus fumigatus (A1, A2).
: Agarose-Gelelektrophorese der PCR nach enzymatischem Verdau mit Lyticase im Vergleich Candida albicans (C1, C2), Penicillium chrysogenum (P1, P2), Aspergillus fumigatus (A1, A2).
: Agarose-Gelelektrophorese der PCR nach enzymatischem Verdau mit Chitinase und Lyticase von Candida albicans (C1–C5).
: Agarose-Gelelektrophorese der PCR nach enzymatischem Verdau mit Chitinase und Lyticase von Saccharomyces cerevisiae (S1–S5).
: Agarose-Gelelektrophorese der PCR nach enzymatischem Verdau mit Chitinase und Lyticase von Rhizopus stolonifer (R1–R5).
: Agarose-Gelelektrophorese der PCR nach enzymatischem Verdau mit Chitinase und Lyticase von Absidia glauca (A1–A5).
: Agarose-Gelelektrophorese der PCR nach enzymatischem Verdau mit Chitinase und Lyticase von Aspergillus fumigatus (Af1–Af5).
: Agarose-Gelelektrophorese der PCR nach enzymatischem Verdau mit Chitinase und Lyticase von Penicillium chrysogenum (P1–P5).
: Der in den Lyseversuchen verwendete Längenstandard. Die Abbildung zeigt die Position des 500 bp-Fragments des Phagen λ im Vergleich zum Längenstandard, der aus einem Mix von HindIII-geschnittener λ-DNA und HaeIII-geschnittener ΦX174-DNA besteht.
: Optische Dichte der Verdünnungsreihe spezifischer Amplifikate von A. fumigatus, C. albicans und P. chrysogenum im Einzelversuch.
: Messung der optischen Dichte der Kreuzversuche in mit C. albicans-Sonde beschichteten Streifen nach 20 h Farbreaktion.
: Messung der optischen Dichte der Kreuzversuche in mit P. chrysogenum-Sonde beschichteten Streifen nach 20 h Farbreaktion.
: Messung der optischen Dichte der Kreuzversuche in mit A. fumigatus-Sonde beschichteten Streifen nach 20 h Farbreaktion.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
DEFINITIONEN
Als „Lysepuffer” werden im Sinne der Anmeldung Lösungen bezeichnet, die in der Lage sind, prokaryotischen und/oder eukaryotischen Zellen zu lysieren. Dabei meint Lysieren das Aufbrechen der Zellwände und/oder Zellmembranen, so dass das Cytoplasma freigesetzt wird. Beispielsweise kann ein Lysepuffer Tenside wie Natriumdodecylsulfat (SDS) oder Triton X enthalten. Ein Lysepuffer kann einen alkalischen pH-Wert haben.
Mit „Pilzen” werden in dieser Anmeldung, sofern nicht ausdrücklich anders bestimmt, Schimmelpilze und Hefen bezeichnet. Unter „Schimmelpilzen” im Sinne der Anmeldung werden filamentöse Pilze verstanden. Mit „Hefen” werden einzellige Pilze bezeichnet, die sich asexuell vermehren können. Insbesondere gehören zu Schimmelpilzen und Hefen im Sinne dieser Anmeldung Ascomycetes, Zygomycetes und Deuteromycetes.
Eine „Nukleinsäure” im Sinne der Erfindung kann jede Nukleinsäure beliebiger Länge sein. Beispiele für Nukleinsäuren sind Desoxyribonukleinsäuren (DNA), Ribonukleinsäuren (RNA) oder Peptidnukleinsäuren (PNA). Nukleinsäuren können einzelsträngig, doppelsträngig, oder teilweise einzelsträngig und teilweise doppelsträngig sein.
Unter „DNA-Polymerase” wird im Sinne der Erfindung jedes Enzym verstanden, das in der Lage ist, einen zu einem einzelsträngigen DNA-Strang komplementären DNA-Strang zu synthetisieren. Beispiele für DNA-Polymerasen, die in Ausführungsformen der Erfindung Verwendung finden können, sind Taq-Polymerase, Pfu-Polymerase, Tth-Polymerase, Tma-Polymerase, Tne-Polymerase, Tfl-Polymerase, Pwo-Polymerase, Bst-Polymerase, Bca-Polymerase, Sac-Polymerase, Tac-Polymerase, Mth-Polymerase, Tru-Polymerase, Tbr-Polymemerase, Stoffel-Fragment, VENT^TM, DEEPVENT^TM oder DYNAZYME^TM, oder funktionale Varianten oder Fragmente solcher Polymerasen.
Unter „Primer” im Sinne der Anmeldung wird eine einzelsträngige DNA oder RNA verstanden, die bei der Amplifikation von Nukleinsäuren verwendet werden kann. Hierbei ist die Sequenz des Primers, oder zumindest eine das 3'-Ende umfassende Teilsequenz, komplementär zu einer Zielsequenz an einem der Enden des Nukleinsäureabschnitts, der amplifiziert werden soll. Die komplementäre Teilsequenz am 3'-Ende des Primers muss eine ausreichende Länge haben, um für die Zielsequenz des zu amplifizierenden Nukleinsäureabschnitts spezifisch zu sein. Die komplementäre Teilsequenz ist vorzugsweise mindestens 10 bp lang. Beispielsweise kann die komplementäre Teilsequenz zwischen 10 und 50 bp, zwischen 12 und 40 bp, zwischen 15 und 30 bp oder zwischen 20 und 25 bp umfassen. Als „komplementär” zu einer Zielsequenz wird im Sinne dieser Anmeldung auch eine Teilsequenz angesehen, die nicht über ihre ganze Länge an allen Positionen zur Zielsequenz komplementäre Basen aufweist, aber dennoch ausreichende Homologie besitzt, um die spezifische Bindung zur Zielsequenz sicherzustellen. Beispielsweise kann eine Teilsequenz des Primers ≥ 80%, ≥ 85%, ≥ 90%, ≥ 92%, ≥ 95%, ≥ 97%, ≥ 98%, oder ≥ 99% Identität zum Komplementärstrang der Zielsequenz aufweisen.
Eine „Markierungsgruppe” im Sinne der Anmeldung ist ein Molekül, das an einer Nukleinsäure angebracht und von einer „Bindungsgruppe” spezifisch gebunden werden kann. Vorzugsweise ist die Markierungsgruppe kovalent an der Nukleinsäure gebunden. Hierbei kann es sich bei der Markierungsgruppe und der Bindungsgruppe prinzipiell um jedes Molekülpaar handeln, solange eine spezifische Bindungsreaktion zwischen den beiden Molekülen möglich ist. Beispielsweise kann es sich bei der Bindungsgruppe um einen Rezeptor und bei der Markeierungsgruppe um dessen spezifischen Liganden handeln. Die Bindungsgruppe kann Streptavidin und die Markierungsgruppe Biotin sein. Die Markierungsgruppe kann ein Antigen und die Bindungsgruppe ein dafür spezifischer Antikörper sein. Die Bindungsgruppe kann aber auch ein DNA-bindendes Protein sein, wobei die Markierungsgruppe dann eine Nukleinsäure ist, die die spezifische Bindungssequenz des DNA-bindenden Proteins umfasst. Markierungs- und Bindungsgsuppe können auch zwei komplementäre Nukleinsäurestränge sein.
Mit „ITS1” und „ITS2” werden die beiden internen transkribierten Spacer in der ribosomalen DNA von Eukaryoten bezeichnet, welche die 18S rDNA und die 5,8S rDNA bzw. die die 5,8S rDNA und die 28S rDNA voneinander trennen. Eine Beschreibung der ITS-Regionen in Pilzen findet sich z. B. bei McCullough et al. (Journal of Clinical Microbiology 1998, 36(4): 1035–1038) und White et al. (S. 315–322 in „PCR protocols: a guide to methods and applications" von Innis, Gelfand, Sninsky und White; San Diego 1996, Academic Press).
„Optisch nachweisbar” ist eine Reaktion im Sinne dieser Erfindung dann, wenn ihr Ablauf mit Hilfe von Licht messenden Analyseverfahren, beispielsweise spektroskopisch, verfolgt werden kann. Hierzu zählen Farbreaktionen, bei denen sich die Absorptionskoeffizienten von Edukt(en) und Produkt(en) bei mindestens einer Wellenlänge unterscheiden. Wenn die Edukte und Produkte löslich sind, können Farbreaktionen unter anderem über die Messung der optischen Dichte einer Lösung bei einer geeigneten Wellenlänge verfolgt werden. Optisch nachweisbar sind aber zum Beispiel auch Reaktionen, in denen sich farbige Niederschläge bilden oder Chemolumineszenz auftritt.
Unter „Zimmertemperatur” werden in dieser Anmeldung Temperaturen zwischen 18°C und 30°C verstanden. Vorzugsweise liegt die Zimmertemperatur zwischen 20°C und 25°C.
LYSEPUFFER
Unter einem Aspekt stellt die Erfindung Lysepuffer bereit, die geeignet sind, die Zellwände taxonomisch weit entfernter Schimmelpilze und Hefen zu lysieren. Dies trägt zu einem erheblich schnelleren Nachweis von Pilzzellen und -sporen bei, da Zellen aller oder fast aller in der Probe vorkommenden Pilzspezies in einem Schritt lysiert und zusammen analysiert werden können. Es wird auch weniger Ausgangsmaterial benötigt, da ein einzelner Reaktionsansatz ausreichend ist, um auf das Vorhandensein aller Pilze von Interesse zu testen.
Die für die Lyse erforderliche Zeitdauer kann unterschiedlich sein und kann unter 24 Stunden betragen. Vorzugsweise liegt die erforderliche Zeitdauer unter 12 Stunden, bevorzugter unter 6 Stunden, noch bevorzugter unter 4 Stunden und am meisten bevorzugt unter 3 Stunden. In manchen Ausführungsformen wird die Lyse bei Zimmertemperatur ausgeführt. In anderen Ausführungsformen kann die Lyse auch bei niedrigeren Temperaturen, z. B. zwischen 2°C und 8°C, oder bei höheren Temperaturen, z. B. zwischen 35°C und 40°C, ausgeführt werden.
Geeignete Puffer der Erfindung können beispielsweise Zellen von so weit entfernten Organismen wie Aspergillus fumigatus, Absidia glauca, Candida albicans, Penicillium chrysogenum, Rhizopus stolonifer oder Saccharomyces cerevisiae zugleich lysieren.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform werden zwei verschiedene Lysepuffer nacheinander verwendet, wobei der erste Lysepuffer Chitinase enthält und der zweite Lysepuffer Lyticase enthält.
Der erste Lysepuffer enthält hierbei Chitinase in einer Konzentration von 0,05–10 μg/ml, bevorzugt 0,1–3,0 μg/ml, besonders bevorzugt 0,2–1,0 μg/ml, und am meisten bevorzugt etwa 0,44 μg/ml. Der erste Lysepuffer sollte einen sauren, neutralen oder leicht alkalischen pH haben. Bevorzugt sind pH-Werte zwischen 4,5 und 7,5, noch bevorzugter zwischen 5,0 und 7,0, besonders bevorzugt zwischen 5,5 und 6,5, am meisten bevorzugt pH-Werte von etwa 6,0. Als Puffersystem kann Tris/HCl verwendet werden, bevorzugt in einer Konzentration von 5–200 mM, noch bevorzugter von 10–100 mM, besonders bevorzugt von 20–50 mM und am meisten bevorzugt von etwa 30 mM. Der erste Lysepuffer kann weiterhin Salze enthalten, beispielsweise NaCl (bevorzugt 10–250 mM, bevorzugter 20–100 mM, besonders bevorzugt 35–70 mM und am meisten bevorzugt etwa 50 mM) und/oder MgCl₂ (bevorzugt 2–50 mM, bevorzugter 4–20 mM, besonders bevorzugt 7–15 mM und am meisten bevorzugt etwa 10 mM).
Der zweite Lysepuffer enthält Lyticase in einer Konzentration von 100–3000 U/ml, bevorzugt 300–2000 U/ml, besonders bevorzugt 500–1000 U/ml, und am meisten bevorzugt etwa 700 U/ml. Der zweite Lysepuffer sollte einen leicht sauren, neutralen oder alkalischen pH haben. Bevorzugt sind pH-Werte zwischen 6,0 und 9,0, noch bevorzugter zwischen 6,5 und 8,5, besonders bevorzugt zwischen 7,0 und 8,0, am meisten bevorzugt pH-Werte von etwa 7,5. Als Puffersystem kann Tris/HCl verwendet werden, bevorzugt in einer Konzentration von 10–250 mM, noch bevorzugter von 20–100 mM, besonders bevorzugt von 35–70 mM und am meisten bevorzugt von etwa 50 mM. Der zweite Lysepuffer kann weiterhin EDTA (Ethylendiamintetraacetat, bevorzugt 2–50 mM, bevorzugter 4–20 mM, besonders bevorzugt 7–15 mM und am meisten bevorzugt etwa 10 mM) und/oder β-Mercaptoethanol (bevorzugt 5–200 mM, noch bevorzugter 10–100 mM, besonders bevorzugt 20–50 mM und am meisten bevorzugt etwa 28 mM) enthalten.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform wird nur ein Lysepuffer verwendet. Hierbei enthält der Lysepuffer zusätzlich zu Chitinase auch Cellulase, Pectinase und Amylase, vorzugsweise jeweils in einer Konzentration von 3–5 U/ml.
VERFAHREN
Die Lysepuffer der Erfindung ermöglichen schnellere und verbesserte Verfahren zum Nachweis von Pilzzellen und -sporen. Offenbart wird daher auch ein Verfahren zum Nachweis von Schimmelpilzen und/oder Hefen, umfassend Entnahme einer Probe von Interesse; Kultivieren von darin enthaltenen Schimmelpilzen und/oder Hefen; Lyse der vermehrten Schimmelpilze und/oder Hefen unter Verwendung erfindungsgemäßer Lysepuffer; Extraktion von Nukleinsäuren aus dem Lysat; Amplifikation eines DNA-Bereichs umfassend die ITS1, die 5,8S rDNA und die ITS2 der extrahierten Nukleinsäuren mittels PCR und mindestens eines Primers; Kontaktieren des Amplifikats in mindestens einem Reaktionsgefäß mit mindestens einer Art Nukleinsäuresonde, wobei jede Art Nukleinsäuresonde an die Innenseite eines Reaktionsgefäßes gebunden ist und eine Bindungssequenz umfasst, die identisch oder komplementär ist zu einer genomischen Sequenz eines Schimmelpilzes und/oder einer Hefe, die in einem DNA-Bereich umfassend die ITS1, die 5,8S rDNA und die ITS2 des Schimmelpilzes und/oder der Hefe liegt; und Nachweis der spezifischen Hybridisierung zwischen einer Nukleinsäuresonde und einer Nukleinsäure aus dem Amplifikat in einem Reaktionsgefäß.
