WO2006069638A1 - Nukleinsäure-bidende chips zur detektion von phosphatmangelzuständen im rahmen der bioprozesskontrolle - Google Patents

Nukleinsäure-bidende chips zur detektion von phosphatmangelzuständen im rahmen der bioprozesskontrolle Download PDF

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WO2006069638A1
WO2006069638A1 PCT/EP2005/013499 EP2005013499W WO2006069638A1 WO 2006069638 A1 WO2006069638 A1 WO 2006069638A1 EP 2005013499 W EP2005013499 W EP 2005013499W WO 2006069638 A1 WO2006069638 A1 WO 2006069638A1
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WO
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gene
seq
nucleic acid
homolog
probes
Prior art date
Application number
PCT/EP2005/013499
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English (en)
French (fr)
Inventor
Thomas Schweder
Britta JÜRGEN
Stefan Evers
Karl-Heinz Maurer
Le Thi Hoi
Michael Hecker
Birgit Voigt
Jörg FEESCHE
Original Assignee
Henkel Kommanditgesellschaft Auf Aktien
Ernst-Moritz-Arndt-Universität Greifswald
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Filing date
Publication date
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Priority to EP05822552A priority patent/EP1828416A1/de
Publication of WO2006069638A1 publication Critical patent/WO2006069638A1/de
Priority to US11/764,926 priority patent/US20070281312A1/en

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria

Definitions

  • the present invention relates to nucleic acid-binding chips for monitoring bioprocesses with a special focus on the detection of phosphate deficiency states and to the use of corresponding gene probes, in particular on such chips, or methods and applications based on such probes and chips.
  • biological processes are meant, for example, the culture of microorganisms on an agar plate or in shaking culture, but in particular their fermentation, or the extraction of raw materials via the fermentation of microorganisms.
  • unicellular eukaryotes such as yeasts or streptomycetes, as well as what gram-negative or gram-positive bacteria.
  • the monitoring of such processes is done on the one hand by observing the changing properties and requirements of the organisms under consideration during the process, which is reflected, for example, in the optical density and viscosity of the medium, in absorbed or emitted gases, in changes in the pH or changing nutrient needs.
  • proteome analysis that is, the consideration of the change in the equipment of the cells in question with proteins, which usually takes place via 2-dimensional gel electrophoresis of the cell lysates
  • analysis of the mRNA formed (transcriptome) via a analogously created "genomic DNA array” and (3.) the chip technology.
  • chip technology is based on the principle of attaching probes for proteins or nucleic acids to physically readable carriers (chips) that directly depend on the presence of the proteins involved , or address nucleic acids.
  • chips physically readable carriers
  • Another advantage is the need for comparatively small sample quantities.
  • the protein-specific chips may be disregarded.
  • mRNA-recognizing chips are usually doped with complementary DNA molecules or DNA analogs. Their preparation and use for very detailed questions such as the differentiation of point mutations is described for example in the application WO 95/11995 A1.
  • DNA chip Analyzes there are those with a PCR amplification of the target sequence and those without amplification. Furthermore, there are those with optical evaluation of the attributable to the detection signals and those with electrical evaluation.
  • the optical detection methods sometimes require an amplification mechanism of the signals.
  • fluorophores, acridinium esters or indirect detection via secondary binding processes for example via biotin, avidin / streptavidin or digoxigenin, are described for this purpose.
  • digoxigenin-specific antibodies are used for optical detection, which are labeled with an enzyme.
  • the enzyme activity is detected either colorimetrically or via luminescence.
  • the hybridization can be coupled to a PCR on the DNA chip so as to perform the entire detection reaction on a chip ("Lab-on-a-Cfr / p "concept).
  • nucleic acid-recognizing chip type If one has decided on a particular nucleic acid-recognizing chip type with regard to the basic structure and the evaluation system, the more concrete problem arises as to which gene activities should be observed. It should be remembered that in the number of simultaneously analyzable genes with a nucleic acid chip type technically related limits exist. Thus, optically readable chips, what the number of probes that can be applied on the chip, the electrically evaluable currently superior. Their limits are set by the miniaturization of the electronic measuring units.
  • the biological problem arises, which selection of gene activities maps the considered process in a suitable way.
  • This also includes the monitoring of product formation, if it is for example a fermentative product production.
  • control genes should also be included which indicate when the process is developing in a direction that is not intended. In the course of this monitoring, for reasons of practicability, a not too high number of different genes should be observed.
  • biotechnological processes with Gram-positive bacteria Because these are used especially for their ability to secretion for the industrial production of recyclables. Among them are those of the genus Bacillus and among these in turn the species ß. subtilis, B. amyloliquefaciens, B. agaradherens, B. licheniformis, B. lentus and B. globigii are currently the most economically important.
  • the stress genes are compared to degP, uvrB, alpA, mltB, recA, ftsH, ibpA, aceA and groEL under the conditions of high cell density By reaction intensity, they clustered among themselves into certain clusters, and this was determined by an RT-PCR and DNA microarray-based and dot-blot added approach, which was run on samples from two time points Fermentation was applied just at the beginning at low cell density and towards the end at high cell density, from which "cell conditioning" approaches were developed to assess the stress response to degrade the cells.
  • the genes used for the purine and the pyrimidine synthesis as well as the specific ribosomal proteins are expressed more strongly in gram-positive bacteria used for overexpression than could be expected on the basis of the findings on Gram-negative bacteria.
  • Another difference concerns the proteases Lon and CIp.
  • nucleic acid-binding chips with individual of these genes are now disclosed in several publications, or at least demonstrated the possibility of their production.
  • the two patent applications DE 10136987 A1 and DE 10108841 A1 each disclose a gene from Corynebacterium glutamicum, namely clpC or citB. Both genes are described as relevant to amino acid metabolism, which is why a commercially interesting use of these genes is to inactivate or at least mitigate them in order to optimize the fermentative production of amino acids by this microorganism. Further applications according to these applications may be to provide probes for the relevant gene products on nucleic acid-binding chips.
  • the application WO 2004/027092 A2 provides a representative cross-section with a manageable number of genes in order to identify various physiological states which an observed microorganism can undergo in the course of the cultivation. These included, for example, starvation of various nutrients or stress situations such as heat or cold shock, shear stress, oxidative stress or oxygen limitation.
  • genes acoA, ahpC, ahpF, citB, clpC, cIpP, codY, cspA, cspB, des, dnaK, eno, glnR, groEL, groL, gsiB, ibpA, ibpB, katA, katE, IctP , Idh, opuAB, phoA, phoD, pstS, purC, purN, pyrB, pyrP, sigB, tnrA, trxA and ydjF.
  • the associated DNA sequences from B. subtilis, E. coli and / or B.
  • nucleic acid-binding chips which, when monitoring a bioprocess based on microorganisms, in particular Gram-positive or Gram-negative bacteria, indicate changes in the metabolic activities characterizing this process.
  • Nucleic acid-binding chips which are based on this selection of genes, provide a certain, but rather rough, overview of the respective metabolic situation. As a rule, they are unable to shed light on a single subproblem; however, a single positive signal may result from different situations or even be false-positive, which is why it often makes sense - and especially in such an unclear situation - to analyze a selected metabolic aspect separately.
  • electrically readable nucleic acid-binding chips which have the advantage of a timely analysis, the number of simultaneously assignable sites is limited, so that additional gene probes can not simply be applied to detect additional, specific metabolic situations.
  • the application DE 10012283 A1 discloses a useful application of the inducibility of genes by phosphate deficiency.
  • the promoters of the genes pstS, phoD, phoB or glpQ from ß. suhtilis is used to regulate transgenes to be activated for heterologous gene expression by gram-positive host bacteria.
  • the PhoP PhoR regulation system from 6. subtilis must be made available at the same time in order to activate the relevant promoters.
  • a phosphate deficiency should be artificially induced in order to achieve via PhoP and PhoR to induce the chosen promoter.
  • phosphate deficiency is a metabolic situation that can be critical for microorganisms and thus limiting for a corresponding bioprocess.
  • nucleotidase whose homologue has an unchanged expression level in E. coli
  • ferritin-like protein and a probable extracellular nuclease NucH whose Expression levels, for example, at ß. licheniformis are not significantly elevated (data not shown).
  • B. licheniformis in the case of phosphate deficiency.
  • the gene for the phytase gave a surprisingly strong signal, which is not the case in B. subtilis.
  • RNA RNA-detecting chips there are a number of fundamental difficulties in designing RNA RNA-detecting chips to monitor bioprocesses.
  • the question of transferability to other organisms arises with each gene: It must be selected genes that provide clear signals in as many microorganisms relevant for such bioprocesses.
  • the strong signals must also be as clearly as possible attributable to the metabolic situation concerned. Such signals, which respond to several different metabolic situations and / or represent general stress signals, should be excluded as much as possible.
  • the approach chosen for the present invention is to make as representative as possible a selection of a whole series of genes, wherein not all, according to the invention but several probes in the respective observed organism signals.
  • those genes should be excluded which also give strong or even stronger signals in other metabolic situations than in the phosphate deficiency.
  • the task was to identify genes that can be brought as clearly as possible in organisms, in particular microorganisms with the stress signal of phosphate deficiency in combination.
  • the aim was to develop probes for these genes in order to be able to use them for the monitoring of corresponding bioprocesses.
  • nucleic acid-binding chips with gene probes for single or several of these genes and thereby to obtain nucleic acid-binding chips which reliably indicate the signal "phosphate deficiency" in the course of a monitored bioprocess (phosphate deficiency sensors)
  • Such a DNA-binding chip should be usable for several comparable processes and be adapted to specific applications with comparatively minor variations. Preferably, it should be directed to bioprocesses based on Bacillus species, especially B.subtilis, B. amyloliquefaciens, B. lentus, B. globigii, and more particularly B. licheniformis. Bioprocesses focused on fermentations, in particular the technical production of products, especially overexpressed proteins.
  • a phosphate-deficient sensor should enable appropriate methods for measuring the physiological state of the cells considered as well as corresponding possibilities of use for monitoring the considered biological processes.
  • genes should be all the more suitable as indicators the stronger this response is. According to the invention, therefore, such genes are selected as phosphate deficiency indicators, which give a clear, significantly above a certain threshold signal lying. The further the result is, the more they are preferred according to the invention, which explains a corresponding staggering with regard to preferred aspects of the invention. At the same time, those genes have been removed that have also produced strong or even stronger signals in situations other than phosphate deficiency (data not shown).
  • Table 1 shows all of the 235 genes of Bacillus licheniformis DSM13 determined in Example 1 whose induction was observed under phosphate deficiency, with a factor of at least three being considered significant. Of these, all 47 genes are compiled in Table 2 whose induction by phosphate deficiency at least amounted to at least the factor 10 at any of the measured times and in which parallel examinations, not shown here, could conclude that they were comparatively specific for this signal. These are listed again in Table 3 for the magnitude of their observed maximum induction.
  • Their DNA and amino acid sequences are listed in the Sequence Listing of the present application, wherein the odd-numbered numbers represent DNA and the subsequent even-numbered for the respective deduced amino acid sequences. These sequences are also referred to the respective SEQ ID Nos. In Tables 2 and 3. These are the following genes, in the order of decreasing strength of the phosphate-induced induction (see Tables 2 and 3):
  • yvnA similar to proteins from S. subtilis; SEQ ID NO: 77, 78;
  • phoB Alkaline Phosphatase III; SEQ ID Nos. 21, 22;
  • pstS phosphate ABC transporter / binding protein; SEQ ID NO: 47, 48); phoD (phosphodiesterase / alkaline phosphatase; SEQ ID NO: 23, 24);
  • cypX cytochrome P450-like enzyme
  • Homolog to dhaS (homolog to aldehyde dehydrogenase DhaS; SEQ ID Nos. 17, 18);
  • pstBA phosphate ABC transporter PstBA; SEQ ID NO: 87, 88;
  • yfmQ (unknown function, SEQ ID NOs: 69, 70);
  • pstC phosphate ABC transporter / permease; SEQ ID NO: 91, 92;
  • yfkN (similar to 2 ', 3'-cyclo-nucleotide-2'-phosphodiesterase; SEQ ID NO: 11, 12);
  • gdh glucose-1-dehydrogenase
  • D alpha-acetolactate decarboxylase
  • spolllAF sporulation factor III AF, SEQ ID NO: 79, 80
  • spoll AB anti-sigma F factor / phase II sporulation protein AB, SEQ ID Nos. 37, 38;
  • yfkH (similar to proteins; SEQ ID NOs: 67, 68);
  • MpG Class III heat shock protein; SEQ ID Nos. 1, 2;
  • yrbE (similar to dehydrogenase; SEQ ID Nos. 9, 10);
  • dhaS aldehyde dehydrogenase
  • yvmA (similar to a multidrug transporter; SEQ ID NOs: 51, 52);
  • spollLAG sporulation factor III AG, SEQ ID NOs 81, 82
  • spollQ sporulation factor IIQ, SEQ ID NO 43, 44
  • spolllAH sporulation factor III AH, SEQ ID NOs 83, 84
  • pstBB phosphate ABC transporter / ATP binding protein
  • yhbE (similar to proteins from B. suhtilis; SEQ ID NO: 73, 74);
  • spoVID sporulation factor VI D, SEQ ID Nos. 45, 46
  • yur1 (similar to ribonuclease; SEQ ID NO: 15, 16); A conserved hypothetical protein gene (SEQ ID NOs: 59, 60);
  • cotE outer spore envelope protein
  • yhbD similar to proteins from B.subtilis; SEQ ID NOs 71, 72;
  • spollAA anti-sigma F-factor antagonist / phase II sporulation protein AA, SEQ ID NOs 35, 36;
  • pstA phosphate ABC transporter / permease; SEQ ID NO: 85, 86;
  • spolIGA sporulation factor II GA, SEQ ID NO: 41, 42
  • ctaC cytochrome CAAS oxidase / subunit II; SEQ ID NO: 5, 6;
  • tatCD component of the twin arginine translocation pathway, SEQ ID NOs 25, 26;
  • yhcR (similar to ⁇ 'nucleotidase; SEQ ID NO 13, 14).
  • a solution to the problem consists of a nucleic acid-binding chip doped with probes for at least three of the following 47 genes: yhcR, tatCD, ctaC, gene for a presumptive acetoin reductase (homolog to SEQ ID NO. 53), spolIGA, nasE , pstA, spollAA, gene for a hypothetical protein (homologue to SEQ ID NO. 65), yhbD, cotE, conserved hypothetical protein gene (homologue to SEQ ID NO.
  • these genes are disclosed as obtainable from B. licheniformis DSM 13. Most of them are also described from other species (see below). However, some are putative (presumed) genes or genes that are putative Encoding (presumed) putative enzymes. According to the invention, these are defined as far as possible on the basis of database comparisons as having an assumed function and additionally as homologues to the B. licheniformis genes found. For this purpose, two things have to be explained:
  • At least three of these genes are selected in order to obtain as reliable a statement as possible, that is, to exclude a single false-positive signal due to only one type of probe.
  • a nucleic acid-binding chip means all objects which are provided with nucleic acid-specific probes and in each case deliver an evaluable signal upon binding of one or more specifically recognized nucleic acids.
  • Such chips are used as follows for monitoring (monitoring) of the particular bioprocess under consideration: From the process, a sample with the biological material to be analyzed is taken out at a certain point in time. From this, according to methods known per se, for example by cell disruption and use of a denaturing buffer RNA, in particular mRNA isolated. This is itself labeled or used as the starting molecule for a molecule introduced into the measurement (for example cDNA obtained by reverse transcription) and the resulting molecules are advantageously passed over / through the chip in a buffer.
  • RNA or its derivative Upon hybridization (sandwich labeling) of a prepared RNA or its derivative with the homologous (congruent with respect to their sequence) provided on the chip probe (target nucleic acid, for example, target DNA or target nucleic acid analogue) results in a corresponding optically or electronically evaluable signal.
  • target nucleic acid for example, target DNA or target nucleic acid analogue
  • the strength of the hybridization signal over a certain - in individual cases optionally to be optimized - range is proportional to the number of specific at the time of sampling in the sample specific mRNA. In this way, the strength of the signal is a direct measure of the activity of the gene in question at the time of sampling.
  • the time interval between sampling and measurement should be kept as short as possible, for example via a largely automated sampling, their processing and management via / through the sensor.
  • probes are to be understood as meaning all molecules which are capable of entering into (respectively binding to) nucleic acids in each case with a largely specific interaction. This interaction is exploited according to the invention in order to obtain a largely unambiguous, evaluable signal within the scope of a corresponding arrangement (chip).
  • a probe according to the invention is usually a compound which is capable of binding mRNA molecules or nucleic acids derived therefrom via hydrogen bonds, as for example also in the interaction of the two strands of a DNA or of the DNA RNA Interaction takes place.
  • This may be, for example, a DNA which is more stable to hydrolysis than RNA.
  • nucleic acid analog probes characterize preferred embodiments of the present application (see below).
  • the specific probes in question would be to synthesize, for example, according to the model of the sequence listing associated with this application. This is in contrast to the aspect that chips according to the invention should advantageously be usable several times, in particular during a single observed process in the course of which continuous monitoring is desirable.
  • the degree of homology between the probe provided and the mRNA or the nucleic acid derived therefrom, which is to be detected by hybridization is limiting for the usefulness of a probe.
  • the degree of hybridization of the probe with the mRNA to be detected decides on its usefulness as a probe and must be experimentally optimized in individual cases and / or taken into account by adjusting the signal evaluation.
  • Example 1 As shown in Example 1, numerous different gene transcripts, that is to say mRNA molecules, were investigated, in particular those of which participation in the phosphate metabolism was generally known. These mRNA molecules were isolated at different times during the transition from B. licheniformis DSM 13 to a phosphate deficient state. Example 1 also describes how the concentration increase of this mRNA inside the cell of B. licheniformis was determined experimentally. Alternative determination possibilities for this may be established in the prior art; decisive for the understanding of the present invention is the compilation in Table 1 (Example 2). It shows the concentration changes associated with the transition for a total of 235 mRNAs.
  • the following threshold values for the ratio of the RNA amount of the respective gene to the control value were considered significant: According to the invention, the genes whose RNA has a ratio of> 3 (ie at least one tripling) are considered induced; a clear induction is present at a ratio of>10; clearly repressed are genes with an RNA ratio ⁇ 0.3 (that is, a lowering to less than 30%). In the 235 genes listed in Table 1, at least one tripling was observed at any of the time points in question.
  • licheniformis DSM 13 is generally available from the German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH, Mascheroder Weg 1 b, 38124 Braunschweig (http://www.dsmz.de). He holds the accession number ATCC 14580 from the American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, USA (http://www.atcc.org).
  • genes from other organisms corresponding to the abovementioned 47 genes are also to a large extent also stored in generally accessible databases, for example for the well-characterized species B. subtilis and E. coli, which are generally regarded as model organisms of Gram-positive or Gram-negative bacteria.
  • the corresponding sequences can be found, for example, in the databases of Institut Pasteur, 25.28 rue du Dondel Roux, 75724 Paris CEDEX 15, France, which can be accessed via the Internet at http://genolist.pasteur.fr/Colibri/ (for E coli), or http://genolist.pasteur.fr/SubtiList/ (for B. subtilis) are accessible (as of December 2, 2004).
  • GenBank National Center for Biotechnology Information, NCBI, National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA.
  • homologs can be found in most species for most of the 47 genes mentioned, including in cyanobacteria, in eukaryotic cells such as fungi, or in gram-negative species such as E. coli or Klebsiella. This probability is even higher for Gram-positive bacteria, in particular the genus Bacillus, because B. licheniformis DSM 13, of which the sequences listed in the sequence listing are derived, is such a Gram-positive bacterium.
  • the homologous genes are also increasingly subjected to the same or equivalent regulatory mechanisms; thus these homologues should also indicate the same metabolic situation, in particular a phosphate deficiency.
  • B. licheniformis DSM 13 of which the sequences listed in the sequence listing are derived
  • licheniformis is a horrinous organism, because the species S. subtilis, B. amyloliquefaciens, B. lentus, B. globigii, which are likewise particularly important commercially, are also Bacilli and thus Gram-positive. This complies with the relevant aspect of the task.
  • nucleic acid-binding chip In the production of a nucleic acid-binding chip according to the invention for an organism not mentioned here, the associated homologous genes must therefore be identified for at least some of the genes mentioned for B. licheniformis, for example by a comparison of those known for the organism concerned DNA sequences with the sequences given here. These or parts thereof (see below) can then serve as probes or as template for the synthesis of corresponding probes, which are applied to a nucleic acid-binding chip by methods known per se.
  • An essential feature of the present invention is that the total number of all phosphate metabolism-specific different probes is not more than 100. This feature correlates with the stated task, according to which it should focus on nucleic acid-binding chips whose number of assignable sites is comparatively low due to their design. These are in particular the electrically evaluable chips.
  • the total number of all phosphate metabolism-specific different probes is not more than 100, 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55 or 50.
  • probes for other genes which are not discussed in the present application, and which serve for the control, for example those which are only expressed if there is sufficient phosphate supply.
  • the disappearance of a signal due to this can also indicate the transition to the phosphate deficiency state. Should such a signal be preserved, this serves to control how reliable the signal of the phosphate deficiency to be determined according to the invention is.
  • metabolism-specific probes may be, for example, those that are induced by an excess of phosphate, possibly also others that are apparently not directly related to the Phosphatstoff Touch, but can be defined as such due to this inducibility.
  • such a chip also provides an evaluable information useful in the considered process, if the lack of phosphate has been overcome, for example, by taking appropriate countermeasures.
  • nucleic acid-specific probes are usually only fragments of the complete genes (see below). In individual cases, for example in the case of regulation via splicing or large, polyfunctional polypeptides, it may therefore be useful to detect one and the same gene with two or more different probes. Thus, appropriate embodiments are optionally characterized by more than 47 probes, but which respond to no more than these 47 genes.
  • the core of the invention lies precisely in the specificity of the respective chip, with which a special metabolic situation should be detected.
  • Producing a chip with more than 100 probes responsive to different genes, or even a chip that mimics most of the genome of an organism, is not part of the invention described herein for such a specific problem because of the expense involved.
  • both types of chips can be sensibly used side by side in an observed bioprocess:
  • the chips with a large number of different gene probes or with a representative cross-section of various possibly relevant situations can be coarse
  • a chip according to the invention is consulted for control, if there is cause for concern, the cells in question could enter into a phosphate deficiency state.
  • it is a nucleic acid-binding chip according to the invention, which is increasingly preferably doped with the probes specified above in the order given there.
  • the genes listed in Table 3 in reverse order.
  • chips with probes to the gene yhcR similar to the 5'-nucleotidase; SEQ ID NO 13, 14
  • SEQ ID NO 13 5'-nucleotidase
  • those with a probe for the gene yvmC are most preferred for gene selection. Because this showed a nearly 150-fold induction compared to the initial level and thus the strongest of all genes. The signal associated with this should therefore be best suited to indicate the metabolic situation "phosphate deficiency" of all genes investigated.
  • it is a nucleic acid-binding chip according to the invention, wherein at least three of the probes are selected from the following 39 genes: gene for a hypothetical protein (homolog to SEQ ID NO. 65), yhbD, cotE, gene for a preserved hypothetical protein (homologue to SEQ ID NO: 59), yur1, spoVID, gene for a putative aromatic-specific dioxygenase (homolog to SEQ ID NO: 55), yhbE, gene for a putative benzoate transport protein (homolog to SEQ ID NO 49), pstBB, spolllAH, gene for a hypothetical protein (homologue to SEQ ID NO: 63), spollQ, spolllAG, yvmA, gene for a putative ribonuclease (homologue to SEQ ID NO: 93), dhaS, yrbE, gene for a putative decarboxylase / dehydratas
  • nucleic acid-binding chips wherein at least three of the probes are selected from the following 14 genes: yfkN, pstC, yfmQ, pstBA, homolog to dhaS (homolog to aldehyde dehydrogenase DhaS; homologue to SEQ ID NO: 17), gene for putative phosphatase (homolog to SEQ ID NO: 61), phy, cypX, as S, phoD, pstS , phoB, yvnA, yvmC.
  • nucleic acid-binding chips wherein at least three of the probes are selected from the following 8 genes: phy, cypX, asS, phoD, pstS, phoB, yvnA, yvmC.
  • nucleic acid-binding chips wherein at least one, more preferably two or three, of the probes are / are selected from the following 3 genes: phoB, yvnA, yvmC.
  • nucleic acid-binding chips according to the invention are at least 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 22, 24, 26 28, 30, 35, 40, 45 or 47 of the probes mentioned in the present invention.
  • the total number of all different probes is increasingly preferably not more than 100, 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55 or 50.
  • the probes considered to be relevant to the invention are those which respond to the respective, or most homologous, in vivo transcribable genes from the organism selected for the bioprocess, preferably those derived from the relevant, or highly homologous, in vivo transcribable genes are derived just this organism.
  • the sequences disclosed in the present application were obtained from B. licheniformis and, owing to the generally known relationships, should be suitable in particular for monitoring related species, in particular those of the genus Bacillus.
  • the genes closely related in the organism in question are used to derive corresponding probes. Care must be taken, however, that no probes are generated to pseudogenes, but to those that are actually rewritten under / n-wVo conditions in mRNA, that is, which lead to a measurable in the cytoplasmic nucleic acid signal.
  • the organism selected for the bioprocess is a representative of unicellular eukaryotes, Gram-positive or Gram-negative bacteria.
  • bioprocess is a fermentation.
  • fermentation processes for example for the production of wine or beer, or the biotechnological production of valuable substances such as proteins or low molecular weight compounds.
  • the unicellular eukaryotes are protozoa or fungi, including in particular yeast, very particularly Saccharomyces or Schizosaccharomyces.
  • This object also includes chips according to the invention which are directed to the monitoring of the course, in particular of the growth of cell cultures of higher eukaryotes, for example of rodents or of humans. They may also be understood, in a sense, as at least largely unicellular eukaryotes, which have considerable commercial significance, in particular in immunology, for example for the production of monoclonal antibodies.
  • the Gram-positive bacteria are Coryneform bacteria or those of the genera Staphylococcus, Corynebacteria or Bacillus, in particular the species Staphylococcus carnosus, Corynebacterium glutamicum, Bacillus subtilis, B. licheniformis, B. amyloliquefaciens, B. agaradherens, B. stearothermophilus, B. globigii or B. lentus, and especially B. licheniformis.
  • the Gram-negative bacteria are those of the genera E. coli or Klebsiella, in particular derivatives of Escherichia coli K12, Escherichia coli B or Klebsiella planticola, and more particularly derivatives of the strains Escherichia coli BL21 (DE3), E. coli RV308, E. coli DH5 ⁇ , E. coli JM109, E. coli XL-1 or Klebsiella planticola (Rf).
  • E. coli or Klebsiella in particular derivatives of Escherichia coli K12, Escherichia coli B or Klebsiella planticola, and more particularly derivatives of the strains Escherichia coli BL21 (DE3), E. coli RV308, E. coli DH5 ⁇ , E. coli JM109, E. coli XL-1 or Klebsiella planticola (Rf).
  • At least one, more preferably more, of the probes mentioned in connection with the invention described herein are derived from the sequences which are listed in the sequence listing under the numbers SEQ ID NO. 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91 and 93 are listed.
  • Preferred embodiments of nucleic acid-binding chips according to the invention are those which are additionally doped with at least one probe for an additional gene, in particular one which is in a metabolic-related relationship to the gene (s) additionally expressed in terms of the process ), especially for one of them or this one.
  • the observed processes serve a technical interest, often associated with other specific genes. This is, for example, in the case that a protein is to be produced to the gene for this protein and in the case that a low molecular weight compound is to be produced, by one or more gene products, which lie in the synthesis route of the compound in question or to regulate this.
  • genes of the cell such as metabolic genes that must be increasingly formed in the course of product manufacture, such as a cell's own oxidoreductase, if the product is to be obtained from a starting material or an intermediate via oxidation or reduction.
  • the additionally expressed gene for the process is that for a commercially useful protein, in particular an amylase, cellulase, lipase, oxidoreductase, hemicellulase or protease, or one which is synthesized for a low molecular weight chemical compound or at least partially regulated.
  • bioprocesses especially fermentations, in which the said proteins are produced.
  • bioprocesses especially fermentations, in which the said proteins are produced.
  • These are commercially particularly important enzymes, which are used for example in the food industry or the detergent industry. In the latter case, in particular for the removal of soils which are hydrolyzable by amylases, cellulases, lipases, hemicellulases and / or proteases, for the treatment of concerned materials, in particular by cellulases or to provide a based on an oxidoreductase enzymatic bleaching system.
  • the latter variant falls within the field of biotransformation, according to which certain metabolic activities of microorganisms, if introduced in addition, are exploited for the synthesis of chemical compounds.
  • nucleic acid-binding chips according to the invention, one, preferably several, of the probes mentioned in connection with the invention described here is / are provided in the form of the single-stranded strand in the form of the codogenic strand.
  • This embodiment aims to improve the hybridization between the probe and the sample to be detected. This applies in particular to the case where the content of the relevant mRNA is actually determined from the sample. Since this is single-stranded and in its sequence matches the coding strand of the DNA, an optimal hybridization should be done with the complementary, that is the codogenic strand.
  • nucleic acid-binding chips according to the invention, one, preferably several, of the probes mentioned in connection with the invention described here is / are provided in the form of the single-stranded strand in the form of the codogenic strand.
  • This embodiment aims to improve the hybridization between the probe and the sample to be detected. This applies in particular to the case where the content of the relevant mRNA is actually determined from the sample. Since this is single-stranded and in its sequence matches the coding strand of the DNA, an optimal hybridization should be done with the complementary, that is the codogenic strand.
  • one, preferably more, of the probes called relevant to the invention is / are provided in the form of a DNA or a nucleic acid analog, preferably a nucleic acid analog.
  • This embodiment aims to improve the durability and multiple use of the chips of the invention. This need arises, in particular, during a single observed process during which constant monitoring is desirable.
  • the durability of chips according to the invention, in particular with respect to nucleic acid-hydrolyzing enzymes, is already increased by the provision of the probes in the form of a DNA, since this per se is less susceptible to hydrolysis than, for example, an RNA.
  • nucleic acid analogs in which, for example, the phosphate of the sugar phosphate backbone is replaced by a chemically different building block which is not hydrolyzable, for example, by natural nucleases.