Der Nachweis der spezifischen Hybridisierung kann erfolgen über Kontaktieren des mindestens einen Reaktionsgefäßes mit einem Enzym, an das eine Bindungsgruppe gebunden ist, die spezifisch die Markierungsgruppe binden kann, wobei das Enzym geeignet ist, eine Reaktion zu katalysieren, deren Ablauf optisch nachweisbar ist; und Kontaktieren des mindestens einen Reaktionsgefäßes mit einem Substrat, das von dem Enzym in der Reaktion umgesetzt werden kann.
zeigt ein generelles Flussschema einer Ausführungsform solcher Verfahren. Zunächst wird eine Probe von Interesse entnommen und die darin enthaltenen Pilze werden kultiviert. Dies geschieht typischerweise auf festem Kulturmedium, wie zum Beispiel auf Agarplatten, wobei sich während der Kultivierung Pilzkolonien bilden. Möglich ist aber auch die Kultivierung der Pilzkeime aus der Probe in Flüssigmedium. Die Kultivierungsbedingungen können sich je nach Art der nachzuweisenden Pilze unterscheiden. Insbesondere die Temperatur sollte den optimalen Wachstumsbedingungen der nachzuweisenden Pilze entsprechen. Die Kultivierungsdauer ist ebenfalls je nach Art der nachzuweisenden Pilze unterschiedlich. Sie beträgt typischerweise 2–3 Tage, jedoch ist auch eine längere oder kürzere Kultivierungsdauer möglich.
Sobald die Pilzkeime aus der Probe im gewünschten Maßstab vermehrt worden sind, wird Nukleinsäure, vorzugsweise DNA, aus den Pilzen extrahiert. Hierzu wird mindestens ein erfindungsgemäßer Lysepuffer verwendet, der es ermöglicht, die Zellwände taxonomisch weit entfernter Schimmelpilze und Hefen zu lysieren und dadurch die Nukleinsäuren vieler verschiedener Pilze in einem Schritt zugänglich zu machen. In diesem Schritt werden Pilzzellen mit einer geeigneten Menge Lysepuffer inkubiert.
In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt zunächst eine erste Inkubation mit einem Chitinase-haltigen ersten Lysepuffer. Die erste Inkubationszeit kann unter 12 Stunden liegen. Vorzugsweise liegt die Inkubationszeit unter 6 Stunden, bevorzugter unter 3 Stunden, noch bevorzugter unter 2 Stunden und am meisten bevorzugt bei etwa 1 Stunde. Die erste Inkubation wird bevorzugt bei Zimmertemperatur (ca. 25°C) ausgeführt. Anschließend erfolgt eine zweite Inkubation mit einem Lyticase-haltigen zweiten Lysepuffer. Die zweite Inkubationszeit kann unter 6 Stunden liegen. Vorzugsweise liegt die Inkubationszeit unter 3 Stunden, bevorzugter unter 1,5 Stunden, noch bevorzugter unter 1 Stunden und am meisten bevorzugt bei etwa 30 Minuten. Die zweite Inkubation wird bevorzugt bei ca. 37°C ausgeführt.
In einer alternativen bevorzugten Ausführungsform wird in der Lyse nur ein Lysepuffer verwendet. Dieser enthält neben Chitinase auch Cellulase, Pectinase und Amylase. Die Inkubationszeit kann unter 6 Stunden liegen. Vorzugsweise liegt die Inkubationszeit unter 2 Stunden, bevorzugter unter 1 Stunde, noch bevorzugter unter 20 Minuten und am meisten bevorzugt bei etwa 5 Minuten. Die Inkubation wird bevorzugt bei ca. 30°C ausgeführt. Nach der Inkubation wird die Probe aufgekocht. Bevorzugt wird die Probe dabei mindestens zwei Minuten gekocht. De Vorteil dieser alternativen Ausführungsform besteht darin, dass die Verwendung von Lyticase vermieden werden kann, das eine Protease ist. Da während des Lysevorgangs keine Protease verwendet wird, ist das Lysat auch für Untersuchungen der vorliegenden Pilzproteine verwertbar, beispielsweise mittels eines MALDI-TOF-Massenspektrometers.
Die anschließende Extraktion der Nukleinsäuren aus dem Lysat kann nach Standardverfahren erfolgen. Eine Möglichkeit stellt die Festphasenextraktion dar, bei der das Lysat mit einem festen Substrat in Kontakt gebracht und die Nukleinsäure an das Substrat adsorbiert wird. Anschließend wird das Substrat mit einem Waschpuffer gewaschen, der Proteine und andere unerwünschte Moleküle vom Substrat entfernt. In einem weiteren Elutionsschritt wird dann die Nukleinsäure vom Substrat desorbiert und in einem Eluat freigesetzt. Als feste Phase kann beispielsweise Siliciumdioxid dienen. Als Waschpuffer sind stark ethanolhaltige Kaliumphosphatpuffer geeignet, beispielsweise ein Waschpuffer mit 70–90% Ethanol und 2 mM bis 10 mM Kaliumphosphatpuffer bei einem pH von 7,5 bis 8,5. Bevorzugt ist ein Waschpuffer mit etwa 80% Ethanol und etwa 5 mM Kaliumphosphatpuffer bei einem pH von 8,0. Zum Eluieren kann destilliertes Wasser verwendet werden. Eine weitere Möglichkeit der Nukleinsäureextraktion ist die alkoholische Fällung (beispielsweise mit eiskaltem Ethanol oder Isopropanol), wobei die Nukleinsäure als ein festes Präzipitat erhalten wird. Dem Fachmann sind die Verfahren zur Nukleinsäureextraktion wohl bekannt.
Anschließend wird mittels einer PCR ein Bereich aus der ribosomalen DNA der vorhandenen Pike amplifiziert. Die Struktur der ribosomalen DNA ist in Pilzen stark konserviert und wird in dargestellt. Hierbei sind die Abschnitte der 18S rDNA, der 5,8S rDNA und der 28S rDNA durch zwei interne transkribierte Spacer (ITS), nämlich ITS1 und ITS2 getrennt. Während in der ITS1, der ITS2 und der 5,8S rDNA Sequenzunterschiede zwischen verschiedenen Pilzspezies festzustellen sind, enthalten sowohl die 18S rDNA als auch die 28S rDNA konservierte Regionen, die in allen Pilzen identisch sind. Daher kann mit Hilfe von Primern, die in diesen konservierten Abschnitten spezifisch binden, aus jedem nachzuweisenden Pilz eine ca. 650 bp lange Sequenz amplifiziert werden, welche die jeweilige ITS1, ITS2 und 5,8S rDNA umfasst. Geeignete Primer für eine solche Amplifikation, beispielsweise in den Pilzspezies Aspergillus fumigatus, Absidia glauca, Candida albicans, Penicillum chrysogenum, Rhizopus stolonifer oder Saccharomyces cerevisiae, sind die Primer „ITS1” (5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3') und „ITS4” (5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'), wie bei McCullough et al. (Journal of Clinical Microbiology 1998, 36(4): 1035–1038) beschrieben.
Vorzugsweise ist dabei mindestens ein Primer mit einer Markierungsgruppe versehen, so dass mindestens ein Strang in der entstehenden amplifizierten DNA die Markierungsgruppe enthält. Die Markierungsgruppe kann beispielsweise Biotin sein. Die Markierungsgruppe kann auch ein Antigen sein.
Nach der Amplifikation werden die doppelsträngigen Amplifikate mittels Erhitzen denaturiert und Aliquots der Amplifikate anschließend in mindestens ein Reaktionsgefäß pipettiert, wobei an die Innenseite jedes Reaktionsgefäß spezifische einzelsträngige Nukleinsäuresonden gebunden sind. Als Reaktionsgefäß eignet sich jedes Gefäß, an das Nukleinsäuresonden stabil gebunden werden können. Vorzugsweise ist das Reaktionsgefäß aus Kunststoff. Besonders geeignet sind Reaktionsgefäße mit mindestens einer durchsichtigen, flachen Begrenzung, welche eine Seite oder der Boden sein kann. Beispiele für geeignete Reaktionsgefäße sind ELISA-Strips, Mikrotiterplatten (vorzugsweise mit flachem Boden) und Küvetten.
Die Nukleinsäuresonden sind vorzugsweise kovalent an die Innenseite des mindestens einen Reaktionsgefäßes gebunden. Besonders bevorzugt ist eine Bindung mittels Carbodiimid-Kondensation.
Jede Nukleinsäuresonde umfasst eine Bindungssequenz, die mit einer amplifizierten Zielsequenz aus dem Bereich der ITS1, ITS2 und/oder 5,8S rDNA einer Hefe oder eines Schimmelpilzes von Interesse hybridisieren kann. Hierbei sollte die Bindungssequenz komplementär zu demjenigen Strang der Zielsequenz sein, der die Markierungsgruppe enthält, so dass bei vorliegen der aus dem entsprechenden Pilz stammenden Sequenz in den Amplifikaten markierte DNA-Stränge an die Sonde gebunden werden. Die Bindungssequenz muss eine ausreichende Länge haben, um für die Zielsequenz spezifisch zu sein. Die Bindungssequenz ist vorzugsweise mindestens 8 bp lang. Beispielsweise kann die Bindungssequenz zwischen 8 und 50 bp, zwischen 12 und 30 bp, zwischen 15 und 25 bp oder zwischen 18 und 22 bp umfassen. Als „komplementär” zu einer Zielsequenz wird im Sinne dieser Anmeldung auch eine Bindungssequenz angesehen, die nicht über ihre ganze Länge an allen Positionen zur Zielsequenz komplementäre Basen aufweist, aber dennoch ausreichende Homologie besitzt, um die spezifische Bindung zur Zielsequenz sicherzustellen. Beispielsweise kann eine Bindungssequenz ≥ 50%, ≥ 65%, ≥ 75%, ≥ 80%, ≥ 85%, ≥ 90%, ≥ 95%, oder ≥ 98% Identität zum Komplementärstrang der Zielsequenz aufweisen.
Die Spezifität der Bindungssequenz kann auch so angepasst werden, dass sie in gewissem Maße degeneriert ist, d. h. mit verschiedenen, aber verwandten Zielsequenzen aus verschiedenen Pilzen hybridisieren kann. Die Nukleinsäuresonde kann je nach den zu untersuchenden Pilzen für eine Familie, eine Gattung, eine Spezies, einen Stamm oder jede beliebige andere Gruppe von Pilzen spezifisch sein. Wenn eine Sonde zugleich für mehrere Stämme oder Spezies spezifisch sein soll, kann der kompelentäre Bereich auch so gewählt werden, dass er an eine relativ konservierte Region bindet, die in allen Pilzen des betreffenden Stammes oder der Spezies, aber nicht in anderen vorkommt. Alternativ können auch mehrere Sonden unterschiedlicher Spezifität im selben Gefäß auf dem Strip angebracht sein, so dass mehrere unterschiedliche Pilze erkannt werden können.
Beispielsweise ist eine Sonde mit der Sequenz 5'-ACCACGTATATCTTCAAACTTT-3' spezifisch für Candida albicans, eine Sonde mit der Sequenz 5'-CACCCAACTTTATTTTTACTA-3' spezifisch für Aspergillus fumigatus und eine Sonde mit der Sequenz 5'-CTTGCCCATCAACCCAAAT-3' spezifisch für Penicillium chrysogenum.
Die Hybridisierungszeit für die Amplifikate mit den Sonden kann je nach den gewählten Bedingungen unterschiedlich sein, und kann beispielsweise unter 6 h betragen. In bevorzugten Ausführungsformen liegt die Hybridisierungszeit unter 3 h, noch bevorzugter zwischen 30 min und 90 min. Besonders bevorzugt ist eine Hybridisierungszeit von etwa 1 h. Die Inkubationstemperatur ist abhängig von der Schmelztemperatur (T_m) der eingesetzten Sonden. Verfahren zur Bestimmung der Schmelztemperatur von Oligonukleotiden sind dem Fachmann bekannt. Nach erfolgter Hybridisierung werden die Gefäße der Strips gewaschen und anschließend mit einem Enzym versetzt, an das eine für die Markierungsgruppe spezifische Bindungsgruppe gebunden ist. Ist die Markierungsgruppe Biotin, kann die Bindungsgruppe Streptavidin sein. Ist die Markierungsgruppe ein Antigen, kann die Bindungsgruppe ein für das Antigen spezifischer Antikörper sein.
Als Enzym ist jedes Enzym geeignet, das eine optisch nachweisbare Reaktion in Lösung katalysieren kann. In bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung ist das Enzym ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus alkalischer Phosphatase, Meerrettichperoxidase und Firefly-Luciferase. Die Inkubationszeit des Enzyms mit den gebundenen Amplifikaten kann je nach den Bedingungen und der Markierungs- bzw. Bindungsgruppe unterschiedlich sein, und kann unter 4 h betragen. In bevorzugten Ausführungsformen liegt die Hybridisierungszeit bei 1–2 h. Die Hybridisierungstemperatur ist ebenfalls von den gewählten Bindungspartnern (Markierungs- und Bindungsgruppe) sowie dem eingesetzten Enzym abhängig. Wenn Streptavidin und Biotin als Bindungspartner und alkalische Phosphatase als Enzym gewählt werden, kann die Hybridisierung bei etwa 37°C erfolgen.
Nach erfolgter Inkubation werden die Gefäße der Strips gewaschen und mit einer Lösung versetzt, die ein geeignetes Substrat des Enzyms enthält, das vom Enzym in einer optisch nachweisbaren Reaktion umgesetzt werden kann. Als Substrat kann auch ein Gemisch verschiedener Verbindungen dienen. Die Lösung sollte auch alle anderen Reagenzien und Kofaktoren enthalten, die für die enzymatische Umsetzung erforderlich sind (je nach Reaktion z. B. ATP, Mg²⁺, NADH/H⁺, usw.). Wenn das Enzym alkalische Phosphatase ist, kann das Substrat beispielsweise p-Nitrophenylphosphat (pNPP) oder eine Mischung von 5-Brom-4-chlor-3-indoxylphosphat mit Nitroblautetrazoliumchlorid (BCIP/NBT) sein.
Waren die gesuchten Pilze in der Probe vorhanden, so bindet das Enzym in den Gefäßen, die die entsprechenden Nukleinsäuresonden enthalten, an die entsprechenden Amplifikate und katalysiert die optisch nachweisbare Reaktion. Diese kann mit bloßem Auge oder mit einem geeigneten Nachweisinstrument verfolgt werden und quantitative und/oder qualitative Informationen über die Pilze in der Probe liefern. Für qualitative Aussagen über das Vorliegen der Pilze von Interesse kann bereits die Beobachtung der Reaktion, etwa einer Farbänderung in den entsprechenden Gefäßen, mit bloßem Auge ausreichend sein. Für zuverlässigere und/oder quantitative Aussagen kann die Reaktion beispielsweise in einem Spektrometer verfolgt werden. Die Quantifizierung der Pilze in einem Ansatz erfolgt dann relativ prozentual über die gemessene optische Dichte im Gefäß. Dadurch ist es beispielsweise möglich, bei Luftproben durch den Vergleich von Außenluft zu Innenraumluft eine Schimmelpilzbelastung nach VDI 6022 zu bestimmen.
Solche Verfahren können zum Beispiel verwendet werden zum Nachweis von Fremdhefen bei der Bierherstellung (z. B. Saccharomyces bayanus, Saccharomyces exiguus, Saccharomyces pastorianus), von Dermatophyten in der klinischen Analytik oder von luftgetragenen Schimmelpilzen im Rahmen von Hygieneüberprüfungen von raumlufttechnischen Anlagen.
KITS
Unter einem weiteren Gesichtspunkt umfasst die Erfindung auch Kits zur vereinfachten Durchführung der oben beschriebenen Verfahren.
In einer Ausführungsform umfasst ein Kit zum schnellen Nachweis von Schimmelpilzen und/oder Hefen mindestens einen erfindungsgemäßen Lysepuffer und mindestens ein Reaktionsgefäß.
In bevorzugten Ausführungsformen umfasst der Kit einen Chitinase-haltigen ersten Lysepuffer und einen Lyticase-haltigen zweiten Lysepuffer. Der erste Lysepuffer enthält hierbei Chitinase in einer Konzentration von 0,05–10 μg/ml, bevorzugt 0,1–3,0 μg/ml, besonders bevorzugt 0,2–1,0 μg/ml, und am meisten bevorzugt etwa 0,44 μg/ml. Der erste Lysepuffer sollte einen sauren, neutralen oder leicht alkalischen pH haben. Bevorzugt sind pH-Werte zwischen 4,5 und 7,5, noch bevorzugter zwischen 5,0 und 7,0, besonders bevorzugt zwischen 5,5 und 6,5, am meisten bevorzugt pH-Werte von etwa 6,0. Als Puffersystem kann Tris/HCl verwendet werden, bevorzugt in einer Konzentration von 5–200 mM, noch bevorzugter von 10–100 mM, besonders bevorzugt von 20–50 mM und am meisten bevorzugt von etwa 30 mM. Der erste Lysepuffer kann weiterhin Salze enthalten, beispielsweise NaCl (bevorzugt 10–250 mM, bevorzugter 20–100 mM, besonders bevorzugt 35–70 mM und am meisten bevorzugt etwa 50 mM) und/oder MgCl₂ (bevorzugt 2–50 mM, bevorzugter 4–20 mM, besonders bevorzugt 7–15 mM und am meisten bevorzugt etwa 10 mM).
Der zweite Lysepuffer enthält Lyticase in einer Konzentration von 100–3000 U/ml, bevorzugt 300–2000 U/ml, besonders bevorzugt 500–1000 U/ml, und am meisten bevorzugt etwa 700 U/ml. Der zweite Lysepuffer sollte einen leicht sauren, neutralen oder alkalischen pH haben. Bevorzugt sind pH-Werte zwischen 6,0 und 9,0, noch bevorzugter zwischen 6,5 und 8,5, besonders bevorzugt zwischen 7,0 und 8,0, am meisten bevorzugt pH-Werte von etwa 7,5. Als Puffersystem kann Tris/HCl verwendet werden, bevorzugt in einer Konzentration von 10–250 mM, noch bevorzugter von 20–100 mM, besonders bevorzugt von 35–70 mM und am meisten bevorzugt von etwa 50 mM. Der zweite Lysepuffer kann weiterhin EDTA (Ethylendiamintetraacetat, bevorzugt 2–50 mM, bevorzugter 4–20 mM, besonders bevorzugt 7–15 mM und am meisten bevorzugt etwa 10 mM) und/oder β-Mercaptoethanol (bevorzugt 5–200 mM, noch bevorzugter 10–100 mM, besonders bevorzugt 20–50 mM und am meisten bevorzugt etwa 28 mM) enthalten.
In einer alternativen bevorzugten Ausführungsform umfasst der Kit einen alternativen Lysepuffer, der Chitinase, Cellulase, Pectinase und Amylase enthält. Diese vier Enzyme können in der gleichen Konzentration oder unterschiedlichen Konzentrationen vorliegen. Vorzugsweise liegt jedes Enzym in einer Konzentration zwischen 0,5 und 20 U/ml, bevorzugt zwischen 1 und 10 U/ml, und besonders bevorzugt zwischen 3 und 5 U/ml vor. Der alternative Lysepuffer sollte einen sauren, neutralen oder leicht alkalischen pH haben. Bevorzugt sind pH-Werte zwischen 4,5 und 7,5, noch bevorzugter zwischen 5,0 und 7,0, besonders bevorzugt zwischen 5,5 und 6,5, am meisten bevorzugt pH-Werte von etwa 6,0. Als Puffersystem kann Tris/HCl verwendet werden, bevorzugt in einer Konzentration von 5–200 mM, noch bevorzugter von 10–100 mM, besonders bevorzugt von 20–50 mM und am meisten bevorzugt von etwa 30 mM. Der alternative Lysepuffer kann weiterhin Salze enthalten, beispielsweise NaCl (bevorzugt 10–250 mM, bevorzugter 20–100 mM, besonders bevorzugt 35–70 mM und am meisten bevorzugt etwa 50 mM) und/oder MgCl₂ (bevorzugt 2–50 mM, bevorzugter 4–20 mM, besonders bevorzugt 7–15 mM und am meisten bevorzugt etwa 10 mM).
Als Reaktionsgefäß eignet sich jedes Gefäß, an das Nukleinsäuresonden stabil gebunden werden können. Vorzugsweise ist das Reaktionsgefäß aus Kunststoff. Besonders geeignet sind Reaktionsgefäße mit mindestens einer durchsichtigen, flachen Begrenzung, welche eine Seite oder der Boden sein kann. Beispiele für geeignete Reaktionsgefäße sind ELISA-Strips, Mikrotiterplatten (vorzugsweise mit flachem Boden) und Küvetten.
An die Innenseite des mindestens einen Reaktionsgefäßes ist wie oben beschrieben mindestens eine Art Nukleinsäuresonde gebunden. Die Nukleinsäuresonden sind vorzugsweise kovalent an die Innenseite des mindestens einen Reaktionsgefäßes gebunden. Besonders bevorzugt ist eine Bindung mittels Carbodiimid-Kondensation.
Jede Art Nukleinsäuresonde ist für einen Schimmelpilz oder eine Hefe spezifisch ist und umfasst eine Bindungssequenz, die komplementär ist zu einer genomischen Sequenz oder der Komplementärsequenz einer genomischen Sequenz des Schimmelpilzes oder der Hefe, die in einem DNA-Bereich umfassend die ITS1, die 5,8S rDNA und die ITS2 liegt. Die Bindungssequenz muss eine ausreichende Länge haben, um für ihre Zielsequenz spezifisch zu sein. Die Bindungssequenz ist vorzugsweise mindestens 8 bp lang. Beispielsweise kann die Bindungssequenz zwischen 8 und 50 bp, zwischen 12 und 30 bp, zwischen 15 und 25 bp oder zwischen 18 und 22 bp umfassen. Als „komplementär” zu einer Zielsequenz wird im Sinne dieser Anmeldung auch eine Bindungssequenz angesehen, die nicht über ihre ganze Länge an allen Positionen zur Zielsequenz komplementäre Basen aufweist, aber dennoch ausreichende Homologie besitzt, um die spezifische Bindung zur Zielsequenz sicherzustellen. Beispielsweise kann eine Bindungssequenz ≥ 50%, ≥ 65%, ≥ 75%, ≥ 80%, ≥ 85%, ≥ 90%, ≥ 95%, oder ≥ 98% Identität zum Komplementärstrang der Zielsequenz aufweisen.
Jedes der mindestens ein Reaktionsgefäße kann Nukleinsäuresonden mit jeweils derselben Spezifität enthalten. Alternativ kann auch mindestens ein Gefäß mehrere Arten Nukleinsäuresonden mit unterschiedlicher Spezifität enthalten.
Beispielsweise ist eine Sonde mit der Sequenz 5'-ACCACGTATATCTTCAAACTTT-3' spezifisch für Candida albicans, eine Sonde mit der Sequenz 5'-CACCCAACTTTATTTTTACTA-3' spezifisch für Aspergillus fumigatus und eine Sonde mit der Sequenz 5'-CTTGCCCATCAACCCAAAT-3' spezifisch für Penicillium chrysogenum.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst der Kit zusätzlich eine Reaktionsmischung, die mindestens eine DNA-Polymerase, dNTPs, und einen ersten Primer und einen zweiten Primer enthält. Hierbei enthält der erste Primer am 3'-Ende eine Sequenz, spezifisch an eine Zielsequenz des Schimmelpilzes oder der Hefe bindet, die in der 18S rDNA liegt, und der zweite Primer am 3'-Ende eine Sequenz, spezifisch an eine Zielsequenz des Schimmelpilzes oder der Hefe bindet, die in der 28S rDNA liegt. Die Primer binden hierbei an stark konservierte Bereiche in der 18S rDNA bzw. der 28S rDNA, die in allen Pilzen identisch sind. Mit Hilfe solcher Primer kann ein ca. 650 bp langer DNA-Bereich amplifiziert werden, der die ITS1, die 5,8S rDNA und die ITS2 umfasst. Geeignete Primer für eine solche Amplifikation, beispielsweise in den Pilzspezies Aspergillus fumigatus, Absidia glauca, Candida albicans, Penicillum chrysogenum, Rhizopus stolonifer oder Saccharomyces cerevisiae, sind die Primer „ITS1” (5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3') und „ITS4” (5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'), wie bei McCullough et al. (Journal of Clinical Microbiology 1998, 36(4): 1035–1038) beschrieben.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist an mindestens einen der beiden Primer eine Markierungsgruppe gebunden. Die Markierungsgruppe kann beispielsweise Biotin oder ein Antigen sein. In einer solchen Ausführungsform kann der Kit auch ein Enzym, das kovalent an eine Bindungsgruppe gebunden ist, die spezifisch die Markierungsgruppe des binden kann, und ein Substrat für das Enzym umfassen. Die Bindungsgruppe kann beispielsweise Streptavidin oder ein Antikörper sein. Das Enzym ist in der Lage, eine optisch nachweisbare Reaktion des Substrats zu katalysieren. Beispiele für geeignete Enzyme sind alkalischer Phosphatase, Meerrettichperoxidase und Firefly-Luciferase.
Das Enzym kann in jeder Form vorliegen, aus der eine Lösung des funktionalen Enzyms hergestellt werden kann. So kann das Enzym beispielsweise bereits in der funktionalen Form in einem geeigneten Puffer vorliegen in Lösung. Der Puffer kann Reagenzien enthalten, die das Enzym in der funktionalen Form stabilisieren, beispielsweise Proteaseinhibitoren wie etwa Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF). Das Enzym kann aber auch in einer hochkonzentrierten Glycerinlösung vorliegen. Alternativ kann das Enzym auch als trockenes Protein, beispielsweise gefriergetrocknet oder lyophilisiert, bereitgestellt werden.
Ebenso kann das Substrat auch in jeder geeigneten Form bereitgestellt werden, vorausgesetzt, es ist vom Enzym physisch getrennt. Das Substrat kann ebenfalls gelöst sein. Das Substrat kann auch in trockener Form, beispielsweise als Pulver oder in Tablettenform vorliegen. Als Substrat kann auch ein Gemisch verschiedener Verbindungen dienen. Beispiele für geeignete Substrate sind p-Nitrophenylphosphat (pNPP) und eine Mischung von 5-Brom-4-chlor-3-indoxylphosphat mit Nitroblautetrazoliumchlorid (BCIP/NBT).
Ein erfindungsgemäßer Kit kann auch noch weitere Bestandteile umfassen. So kann auch mindestens eine Zentrifugationssäule zur Festphasenextraktion von Nukleinsäuren aus dem Zellysat im Kit enthalten sein. Die Zentrifugationssäule(n) kann/können eine feste Phase aus Siliciumdioxid umfassen.
Ferner kann der Kit auch einen ersten Waschpuffer umfassen, der geeignet ist, andere Moleküle als Nukleinsäuren von der Zentrifugationssäule zu entfernen. Dabei handelt es sich vorzugsweise um einen alkoholischen Waschpuffer, beispielsweise umfassend 70–90% Ethanol und 2 mM bis 10 mM Kaliumphosphatpuffer bei einem pH von 7,5 bis 8,5. Besonders bevorzugt sind etwa 80% Ethanol und etwa 5 mM Kaliumphosphatpuffer bei einem pH von 8,0.
Auch kann in dem Kit ein zweiter Waschpuffer enthalten sein, der geeignet ist, nicht an die Nukleinsäuresonden gebundene DNA von den ELISA-Strips zu entfernen. Vorzugsweise umfasst der zweite Waschpuffer PBS mit 0,1–2,0 Vol.-% Tween 20.
Beispiele
A. Material und Methoden
A1 Material
A1.1 Pilzstämme
Alle Pilzkulturen, bis auf Penicillium chrysogenum, wurden als Aktivkulturen von der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) bezogen.