  • Such compounds are known in principle in the art and are commercially synthesized for desired, respectively to be given sequences of specialized companies on request. The relevant probes are to be synthesized on the model of the sequences given in the Sequence Listing.
  • one or more of the probes referred to as being relevant to the invention comprises gene regions which are transcribed into mRNA by the organism to be examined, in particular the gene regions which are close to the 5 'end of the mRNA.
  • the chip according to the invention should be used to detect the mRNA actually present in the observed cells, so that for the purpose under consideration only the gene segment that is actually translated into mRNA is of importance.
  • introns occur, in particular in the case of eukaryotes, ie the coding region is interrupted by sections which are not translated into mRNA. Probes containing introns are therefore unlikely to respond poorly to the mRNA in question. To realize this aspect, it is advisable not to resort to genomic DNA sequences, but to cDNA sequences, that is, those obtained from the actual mRNA.
  • hybridization over the entire length of the sequence is often unnecessary to detect mRNA.
  • the specific probes therefore usually only need to comprise a smaller of the transcribed into mRNA gene. It is advantageous for this a selection of a region that is close to the 5 'end of the mRNA, since this is first transcribed into mRNA and thus is the first detectable after activation of the gene. This is contrary to a timely proof.
  • one or more of the probes called relevant to the invention are / are responsive to fragments of the respective nucleic acids, in particular to those which have a low degree of secondary folding in the relevant mRNA, based on the respective total mRNA ,
  • mRNA molecules are often present in a secondary structure, which is based on hybridization of individual mRNA regions with their own other areas. For example, it comes to loop or Stem-Ioop structures. However, such regions are generally less likely to hybridize to other nucleic acid molecules, even if they are homologous. Such areas can be calculated quite accurately from computer programs directed thereto (see below).
  • one, preferably more, of the probes called relevant to the invention has a length of increasingly preferably less than 200, 150, 125 or 100 nucleotides, preferably from 20 to 60 nucleotides, particularly preferably from 45 to 55 nucleotides on.
  • the probes used for the detection reaction need only to include parts of the mRNA to be detected, if the signal available on them is still specific enough. This specificity, the distinctness of different mRNA sets the lower limit for the length of the respective probes and must be determined experimentally if necessary in preliminary experiments.
  • the identification of suitable probe lengths and regions is known per se to the person skilled in the art and is normally carried out with the aid of specialized software. Examples of such software are the programs array designer of the company. Premier Biosoft International, USA, and Vector NTI ® Suite, V. 7, available from InforMax, Inc., Bethesda, USA. In addition to the secondary structures already mentioned, these software programs also take into account, for example, given probe lengths and melting temperatures.
  • an electrical signal is triggered by the binding of the mRNA to the probe in question as relevant to the invention.
  • the time from sampling to measuring the signal for optically analyzable chips is about 24 hours.
  • the time required is currently less than 2 h (see Figure 1).
  • the number of simultaneously analyzable samples in electrically analyzable chips is currently in the double digits, but a rapid development suggests that this magnitude can be exceeded soon. Limiting this are the electronic evaluation units for the various signals.
  • a method for mRNA quantification established in the prior art is, for example, RT-PCT.
  • This is described in the article "Quantification of Bacterial mRNA by One-Step RT-PCR Using the LightCycler System” (2003) by S.Tobisch, T Koburger, B. Jürgen, S. Léja, M. Hecker and T. Schweder in BIOCHEMICA, Volume 3, pages 5 to 8.
  • the detection of electrical chips has another advantage, namely the higher reliability of the data these have significantly lower fluctuation ranges compared to the RT-PCR.
  • the mode of operation of electrically readable chips of a particularly preferred embodiment can be described as follows:
  • the gene-specific probes are covalently bonded in a manner known per se to magnetic beads which are located in chambers of the chips provided for this purpose.
  • the specific hybridization of the corresponding mRNA to the respective beads takes place in this hybridization chamber, which can be tempered and can be flushed through by the solutions in question.
  • the beads are held in this chamber by a magnet.
  • a washing step is carried out to remove the unbound RNA so that only specific hybrids are still present in the incubation chamber, bound to the magnetic beads.
  • a detection probe is introduced into the incubation chamber labeled with a biotin extravidin-linked alkaline phosphatase. This probe binds to a second free region of the hybridized mRNA. This hybrid is then washed again and incubated with the substrate of the alkaline phosphatase para-aminophenol phosphate (pAPP). The enzymatic reaction in the incubation chamber leads to the release of the redox-active product para-aminophenol (pAP). This is now passed over the Red / Ox electrode on the electrical chip and sent the signal to a potentiostat.
  • System-specific software reads the data obtained and the results can be evaluated and displayed on another computer using another program (for example, Origin).
  • the detection reaction can also be carried out by another, but preferably a redox reaction because of the electrical measuring principle.
  • the advantage of chips Compared to conventional detection methods, in addition to gaining time and accuracy, with the provision of multiple probes on one support simultaneously in the same sample, the activities of several different genes can be detected and a more solid and detailed picture as described herein for a specific problem for example, the time at which a phosphate deficiency occurred.
  • a separate subject of the invention is thus the simultaneous use of nucleic acid or nucleic acid analog probes for at least three of the following 47 genes: yhcR, tatCD, ctaC, gene for a presumptive acetoin reductase (homolog to SEQ ID NO.
  • gene for a putative phosphatase (homolog to SEQ ID NO: 61), phy, cypX, asS, phoD, pstS, phoB, yvnA, yvmC, bound to a nucleic acid-binding chip, preferably to the same, for determination of physiological State of a biological process going through an organism.
  • these genes are selected so as to provide an idea of the situation of the phosphate metabolism of the organism under consideration because they are involved in the transition of the Gram-positive bacterium, ⁇ , as described in Examples 1 to 3. licheniformis in the phosphate deficient state significantly and comparatively specific induced. A similar statement is to be expected for other organisms that have the homologous genes or proteins with essentially the same metabolism-relevant properties.
  • gene activities can in principle be determined in various ways, for example by Northern hybridization.
  • the metabolic changes of an organism undergoing a biological process can be monitored promptly and, if necessary, intervened by regulatory means.
  • nucleic acid-binding chips apply correspondingly to the uses of the probes described here.
  • the total number of all phosphate metabolism-specific different probes does not exceed 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55 or 50, again including positive controls from the other phosphate metabolism.
  • nucleic acid or nucleic acid analog probes just mentioned are increasingly preferred:
  • nucleic acid or nucleic acid analogue probes are specific for genes from the following 39 genes: gene for a hypothetical protein (homologue to SEQ ID NO: 65), yhbD, cotE, conserved gene hypothetical protein (homologue to SEQ ID NO: 59), yur1, spoVID, gene for a probable aromatic-specific dioxygenase (homolog to SEQ ID NO: 55), yhbE, gene for a putative benzoate transport protein (homolog to SEQ ID NO.
  • pstBB gene for a hypothetical protein (homologue to SEQ ID NO: 63), spollQ, spolllAG, yvmA, gene for a putative ribonuclease (homolog to SEQ ID NO: 93), dhaS, yrbE, gene for a presumptive decarboxylase / dehydratase (homolog to SEQ ID NO.
  • yfkN preferably including at least three of the following genes: yfkN, pstC, yfmQ, pstBA, homolog to dhaS (homolog to aldehyde dehydrogenase DhaS, homologue to SEQ ID NO: 17), gene for a putative phosphatase (homolog to SEQ ID NO 61), phy, cypX, as S, phoD, pstS, phoB, yvnA, yvmC;
  • the total number of all different probes is increasingly preferably not more than 100, 95, 90, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 40, 30, 20 or 10 ,
  • At least one, more preferably more of the said probes are / is derived from the sequences which are listed in the sequence listing under the numbers SEQ ID NO. 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91 and 93 are listed.
  • a separate subject of the invention are methods of determining the physiological state of an organism passing through a biological process by using a nucleic acid-binding chip according to the invention.
  • nucleic acid-binding chips apply correspondingly to the methods described herein for the determination of the physiological state of an organism passing through a biological process.
  • a change in the phosphate metabolism of the organism passing through the biological process is determined, preferably a phosphate deficiency state.
  • the unicellular eukaryotes are protozoa or fungi, including in particular yeast, especially Saccharomyces or Schizosaccharomyces.
  • the Gram-positive bacteria are Coryneform bacteria or those of the genera Staphylococcus, Corynebacteria or Bacillus, in particular of the species Staphylococcus carnosus,
  • the gram-negative bacteria being those of the genera E. coli or Klebsiella, in particular derivatives of Escherichia coli K12, Escherichia coli B or Klebsiella planticola, and whole especially derivatives of strains Escherichia coli BL21 (DE3), E. coli RV308, E. coli DH5 ⁇ , E. coli JM109, E. coli XL-1 or Klebsiella planticola (Rf).
  • E. coli or Klebsiella in particular derivatives of Escherichia coli K12, Escherichia coli B or Klebsiella planticola, and whole especially derivatives of strains Escherichia coli BL21 (DE3), E. coli RV308, E. coli DH5 ⁇ , E. coli JM109, E. coli XL-1 or Klebsiella planticola (Rf).
  • probes which are of the SEQ ID NO. 1, 3, 5, 7, 9, 11, 15, 19, 23, 25, 29, 31, 33, 37, 43, 45, 49, 51, 53, 55, 59, 61, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 81, 83, 85, 87, 89, 91 or 93 are derived.
  • probes mentioned here are used for the Gram-positive bacteria listed above, in particular B. licheniformis, since these sequences have been isolated from this very organism and thus can be used most successfully on these species.
  • such methods according to the invention are preferred, wherein the determination of the physiological state is carried out at different times of the same process, preferably using a plurality of identically constructed nucleic acid-binding chips, particularly preferably the same nucleic acid-binding chip.
  • such processes according to the invention are furthermore preferred, the process being a fermentation, in particular the fermentative production of a commercially useful product, more preferably the production of a protein or a low-molecular-weight chemical compound.
  • the low-molecular chemical compound is a natural substance, a food supplement or a pharmaceutically relevant compound.
  • the protein is an enzyme, in particular one from the group of ⁇ -amylases, proteases, cellulases, lipases, oxidoreductases, peroxidases, laccases, oxidases and hemicellulases.
  • nucleic acid-binding chips according to the invention, as described in detail above, for determining the physiological state of an organism passing through a biological process.
  • nucleic acid-binding chips apply correspondingly to the uses described herein for determining the physiological state of an organism passing through a biological process.
  • such uses according to the invention are preferred, wherein a change in the phosphate metabolism of the organism passing through the biological process is determined, preferably a phosphate deficient state.
  • the organism selected for the bioprocess is a representative of unicellular eukaryotes, Gram-positive or Gram-negative bacteria.
  • the unicellular eukaryotes being protozoa or fungi, in particular yeast, especially Saccharomyces or Schizosaccharomyces.
  • the Gram-positive bacteria being Coryneform bacteria or those of the genera Staphylococcus, Corynebacteria or Bacillus, in particular the species Staphylococcus carnosus, Corynebacterium glutamicum, Bacillus subtilis, B. licheniformis B. amyloliquefaciens, B. agaradherens, B. stearothermophilus, B. globigii or B. lentus, and more particularly ⁇ . licheniformis.
  • the Gram-positive bacteria being Coryneform bacteria or those of the genera Staphylococcus, Corynebacteria or Bacillus, in particular the species Staphylococcus carnosus, Corynebacterium glutamicum, Bacillus subtilis, B. licheniformis B. amyloliquefaciens, B. agaradherens, B. stearothermophilus, B. globigii or B. lentus, and more particularly ⁇ .
  • the Gram-negative bacteria being those of the genera E. coli or Klebsiella, in particular derivatives of Escherichia coli K12, Escherichia coli B or Klebsiella planticola, and more particularly Derivatives of strains Escherichia coli BL21 (DE3), E. coli RV308, E. coli DH5 ⁇ , E. coli JM109, E. CO // XL-1 or Klebsiella planticola (Rf).
  • the Gram-negative bacteria being those of the genera E. coli or Klebsiella, in particular derivatives of Escherichia coli K12, Escherichia coli B or Klebsiella planticola, and more particularly Derivatives of strains Escherichia coli BL21 (DE3), E. coli RV308, E. coli DH5 ⁇ , E. coli JM109, E. CO // XL-1 or Klebsiella planticola (Rf).
  • such uses according to the invention are furthermore preferred, the process being a fermentation, in particular the fermentative production of a commercially useful product, more preferably the production of a protein or a low-molecular chemical compound.
  • the low-molecular chemical compound is a natural substance, a food supplement or a pharmaceutically relevant compound.
  • the protein is an enzyme, in particular one from the group of ⁇ -amylases, proteases, cellulases, lipases, oxidoreductases, peroxidases, laccases, oxidases and hemicellulases.
  • This medium has the following composition: (1.) Base medium (pH 7.5): 0.015 M (NH 4 ) 2 SO 4 , 0.008 M MgSO 4 ⁇ 7H 2 O, 0.027 M KCl, 0.007 M Na 3 citrate ⁇ 2H 2 O, 0.050 M Tris-HCl and 0.009 M glutamic acid; (2) Supplements: 0.2 M KH 2 PO 4 , 0.039 M L-T ⁇ yptophan-HCL, 1 M CaCl 2 ⁇ 2H 2 O, 0.0005 M FeSO 4 ⁇ 7H 2 O, 0.025 M MnSO 4 ⁇ 4H 2 O and 20% (w / v) glucose; and as (3) medium supplementation scheme: 0.14 ml KH 2 PO 4 , 0.2 ml CaCl 2 , 0.2 ml FeSO 4 , 0.04 ml MnSO 4 , 1 ml glucose. All values are based on 100 ml of basal medium.
  • the cell disruption was carried out with the "Hybaid RiboLyser TM Cell Disruptor” (Thermo Electron Corporation, Dreieich, Germany) . This method is based on the mechanical destruction of the cell wall and the cell membrane with the aid of approximately 0.1 mm small glass beads (Fa.
  • the RNA-containing aqueous phase is separated from the protein and cell fragments, the chromosomal DNA and the glass beads by centrifugation and the RNA is purified therefrom by means of the KingFisher ml_ apparatus (Thermo Electron Corporation, Dreieich, Germany) using the apparatus MagNA Pure LC RNA Isolation Kit I (Roche Diagnostics, Penzberg, Germany).
  • This purification is based on the binding of the RNA to magnetic glass particles in the presence of chaotropic salts, which also cause the inactivation of RNases.
  • the magnetic particles serve as a means of transport of RNA between different reaction vessels, which are filled with binding, washing and Elutionpuffem.
  • the KingFisher mL used for this purpose is a kind of pipetting robot that uses magnets to transport the particles with the bound RNA between the vessels and also to use them for mixing the samples. Finally, the RNA is released from the magnetic particles and is purified.
  • RNA 6000 Nano Kit The Agilent Bioanalyzer 2100 apparatus (Agilent Technologies, Berlin, Germany), which is used for this purpose, makes it possible to analyze RNA on a lab-on-a-chip scale. Together with Agilent's "RNA 6000 Nano Kit", the total RNA is separated by gel electrophoresis and thus offers the opportunity to study the quality of partial degradation and contamination by using ribosomal RNA (16 S and 23 S rRNA). detected. If these are clear bands, one can assume that the RNA was not degraded in the course of processing and thus is intact and can be introduced into the subsequent explorations. In addition, the exact concentration is determined.
  • Transcriptome analyzes were performed on whole genomic B. licheniformis DSM13 DNA microarrays which had been prepared in a conventional manner (for example according to WO 95/11995 A1) and can be evaluated by means of an optical system. Almost every B. licheniformis gene was duplicated on these DNA microarrays so that two samples could be analyzed in parallel on the same chip and the values obtained could be averaged.
  • the principle of the measurement carried out is that the respective mRNA molecules are transcribed from the sample taken in vitro via a reverse transcription into DNA, wherein one of the added deoxyribonucleotides carries a color marker. These labeled molecules are then hybridized with the known, lying on known locations of the chip probes and optically detected the respective strength of the attributable to the relevant sites on the fluorescent marker signal.
  • fluorescent markers for a control and for a sample actually to be examined, which are simultaneously hybridized and thus compete for binding to the probe presented, different color values are obtained, which are a measure of the concentration of the control Provide concentration of the sample.
  • dUTP was selected, which was labeled with the fluorescent dye cyanine 3 or with cyanine 5.
  • the fluorescent dye cyanine 3 (Amersham Biosciences Europe GmbH, Freiburg, Germany)
  • 25 ug total RNA of the respective stress test transient phase, 30, 60 and 120 min
  • the fluorescent dye cyanine 5 (GE Healthcare, Freiburg, Germany).
  • the optical readout of the arrays was performed using the ScanArray® Express Laser Scanner (PerkinElmer Life and Analytical Sciences, Rodgau-Jügesheim, Germany). All hybridizations were repeated, with the samples labeled with the respective other dye (dye swap method). The quantitative evaluation of the arrays was carried out using the software ScanArray® Express (available from the company PerkinElmer Life and Analytical Sciences Rodgau-Jügesheim, Germany) according to the manufacturer and under standard parameters.
  • the arrays were normalized and evaluated.
  • this "score card” which serves to control the efficiency and quality of the hybridization
  • known control DNA and so-called spikes in the form of oligos were applied to the array according to the manufacturer's instructions and in the hybridization with complementary sequences were added
  • the controls should have the same amount of hybridization and dye incorporation, and the controls should be the same amount in both samples and appear yellow after scanning, or have a ratio between both channels of 1.
  • the spikes are for each sample specifically, and are applied at various dilutions, that is they appear red or green after scanning for the particular sample.
  • Example 2 For expression of the genes, mean values from the two hybridizations and the respective standard deviations were calculated. For a significant induction or a significant repression, the following threshold values are considered for the ratio of the RNA amount of the respective gene to the control value: The genes whose RNA has a ratio of> 3 (ie at least one tripling) are considered as induced; clearly repressed are genes with an RNA ratio ⁇ 0.3 (that is, a lowering to less than 30%). These results are listed in Example 2.
  • Example 2 Example 2
  • Table 1 below lists all of the 235 genes of Bacillus licheniformis DSM13 determined in Example 1 whose induction (amounting to at least the factor 3) was observed under the conditions of the phosphate deficiency described in Example 1.
  • the respective name of the derived protein or (if available) its abbreviation are given; the "bli number” corresponds to the "locus_tag" of the entry AE017333 (bases 1 to 4.222.645) in the database GenBank (National Center for Biotechnology Information NCBI, National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA; http: // /www.ncbi.nlm.nih.gov, as of December 2, 2004).
  • GenBank National Center for Biotechnology Information NCBI, National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA; http: // /www.ncbi.nlm.nih.gov, as of December 2, 2004).
  • licheniformis This is followed by the factors observed at the times indicated above for increasing the concentration
  • Example 1 The determined in Example 1 235 genes of Bacillus licheniformis DSM13, whose (at least the factor of 3 amounts) induction was observed under phosphate deficiency (for explanations see text).
  • Table 2 below lists all the genes of Bacillus licheniformis DSM13 determined in Example 1 whose induction under the conditions of the phosphate deficiency described in Example 1 at any of the measured times was at least a factor of 10 and those based on comparative experiments (data not shown) comparatively specific for phosphate deficiency can be classified. This is a total of 47.
  • the column names are the same as in the previous example.
  • sequence numbers are given which carry the respective DNA or amino acid sequences in the sequence listing belonging to the present application. Particularities of the respective sequences, which appear as free text in the sequence listing, are supplemented under the category gene name / gene function.
  • Table 2 The 47 genes of Bacillus licheniformis DSM13 determined in Example 1, whose specifically induced by phosphate deficiency induction at any of the measured times was at least a factor of 10 (for explanations: see text).
  • Table 3 The 47 genes of Bacillus licheniformis DSM13 determined in Example 1 whose specifically induced by phosphate deficiency induction at any of the measured times has been at least the factor 10, in descending order of the measured maximum value (last column).
  • the measurement started in the LightCycler.
  • two different dilutions were used for each sample to be analyzed.
  • the specific transcript was then amplified with the respective primers and the incorporation of the dye was measured.
  • FIG. 1 Schematic representation of the yAM / ne monitoring of a bioprocess with electrical DNA chips according to the invention
  • nucleic acids for example DNA
  • nucleic acid analogs for example, compounds which are difficult to hydrolyze, analogously constructed

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Abstract

Gegenstand der vorliegenden Anmeldung sind Nukleinsäure-bindende Chips zur Überwachung von Bioprozessen unter spezieller Ausrichtung auf die Detektion von Phosphatmangelzuständen. Sie tragen Sonden für mindestens drei der folgenden 47 Gene: yhcR, tatCD, ctaC, Gen für eine vermutliche Acetoin-Reductase, spollGA, nasE, pstA, spollAA, Gen für ein hypothetisches Protein, yhbD, cotE, Gen für ein konserviertes hypothetisches Potein, yurl, spoVID, Gen für eine vermutliche Aromaten-spezifische Dioxygenase, yhbE, Gen für ein vermutliches Benzoat-Transportprotein, pstBB, spolliAH, Gen für ein hypothetisches Protein, spollQ, spollIAG,. yvmA, Gen für eine vermutliche Ribonuclease, dhaS, yrbE, Gen für eine vermutliche Decarboxylase/Dehydratase, htpG, yfkH, spollAB, spolllAF, alsD, gdh, yfkN, pstC, yfmQ, pstBA, Homolog zu dhaS, Gen für eine vermutliche Phosphatase, phy, cypX, aisS, phoD, pstS, phoB, yvnA, yvmC, wobei die Gesamtzahl aller Phosphatstoffwechsel-spezifischen unterschiedlichen Sonden auf den Nukleinsäure-bindenden Chips nicht über 100 liegt. Ferner betrifft diese Anmeldung die Verwendung entsprechender Gensonden, insbesondere auf solchen Chips, beziehungsweise entsprechende Verfahren und Verwendungsmöglichkeiten.

Description

Nukleinsäure-bindende Chips zur Detektion von Phosphatmangelzuständen im Rahmen der Bioprozeßkontrolle
Die vorliegende Erfindung betrifft Nukleinsäure-bindende Chips zur Überwachung von Bioprozessen unter spezieller Ausrichtung auf die Detektion von Phosphatmangelzuständen sowie die Verwendung entsprechender Gensonden, insbesondere auf solchen Chips, beziehungsweise Verfahren und Verwendungsmöglichkeiten, die auf derartigen Sonden und Chips beruhen.
Bei der technischen Nutzung biologischer Prozesse stellt sich das sehr grundlegende Problem, deren Verlauf zu überwachen, um zum gewünschten Ergebnis zu gelangen, um Ressourcen zu schonen und/oder um in einer gegebenen Zeit ein optimales Ergebnis zu erzielen. Unter biologischen Prozessen sind beispielsweise die Kultur von Mikroorganismen auf einer Agarplatte oder in Schüttelkultur zu verstehen, insbesondere aber deren Fermentation, beziehungsweise die Gewinnung von Rohstoffen über die Fermentation von Mikroorganismen. Hierzu gibt es einen reichhaltigen Stand der Technik, sowohl was einzellige Eukaryonten wie Hefen oder Streptomyceten, als auch was gramnegative oder grampositive Bakterien angeht.
Die Überwachung derartiger Prozesse (Monitoring) geschieht einerseits durch die Beobachtung der sich im Laufe des Prozesses wandelnden Eigenschaften und Anforderungen der betrachteten Organismen, was sich beispielsweise in der optischen Dichte und Viskosität des Mediums, in aufgenommenen oder abgegebenen Gasen, in Änderungen des pH-Werts oder sich wandelnden Nährstoffbedürfnissen niederschlägt. Hierzu kann man auch die Messung enzymatischer Aktivitäten über geeignete Assays rechnen, beispielsweise den Nachweis interessierender Aktivitäten im Kulturüberstand.
Andererseits sind in den letzten Jahren verschiedene Techniken entwickelt worden, um die Stoffwechselprozesse der betreffenden Organismen auf der Ebene der Genexpression zu verfolgen. Eine gängige Methode hierfür ist die Verwendung von Genen für leicht nachzuweisende Proteine als Indikatoren für die Aktivität der Promotoren für die eigentlich interessierenden Gene (Promotor-Analyse, Genexpressions-Analyse). Hierfür sind auch entsprechende Apparaturen (sogenannte (Bio-)Sensoren) entwickelt worden. Andere Techniken befassen sich mit dem Nachweis der interessierenden Proteine beziehungsweise der für diese Proteine codierenden mRNA. Hierzu gehören (1.) die Proteom-Analyse, das heißt die Betrachtung der Veränderung der Ausstattung der betreffenden Zellen mit Proteinen, welche zumeist über 2-dimensionale Gelelektrophorese der Zellysate erfolgt, (2.) die Analyse der gebildeten mRNA (Transkriptom) über ein in analoger Weise erstelltes „genomisches DNA-Array" und (3.) die Chip-Technologie.
Letztere befindet sich in einem vergleichsweise frühen Entwicklungsstadium. Während die beiden zuerst genannten Methoden letzlich auf quantitativen Isolierungen und zeitaufwendigen Analysen der betreffenden Makromoleküle beruhen, liegt der Chip-Technologie das Prinzip zugrunde, auf physikalisch auslesbaren Trägern (Chips) Sonden für Proteine oder für Nukleinsäuren anzubringen, die unmittelbar auf das Vorhandensein der betreffenden Proteine, beziehungsweise Nukleinsäuren ansprechen. Gegenüber den beiden zuerst genannten Technologien verspricht man sich von derartigen Chips eine zum betrachteten Prozeß zeitnahe Analyse (/\f-//ne-Analyse). Ein weiterer Vorteil ist der Bedarf an vergleichsweise kleinen Probenmengen.
Das Prinzip von Chip-basierten Messungen wird beispielsweise in dem Artikel „Real-time electrochemical monitoring: toward green analytical chemistry" von J. Wang (Acc. Chem. Res.; ISSN 0001-4842; Rec. Sept. 12. 2001 , Seiten A - F) schematisch in Figur 2 vorgestellt. Demnach wird die zu analysierende Probe mit einer Erkennungsschicht (biorecognition layer) in Kontakt gebracht, bei der es sich beispielsweise um Enzym, Antikörper, Rezeptor oder DNA handeln kann; das hierüber empfangene Signal wird über einen Umwandler (Transducer), beispielsweise eine amperometrische oder potentiome- trische Elektrode, über einen Verstärker (amplification/processing) als elektrische Spannung oder als elektrisches Potential ausgegeben. In der betreffenden Arbeit werden auch optische Systeme angesprochen, denen gegenüber die elektronisch auswertbaren Systeme hinsichtlich der Miniaturisierbarkeit und anderer Vorteile dem Autor günstiger erschienen.
Aufgrund der vorliegenden Erfindung können die Protein-spezifischen Chips außer Betracht bleiben. mRNA erkennende Chips sind in der Regel mit komplementären DNA- Molekülen oder DNA-Analoga dotiert. Deren Herstellung und Nutzung zu sehr detaillierten Fragestellungen wie beispielsweise der Differenzierung von Punktmutationen wird beispielsweise in der Anmeldung WO 95/11995 A1 beschrieben. Unter den DNA-Chip- Analysen gibt es solche mit einer PCR-Amplifikation der Zielsequenz und solche ohne Amplifikation. Ferner gibt es solche mit optischer Auswertung der auf die Erkennung zurückzuführenden Signale und solche mit elektrischer Auswertung.
Die optischen Detektionsmethoden erfordern zum Teil einen Verstärkungsmechanismus der Signale. Hierfür werden zum Beispiel Fluorophore, Acridiniumester oder eine indirekte Detektion über sekundäre Bindungsvorgänge, zum Beispiel über Biotin, Avi- din/Streptavidin oder Digoxigenin beschrieben. Im letzteren Falle werden zum optischen Nachweis Digoxigenin-spezifische Antikörper eingesetzt, die mit einem Enzym markiert werden. Dabei wird die Enzymaktivität entweder kolorimetrisch oder über Lumineszenz nachgewiesen. Nach Westin et al. (2000), Nature Biotechnol., 18, S. 199-204, kann die Hybridisierung mit einer PCR auf dem DNA-Chip gekoppelt werden, um so die gesamte Nachweisreaktion auf einem Chip durchführen zu können („Lab-on-a-Cfr/p-Konzept").
Weitere Arbeiten beschreiben die Entwicklung von DNA-Chips, die das Prinzip der Kapillarelektrophorese zur DNA-Sequenzierung, beziehungsweise Trennung miniaturisieren (Woolley und Mathies (1994), Proc. Natl. Acad. Sei., 91, S. 11348-11352; Liu et al. (2000), Proc. Natl. Acad. Sei., 97, S. 5369-5374).
Elektrisch auslesbare DNA-Chips sind in einigen Publikationen prinzipiell bereits vorgestellt worden (Hoheisel (1999), DECHEMA Jahresbericht 1999, S. 8-11 ; Hintsche et al. (1997), EXS, 80, S. 267-283). Wright et al. (2000; Anal. Biochem., 282, S. 70-79) nutzten einen „lon-Channel-Sensor" (ICS) zur DNA-Detektion, wie er erstmalig von Cornell et al. (1997; Nature, 387, S. 580-583) beschrieben wurde. Dabei handelt es sich um ein Verfahren, bei dem die Leitfähigkeit molekularer lonenkanäle durch eine Bindungsreaktion detektiert wird. Im wesentlichen stellt der Sensor ein Impedanz-Element dar. Cheng et al. (1998; Nat. Biotechnol., 16, S. 541-546) zufolge können elektrische Impulse zu einer Verstärkung der Hybridisierungsreaktion auf optischen DNA-Chips genutzt werden. Fritsche et al. (2002; Laborwelt II) schlugen ein elektrisches Chip-System vor, das mit metallischen Nanopartikeln arbeitet, die zum Beispiel an Oligonukleotide gebunden sind. Bei diesem System wird durch eine sogenannte „metallische Verstärkung" während der Hybridisierungsreaktion ein Abfall des elektrischen Widerstandes an der Elektrode ausgelöst, der dann als Signal meßbar ist. Ein weiterer Ansatz basiert auf einem elektrischen Detektionsprinzip, in dem DNA-Sonden verwendet werden, die durch die Markierung mit einem geeigneten Enzym (zum Beispiel alkalische Phosphatase) nach der Hybridisierung zu einem elektrisch aktiven Substrat führen, das dann durch eine Redox-Reaktion an der Elektrode detektierbar ist (Hintsche et al. (1997), EXS, 80, S. 267-283).