Bezeichnung DSM-Nr.

Aspergillus fumigatus 819

Candida albicans 1665

Absidia glauca 63295

Rhizopus stolonifer 63011

Saccharomyces cerevisiae 1334
Der Penicillium entstammt einer Luftprobe der Firma biotec GmbH, Elbrachtsweg 76, 33332 Gütersloh. Eine Bestimmung über 285 rDNA Ribotyping am Herz- und Diabeteszentrum Nordrhein-Westfalen ergab zu 99% Penicillium chrysogenum.
A1.2 Primer und Sonden
Die in den Versuchen verwendeten Primer und Sanden wurden bei der Firma Invitrogen Life Technologies bezogen. Primer:
Sonden:
A1.3 Polymerase

DyNazyme^TM II DNA Polymerase (Polymerasegen aus Thermus borckianus (F55) exprimiert in E. coli) von Finnzymes. A1.4 Puffer, Nährmedien und Lösungen A1.4.1 Puffer

TAE-Puffer 50×	242,0 g	Tris Base
	57,1 ml	Essigsäure
	100 ml	0,5 M EDTA,
		mit H₂O auf 1000 ml auffüllen
		pH 8,0 einstellen

Phosphat-Puffer	7,0 g	K₂HPO₄
	3,0 g	KH₂PO₄
	4,0 g	NaCl
		mit H₂O auf 1000 ml auffüllen
		pH 7,0 einstellen
		15 min bei 121°C autoklavieren

Hybridisierungspuffer	7,00 g	Sarkosyl
	7,1 g	Na₂HPO₄
		mit H₂O bidest. auf 100 ml auffüllen
		pH 7,2 einstellen
		15 min bei 121°C autoklavieren

Waschpuffer	100 ml	1 × PBS
	50 μl	Tween 20
		15 min bei 121°C autoklavieren

PBS	8,0 g	NaCl
	0,2 g	KCl
	0,2 g	KH₂PO₄
	1,26 g	Na₂HPO₄ × 2 H₂O
		mit H₂O auf 1000 ml auffüllen
		pH 7,0 einstellen
		15 min bei 121°C autoklavieren

Antikörperkonjugat	Streptavidin-Alkaline-Phosphatase (Sigma Aldrich)
	1:2000 mit DIAPROPS-Puffer verdünnen

DIAPROPS-Puffer	80 mM	Tris-HCl
	20 mM	Tris-Base
	150 mM	NaCl
	0,1%	Tween 20
		pH 7,5 einstellen
		15 min bei 121°C autoklavieren

Farbnachweispuffer	10 mg/ml	pNPP (p-Nitrophenylphosphat)
	1 M	Diethanolamin
	1 mM	MgCl₂
		pH 9,8

A1.4.2 Nährmedien

Das zur Anzucht der Pilzstämme verwendete Nährmedium ist ein Malz-Hefeetrakt-Agar, der zur Kultivierung und Stammhaltung von Schimmelpilzen und Hefen geeignet ist.

Malzmedium	25,0 g	Malzextrakt
fest	2,0 g	Hefeextrakt
	20,0 g	Agar-Agar
		mit H₂O auf 1000 ml auffüllen
		(pH 5,6 ± 0,2 bei 25°C)
		15 min bei 121°C autoklavieren
		auf 48°C abkühlen lassen
		100 μg/ml Ampicillin zusetzen und rühren
		Handwarm gießen

A1.4.3 Lösungen

Blaumarker	50,00% (v/v)	Glycerin
	0,05% (w/v)	Bromphenolblau
	50,00 mM	EDTA
		pH 8,0

Lyticase-Solution	50,00 mM	Tris Base, pH 7,5
	10,00 mM	EDTA
	28,00 mM	β-Mercaptoethanol
	700 U/ml	Lyticase

Chitinase Solution	30,00 mM	Tris HCl
	50,00 mM	NaCl
	10,00 mM	MgCl₂
	0,44 μg/ml	Chitinase
		pH 6,0 einstellen

Methylimidazol-Lösung	82 μl	1-Methylimidazol
	100 μl	H₂O bidest.

EDAC-Lösung (40 mM)	0,38 g	1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid
	50,0 ml	10 mM Methylimidazol