Wenn man sich hinsichtlich des prinzipiellen Aufbaus und des Auswertungssystems für einen bestimmten Nukleinsäure-erkennenden Chip-Typus entschieden hat, stellt sich das konkretere Problem, welche Genaktivitäten beobachtet werden sollen. Dabei ist zu bedenken, daß in der Zahl der mit einem Nukleinsäure-Chip-Typ gleichzeitig analysierbaren Gene technisch bedingte Grenzen bestehen. So sind optisch auslesbare Chips, was die Zahl der Sonden, die auf dem Chip aufgebracht werden können, den elektrisch auswertbaren derzeit überlegen. Deren Grenzen werden durch die Miniaturisierbarkeit der elektronischen Meßeinheiten gesetzt.
Es stellt sich somit das biologische Problem, welche Auswahl von Genaktivitäten den betrachteten Prozeß in geeigneter Weise abbildet. Hierzu gehört auch die Überwachung der Produktbildung, wenn es sich beispielsweise um eine fermentative Produktherstellung handelt. Gleichzeitig sollten auch Kontrollgene eingeschlossen werden, die anzeigen, wenn der Prozeß sich in eine Richtung entwickelt, die nicht beabsichtigt ist. Im Zuge dieses Monitoring sollte aus Praktikabilitätsgründen eine nicht zu hohe Zahl an verschiedenen Genen beobachtet werden.
Von besonderem technischem Interesse sind biotechnologische Prozesse mit grampositiven Bakterien. Denn diese werden besonders aufgrund ihrer Fähigkeit zur Sekretion zur industriellen Herstellung von Wertstoffen eingesetzt. Hierunter haben solche der Gattung Bacillus und hierunter wiederum die Spezies ß. subtilis, B. amyloliquefaciens, B. agaradherens, B. licheniformis, B. lentus und B. globigii derzeit die wirtschaftlich größte Bedeutung.
Mit der simultanen Beobachtung der Aktivität mehrerer Gene in Bakterien (multiparame- trische Erfassung) befassen sich beispielsweise die im folgenden vorgestellten Arbeiten. In dem Artikel „Monitoring of genes that respond to process-related stress in large-scale bioprocesses" von Schweder et al. (1999), Biotech. Bioeng., 65, S. 151-159, wird die Veränderung der mRNA-Spiegel verschiedener durch Streß-Faktoren induzierbarer Gene, nämlich clpB, dnaK (induziert bei Hitzeschock), uspA (Glucose-Mangel), proU (osmotischer Streß), pfl und frd (O2-Mangel) und ackA (Glucose-Überschuß) im Verlauf einer Fermentation von E. coli und in der nachfolgenden Konzentrierungsphase beschrieben. Sie wurden über eine PCR-basierte, auf herkömmliche Weise durchgeführte Methode erfaßt. Hierbei wurden unterschiedliche Expressionsraten bereits an verschiedenen Stellen des Reaktors und sekundenschnelle Reaktionen auf veränderte Bedingungen festgestellt.
Eine weitere Fermentation von E. coli wird in der Arbeit „Monitoring of genes that respond to overproduction of an insoluble recombinant protein in Escherichia coli glucose-limited fed-batch fermentations" von Jürgen et al. (2000), Biotech. Bioeng., 70, S. 217-224, beschrieben. Hierin wird die Expression der Gene Ion, dnaK, ibpB, MrA, ppiB, groEL, tig, s6, 19 und dps, teilweise auf mRNA-, teilweise auf Proteinebene, teilweise auf beiden Ebenen betrachtet. Dabei erfolgte die Untersuchung über 2D-PAGE, beziehungsweise die DNA-array-Technik. Angesichts der Ergebnisse wird vorgeschlagen, rekombinante Bioprozesse wie die heterologe Protein-Herstellung über (unmittelbar) Prozeß-relevante Proteine und Reporter-Gene wie ibpB zu verfolgen.
Mit einer weiteren Beobachtung des Fermentationsverlaufs bei Expression eines rekombinanten Proteins durch E. coli befaßt sich die Arbeit „Genomic analysis of high- cell-density recombinant Escherichia coli fermentation and "cell conditioning" for improved recombinant protein yield" von R.T.Gill et al. (2001 ; Biotech. Bioeng., 72, S. 85-95). Hierin wird beschrieben, daß die Streß-Gene degP, uvrB, alpA, mltB, recA, ftsH, ibpA, aceA und groEL unter den genannten Bedingungen bei hoher Zelldichte gegenüber niedriger Zelldichte verstärkt exprimiert werden. Der Stärke der Reaktion nach gruppierten sie sich untereinander zu gewissen Clustern. Dies wurde über einen auf RT-PCR und DNA- Microarray beruhenden und durch Dot-blot-Analyse ergänzten Ansatz ermittelt, der auf Proben von zwei Zeitpunkten der Fermentation angewendet wurde, eben zu Beginn bei niedriger Zelldichte und gegen Ende bei hoher Zelldichte. Hieraus wurden „Cell Conditioning"-Ansätze entwickelt, um die Streß-Antwort der Zellen herabzusetzen.
Grundsätzliche Unterschiede in den Expressionsmustern grampositiver Organismen gegenüber denen von gramnegativen Bakterien werden mit der Arbeit „Proteome and transcriptome based analysis of Bacillus suhtilis cells overproducing an insoluble heterologous protein" von Jürgen et al. (2001), Appl. Microbiol. Biotechnol., 55, S. 326- 332 aufgedeckt. Darin wird die Expression unter anderem der Gene dnaK, groEL, grpE, cIpP, clpC, clpX, rpsB und rplJ in S. subtilis beschrieben, wie sie über die DNA-macro- array-Technik, beziehungsweise über zweidimensionale Polyacrylgelelektrophorese ermittelt werden können. Hiernach werden in grampositiven zur Überexpression eingesetzten Bakterien die Gene für die Purin- und die Pyrimidin-Synthese sowie die bestimmter ribosomaler Proteine stärker exprimiert, als aufgrund der Erkenntnisse an gramnegativen Bakterien zu erwarten war. Ein weiterer Unterschied betrifft die Proteasen Lon und CIp.
Einzelne dieser Gene oder sogar Nukleinsäure-bindende Chips mit einzelnen dieser Gene werden inzwischen in mehreren Publikationen offenbart oder zumindest die Möglichkeit ihrer Herstellung aufgezeigt. So offenbaren beispielsweise die beiden Patentanmeldungen DE 10136987 A1 und DE 10108841 A1 jeweils ein Gen aus Corynebacterium glutamicum, nämlich clpC beziehungsweise citB. Beide Gene werden als relevant für den Aminosäure-Stoffwechsel beschrieben, weshalb eine kommerziell interessante Nutzung dieser Gene darin bestehen soll, sie zu inaktivieren oder zumindest abzuschwächen, um die fermentative Herstellung von Aminosäuren durch diesen Mikroorganismus zu optimieren. Weitere Anwendungsmöglichkeiten können nach diesen Anmeldungen darin bestehen, Sonden für die betreffenden Gen-Produkte auf Nukleinsäure-bindenden Chips vorzulegen.
Auf der anderen Seite werden zunehmend mehr Genomdaten verschiedener Organismen publiziert, die eine solche Fülle von Sequenzdaten enthalten, daß hieraus eine repräsentative Auswahl wünschenswert erscheint. So offenbart die Patentanmeldung WO 02/055655 A2 mehr als 1.800 DNA-Sequenzen, die durch die vollständige Sequenzierung des Genoms des Mikroorganismus Methylococcus capsulatus ermittelt worden sind.
Inzwischen ist beispielsweise auch das komplette Genom des grampositiven Bacillus licheniformis sequenziert worden. Es wird in der Publikation „The Complete Genome Sequence of Bacillus licheniformis DSM13, an Organism with Great Industrial Potential" (2004) von 8. Veith et al. in J. Mol. Microbiol. Biotechnol., Band 7 (4), Seiten 204 bis 211 , beschrieben und ist zusätzlich unter dem Eintrag AE017333 (Basen 1 bis 4.222.645) in der Datenbank GenBank (National Center for Biotechnology Information NCBI, National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA; http://www.ncbi.nlm.nih.gov; Stand 2.12.2004) zugänglich. Unter Verwendung der Technik optisch auswertbarer Chips ist es inzwischen sogar möglich, Nukleinsäure-bindende Chips herzustellen, die ein nahezu vollständiges Genom beziehungsweise das zugehörige Transkriptom abdecken (genomische DNA-Chips).
Mit der Anmeldung WO 2004/027092 A2 wird ein repräsentativer Querschnitt mit einer überschaubaren Anzahl von Genen zur Verfügung gestellt, um verschiedene physiologische Zustände, die ein beobachteter Mikroorganismus im Laufe der Kultivierung durchlaufen kann, zu identifizieren. Hierzu gehörten beispielsweise Hungerzustände gegenüber verschiedenen Nährstoffen oder Streßsituationen wie beispielsweise Hitze- oder Kälteschock, Scherstreß, oxidativer Streß oder Sauerstofflimitierung. Es handelt sich dabei um die folgenden Gene: acoA, ahpC, ahpF, citB, clpC, cIpP, codY, cspA, cspB, des, dnaK, eno, glnR, groEL, groL, gsiB, ibpA, ibpB, katA, katE, IctP, Idh, opuAB, phoA, phoD, pstS, purC, purN, pyrB, pyrP, sigB, tnrA, trxA und ydjF. Aus dieser Anmeldung gehen auch die zugehörigen DNA-Sequenzen aus B. subtilis, E. coli und/oder B. licheniformis hervor. Dadurch ist es möglich geworden, auch entsprechende Nukleinsäure-bindende Chips herzustellen, die bei der Überwachung eines auf Mikroorganismen, insbesondere grampositiven oder gramnegativen Bakterien beruhenden Bioprozesses Änderungen der diesen Prozeß kennzeichnenden Stoffwechselaktivitäten anzeigen.
Nukleinsäure-bindende Chips, die auf dieser Auswahl von Genen beruhen, liefern einen gewissen, insgesamt aber eher nur groben Überblick über die jeweilige Stoffwechselsituation. Sie vermögen in der Regel nicht, ein einzelnes Teilproblem besonders zu beleuchten; allerdings kann sich ein einzelnes positives Signal aus verschiedenen Situationen heraus ergeben oder auch nur falsch-positiv sein, weshalb es oft - und insbesondere in einer solchen unklaren Situation - sinnvoll ist, einen ausgewählten Stoffwechselaspekt separat zu analysieren. Andererseits ist gerade bei elektrisch auslesbaren Nukleinsäure-bindenden Chips, welche den Vorteil einer zeitnahen Analyse besitzen, die Zahl der gleichzeitig belegbaren Plätze begrenzt, so daß zur Erfassung zusätzlicher, spezieller Stoffwechselsituationen nicht einfach zusätzliche Gensonden aufgebracht werden können.
Gewisse Stoffwechselsituationen und darunter sogar Mangelzustände werden in der Biotechnologie ausgenutzt. So offenbart die Anmeldung DE 10012283 A1 eine Nutzanwendung der Induzierbarkeit von Genen durch Phosphatmangel. In der darin beschriebenen Untersuchung werden die Promotoren der Gene pstS, phoD, phoB oder glpQ aus ß. suhtilis zur Regulation von Transgenen verwendet, die für die heterologe Genexpression durch grampositive Wirtsbakterien aktiviert werden sollen. Hierfür muß gleichzeitig das PhoP-PhoR-Regulationssystem aus 6. subtilis zur Verfügung gestellt werden, um die betreffenden Promotoren zu aktivieren. Dieser Anmeldung zufolge soll ein Phosphatmangel künstlich herbeigeführt werden, um über PhoP und PhoR zu einer Induktion des jeweils gewählten Promotors zu gelangen. Es wird also nicht davon ausgegangen, daß zelleigene Regulationssysteme die künstlich eingeführten Promotoren der B. subtilis Gene pstS, phoD, phoB und glpQ zu induzieren vermögen. So ist beispielsweise aus anderen Untersuchungen (hier nicht gezeigt) bekannt, daß die pho- Gene in B. licheniformis anders organisert, das heißt auch anders reguliert sind.
Allerdings ist es im Laufe eines Bioprozesses wie oben erläutert zumeist nicht erwünscht, die Zellen einer Streßsituation auszusetzen. Denn insbesondere Phosphatmangel ist eine Stoffwechselsituation, die für Mikroorganismen kritisch und somit für einen entsprechenden Bioprozeß limitierend sein kann.
Somit besteht ein besonderer Bedarf, diesbezüglich eine Chip-basierte, zeitnahe Analyse durchzuführen und aufgrund des hierdurch rasch zu erhaltenden Ergebnisses punktuell und damit noch zielgerichteter in den laufenden Bioprozeß eingreifen zu können. Dadurch wird einem Verlust an Ausbeute vorgesorgt, der sich durch einen nicht oder zu spät erkannten Phosphat-Engpaß ergeben würde.
Im Stand der Technik sind weitere/andere Gene beschrieben, die bei Phosphatmangel verstärkt exprimiert werden, wenn auch nicht in allen für die Biotechnologie relevanten Mikroorganismen gleichermaßen. So behandelt die Publikation von Ishige et al. in J. Bacteriol., Band 185 (Nr. 15), Seiten 4519 bis 4529, eine DNA-Microarray-Analyse der durch Phosphatmangel aktivierten Gene (des „Phosphat-Stimulons") bei Corynebacterium glutamicum. In dieser Untersuchung wird der Reiz dadurch ausgelöst, daß von Orthophosphat als einziger Phosphatquelle in einen Phosphatmangelzustand übergegangen wird. Hierdurch werden in Übereinstimmung mit den Daten zu anderen Mikroorganismen einige Gene deutlich induziert, die in einem Zusammenhang mit dem Phosphatstoffwechsel stehen. Die Induktion weiterer Gene wird dagegen nur auf bloße Wachstumseffekte zurückgeführt. Ferner wurde beobachtet, daß von den bekannten Genen des Phosphatstoffwechsels nicht alle sondern nur einzelne induziert werden. Umgekehrt werden manche Proteine verstärkt gebildet, deren Homologe in anderen Mikroorganismen nicht auf diesen Reiz hin verstärkt exprimiert werden, beispielsweise eine Nukleotidase, deren Homolog bei E. coli ein unverändertes Expressionsniveau aufweist, und ein Ferritin-ähnliches Proteins sowie eine wahrscheinliche extrazelluläre Nuclease NucH, deren Expressionsniveaus beispielsweise bei ß. licheniformis nicht signifikant erhöht sind (Daten nicht gezeigt).
Die Publikation von Antelmann et al. in J. Bacteriol., Band 182 (Nr. 16), S. 4478 bis 4490 untersucht die durch Phosphatmangel bei B. subtilis induzierbaren Proteine auf Proteom- und Transkriptom-Ebene mit Hilfe zweidimensionaler Gelelektrophorese; die Micro-Array- Technolgie wird hierin lediglich als eine in gewisser Hinsicht möglicherweise ergänzende Technologie angesprochen. Abbildung 4 offenbart insgesamt zehn Proteine, die in diesem Organismus auf einen Phosphatmangel-Reiz hin verstärkt gebildet werden. Die stärksten Signale sind die von GIpQ, PhoD und PstS, gefolgt von PhoB und PeI. Demgegenüber ergaben eigene Untersuchungen im Zusammenhang mit der vorliegenden Anmeldung, daß glpQ und pel in B. licheniformis bei Phosphatmangel nur unwesentlich überexprimiert werden. Stattdessen lieferte in B. licheniformis beispielsweise das Gen für die Phytase (siehe Beispiele) ein überraschend starkes Signal, was in B. subtilis nicht der Fall ist.
Bei der Überlegung, zur Überwachung von Bioprozessen geeignete RNA-erkennende Chips zu entwerfen, bestehen also mehrere grundsätzliche Schwierigkeiten. Zum einen stellt sich bei jedem Gen die Frage der Übertragbarkeit auf andere Organismen: Es müssen Gene ausgewählt werden, die in möglichst vielen für derartige Bioprozesse relevanten Mikroorganismen deutliche Signale liefern. Zum anderen stellt sich die Frage der Spezifität: die starken Signale müssen auch möglichst eindeutig der betreffenden Stoffwechselsituation zuordenbar sein. Solche Signale, die auf mehrere verschiedene Stoffwechselsituationen ansprechen und/oder allgemeine Streßsignale darstellen, sollten möglichst weitgehend ausgeschlossen werden.
Der für die vorliegende Erfindung gewählte Lösungsansatz besteht darin, eine möglichst repräsentative Auswahl einer ganzen Reihe von Genen zu treffen, wobei meist nicht alle, erfindungsgemäß aber mehrere Sonden bei dem jeweils beobachteten Organismus Signale ergeben. Zum anderen sollten solche Gene ausgeschlossen werden, die in anderen Stoffwechselsituationen als in der des Phosphatmangels ebenfalls starke oder sogar noch stärkere Signale ergeben. Für die vorliegende Erfindung stellte sich somit die Aufgabe, Gene zu identifizieren, die bei Organismen, insbesondere Mikroorganismen möglichst eindeutig mit dem Streß- Signal des Phosphatmangels in Verbindung gebracht werden können. Ziel war es, Sonden für diese Gene zu entwickeln, um sie für die Überwachung entsprechender Bioprozesse einsetzen zu können.
Damit sollte es möglich sein, Nukleinsäure-bindende Chips mit Gensonden für einzelne oder mehrere dieser Gene zu belegen und hierdurch zu Nukleinsäure-bindenden Chips zu gelangen, die im Verlaufe eines überwachten Bioprozesses zuverlässig das Signal „Phosphatmangel" anzeigen (Phosphatmangel-Sensoren). Diese Aufgabe stellte sich insbesondere für solche Nukleinsäure-bindenden Chips, deren Anzahl an belegbaren Plätzen aufgrund ihrer Bauart vergleichsweise gering ist, insbesondere die elektrisch auswertbaren. Denn diese weisen andererseits die Vorteile einer raschen Auslesbarkeit auf und ermöglichen damit eine /tf-//ne-Analyse. Dies gewährleistet ein gegebenenfalls frühzeitiges Eingreifen, um den betreffenden Bioprozeß hinsichtlich der Phosphatversorgung zu optimieren.
Solch ein DNA-bindender Chip sollte für mehrere miteinander vergleichbare Prozesse einsetzbar und mit vergleichsweise geringfügigen Variationen an spezifische Einsatzmöglichkeiten anzupassen sein. Vorzugsweise sollte er auf Bioprozesse auf der Grundlage von Bacillus-Spezies, insbesondere B. subtilis, B. amyloliquefaciens, B. lentus, B. globigii, und ganz besonders auf B. licheniformis ausgerichtet sein. Unter Bioprozessen standen Fermentationen, insbesondere die technische Herstellung von Produkten, ganz besonders von überexprimierten Proteinen im Vordergrund.
Ferner sollte solch ein Phosphatmangel-Sensor entsprechende Verfahren zur Messung des physiologischen Zustande der betrachteten Zellen sowie entsprechende Verwendungsmöglichkeiten zur Überwachung der betrachteten biologischen Prozesse ermöglichen.
Zur Lösung dieser Aufgabe wurde eine Vielzahl von Genen aus dem biotechnologisch wichtigen Bakterium B. licheniformis hinsichtlich ihrer Aktivierbarkeit durch den Übergang der betreffenden Kultur in einen Phosphatmangelzustand untersucht (Beispiel 1). Dabei wurde überraschenderweise festgestellt, daß bei weitem nicht alle Gene, die am Phosphatstoffwechsel beteiligt sind, ein diesbezüglich eindeutiges Signal liefern. Zusätzlich wurde - ebenso überraschend - eine Aktivierung von solchen Genen beobachtet, die zuvor nicht ohne weiteres mit dem Phophsphatstoffwechsel in Verbindung gebracht worden sind, beispielsweise Sporulationsgenen; diese sollen nun unabhängig von ihrer bislang bekannten Funktion erfindungsgemäß ebenfalls als Phosphatstoffwechselgene angesehen werden. Beides belegt Beispiel 2 der vorliegenden Anmeldung. Dabei wurden sehr unterschiedlich starke Induktionen beobachtet. Der Lehre der vorliegenden Erfindung zufolge sollen Gene umso mehr als Indikatoren geeignet sein, je stärker diese Antwort ausfällt. Erfindungsgemäß werden deshalb solche Gene als Phosphatmangel-Indikatoren ausgewählt, die ein deutliches, signifikant über einem bestimmten Schwellenwert liegendes Signal ergeben. Je weiter das Ergebnis darüber liegt, desto mehr sind sie erfindungsgemäß bevorzugt, womit sich eine entsprechende Staffelung hinsichtlich bevorzugter Erfindungsaspekte erklärt. Gleichzeitig wurden solche Gene wieder herausgenommen, die in anderen Situationen als in der des Phosphatmangels ebenfalls starke oder sogar noch stärkere Signale ergeben haben (Daten nicht gezeigt).
Tabelle 1 zeigt alle in Beispiel 1 ermittelten 235 Gene von Bacillus licheniformis DSM13, deren Induzierung unter Phosphatmangel beobachtet wurde, wobei ein Faktor von mindestens drei als signifikant angesehen wurde. Hiervon sind in Tabelle 2 alle 47 Gene zusammengestellt, deren Induzierung durch Phosphatmangel zu irgendeinem der gemessenen Zeitpunkte mindestens den Faktor 10 betragen hat und bei denen aus parallelen, hier nicht gezeigten Untersuchungen geschlossen werden konnte, daß sie vergleichsweise spezifisch für dieses Signal waren. Diese sind in Tabelle 3 noch einmal hinsichtlich der Stärke ihrer beobachteten maximalen Induktion aufgelistet. Ihre DNA- und Aminosäuresequenzen werden im Sequenzprotokoll zur vorliegenden Anmeldung aufgeführt, wobei die ungeradzahligen Nummern für DNA- und die nachfolgenden geradzahligen für die jeweils abgeleiteten Aminosäuresequenzen stehen. Auf diese Sequenzen verweisen auch die jeweiligen SEQ ID-Nummern in den Tabellen 2 und 3. Dabei handelt es sich um folgende Gene, in der Reihenfolge abnehmender Stärke der durch Phosphatmangel ausgelösten Induktion (vergleiche Tabelle 2 und 3):
- yvmC (Ähnliches zu Proteinen unbekannter Funktion; SEQ ID NO. 75, 76);
- yvnA (Ähnliches zu Proteinen aus S. subtilis; SEQ ID NO. 77, 78);
- phoB (Alkalische Phosphatase III; SEQ ID NO. 21 , 22);
- pstS (Phosphat-ABC-Transporter / Bindungsprotein; SEQ ID NO. 47, 48); - phoD (Phosphodiesterase / Alkalische Phosphatase; SEQ ID NO. 23, 24);
- alsS (Alpha-Acetolactat-Synthase; SEQ ID NO. 29, 30);
- cypX (Cytochrom-P450-ähnliches Enzym; SEQ ID NO. 3, 4);
- phy (Phytase; SEQ ID NO. 33, 34);
- Gen für eine vermutliche Phosphatase (SEQ ID NO. 61 , 62);
- Homolog zu dhaS (Homolog zur Aldehyd-Dehydrogenase DhaS; SEQ ID NO. 17, 18);
- pstBA (Phosphat-ABC-Transporter PstBA; SEQ ID NO. 87, 88);
- yfmQ (unbekannte Funktion; SEQ ID NO. 69, 70);
- pstC (Phosphat-ABC-Transporter / Permease; SEQ ID NO. 91 , 92);
- yfkN (Ähnliches zur 2',3'-Cyclo-Nucleotid-2'-Phosphodiesterase; SEQ ID NO. 11 , 12);
- gdh (Glucose-1 -Dehydrogenase; SEQ ID NO. 31 , 32);
- alsD (Alpha-Acetolactat-Decarboxylase; SEQ ID NO. 27, 28);
- spolllAF (Sporulationsfaktor III AF; SEQ ID NO. 79, 80);
- spollAB (Anti-sigma-F-Factor / Phase-Il-Sporulationsprotein AB; SEQ ID NO. 37, 38);
- yfkH (Ähnliches zu Proteinen; SEQ ID NO. 67, 68);
- MpG (Klasse-Ill-Hitzeschockprotein; SEQ ID NO. 1 , 2);
- Gen für eine vermutliche Decarboxylase/Dehydratase (SEQ ID NO. 57, 58);
- yrbE (Ähnliches zur Dehydrogenase; SEQ ID NO. 9, 10);
- dhaS (Aldehyd-Dehydrogenase; SEQ ID NO. 19, 20);
- Gen für eine vermutliche Ribonuclease (SEQ ID NO. 93, 94);
- yvmA (Ähnliches zu einem Multidrug-Transporter; SEQ ID NO. 51 , 52);
- spolllAG (Sporulationsfaktor III AG; SEQ ID NO. 81 , 82);
- spollQ (Sporulationsfaktor Il Q; SEQ ID NO. 43, 44);
- Gen für ein hypothetisches Protein (SEQ ID NO. 63, 64);
- spolllAH (Sporulationsfaktor III AH; SEQ ID NO. 83, 84);
- pstBB (Phosphat-ABC-Transporter / ATP-Bindungsprotein; SEQ ID NO. 89, 90);
- Gen für ein vermutliches Benzoat-Transportprotein (SEQ ID NO. 49, 50);
- yhbE (Ähnliches zu Proteinen aus B. suhtilis; SEQ ID NO. 73, 74);
- Gen für eine vermutliche Aromaten-spezifische Dioxygenase (SEQ ID NO. 55, 56);
- spoVID (Sporulationsfaktor VI D; SEQ ID NO. 45, 46);
- yurl (Ähnliches zur Ribonuclease; SEQ ID NO. 15, 16); - Gen für ein konserviertes hypothetisches Potein (SEQ ID NO. 59, 60);
- cotE (äußeres Sporenhüllprotein; SEQ ID NO. 39, 40);
- yhbD (Ähnliches zu Proteinen aus B. subtilis; SEQ ID NO. 71 , 72);
- Gen für ein hypothetisches Protein (SEQ ID NO. 65, 66);
- spollAA (Anti-Sigma F-Faktor-Antagonist / Phase-Il-Sporulationsprotein AA; SEQ ID NO. 35, 36);
- pstA (Phosphat-ABC-Transporter / Permease; SEQ ID NO. 85, 86);
- nasE (Untereinheit der Assimilatorischen Nitritreductase; SEQ ID NO. 7, 8);
- spolIGA (Sporulationsfaktor Il GA; SEQ ID NO. 41 , 42);
- Gen für eine vermutliche Acetoin-Reductase (SEQ ID NO. 53, 54);
- ctaC (Cytochrom-CAAS-Oxidase / Untereinheit II; SEQ ID NO. 5, 6);
- tatCD (Komponente des Twin-Arginin-Translokations-Wegs; SEQ ID NO. 25, 26);
- yhcR (Ähnliches zur δ'-Nucleotidase; SEQ ID NO. 13, 14).
Eine Lösung der gestellten Aufgabe besteht in einem Nukleinsäure-bindenden Chip, dotiert mit Sonden für mindestens drei der folgenden 47 Gene: yhcR, tatCD, ctaC, Gen für eine vermutliche Acetoin-Reductase (Homolog zu SEQ ID NO. 53), spolIGA, nasE, pstA, spollAA, Gen für ein hypothetisches Protein (Homolog zu SEQ ID NO. 65), yhbD, cotE, Gen für ein konserviertes hypothetisches Potein (Homolog zu SEQ ID NO. 59), yurl, spoVID, Gen für eine vermutliche Aromaten-spezifische Dioxygenase (Homolog zu SEQ ID NO. 55), yhbE, Gen für ein vermutliches Benzoat-Transportprotein (Homolog zu SEQ ID NO. 49), pstBB, spolllAH, Gen für ein hypothetisches Protein (Homolog zu SEQ ID NO. 63), spollQ, spolllAG, yvmA, Gen für eine vermutliche Ribonuclease (Homolog zu SEQ ID NO. 93), dhaS, yrbE, Gen für eine vermutliche Decarboxylase/Dehydratase (Homolog zu SEQ ID NO. 57), MpG, yfkH, spollAB, spolllAF, alsD, gdh, yfkN, pstC, yfmQ, pstBA, Homolog zu dhaS (Homolog zur Aldehyd-Dehydrogenase DhaS; Homolog zu SEQ ID NO. 17), Gen für eine vermutliche Phosphatase (Homolog zu SEQ ID NO. 61), phy, cypX, alsS, phoD, pstS, phoB, yvnA, yvmC, wobei die Gesamtzahl aller Phosphatstoffwechsel-spezifischen unterschiedlichen Sonden nicht über 100 liegt.
Detaillierte Informationen zu diesen Genen gehen aus den Beispielen 1 bis 3 und den Tabellen 1 bis 3 der vorliegenden Anmeldung hervor. Im Sequenzprotokoll werden diese Gene offenbart, wie sie aus B. licheniformis DSM 13 erhältlich sind. Die meisten davon sind auch aus anderen Spezies beschrieben (s.u.). Bei einigen handelt es sich jedoch um putative (angenommene; vermutliche) Gene oder um Gene, die für putative (angenommene; vermutliche) Enzyme codieren. Diese werden erfindungsgemäß soweit wie möglich aufgrund von Datenbankvergleichen als solche mit einer angenommenen Funktion und zusätzlich als Homologe zu den gefundenen B. licheniformis-Genen definiert. Hierzu muß zweierlei erläutert werden:
- Zum einen könnte sich bei dem einen oder anderen durch eine biochemische Analyse herausstellen, daß diese putative Funktion nicht mit der wirklichen Funktion übereinstimmt. Dann wird nicht an der putativen Funktion festgehalten. Vielmehr stellen diese Erkenntnisse die Erfindung insofern nicht in Frage, als es erfindungsgemäß lediglich auf die Beobachtung der verstärkten Transkription im Zusammenhang mit dem Phosphatmangel ankommt, so daß die betreffende Genaktivität unabhängig von der letztlich ausgeübten Enzymaktivität durchaus als Indikator für Phosphatmangel dienen kann.