Waschlösung	40,0 ml	1 N NaOH
	60,0 ml	H₂O bidest.
	250 μl	Tween 20

A2 Methoden
A2.1 Formen der Zellyse bei Aspergillus fumigatus, Absidia glauca, Candida albicans, Penicillium chrysogenum, Rhizopus stolonifer und Saccharomyces cerevisiae
Die Aufarbeitung der Zellwände der genannten Pilze erfolgt nach drei Methoden, die in A2.1.1–A2.1.3 dargestellt sind. Das Ausgangsmaterial für alle drei Zelllysen wurde durch Anzucht der Pilzstämme über 72 Stunden bei 28°C erhalten.
A2.1.1 Kochlyse
Für die Kochlyse wird zunächst Koloniematerial mit einem sterilen Zahnstocher von der Agarplatte abgenommen und in 1 ml H₂O bidest. suspendiert. Die Suspension wird 30 sec. lang gevortext und der Titer in einer Zählkammer ermittelt. Nach 10 Min. Inkubationszeit bei 95°C im Wasserbad wird die Suspension erneut 30 sec. gevortext und 1 min. bei 13.000 rpm und Raumtemperatur (RT) in der Eppifuge zentrifugiert. Im Anschluss erfolgt die Aufreinigung des DNA-Extraktes durch NucleoSpin^® Food Kit (siehe A2.2).
A2.1.2 Enzymatischer Verdau mit Lyticase
Koloniematerial wird mit einem sterilen Zahnstocher von der Agarplatte abgenommen und in 1 ml H₂O bidest. suspendiert, 30 sec. gevortext und der Titer mittels Zählkammer ermittelt. Die Suspension wird bei 13.000 rpm und RT 1 min. in der Eppifuge zentrifugiert. Der Überstand wird abgenommen und das Pellet in 500 μl Lyticase-Solution resuspendiert. Die Suspension inkubiert 30 min. bei 37°C. Im Anschluss wird sie erneut 1 min. bei 13.000 rpm und RT in der Eppifuge zentrifugiert. Der Überstand wird verworfen und das Pellet in 500 μl H₂O bidest. gewaschen, erneut 1 min. mit 13.000 rpm bei RT in der Eppifuge zentrifugiert. Die Aufreinigung des DNA-Extraktes erfolgt durch den NucleoSpin^® Food Kit (siehe A2.2).
A2.1.3 Enzymatischer Verdau mit Chitinase und Lyticase
Zunächst wird mit einem sterilen Zahnstocher Koloniematerial von der Agarplatte abgenommen und in 1 ml H₂O bidest. suspendiert. Wie bei den anderen beiden Methoden wird 30 sec. lang gevortext und der Titer mittels Zählkammer ermittelt. Die Suspension wird 1 min. mit 13.000 rpm bei RT in der Eppifuge zentrifugiert und der Überstand abgenommen. Das Pellet wird in 500 μl Chitinase-Lösung resuspendiert. Der enzymatische Verdau durch die Chitinase erfolgt über 1 Stunde bei 25°C im Wasserbad.
Im Anschluss wird die Suspension erneut 1 min. bei RT in der Eppifuge mit 13.000 rpm zentrifugiert, der Überstand verworfen, mit 500 μl H₂O bidest. gewaschen und erneut bei gleichen Bedingungen zentrifugiert. In den folgenden Schritten erfolgt der enzymatische Verdau des Pellets durch die Lyticase und entspricht der Methodenbeschreibung aus A2.1.2. Die Aufreinigung des DNA-Extraktes erfolgt ebenfalls mittels NucleoSpin^® Food Kit (siehe A2.2).
A2.2 Aufreinigung des DNA-Extraktes mittels NucleoSpin^® Food Kit
Die Aufreinigung des DNA-Extraktes aus den Zelllysen erfolgt mittels des NucleoSpin^® Food Kit der Firma Macharey-Nagel. Es handelt sich um eine Säulenreinigung über eine Membran, die nach der Vorschrift zum Kit mit den enthaltenen Reagenzien (CF, Puffer zum Binden der DNA an die Membran; C4, Waschpuffer; CQW, Waschpuffer; C5, Puffer zum Lösen der DNA von der Membran und CE, zum Binden der DNA im Puffer) ausgeführt wird. Dazu werden die nach der jeweiligen Lysetechnik entstandenen Pellets in 500 μl CF gelöst und 30 min bei 65°C im Wasserbad inkubiert. Es folgt eine zehnminütige Zentrifugation mit 13.000 rpm bei RT in der Eppifuge. Es wird eine Mixtur aus 300 μl Überstand, 300 μl C4 und 200 μl Ethanol (reinst) erstellt. 750 μl dieser Mixtur werden auf die Säule gegeben und bei 10.000 rpm und RT 1 min. zentrifugiert. Der Überstand wird verworfen. Es folgen Waschschritte mit 400 μl Waschpuffer CQW und 700 μl Waschfuffer C5. Zwischen den Waschschritten wird jeweils 1 min. bei 10.000 rpm und RT in der Eppifuge zentrifugiert und der Überstand verworfen. Erneut wird mit 200 μl Waschfuffer C5 gewaschen. Die Zentrifugation erfolgt 2 Min. in der Eppifuge bei 13.000 rpm und RT. Es werden 100 μl Elutionspuffer CE, der zuvor 5 min. auf 70°C erhitzt wurde, auf die Säule gegeben und 5 min. inkubiert. Im Anschluss wird die Säule 1 min. bei 13.000 rpm und RT in der Eppifuge zentrifugiert. Der Durchfluss enthält den gereinigten DNA-Extrakt, der für die PCR verwendet werden kann.
A2.3 Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR)
Für die in diesen Versuchen durchgeführten Polymerase-Ketten-Reaktionen werden die Mastermixe nach folgenden Vorschriften angesetzt und verwendet. A2.3.1 PCR Ansatz D1–D2 Region

36,25 μl H₂O Millipore

5,00 μl 10 × PCR-Puffer

2,00 μl dNTPs

0,50 μl Primer 1

0,50 μl Primer 2 (-Biotin)

0,25 μl Taq-Polymerase

5,00 μl DNA-Extrakt

A2.3.2 PCR Ansatz für ITS1–ITS2 Region

36,25 μl H₂O Millipore

5,00 μl 10 × PCR-Puffer

2,00 μl dNTPs

0,50 μl Primer 1

0,50 μl Primer 2 (-Biotin)

0,25 μl Taq-Polymerase

5,00 μl DNA-Extrakt
Zur Detektion der Spezies wird zunächst eine Biotin-labelled PCR durchgeführt. Dabei wird der reverse Primer mit Biotin markiert und die PCR wie in A2.3.2 beschrieben angesetzt und das Programm wie in A2.3.3 beschrieben verwendet.
Die in diesen Versuchen verwendeten PCR-Programme entstammen einer Empfehlung des Herz- und Diabeteszentrums, Bad Oeynhausen, Dr. Dreier. Es umfasst für die PCR der D1–D2 Region die in A2.3.3 beschriebenen Schritte. Für der ITS1–ITS2 Region sind sie in A2.3.4 aufgeführt. A2.3.3 Programm für die PCR zur Amplifizierung der D1–D2-Region der 28S rDNA

1. 94°C 300 s

2. 94°C 15 s

3. 54°C 30 s

4. 72°C 30 s

5. 72°C 300 s

Schritt 2.–4. mit 35 Wiederholungen A2.3.4 Programm für die PCR zur Amplifizierung der ITS1–ITS2-Region der 28S rDNA

1. 94°C 180 s

2. 94°C 60 s

3. 60°C 60 s

4. 72°C 150 s

5. 94°C 180 s

Schritt 2.–4. mit 30 Wiederholungen
A2.4 Agarosegelelektrophorese
Für die Auftrennung eines 500 bp großen Fragments eignet sich ein Agarosegel mit einer Agarosekonzentration von 1,5% (w/v). Eine für dieses Verhältnis erforderlich Agarosemenge wird dazu in 1 × TAE-Elektrophoresepuffer durch Erhitzen gelöst. Nach dem Abkühlen der Lösung auf ca. 50°C werden 18 ml auf einen Gelträger der Maße 7 × 8 cm pipettiert. Nach dem Aushärten des Gels wird die Gelkammer mit 1 × TAE-Elektrophoresepuffer aufgefüllt, bis das Gel 1 bis 2 mm mit dem Puffer bedeckt ist, und der Gelkamm gezogen. 5 μl–10 μl des PCR-Produktes werden mit 3 μl Bromphenolblau vermischt und in die Geltaschen pipettiert. 3 μl des Längenstandards, der λ-DNA HindIII geschnitten und ΦY174-DNA HaeIII geschnitten enthält, wird in die äußeren Geltaschen pipettiert. Die Spannung an der Gelkammer beträgt 5 V/cm Elektrodenabstand. Nach der Elektrophorese wird das Gel in einer einfach konzentrierten SYBR Gold-Lösung 30–40 min lang gefärbt, auf den Transluminator gelegt und mit dem Polaroid GelCamSystem fotografiert.
A2.5 Quantitative Nukleinsäurebestimmung durch UV-Messung
Nach Warburg und Christian können Gesamt-Nukleinsäuremengen neben Proteinmengen spektrometrisch bestimmt werden. Dazu muss die Extinktion der Probe bei 260 und 280 nm gemessen werden. Die Protein- und die Nukleinsäuremenge lässt sich dann anhand der folgenden Formeln berechnen. Die dazu benötigten Faktoren Fund T sind, ausgehend von der Differenz zwischen der Extinktion bei 280 nm (E280) zu der Extinktion bei 260 nm (E260), der Tabelle 1 zu entnehmen. P = E₂₈₀·F/d N = T·P/(1 – T)

P:: Proteinmenge in mg/ml
d:: Schichtdicke in cm
N:: Nukleinsäuremenge in mg/ml

E₂₈₀/E₂₆₀	T	F	E₂₈₀/E₂₆₀	T	F
1,75	0	1,118	0,86	0,052	0,671
1,60	0,0030	1,078	0,84	0,056	0,650
1,50	0,0056	1,047	0,82	0,061	0,628
1,40	0,0087	1,011	0,80	0,066	0,605
1,30	0,0126	0,969	0,78	0,071	0,581
1,25	0,0146	0,946	0,76	0,076	0,555
1,20	0,0175	0,921	0,74	0,085	0,528
1,15	0,0205	0,893	0,72	0,093	0,500
1,10	0,024	0,836	0,70	0,103	0,470
1,05	0,028	0,831	0,68	0,114	0,438
1,00	0,033	0,794	0,66	0,128	0,404
0,96	0,037	0,763	0,64	0,145	0,368
0,92	0,043	0,728	0,62	0,166	0,330
0,90	0,046	0,710	0,60	0,192	0,289
0,88	0,049	0,691