- Zum anderen ließ sich für diese in Ermangelung eines Gennamens keine passendere Definition als die über das Gen selbst finden. Deshalb wird von Homologen gesprochen. So ist anzunehmen, daß in anderen Spezies als ß. licheniformis unter Phosphatmangel die homologen Gene aktiviert werden. Sollte sich herausstellen, daß in einer betrachteten Spezies zu einem dieser Gene mehrere Homologe existieren, die in vivo zur Transkriptbildung befähigt sind, so bezieht sich die Angabe „Homolog zu SEQ ID NO. ..." auf das jeweils nächstähnliche dieser verschiedenen in Frage kommenden Gene.
Erfindungsgemäß werden mindestens drei dieser Gene ausgewählt, um eine möglichst zuverlässige Aussage zu erhalten, das heißt um ein einzelnes, auf nur einen Sondentyp zurückzuführendes falsch-positives Signal auszuschließen.
Unter einem Nukleinsäure-bindenden Chip sind erfindungsgemäß alle Gegenstände zu verstehen, die mit Nukleinsäure-spezifischen Sonden versehen sind und bei Bindung einer oder mehrerer spezifisch erkannter Nukleinsäuren jeweils ein auswertbares Signal liefern.
Aus dem einleitend dargestellten Stand der Technik ist die Gestaltung von Chips bekannt, die mit Nukleinsäuren als Sonden dotiert sind. Prinzipiell können sie alle für Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung genutzt werden. Sie basieren auf dem Prinzip der Nukleinsäure-Hybridisierung der zu detektierenden mRNA (oder einem hiervon abgeleiteten Molekül) mit der auf dem Chip vorgelegten Sonde. Je nach System zur Auswertung des durch die Hybridisierung ausgelösten Signals wird zwischen Chips mit einem optischen und mit einem elektrischen Analysesystem unterschieden. Erfindungsgemäß sind prinzipiell beide Systeme anwendbar.
Solche Chips werden folgendermaßen zur Kontrolle (Monitoring) des jeweils betrachteten Bioprozesses eingesetzt: Aus dem Prozeß wird zu einem bestimmten Zeitpunkt eine Probe mit dem zu analysierenden biologischem Material entnommen. Aus diesem wird, nach an sich bekannten Methoden, beispielsweise unter Zellaufschluß und Verwendung einen denaturierenden Puffers RNA, insbesondere mRNA isoliert. Diese wird selbst markiert oder als Ausgangsmolekül für ein in die Messung eingebrachtes Molekül eingesetzt (zum Beispiel durch reverse Transkription erhaltene cDNA) und die erhaltenen Moleküle vorteilhafterweise in einem Puffer über/durch den Chip geleitet. Bei Hybridisierung (Sandwich-Markierung) einer präparierten RNA beziehungsweise deren Derivat mit der homologen (das heißt hinsichtlich ihrer Sequenz kongruenten) auf dem Chip bereitgestellten Sonde (Target-Nukleinsäure, beispielsweise Target-DNA oder Target-Nukleinsäureanalog) ergibt sich ein entsprechendes optisch oder elektronisch auswertbares Signal. Dieses beruht beispielsweise auf der Markierung der bindenden mRNA oder einem Transkript davon mit einem Färb- oder Fluoreszenzmarker, einer Hybridisierung mit einer zweiten Sonde oder auf einer sekundären Nachweisreaktion, etwa über eine RT-PCR.
Da von derselben Sonde in der Regel jeweils mehrere Moleküle an den Chip gebunden sind, ist die Stärke des Hybridisierungssignal über einen gewissen - im Einzelfall gegebenenfalls zu optimierenden - Bereich proportional zur Zahl der zum Zeitpunkt der Probennahme in der Probe vorhandenen spezifischen mRNA. Auf diese Weise ist die Stärke des Signals ein direktes Maß für die Aktivität des betreffenden Gens zu dem Zeitpunkt der Probennahme.
Die Zeitspanne zwischen Probennahme und Messung sollte dabei so kurz wie möglich gehalten werden, beispielsweise über eine weitgehend automatisierte Probennahme, deren Aufarbeitung und Leitung über/durch den Sensor.
Als mithilfe eines erfindungsgemäßen Chips betrachtete (monitorierte) Organismen kommen prinzipiell alle Pflanzen, Tiere und Mikroorganismen in Frage, insbesondere solche, die kommerziell genutzt werden. So geht beispielsweise aus der Anmeldung DE 19860313 A1 mit dem Titel „Verfahren zur Erkennung und Charakterisierung von Wirkstoffen gegen Pflanzen-Pathogene" hervor, daß es in Pflanzen, insbesondere Nutzpflanzen Stoffwechselsituationen gibt, die beobachtet werden müssen. Ebenso können beispielsweise Nutztiere oder Labortiere beobachtet weden. Von nicht geringem kommerziellem Interesse sind eukaryontische Zellkulturen, etwa bei der Herstellung monoklonaler Antikörper, und insbesondere die fermentative Herstellung von Lebensmitteln, etwa über die von Hefen betriebene alkoholische Gärung. Bakterien werden insbesondere zur technischen Herstellung von Proteinen oder niedermolekularen Wertstoffen (Biotransformation), etwa von Vitaminen oder Antibiotika genutzt.
Unter Sonden sind erfindungsgemäß alle Moleküle zu verstehen, die in der Lage sind, mit Nukleinsäuren eine jeweils weitgehend spezifische Wechselwirkung einzugehen (sie zu binden). Diese Wechselwirkung wird erfindungsgemäß ausgenutzt, um im Rahmen einer entsprechenden Anordnung (Chip) ein weitgehend eindeutig zuzuordnendes, auswertbares Signal zu erhalten.
Chemisch gesehen handelt es sich bei einer erfindungsgemäßen Sonde zumeist um eine Verbindung, die in der Lage ist, über Wasserstoffbrückenbindungen mRNA-Moleküle oder hiervon abgeleitete Nukleinsäuren zu binden, so wie dies beispielsweise auch bei der Wechselwirkung der beiden Stränge einer DNA oder der DNA-RNA-Wechselwirkung erfolgt. Dies kann beispielsweise eine DNA sein, welche gegenüber Hydrolyse stabiler ist als RNA.
Im Stand der Technik sind darüber hinaus weitere Moleküle bekannt, insbesondere chemisch synthetisierte, die biomimetisch dieselbe Wechselwirkung ermöglichen, aber stabiler als DNA sind, beispielsweise dadurch, daß die Phophatester-Bindungen des Rückgrats gegen weniger hydrolyseempfindliche Bindungen ausgetauscht worden sind. Solche Nukleinsäure-Analogon-Sonden kennzeichnen bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Anmeldung (siehe unten). Die betreffenden spezifischen Sonden wären, etwa nach dem Vorbild des mit dieser Anmeldung verbundenen Sequenzprotokolls entsprechend zu synthetisieren. Dies kommt dem Aspekt entgegen, daß erfindungsgemäße Chips vorteilhafterweise mehrmals verwendbar sein sollten, insbesondere während eines einzelnen beobachteten Prozesses, in dessen Verlauf eine ständige Überwachung erstrebenswert ist. Limitierend für die Brauchbarkeit einer Sonde ist jeweils das Maß der Homologie zwischen der bereitgestellten Sonde und der mRNA oder der davon abgeleiteten Nukleinsäure, die über Hybridisierung erkannt werden soll. Letztlich entscheidet das Maß an Hybridisierung der Sonde mit der zu detektierenden mRNA (siehe oben) über deren Brauchbarkeit als Sonde und muß im Einzelfall experimentell optimiert und/oder über Anpassung der Signalauswertung berücksichtigt werden. Es muß unter den durch den Aufbau der Meßapparatur, und sonstigen Einflüssen vorgegebenen Bedingungen eine Hybridisierung erfolgen, die spezifisch nur auf das interessierende Gen zurückgeführt werden kann, ausreichend stark ist, um ein positives Signal zu ergeben, und andererseits nicht zu stark ist, als daß das erkannte Molekül nach Erzeugung des Signals wieder abdiffundiert, um die Bindungsstelle für das nächste Molekül freizumachen, beziehungsweise ein Abklingen des Signals zu ermöglichen; letzteres gegebenenfalls über einen entsprechenden Waschschritt.
Allerdings ist es nötig, vor Verwendung erfindungsgemäßer Chips für einen interessierenden Organismus das Maß der Homologie zwischen den betreffenden Genen abzuschätzen, bei nicht ausreichender Affinität der zu detektierenden mRNAs zu den voregelegten Sonden solche über dieselben erfindungsgemäßen Gene aus näher verwandten Spezies auf dem Chip zu verankern und Kalibrierungsmessungen durchzuführen, um verläßliche Aussagen darüber zu erhalten, welche Signalstärke welcher Konzentration an spezieller mRNA entspricht.
Die Identifizierung der für die vorliegende Erfindung wesentlichen 47 Gene ist in den Beispielen zur vorliegenden Anmeldung beschrieben. Deren aus Bacillus licheniformis erhältlichen Sequenzen sind im Sequenzprotokoll der vorliegenden Anmeldung angegeben (SEQ ID NO. 1 bis 94), wobei es sich bei den Sequenzen mit ungeradzahligen Nummern um DNA-Sequenzen und bei den jeweils um einen Zahlwert höheren Sequenzen um die jeweils davon abgeleiteten Aminosäuresequenzen handelt. Während die DNA-Sequenzen unmittelbar für die Herstellung von Sonden genutzt werden können (siehe oben), dienen die Aminosäuresequenzen beispielsweise über Sequenzdatenbank- Vergleiche der Überprüfung der Genfunktion und können ferner dazu dienen, um etwa über Rück-Übersetzung des genetischen Codes ähnliche Nukleinsäuren-erkennende Sonden zu generieren. Wie in Beispiel 1 dargestellt ist, wurden zahlreiche verschiedene Gentranskripte, das heißt mRNA-Moleküle untersucht, insbesondere solche, von denen eine Beteiligung am Phosphatstoffwechsel allgemein bekannt war. Diese mRNA-Moleküle wurden zu verschiedenen Zeitpunkten während des Übergangs von B. licheniformis DSM 13 in einen Phosphatmangelzustand isoliert. In Beispiel 1 wird ebenfalls beschrieben, wie der Konzentrationsanstieg dieser mRNA im Zellinneren von B. licheniformis experimentell ermittelt wurde. Alternative Bestimmungsmöglichkeiten hierzu mögen im Stand der Technik etabliert sein; entscheidend für das Verständis der vorliegenden Erfindung ist die Zusammenstellung in Tabelle 1 (Beispiel 2). Sie zeigt die mit dem Übergang verbundenen Konzentrationsänderungen für insgesamt 235 mRNAs. Dabei wurden folgende Schwellenwerte für das Verhältnis der RNA Menge des jeweiligen Gens gegenüber dem Kontrollwert als signifikant angesehen: Als induziert gelten erfindungsgemäß die Gene, deren RNA ein Verhältnis > 3 (das heißt mindestens eine Verdreifachung) aufweist; eine deutliche Induktion liegt bei ein Verhältnis von > 10 vor; deutlich reprimiert sind Gene mit einem RNA-Verhältnis < 0,3 (das heißt einem Absenken auf weniger als 30%). Bei den in Tabelle 1 aufgeführten 235 Genen wurde zu irgendeinem der betrachteten Zeitpunkte mindestens eine Verdreifachung beobachtet.
Unter diesen 235 Genen befinden sich, wie Tabelle 2 belegt, überraschenderweise lediglich 47 Gene mit einer mindestens 10fachen Induktion zu irgendeinem der beobachteten Zeitpunkte unter den Bedingungen des in Beispiel 1 beschriebenen Phosphatmangels. Diese 47 Gene werden erfindungsgemäß als repräsentative Indikatoren eines Phosphatmangelzustands angesehen. Weitere Angaben zu diesen Genen, beispielsweise über deren Funktion oder abweichende Start-Codons sind den Tabellen 2 und 3 und dem Sequenzprotokoll zu entnehmen; die jeweiligen deutschsprachigen Bezeichnungen für die zugehörigen Proteine sind bereits oben, in der Reihenfolge der Angaben in Tabelle 3 aufgeführt worden.
All diese Gene sind jeweils für sich im Stand der Technik beschrieben. Sie können für die verschiedenen Organismen aus allgemein zugänglichen Datenbanken entnommen werden. Wie oben erwähnt sind die im Sequenzprotokoll für B. licheniformis DSM 13 angegebenen Sequenzen aus diesem Mikroorganismus ermittelt worden und stimmen praktisch mit den in der Publikation „The Complete Genome Sequence of Bacillus licheniformis DSM13, an Organism with Great Industrial Potential" (2004) von B. Veith et al. in J. Mol. Microbiol. Biotechnol., Band 7 (4), Seiten 204 bis 211 , beschriebenen und zusätzlich unter dem Eintrag AE017333 (Basen 1 bis 4.222.645) in der Datenbank GenBank (siehe oben) zugänglichen Angaben überein. Der Stamm ß. licheniformis DSM 13 ist über die Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1 b, 38124 Braunschweig (http://www.dsmz.de) allgemein erhältlich. Er trägt bei der American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, USA (http://www.atcc.org) die Hinterlegungsnummer ATCC 14580.
Die zu den genannten 47 Genen entsprechenden Gene aus anderen Organismen sind zu einem Großteil ebenfalls in allgemein zugänglichen Datenbanken hinterlegt, beispielsweise für die gut charakterisierten Spezies B. subtilis und E. coli, die allgemein als Modellorganismen der grampositiven, beziehungsweise gramnegativen Bakterien angesehen werden. Die entsprechenden Sequenzen können beispielsweise den Datenbanken des Institut Pasteur, 25,28 rue du Docteur Roux, 75724 Paris CEDEX 15, Frankreich, entnommen werden, welche über die Internet-Adressen http://genolist.pasteur.fr/Colibri/ (für E. coli), beziehungsweise http://genolist.pasteur.fr/SubtiList/ (für B. subtilis) zugänglich sind (Stand: 2.12.2004). Weitere hierfür geeignete Datenbanken sind die des EMBL-European Bioinformatics Institute (EBI) in Cambridge, Großbritannien (http://www.ebi.ac.uk), Swiss-Prot (Geneva Bioinformatics (GeneBio) S.A., Genf, Schweiz; http://www.genebio.com/sprot.html) oder GenBank (National Center for Biotechnology Information NCBI, National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA).