In Tabelle 1 sind die Faktoren F und T aufgeführt, die für die Berechnung der Gesamt-Nukleinsäuren neben Protein benötigt werden.
A2.6 Gesamteiweißtest mit Biuret-Methode
Der Gesamteiweißtest erfolgte mittels der Biuret-Methode (Kit der Firma Merck). Der Test erfolgt nach dem Informationszettel, der im Kit enthalten ist.
A2.7 Bestimmung der Mindestnachweisgrenze
Ziel des Versuchs ist es, die minimale Zellzahl zu bestimmen, die nach Aufschluss der Pilze und anschließender PCR eine Darstellung in der Agarose-Gelelektrophorese zulässt. Hierfür wurden frisch auf Malzagar gewachsene Kulturen der Spezies Candida albicans und Aspergillus fumigatus mit 2 ml Phosphatpuffer abgeschwämmt. Nachdem die Probe 10 min auf dem Schüttler stand, wurde 1 ml abgenommen und der darin enthaltene Konidientiter bestimmt. Von den Proben wurden mit Phosphatpuffer Verdünnungsreihen von 10⁰ bis 10^–5 hergestellt. Diese Verdünnungen wurden mit Hilfe der in A2.1.3 beschriebenen Methode zur Zelllyse aufgearbeitet und der PCR (A2.3.1/A2.3.3) unterzogen. Die aus der Verdünnung ermittelte Zellzahl, bei der gerade noch ein sichtbares Signal in der Elektrophorese zu erkennen ist, wird als Mindestnachweisgrenze angenommen.
A2.8 Festlegung der Mindestwachstumsdauer
Für praktische Untersuchungen ist es interessant festzustellen, nach welcher Anzuchtzeit ein Pilz mit der beschriebenen Methodik nachweisbar ist. Hierfür werden Proben einer definierten Konidienzahl hergestellt. Dazu wurden 5 ml Phosphatpuffer auf Agar mit jeweils einer frisch auf Malzagar gewachsenen Pilzspezies gegeben.
Nachdem die Platte 10 min. auf dem Schüttler stand, wurde 1 ml Suspension abgenommen und der Titer bestimmt. Die Suspension wurde soweit verdünnt, bis sie 1000 Konidien/ml enthielt. Die exakte Konidienzahl wird durch ausplattieren von jeweils 100 μl der jeweiligen Suspension auf fünf Malzagarplatten (Kontrollplatten) durch Mittelwertbildung bestimmt. Außerdem werden 100 μl der jeweiligen Suspension auf weitere sieben Malzagarplatten ausplattiert und ebenfalls bei 28°C bebrütet. Nach 8, 16, 24, 32, 40, 48 und 72 Stunden wurden jeweils 2 ml Phosphatpuffer auf eine Platte gegeben. Nachdem die Platte 10 min auf dem Schüttler stand, wurde 1 ml Suspension abgenommen und der Titer bestimmt. Weiter wird die Suspension der in A2.1.3 beschriebenen Methode zur Zelllyse unterzogen. Das Ergebnis nach der in A2.3.1/A2.3.3 beschriebenen PCR ist in B3 dargestellt.
A2.9 Nachweisreaktionen
Die Methodik zur Detektion der Pilzspezies erfolgt auf Basis der DIAPROPS-Technologie (Nunc). Diese erfolgt in drei Schritten. Zunächst wird eine spezifische Sonde an die Oberfläche der NucleoLink^TM Mikrotiterstreifen angekoppelt (A2.9.1). Dann erfolgt die Hybridisierung mit dem biotinmarkierten Amplifikat aus der PCR (A2.9.2) und schließlich die Nachweisreaktion, in diesem Fall mittels SAP und pNPP (A2.9.3). Die drei Schritte werden in den Punkten A2.17.2–C2.17.4 genauer beschrieben und sind in schematisch dargestellt.
A2.9.1 Ankopplung spezifischer Sonden an die Oberfläche von NucleoLink^TM Mikrotiterstreifen
Für einen Nachweis der Spezies ist es nötig, für die jeweiligen zu detektierenden Pilzarten spezifische Sonden an die Oberflache der NucleoLink^TM Wells zu binden. Dies geschieht wie folgt: Zunächst werden die spezifischen Oligonucleotide mit H₂O bidest. Auf eine Endkonzentration von 7.5 μg/ml verdünnt. 1/10 des Volumens werden in Form von kalter Methylimidazol-Lösung hinzugegeben. In jede Vertiefung des NucleoLink^TM Streifens werden 75 μl dieser Lösung pipettiert. Hinzu kommen 25 μl EDAC-Lösung je Vertiefung. Der Streifen wird mit einer Klebefolie (Tape 8, Nunc) verschlossen und über Nacht in einer feuchten Kammer oder im Brutschrank bei 50°C inkubiert. Die Streifen werden nun fünfmal mit auf 50°C vorgewärmter Waschlösung gewaschen. Dabei werden sie zwischen den Waschschritten leicht ausgeklopft. Die Streifen werden nun leicht getrocknet und mit Klebefolie (Tape 8, Nunc) verschlossen. Sie können bei 4°C bis zu zwei Monaten aufbewahrt werden.
A2.9.2 Hybridisierung der spezifischen Sonden mit dem biotinylierten Amplifikat
Für den Nachweis der jeweiligen Spezies ist es nötig, das biotinylierte Amplifikat aus der PCR an die jeweiligen Sonden zu hybridisieren. Dafür werden 5 μl PCR Produkt (A2.3.2/A2.3.4b) mit 95 μl Hybridisierungspuffer in die mit der Sonde beschichteten NucleoLink^TM Wells pipettiert und mit Klebeband (Tape 8, Nunc) verschlossen. Als Kontrollreaktion werden 100 μl Hybridisierungspuffer ohne PCR Produkt verwendet. Die Wells werden eine Stunde lang bei 49°C inkubiert. Im Anschluss werden ungebundene Amplifikate durch dreimaliges Waschen mit Waschpuffer entfernt. Die Wells werden für 15 Minuten bei 50°C mit Waschpuffer gewässert und anschließend erneut dreimal gewaschen und vorsichtig auf einem Papier ausgeklopft.
A2.9.3 Nachweisreaktion mittels SAP und pNPP
Nach der Hybridisierung spezifischer Sonden mit dem PCR-Produkt erfolgt die Detektion schließlich über einen optischen Nachweis. Dieser wird durch die Spaltreaktion von pNPP durch die alkalische Phosphatase erreicht. Dafür wird SAP 1:2000 in DIAPROPS Puffer verdünnt und jeweils 100 μl der Lösung in jedes Well pipettiert. Die Streifen werden bei 37°C ein bis zwei Stunden inkubiert. Anschließend werden die Wells dreimal mit Waschpuffer gewaschen, fünf Minuten gewässert und erneut dreimal gewaschen. In jedes Well werden 100 μl Farbnachweispuffer pipettiert. Eine Farbentwicklung erfolgt im Dunklen bei Raumtemperatur. Die optische Dichte wird spektrometrisch bei 405 nm gemessen.
A2.10 Tests zur Nachweisreaktion
Das in diesen Versuchen entwickelte Nachweis-System (vgl. A2.9) besteht aus vier einzelnen Reaktionen. Um Fehlerquellen wie beispielsweise unspezifische Bindungen der einzelnen Komponenten ausschließen zu können, müssen die Reaktionen einzeln vorab getestet werden. So geht einer Detektion aus der Mischkultur zunächst ein Nachweis der einzelnen Spezies in den dafür vorgesehenen Wells voraus. Dabei wird die Hybridisierung der jeweiligen Sonde mit dem homologen biotinylierten Amplifikat aus der PCR (A2.3.2, A2.3.4) durchgeführt. Eine genaue Versuchsbeschreibung ist in A2.10.1 gegeben. Im Anschluss an die Einzelpilzversuche kann im Kreuzversuch die Spezifität der hergestellten Sonden für die jeweilige Pilzspezies überprüft werden. Hierfür werden alle Pilze in Form von isolierten Einzelanzuchten aufgezogen. Die Amplifikate, die aus der der Zelllyse, wie in A2.1.3 beschreiben, folgenden PCR stammen, werden in den dafür vorgesehenen, mit spezifischen Sonden beschichteten Wells dem Nachweis-System unterzogen. Hierbei ist es wichtig, dass die Amplifikate jedes Pilzes an jeder Sonde getestet werden.
A2.10.1 Nachweis spezifischer Amplifikate von A. fumigatus, P. chrysogenum und C albicans im Einzelversuch
Das in A2.9 beschriebene Nachweis-System muss zunächst an Pilzen, die in isolierter Einzelkolonie gewachsen sind, getestet werden. Im Anschluss an die Zelllyse (A2.1.3) und der PCR mit biotinyliertem Primer (A2.3.2, A2.3.4) werden die in den Wells befindlichen spezifischen Sonden nur mit den homologen Amplifikaten hybridisiert. Dafür wird das beschriebene Nachweisverfahren zunächst für jeden Pilz einzeln durchgeführt. In je einem halben NucleoLink^TM Streifen (vier Wells), die mit der spezifischen Sonde jeweils eines Pilzes beschichtet sind, werden 100 μl Hybridisierungspuffer pipettiert. In drei Wells werden zusätzlich 15 μl des PCR-Produktes, bestehend aus den für die Sonde spezifischen Amplifikaten, hinzugegeben. Beispielsweise wird in einem Well mit einer C. albicans-Sonde diese nur mit Amplifikaten aus der PCR von C. albicans hybridisiert. Als Kontrolle dient ein Well pro Streifen, in dem kein PCR-Produkt in den Hybridisierungspuffer pipettiert wird. Nach der Hybridisierung erfolgt die Nachweisreaktion mittels SAP und pNPP, wie in A2.9.3 beschrieben. Die Reaktion wird für A. fumigatus, P. chrysogenum und C. albicans durchgeführt und dreimal wiederholt. Das Ergebnis ist in B4 dargestellt. An dieser Stelle stellt sich ebenfalls die Frage, wie groß die eingesetzte DNA-Menge sein muss, um eine eindeutige Farbreaktion hervorzurufen. Dafür wurde ein Test mit NucleoLink^TM Streifen von allen drei Sonden durchgeführt. Hierbei werden in den Hybridisierungsansatz, jeweils in ein Well, 15 μl, 10 μl, 7,5 μl, 5 μl, 2,5 μl und 1 μl des Amplifikats aus der PCR mit dem jeweils zur Sonde homologen Genabschnitt pipettiert. Die zwei verbleibenden Wells pro Streifen dienen als Negativ-Kontrolle und werden ohne Amplifikate angesetzt. Nach der Hybridisierung über eine Stunde bei 48°C wird die Nachweisreaktion wie in A2.9.3 beschrieben durchgeführt. Die Ergebnisse dazu sind in B4.2 aufgeführt.
A2.10.2 Nachweis spezifischer Amplifikate von A. fumigatus, P. chrysogenum und C. albicansim Kreuzversuch
Nachdem eine Nachweisreaktion der spezifischen Pilz-DNA in den Wells, die mit den dafür vorgesehenen Sonden beschichtet waren, erfolgte (A2.10.1), wird nun im Kreuzversuch die Spezifität der Sonden getestet. Dabei soll der Frage nachgegangen werden, ob auch Fremd-DNA an die jeweiligen Sonden hybridisiert. Dafür werden zu 100 μl Hybridisierungspuffer in den Wells pro einem halben NucleoLink^TM Streifen jeweils ein Well mit 15 μl vom PCR-Produkt eines der drei zu detektierenden Pilze gegeben. Das heißt beispielsweise, in einen halben Streifen (vier Wells) mit A. fumigatus-Sonde wird in ein Well der Hybridisieungsansatzmit 15 μl C. albicans-Amplifikat, einer mit 15 μl P. chrysogenum-Amplifikat und einer mit 15 μl A. fumigatus-Amplifikat angesetzt. Als Kontrollreaktion wird in das übrigen Well nur Hybridisierungspuffer ohne PCR-Produkt gegeben und mit dem Streifen die Nachweisreaktion (A2.9) durchgeführt. Der Kreuzversuch wird mit den Sonden von A. fumigatus, P. chrysogenum und C. albicans und ihren Amplifikaten aus der PCR, von den jeweiligen Pilzen in Einzelkolonie, anhand von vier Teststreifen durchgeführt. Die Ergebnisse sind in B5 dargestellt.
A2.11 Identifizierung von A. fumigatus, C. albicans und P. chrysogenum aus der Mischkultur
Des Weiteren ist ein Test der Nachweisreaktion mit einem Amplifikatgemisch aus den in diesen Versuchen verwendeten Spezies, A. fumigatus (A), C. albicans (C) und P. chrysogenum (P), erforderlich.
Hierbei werden in Streifen (acht Wells) der jeweiligen Sonde Hybridisierungsansätze aus 100 μl Hybridisierungspuffer und 15 μl eines Gemisches der Amplifikate erstellt. Es werden drei Wells mit einem Amplifikategemisch aller drei Pilze (APC) und drei weitere jeweils mit einem Gemisch aus nur zwei Pilzamplifikaten (PC, AC und AP) erstellt. Die beiden übrigen Wells pro Streifen dienen als Negativ-Kontrolle ohne PCR-Produkt. Nach der Hybridisierung, eine Stunde bei 48°C, wird das Nachweis-System wie in A2.9.3 beschrieben angewandt. Das Ergebnis ist in B6 dargestellt.
B. Ergebnisse
B1 Aufarbeitungsmethoden
Der Vergleich der in A2.1.1, A2.1.2 und A2.1.3 beschrieben Aufarbeitungsmethoden wurde jeweils zweimal mit Candida albicans (C1 und C2), Penicillium chrysogenum (P1 und P2) und Aspergillus fumigatus (A1 und A2) und fünfmal mit dem in A2.1.3 beschriebenen enzymatischem Verdau mit Chitinase und Lyticase durchgeführt.
In den Agarosegelen wurden bei dem Vergleich der Aufarbeitungsmethoden stets 3 μl Bromphenolblau (BPB) mit 5 μl PCR Produkt gemischt und in eine Tasche pipettiert. In die äußeren Taschen wurden stets 3 μl Längenstandard (M) pipettiert (siehe A2.4). Als Kontrolle (K) wurden 5 μl eines PCR-Ansatzes ohne DNA verwendet, der wie eine Probe mit 3 μl BPB aufgetragen wurde.
B1.1 Kochlyse
In dem Gel in sind die PCR Produkte der sechs Ansätze (je zwei pro Spezies) nach der Kochlyse (vgl. A2.1.1) aufgetragen. Tabelle 2: Konidientiter der Ansätze vor der Kochlyse

Probe C1 C2 P1 P2 A1 A2

Konidientiter 3,5·10⁸ 3,4·10⁸ 2,8·10⁸ 2,9·10⁸ 1,2·10⁸ 1,7·10⁸
Die Polaroid-Aufnahme des Agarose-Gels der drei Pilzspezies nach der Kochlyse und der PCR, wie in A2.1.1 beschrieben zeigen, das diese Aufarbeitungsmethode bei etwa vergleichbaren Titern nur bei C. albicans (C1 und C2) erfolgreich war. Auch höhere Titer von P. chrysogenum (P1, P2) und A. fumigatus (A1, A2) führten nicht zu PCR-Amplifikaten (Ergebnisse nicht aufgeführt). Das Amplifikat entspricht einer erwarteten Größe und bandiert auf Hohe der 603 bp Sande des Markers (vgl. )
B1.2 Enzymatischer Verdau mit Lyticase
Auf dem Gel-Foto in sind die PCR-Produkte der sechs Ansätze der zu vergleichenden Spezies nach dem enzymatischen Verdau durch Lyticase (vgl. A2.1.2) zu sehen. Tabelle 3: Konidientiter der Ansätze vor dem enzymatischen Verdau durch Lyticase

Probe C1 C2 P1 P2 A1 A2

Konidientiter 3,6·10⁸ 3,1·10⁸ 4,5·10⁸ 3,8·10⁸ 2,2·10⁸ 2,8·10⁸
Die Polaroid-Aufnahme des Agarosegels der drei Pilzspezies nach enzymatischen Verdau mittels Lyticase, wie in A2.1.2 beschreiben, zeigt, das die Aufarbeitungsmethode bei etwa vergleichbaren Titern ebenfalls nur bei C. albicans (C1 und C2) erfolgreich war. Auch höhere Titer von P. chrysogenum (P1, P2) und A. fumigatus (A1, A2) führten hier nicht zu PCR-Amplifikaten (Ergebnisse nicht aufgeführt).
B1.3 Verdau mittels Chitinase und Lyticase

Die in A2.1.3 beschriebene Aufarbeitungsmethode mit enzymatischerm Verdau durch Chitinase und Lyticase wurde an jeder Pilzspezies fünfmal getestet. In den Agarose-Gelen in – sind die PCR-Produkte der Spezies A. fumigatus, A. glauca, C albicans, P. chrysogenum, R. stolonifer und S. cerevisiae aufgetragen. In einem Gel sind jeweils die fünf PCR-Produkte einer Spezies und jeweils eine Negativ-Kontrolle aufgetragen. Der Längenstandard ist in beschrieben. Der Konidientiter der Ansätze der Spezies vor dem enzymatischen Verdau mit Chitinase und Lyticase ist in Anschluss Tabelle 4 aufgetragen. Tabelle 4: Konidientiter der Ansätze vor dem enzymatischen Verdau mit Chitinase und Lyticase

Probe	1	2	3	4	5
Konidientiter:
C. albicans	1,4·10⁸	2,8·10⁸	1,0·10⁸	1,0·10⁸	0,9·10⁸
S. cerevisiae	1,2·10⁸	1,8·10⁸	1,5·10⁸	2,3·10⁸	1,0·10⁸
R. stolonifer	3,2·10⁸	4,6·10⁸	1,7·10⁸	0,9·10⁸	2,3·10⁸
A. glauca	2,6·10⁸	0,8·10⁸	4,4·10⁸	3,2·10⁸	2,7·10⁸
A. fumigatus	4,3·10⁸	5,3·10⁸	0,9·10⁸	5,2·10⁸	0,8·10⁸
P. chrysogenum	1,1·10⁸	1,3·10⁸	1,9·10⁸	1,0·10⁸	1,4·10⁸

Die Polaroid-Aufnahmen der Agarosegele nach der PCR zeigen, dass diese Methode der Lyse und Aufreinigung mittels NucleoSpin^® Kit bei den verglichenen Pilzspezies A. fumigatus, A. glauca, C. albicans, P. chrysogenum, R. stolonifer und S. cerevisiae erfolgreich war. Der zu amplifizierende Bereich hat erwartungsgemäß eine Größe von etwa 600 bp. Variationen in der Größe sind speziesabhängig möglich. Da dieses Aufarbeitungsverfahren (C) bei allen untersuchten Spezies ein positives Ergebnis aufweist, wurden die weiteren Versuche an der D1–D2 Region zur Lyse der Pilze ausschließlich mit diesem Lyse- und Aufarbeitungsverfahren und mit dem verwendeten PCR-Programm (A2.3.3) durchgeführt. Für die Versuche zur Detektion an der ITS1–ITS2 Region wurde ebenfalls das oben beschriebene Lyse- und Aufarbeitungsverfahren (Enzymatischer Verdau mit Chitinase und Lyticase, A2.1.3) verwendet, aber das PCR-Protokoll und Programm aus A2.3.2 bzw. A2.3.4.
B2 Bestimmung der Mindestnachweisgrenze
Die Methode zur Bestimmung der Mindestnachweisgrenze wird in A2.7 beschrieben. In den Agarosegelen zu dieser Versuchsreihe wurden jeweils 3 μl BPB mit 5 μl PCR-Produkt vermischt und aufgetragen. In die äußeren Taschen wurden jeweils 3 μl Marker mit 3 μl BPB aufgetragen.
Zusätzlich wurde eine Negativ-Kontrolle (K) mitgeführt.
B2.1 Candida albicans
Die Konidiensuspension von C. albicans wurde in 10er-Schritten verdünnt und die Verdünnungsstufen dem Lyseverfahren C unterworfen. Die Lyseprodukte wurden einer Aufreinigung mittels NucleoSpin^® Food Kit unterzogen (vgl. A2.2). Die Verdünnungsreihe der Candida albicans-Konidiensuspension wies bis zu einem Konidientiter von 1,9·10⁴ ein im Agarosegel sichtbares Ergebnis auf. Candida albicans kann folglich mit einem enzymatischen Verdau durch Chitinase und Lyticase bis zu einem Titer von ca. 19.000 Zellen/ml mittels PCR nachgewiesen werden.
B2.2 Aspergillus fumigatus
Die Konidiensuspension von A. fumigatus wurde in 10er-Schritten verdünnt und die Verdünnungsstufen dem Lyseverfahren C unterworfen. Die Lyseprodukte wurden einer Aufreinigung mittels NucleoSpin^® Food Kit unterzogen (vgl. C2.13. Die Verdünnungsreihe der Aspergillus fumigatus-Konidiensuspension wies bis zu einem Konidientiter von 4,2·10³ ein im Agarosegel sichtbares Ergebnis auf. Aspergillus fumigatus kann folglich mit einem enzymatischen Verdau durch Chitinase und Lyticase bis zu einem Titer von ca. 4.200 Zellen/ml mittels PCR nachgewiesen werden.
B2.3 Penicillium chrysogenum
Die Konidiensuspension von P. chrysogenum wurde in 10er-Schritten verdünnt und die Verdünnungsstufen dem Lyseverfahren C unterworfen. Die Lyseprodukte wurden einer Aufreinigung mittels NucleoSpin^® Food Kit unterzogen (vgl. A2.2). Die Verdünnungsreihe der Penicillium chrysogenum-Konidiensuspension wies bis zu einem Konidientiter von 1,6·10⁴ ein im Agarosegel sichtbares Ergebnis auf. Aspergillus fumigatus kann folglich mit einem enzymatischen Verdau durch Chitinase und Lyticase bis zu einem Titer von ca. 16.000 Zellen/ml mittels PCR nachgewiesen werden.
B3 Festlegung der für einen Nachweis notwendigen Mindestwachstumsdauer
B3.1 Kontrolle des Ausgangstiters
Konidiensuspensionen wurden soweit in Phosphatpuffer verdünnt, dass nach Ausplattierung von 0,1 ml Aliquoten etwa 10 Kolonien pro Agarplatte erwartet wurden. Pro Ansatz wurden 11 Platten beimpft, von denen jeweils 5 Platten zur Titerung herangezogen wurden. Die Verbleibenden 6 Platten wurden bebrütet und jeweils eine Platte nach 5, 8, 15, 20, 24 und 29 Stunden abgeschwemmt. Die Suspensionen wurden dem entwickelten Verfahren zur Zelllyse und Aufreinigung unterzogen (vgl. A2.8).
B3.2 Candida albicans
Für Candida albicans ergab sich, dass mit einer durchschnittlichen Koloniezahl von 7 KBE/Platte und 20 Stunden Wachstumszeit eine Gesamtsporen- und Gesamtzellzahl in der abgeschwemmten Suspension messbar und im Agarosegel nachweisbar war. Die Experimente wurden mit gleichem Ergebnis mehrfach wiederholt {Ergebnisse nicht angegeben).
B3.3 Aspergillus fumigatus
Für Aspergillus fumigatus ergab sich, dass mit einer durchschnittlichen Koloniezahl von 12 KBE/Platte und einer Bebrütung von 40 Stunden im Agarosegel nachweisbar war. Zu diesem Zeitpunkt lassen sich auch mikroskopisch Konidien darstellen. Die Experimente wurden mit gleichem Ergebnis mehrfach wiederholt {Ergebnisse nicht angegeben).
B4 Identifizierung über NucleoLink^TM Wells
B4.1 Nachweis spezifischer Amplifikate von A. fumigatus, C. albicans und P. chrysogenum im Einzelversuch

Das in A2.10.1 beschriebene Verfahren zum Nachweis der Amplifikate von A. fumigatus, C. albicans und P. chrysogenum wird in Einzeltests der jeweiligen Spezies durchgeführt. Ziel des Versuches ist es, die Bindung der spezifischen Sonden und der dazugehörigen Amplifikate sicherzustellen. In Tabelle 5 sind die Mittelwerte der optischen Dichten, gemessen nach 20 h bei 405 nm, aufgetragen. Der Versuch wurde dreimal wiederholt. Tabelle 5: Mittelwerte der Optischen Dichte bei 405 nm nach 20 h der im Einzelversuch nachgewiesenen Amplifikate von A. fumigatus, C albicans und P. chrysogenum in den NucleoLink^TM Wells

Beschichtung der Sonde mit:	O. D. nach Hybridisierung mit spezifischen Amplifikaten n = 9	Standardabweichung	Signifikanz im t-Test mit einer Irrtumswahrscheinlichkeit von α
A. fumigatus	1,092	0,057	0,0001
P. chrysogenum	1,960	0,169	0,0001
C. albicans	2,153	0,331	0,0001
Negativ-Kontrolle ohne Amplifikat	0,078	0,033

Die optischen Dichten nach der Hybridisierung mit den Amplifikaten unterscheiden sich signifikant von der Negativ-Kontrolle (Signifikanz im t-Test mit einer Irrtumswahrscheinlichkeit von α = 0,0001; bei FG = 8). Dies lässt einen eindeutigen Schluss auf eine positive Hybridisierung der Amplifikate von A. fumigatus, C albicans und P. chrysogenum mit der jeweiligen spezifischen Sonde zu.
B4.2 Überprüfung der Sensitivität der Nachweisreaktion

In dem folgenden Experiment wurde die Sensitivität der Nachweisreaktion getestet. Hierzu wurden abnehmende Volumina (15 μl, 10 μl, 7,5 μl, 5 μl, 2,5 μl und 1 μl) der Amplifikate für die Hybridisierung eingesetzt. Die Nachweisreaktion erfolgt nach dem in A2.9.3 beschriebenen Verfahren. Die Messung der Optischen Dichte erfolgte bei 405 nm nach einer Reaktionsperiode von 20 h bei RT. Die in Tabelle 6 gesammelten Daten werden in dargestellt. Tabelle 6: Optische Dichte der Verdünnungsreihe spezifischer Amplifikate von A. fumigatus, C. albicans und P. chrysogenum im Einzelversuch

	15 μl	10 μl	7,5 μl	5 μl	2,5 μl	1 μl	0 μl	0 μl
Aspergillus	1,814	1,550	1,026	0,709	0,330	0,250	0,120	0,057
Penicillium	3,224	3,598	3,198	1,238	0,770	0,201	0,099	0,086
Candida	3,554	3,253	2,877	1,092	0,975	0,181	0,097	0,049

Die in Tabelle 5 und dargestellten Daten zeigen, dass die nach Amplifikation erreichten rDNA-Mengen bei einem Versuchsansatzvolumen von 10 μl–15 μl eine ausreichende Sensitivität für einen Speziesnachweis liefern. Erst bei Volumina von etwa 5 μl–2,5 μl lässt die Testspezifität deutlich nach. Die eingesetzten Volumina entsprechen ausgehend von der Bandenstärke der Amplifikate im Agarose-Gel (Gelfoto nicht mit aufgetragen) DNA-Mengen von etwa 6,6 ng/μl PCR-Produkt für A. fumigatus, etwa 7,7 ng/μl PCR-Produkt für P. chrysogenum und etwa 8,3 ng/μl PCR-Produkt für C albicans.
B5 Überprüfung der Spezifität des Nachweissystems
Homologe Amplifikate zeigen im Vergleich zur Kontrolle eine signifikante Reaktion (B4.1). Im Folgenden wurde die Spezifität der Hybridisierungssonden getestet. Dazu wurden Amplifikate der Spezies A. fumigatus, C. albicans und P. chrysogenum einer Hybridisierung mit jeder in den Versuchen verwendeten Sonde unterzogen und weiter mit dem Nachweissystem getestet. Beispielsweise wurde im homologen System von der Candida-Sonde diese mit Candida-Amplifikaten hybridisiert. Im heterogenen System der Candida-Sonde wurde diese mit Aspergillus-, bzw. Penicillium-Amplifikaten hybridisiert. Als Kontrolle diente ein Reaktionsansatz, der mit 15 μl Wasser anstelle des Amplifikates angesetzt wurde. Es wurde pro Sonde jeweils eine Kontrollreaktion durchgeführt. Die genaue. Versuchsbeschreibung wird in C2.18.2 ausführlich dargestellt. Die Ergebnisse aus den Messungen der optischen Dichte (OD) bei 405 nm der Kreuzversuche sind für die Spezies A. fumigatus, C. albicans und P. chrysogenum in den – dargestellt und erfolgten im Spektrometer nach 20 h Farbreaktion. Die dunkel hervorgehobenen Säulen in den Diagrammen stellen jeweils den Mittelwert der Messungen (helle Säulen) der verschiedenen Ansätze dar. Der Mittelwert ist zusätzlich in Zahlen in den Diagrammen mit angegeben. Der Kreuzversuch wurde mit C. albicans-Sonde, P. chrysogenum-Sonde und A. fumigatus-Sonde und den jeweils dazu gehörigen Amplifikaten der 28S rDNA durchgeführt.
Candida albicans-Sonde:
Aus den Ergebnissen, dargestellt in , geht hervor, dass die den Sonden homologen Amplifikate (mit Candida-Amplifikat) in allen Fällen die stärkste Reaktion zeigen. Im Vergleich dazu zeigen die heterogenen Amplifikate, eine deutlich schwächere Farbreaktion. In den Ansätzen ohne jegliches Amplifikat, der Negativ-Kontrlle, geht die Farbreaktion gegen Null.
Penicillium chrysogenum-Sonde
Auch beim Kreuzversuch mit der Penicillium-Sonde lasst sich im homologen System (Penicillium-Amplifikat mit Penicillium-Sonde) eine stärkere Reaktion feststellen, als im heterogenen System ( ). Obwohl die Reaktionsstärke im homogenen System etwa 60% höher ist als im heterogenen System, zeigen die Candida-Amplifikate im Einzelfall relativ hohe optische Dichten (1,036/0,955).
Aspergillus fumigatus-Sonde
verdeutlicht das Ergebnis für A. fumigatus. Es wird auch für die Aspergillus-Sonde gezeigt, dass die Farbreaktion in den Wells mit den für die Sonden homologen Aspergillus-Amplifikaten deutlich stärker ist als in den Wells mit den heterogenen Amplifikaten. Im Schnitt betragt die OD der Proben in den Wells zwei und drei (heterogenes System) weniger als die Hälfte bzw. nur ein Drittel der OD des homogenen Systems. Die Farbreaktion in den Ansätzen ohne Amplifikat, die als Negativ-Kontrolle dienen, geht gegen Null.
Aus den Experimenten zur Überprüfung der Spezifität im Nachweissystem, dargestellt in – , ist ersichtlich, dass in allen Fällen die den Sonden homologen Amplifikate die stärkste Reaktion zeigen. Währenddessen erzeugen die heterogenen Amplifikate deutlich schwächere Nachweisreaktionen, deren OD allerdings über der der Kontrollen ohne Amplifikat rangieren. Ein Vergleich der drei Spezies zeigt, dass für die Sonden von C. albicans und P. chrysogenum ein deutlicher Nachweis erfolgt. Die Negativ-Kontrolle zeigt in allen Fällen nur eine sehr geringe optische Dichte.
B6 Identifizierung von A. fumigatus, C. albicans, und P. chrysogenum aus der Mischkultur

Der Test der Nachweisreaktion aus der Mischkultur erfolgt mit einem Amplifikatgemisch von A. fumigatus- (A), C. albicans (C), und P. chrysogenum-Amplifikaten (P) und ist in A2.11 genau beschrieben. Dabei werden Amplifikatgemische aller Amplifikate (APC) oder nur zweier (AP, PC, AC) in die Hybridisierung eingesetzt und dem Nachweissystem unterzogen. Als Ergebnis sind tabellarisch die Messungen der optischen Dichte bei 405 nm nach 20 Stunden Inkubationszeit mit dem Farbepuffer in Tabelle 7 aufgeführt. Tabelle 7: Optische Dichten der Nachweisreaktion aus der Mischkultur

	APC	APC	APC	PC	AC	AP	Ohne Amplifikat	Ohne Amplifikat
Asp	0,458	0,509	0,556	0,118	0,437	0,381	0,056	0,052
Pen	0,637	0,837	0,573	0,562	0,098	0,499	0,103	0,098
Can	1,055	0,643	0,599	0,498	0,584	0,162	0,097	0,101

Die Messung der optischen Dichten ergab in den Wells, in denen die zur Sonde homologen Amplifikate enthalten waren (Werte hervorgehoben) eine stärkere Farbreaktion, als in denen, in denen heterogene Amplifikate enthalten waren. Die Reaktionsstärke der heterogenen Amplifikate liegt etwa im Bereich der Kontrollen. Insgesamt kann gezeigt werden, dass eine Detektion auch aus der Mischkultur erfolgreich ist.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Nicht-Patentliteratur

McCullough et al. (Journal of Clinical Microbiology 1998, 36(4): 1035–1038) [0036]
White et al. (S. 315–322 in „PCR protocols: a guide to methods and applications” von Innis, Gelfand, Sninsky und White; San Diego 1996, Academic Press) [0036]
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VDI 6022 [0063]
McCullough et al. (Journal of Clinical Microbiology 1998, 36(4): 1035–1038) [0075]

Claims

Ein Lysepuffer zur Lyse von Schimmelpilzen und/oder Hefen, wobei der Lysepuffer geeignet ist, die Zellwände taxonomisch weit entfernter Schimmelpilze und Hefen zu lysieren.
Der Lysepuffer aus Anspruch 1, wobei der Lysepuffer Chitinase umfasst, optional wobei die Chitinase in einer Konzentration von 0,1 μg/ml bis 3,0 μg/ml im Lysepuffer vorliegt, vorzugsweise wobei die Chitinase in einer Konzentration von etwa 0,44 μg/ml im Lysepuffer vorliegt.
Der Lysepuffer aus Anspruch 2 weiter umfassend 5 mM bis 200 mM Tris/HCl, 10 mM bis 250 mM NaCl und 2 mM bis 50 mM MgCl₂, wobei der Lysepuffer einen pH von 4,5 bis 7,5 aufweist.
Der Lysepuffer aus Anspruch 2, wobei der Lysepuffer zusätzlich Cellulase, Pectinase und Amylase umfasst, vorzugsweise wobei Chitinase, Cellulase, Pectinase und Amylase jeweils in einer Konzentration von 3–5 U/ml vorliegen.
Ein Kit zum Nachweis von Schimmelpilzen und/oder Hefen, umfassend: i) einen ersten Lysepuffer gemäß irgendeinem der Ansprüche 1–3; ii) einen zweiten Lysepuffer, wobei der zweite Lysepuffer Lyticase umfasst, optional wobei die Lyticase in einer Konzentration von 300 bis 2000 U/ml im zweiten Lysepuffer vorliegt, vorzugsweise wobei die Lyticase in einer Konzentration von etwa 700 U/ml im zweiten Lysepuffer vorliegt; und iii) mindestens ein Reaktionsgefäß, wobei an der Innenseite des mindestens einen Reaktionsgefäßes mindestens eine Art Nukleinsäuresonde gebunden ist, wobei jede Art Nukleinsäuresonde für einen Schimmelpilz oder eine Hefe spezifisch ist und eine Bindungssequenz umfasst, die komplementär ist zu einer genomischen Sequenz oder der Komplementärsequenz einer genomischen Sequenz des Schimmelpilzes oder der Hefe, die in einem DNA-Bereich umfassend die ITS1, die 5,8S rDNA und die ITS2 liegt.
Der Kit aus Anspruch 5, wobei der zweite Lysepuffer weiter 10 mM bis 250 mM Tris/HCl, 2 mM bis 50 mM EDTA und 5 mM bis 100 mM β-Mercaptoethanol umfasst, wobei der zweite Lysepuffer einen pH von 6,0 bis 9,0 aufweist.
Ein Kit zum Nachweis von Schimmelpilzen und/oder Hefen, umfassend: i) einen Lysepuffer gemäß Anspruch 4; ii) mindestens ein Reaktionsgefäß, wobei an der Innenseite des mindestens einen Reaktionsgefäßes mindestens eine Art Nukleinsäuresonde gebunden ist, wobei jede Art Nukleinsäuresonde für einen Schimmelpilz oder eine Hefe spezifisch ist und eine Bindungssequenz umfasst, die komplementär ist zu einer genomischen Sequenz oder der Komplementärsequenz einer genomischen Sequenz des Schimmelpilzes oder der Hefe, die in einem DNA-Bereich umfassend die ITS1, die 5,8S rDNA und die ITS2 liegt.
Der Kit aus einem der Ansprüche 5–7, wobei die Schimmelpilze und/oder Hefen ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus den Zygomycetes, den Ascomycetes und den Deuteromycetes.
Der Kit aus einem der Ansprüche 5–8, wobei an jedes der mindestens ein Reaktionsgefäße jeweils eine einzige Art Nukleinsäuresonde gebunden ist, oder wobei an mindestens ein Reaktionsgefäß mehrere Arten von Nukleinsäuresonden gebunden sind.
Der Kit aus einem der Ansprüche 5–9, weiter umfassend: iv) eine Reaktionsmischung umfassend mindestens eine DNA-Polymerase, dNTPs, einen ersten Primer und einen zweiten Primer, wobei der erste Primer am 3'-Ende eine Sequenz enthält, die spezifisch an eine Zielsequenz eines Schimmelpilzes oder einer Hefe bindet, die in der 18S rDNA liegt, und wobei der zweite Primer am 3'-Ende eine Sequenz enthält, spezifisch an eine Zielsequenz des Schimmelpilzes oder der Hefe bindet, die in der 28S rDNA liegt.
Der Kit aus Anspruch 10, wobei die DNA-Polymerase ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Taq-Polymerase, Pfu-Polymerase und Tbr-Polymerase.
Der Kit aus einem der Ansprüche 5–11, wobei an mindestens einen der beiden Primer eine Markierungsgruppe gebunden ist, der Kit weiter umfassend: v) ein Enzym, an das eine Bindungsgruppe gebunden ist, die spezifisch die Markierungsgruppe des ersten und/oder zweiten Primers binden kann, wobei das Enzym geeignet ist, eine Reaktion zu katalysieren, deren Ablauf optisch nachweisbar ist; und vi) ein Substrat, das von dem Enzym in der Reaktion umgesetzt werden kann.
Der Kit aus Anspruch 12, wobei die Markierungsgruppe Biotin und die Bindungsgruppe Streptavidin ist oder wobei die Markierungsgruppe ein Antigen und die Bindungsgruppe ein für das Antigen spezifischer Antikörper ist.
Der Kit aus einem der Ansprüche 12 oder 13, wobei das Enzym ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus alkalischer Phosphatase, Meerrettichperoxidase und Firefly-Luciferase.
Der Kit aus Anspruch 14, wobei das Enzym alkalische Phosphatase ist und das Substrat p-Nitrophenylphosphat (pNPP) ist oder eine Mischung von 5-Brom-4-chlor-3-indoxylphosphat mit Nitroblautetrazoliumchlorid (BCIP/NBT) ist.
Der Kit aus einem der Ansprüche 5–15, weiter umfassend: vii) mindestens eine Zentrifugationssäule zur Festphasenextraktion von Nukleinsäuren; viii) einen ersten Waschpuffer, der geeignet ist, andere Moleküle als Nukleinsäuren von der Zentrifugationssäule zu entfernen; und ix) einen zweiten Waschpuffer, der geeignet ist, nicht an die Nukleinsäuresonden gebundene DNA aus einem Reaktionsgefäß zu entfernen.
Der Kit aus Anspruch 16, wobei der erste Waschpuffer 70–90% Ethanol und 2 mM bis 10 mM Kaliumphosphatpuffer bei einem pH von 7,5 bis 8,5 umfasst, vorzugsweise wobei der erste Waschpuffer etwa 80% Ethanol und etwa 5 mM Kaliumphosphatpuffer bei einem pH von 8,0 umfasst.
Der Kit aus einem der Ansprüche 16 oder 17, wobei die mindestens eine Zentrifugationssäule eine feste Phase aus Siliciumdioxid umfasst.
Der Kit aus einem der Ansprüche 5–18, wobei der zweite Waschpuffer PBS mit 0,1–2,0 Vol.-% Tween 20 umfasst.