Unter diesen „entsprechenden Genen" sind diejenigen zu verstehen, die jeweils für die Proteine codieren, die im betrachteten Organismus dieselbe chemische Reaktion katalysieren oder an demselben physiologischen Vorgang wie die genannten 47 Proteine in ß. licheniformis DSM 13 beteiligt sind. Die meisten davon tragen für andere Organismen ähnliche Namen und Abkürzungen wie die, die in den Tabellen 1 und 2 für B. licheniformis angegeben sind, weil diese Namen für die jeweilige Funktion stehen. Im Zweifelsfall geben sie sich über ihre Sequenz zu erkennen, welche aus dem betreffenden Organismus die zu den hier genannten jeweils nächstähnliche (am stärksten homologe) ist. Bei der Funktionszuordnung kommt es vor allem auf die Ähnlichkeit der Aminosäuresequenzen zueinander an, weil die Aminosäuren die Funktionsträger des Proteins darstellen und aufgrund der Degeneriertheit des genetischen Codes verschiedene Nukleotidsequenzen für dieselbe Aminosäuresequenz codieren können. Besonders hohe Verwandtschaftsgrade bestehen zwischen nahe verwandten Spezies. So kann prinzipiell davon ausgegangen werden, daß sich zu den meisten der genannten 47 Gene Homologe in allen Spezies finden lassen, auch in Cyanobakterien, in eukaryontischen Zellen wie etwa Pilzen, oder gramnegativen Spezies wie E. coli oder Klebsiella. Noch höher ist diese Wahrscheinlichkeit für grampositive Bakterien, insbesondere der Gattung Bacillus, weil es sich bei B. licheniformis DSM 13, von dem die im Sequenzprotokoll aufgeführten Sequenzen stammen, um ein solches grampositives Bakterium handelt. Zudem ist davon auszugehen, daß in zunehmend verwandten Organismen die homologen Gene auch zunehmend denselben oder gleichwirkenden Regulationsmechanismen unterworfen sind; somit sollten diese Homologen auch dieselbe Stoffwechselsituation, insbesondere einen Phosphatmangel anzeigen. Insofern ist B. licheniformis ein glücklich gewählter Beispielorganismus, weil die kommerziell ebenfalls besonders wichtigen Spezies S. subtilis, B. amyloliquefaciens, B. lentus, B. globigii ebenfalls Bacilli und damit grampositiv sind. Damit wird dem diesbezüglichen Aspekt der gestellten Aufgabe entsprochen.
Es sei angemerkt, daß zum Nacharbeiten der Erfindung für eine bestimmte Spezies nicht alle genannten 47 Gene bekannt sein müssen, sondern lediglich einige davon (siehe unten) ausreichen, um den Phosphatstoffwechsel abzubilden und insbesondere den Übergang in einen Phosphatmangelzustand detektieren zu können. Gleichwohl steigt mit zunehmender Zahl von Sonden die Verläßlichkeit der Aussage über den Phosphat- Versorgungsszustand. Sind mehrere prinzipiell aufgrund der vorliegenden Offenbarung geeignet erscheinende Gene bekannt, empfiehlt es sich, vor Herstellung eines entsprechenden Chips eine Expressionsstudie durchzuführen, um ähnlich der Darstellung in Beispiel 1 oder auch über eine Northern-Analyse zu überprüfen, ob die betreffenden Gene tatsächlich signifikante Aussagen erlauben. Je weniger die betrachtete Spezies mit B. licheniformis verwandt ist, desto eher mögen sich Verschiebungen hinsichtlich des durch Phosphatmangel hervorgerufenen Expressionsniveaus ergeben, so daß sich (gegebenenfalls andere als die unten zusammengestellten) Unterguppen dieser 47 Gene als besonders geeignet und damit als bevorzugt herausstellen.
Bei der Herstellung eines erfindungsgemäßen Nukleinsäure-bindenden Chips für einen hier nicht genannten Organismus müssen also zu zumindest einzelne der für B. licheniformis genannten Gene die zugehörigen homologen Gene identifiziert werden, beispielsweise durch einen Vergleich der für den betreffenden Organismus bekannten DNA-Sequenzen mit den hier angegebenen Sequenzen. Diese oder Teile davon (siehe unten) können sodann an sich als Sonden oder als Vorlage zur Synthese entsprechender Sonden dienen, welche nach an sich bekannten Methoden auf einen Nukleinsäure- bindenden Chip aufgebracht werden.
Sollten einzelne homologe Sequenzen nicht in Datenbanken hinterlegt sein, ist es dem Fachmann möglich, anhand der im Sequenzprotokoll zur vorliegenden Anmeldung offenbarten Sequenzen jeweilige Sonden zu synthetisieren, um mit deren Hilfe eine für den gewünschten Organismus erstellte Genbank (genomisch oder vorzugsweise auf der Basis der cDNA) nach allgemein üblichen Methoden nach dem betreffenden Homolog zu durchsuchen. Alternativ hierzu ist es auch möglich, anhand der im Sequenzprotokoll angegebenen DNA-Sequenzen Oligonukleotide zu synthetisieren, die als PCR-Primer dienen, um die betreffenden Gene oder als Sonden brauchbare Teile davon aus einer gesamtgenomischen DNA-Präparation oder einer cDNA-Präparation des interessierenden Organismus herauszuamplifizieren. Diese oder Teile davon (siehe unten) können als Sonden auf erfindungsgemäßen Nukleinsäure-spezifischen Chips eingesetzt werden.
Ein wesentliches Merkmal der vorliegenden Erfindung besteht darin, daß die Gesamtzahl aller Phosphatstoffwechsel-spezifischen unterschiedlichen Sonden nicht über 100 liegt. Dieses Merkmal korreliert mit der gestellten Aufgabe, wonach sie schwerpunktmäßig auf solche Nukleinsäure-bindenden Chips ausgerichtet sein sollte, deren Anzahl an belegbaren Plätzen aufgrund ihrer Bauart vergleichsweise gering ist. Dies sind insbesondere die elektrisch auswertbaren Chips.
Zunehmend bevorzugt ist es deshalb, wenn die Gesamtzahl aller Phosphatstoffwechsel- spezifischen unterschiedlichen Sonden nicht über 100, 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55 oder 50 liegt.
Darin können auch Sonden für andere, in der vorliegenden Anmeldung nicht diskutierte Gene enthalten sein, die der Kontrolle dienen, beispielsweise solche, die nur bei ausreichender Phosphatversorgung exprimiert werden. Das Verschwinden eines hierauf zurückzuführenden Signals kann ebenfalls den Übergang in den Phosphatmangelzustand anzeigen. Sollte solch ein Signal erhalten bleiben, dient das der Kontrolle, wie zuverlässig das erfindungsgemäß zu ermittelnde Signal des Phosphatmangels ist. Unter den weiteren Phosphatstoffwechsel-spezifischen Sonden können beispielsweise solche sein, die durch einen Phosphatüberschuß induziert werden, eventuell auch weitere, die mit dem Phosphatstoffwechsel scheinbar in keinem direkten Zusammenhang stehen, aufgrund dieser Induzierbarkeit aber als solche definiert werden können. Damit ergibt solch ein Chip auch eine auswertbare und im betrachteten Prozeß brauchbare Information, wenn der Phosphatmangel, beispielsweise durch Ergreifen entsprechender Gegenmaßnahmen überwunden worden ist.
Ferner handelt es sich bei Nukleinsäure-spezifischen Sonden in der Regel jeweils nur um Fragmente der kompletten Gene (siehe unten). In Einzelfällen, beispielsweise bei einer Regulation über Spleißen oder großen, mehrfachfunktionellen Polypeptiden kann es deshalb sinnvoll sein, ein und dasselbe Gen mit zwei oder mehr verschiedenen Sonden zu detektieren. Somit sind entsprechende Ausführungsformen gegebenenfalls durch mehr als 47 Sonden gekennzeichnet, die jedoch auf nicht mehr als diese 47 Gene ansprechen.
Je nach zu beobachtendem Prozeß können auf erfindungsgemäßen Chips auch Sonden für weitere Gene beziehungsweise Genprodukte enthalten sein (siehe unten).
Zum anderen besteht der Kern der Erfindung gerade in der Spezifität des betreffenden Chips, mit dem eine spezielle Stoffwechselsituation erfaßt werden sollte. Die Herstellung eines Chips mit mehr als 100 auf verschiedene Gene ansprechenden Sonden oder sogar eines Chips, der einen Großteil des Genoms eines Organismus abbildet, ist bei einer solch spezifischen Fragestellung wegen des damit verbundenen Aufwands nicht Teil der hier beschriebenen Erfindung. Vielmehr können beide Arten von Chips in einem beobachteten Bioprozeß sinnvoll nebeneinander eingesetzt werden: So können die Chips mit zahlreichen verschiedenen Gensonden oder mit einem repräsentativen Querschnitt verschiedener möglicherweise relevanter Situationen, wie sie mit der Anmeldung WO 2004/027092 A2 zur Verfügung gestellt werden, einen groben Überblick über den Zustand des betreffenden Organismus liefern, während ein erfindungsgemäßer Chip zur Kontrolle hinzugezogen wird, wenn Anlaß zur Sorge besteht, die betreffenden Zellen könnten in einen Phosphatmangelzustand eintreten.
In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich um einen erfindungsgemäßen Nukleinsäure-bindenden Chip, der zunehmend bevorzugt mit den oben angegebenen Sonden in der dort angegebenen Reihenfolge dotiert ist. Hiermit sind die in Tabelle 3 aufgeführten Gene in umgekehrter Reihenfolge gemeint. Demnach sind Chips mit Sonden zum Gen yhcR (Ähnliches zur 5'-Nucleotidase; SEQ ID NO. 13, 14) unter den erfindungsgemäßen Chips hinsichtlich der Genauswahl zur Bildung von Sonden noch am wenigsten bevorzugt, weil dieses unter den 47 genannten, durch Phosphatmangel signifikant verstärkt transkribierten Genen am schwächsten induziert worden ist. Demgegenüber sind solche mit einer Sonde für das Gen yvmC (Ähnliches zu Proteinen unbekannter Funktion; SEQ ID NO. 75, 76) hinsichtlich der Genauswahl am stärksten bevorzugt. Denn dieses zeigte gegenüber dem Ausgangsniveau eine nahezu 150fache Induktion und damit die stärkste von allen gemessenen Genen. Das hiermit verbundene Signal sollte also von allen untersuchten Genen am besten dazu geeignet sein, die Stoffwechselsituation „Phosphatmangel" anzuzeigen.
In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich um einen erfindungsgemäßen Nukleinsäure-bindenden Chip, wobei mindestens drei der Sonden aus den folgenden 39 Genen ausgewählt sind: Gen für ein hypothetisches Protein (Homolog zu SEQ ID NO. 65), yhbD, cotE, Gen für ein konserviertes hypothetisches Potein (Homolog zu SEQ ID NO. 59), yurl, spoVID, Gen für eine vermutliche Aromaten-spezifische Dioxygenase (Homolog zu SEQ ID NO. 55), yhbE, Gen für ein vermutliches Benzoat-Transportprotein (Homolog zu SEQ ID NO. 49), pstBB, spolllAH, Gen für ein hypothetisches Protein (Homolog zu SEQ ID NO. 63), spollQ, spolllAG, yvmA, Gen für eine vermutliche Ribonuclease (Homolog zu SEQ ID NO. 93), dhaS, yrbE, Gen für eine vermutliche Decarboxylase/Dehydratase (Homolog zu SEQ ID NO. 57), MpG, yfkH, spollAB, spolllAF, alsD, gdh, yfkN, pstC, yfmQ, pstBA, Homolog zu dhaS (Homolog zur Aldehyd-De- hydrogenase DhaS; Homolog zu SEQ ID NO. 17), Gen für eine vermutliche Phosphatase (Homolog zu SEQ ID NO. 61), phy, cypX, alsS, phoD, pstS, phoB, yvnA, yvmC.
Denn diese Gene zeigten bei den in den Beispielen anhand von B. licheniformis DSM 13 durchgeführten, in den Beispielen 1 bis 3 dargestellten Untersuchungen Geninduktionen, die mindestens um den Faktor 13 erhöht waren. Entsprechend bevorzugte Ausführungsformen sind also durch die ersten 39 der in Tabelle 3 aufgeführten Gene gekennzeichnet.
Weiterhin bevorzugt sind solche erfindungsgemäßen Nukleinsäure-bindenden Chips, wobei mindestens drei der Sonden aus den folgenden 14 Genen ausgewählt sind: yfkN, pstC, yfmQ, pstBA, Homolog zu dhaS (Homolog zur Aldehyd-Dehydrogenase DhaS; Homolog zu SEQ ID NO. 17), Gen für eine vermutliche Phosphatase (Homolog zu SEQ ID NO. 61), phy, cypX, alsS, phoD, pstS, phoB, yvnA, yvmC.
Denn diese Gene zeigten bei den in den Beispielen anhand von B. licheniformis DSM 13 durchgeführten, in den Beispielen 1 bis 3 dargestellten Untersuchungen Geninduktionen, die mindestens um den Faktor 25 erhöht waren.
Weiterhin bevorzugt sind solche erfindungsgemäßen Nukleinsäure-bindenden Chips, wobei mindestens drei der Sonden aus den folgenden 8 Genen ausgewählt sind: phy, cypX, alsS, phoD, pstS, phoB, yvnA, yvmC.
Denn diese Gene zeigten bei den in den Beispielen anhand von B. licheniformis DSM 13 durchgeführten, in den Beispielen 1 bis 3 dargestellten Untersuchungen Geninduktionen, die mindestens um den Faktor 40 erhöht waren.
Weiterhin bevorzugt sind solche erfindungsgemäßen Nukleinsäure-bindenden Chips, wobei mindestens eine, zunehmend bevorzugt zwei oder drei der Sonden aus den folgenden 3 Genen ausgewählt ist/sind: phoB, yvnA, yvmC.
Denn diese zeigten bei den in den Beispielen anhand von ß. licheniformis DSM 13 durchgeführten, in den Beispielen 1 bis 3 dargestellten Untersuchungen Geninduktionen, die mindestens um den Faktor 100, in den Fällen von yvnA und yvmC um mehr als 115 und im zuletztgenannten Fall sogar um deutlich mehr als den Faktor 140 erhöht waren.
In bevorzugten Ausführungsformen sind erfindungsgemäße Nukleinsäure-bindende Chips mit mindestens 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 22, 24, 26 28, 30, 35, 40, 45 oder 47 der in der für die vorliegende Erfindung genannten Sonden dotiert.
Denn je mehr dieser Sonden auf ein entsprechendes Signal ansprechen, desto zuverlässiger ist die hiermit verbundene Aussage über die augenblickliche Phosphatversorgung beziehungsweise -Unterversorgung. So ist es auch sinnvoll, die besonders aussagekräftigen und somit bevorzugte Ausführungsformen kennzeichnenden Sonden mit scheinbar weniger aussagekräftigen zu kombinieren, um falsch-positive Signale ausschließen zu können. Ferner ist es vorteilhaft, entsprechend den Angaben in Tabelle 2 solche Sonden miteinander zu kombinieren, die zu unterschiedlichen der dort angegebenen Zeitpunkte unterschiedlich starke Signale ergeben. So kann man zu einer Abschätzung darüber gelangen, wie lange vor Probennahme der Eintritt des Phosphatmangels zurückliegt und ob er - unter Protokollierung der Kultivierungsbedingugen - möglicherweise auf einen bestimmten Umwelteinfluß zurückzuführen ist.
Hinsichtlich ihrer konkreten Sequenzen verschiedene Sonden, die aber auf dieselbe mRNA ansprechen, beispielsweise Fragmente, die mit unterschiedlichen Bereichen derselben mRNA hybridisieren (s.u.), können zur Erhöhung der Auslesesicherheit mehrmals vertreten sein, werden im Sinne dieses Erfindungsaspekts aber nur einmal gezählt, weil sie im besten Fall gleichstark auf dasselbe Signal ansprechen und prinzipiell gegeneinander austauschbar wären.
In bevorzugten Ausführungsformen erfindungsgemäßer Nukleinsäure-bindender Chips liegt die Gesamtzahl aller unterschiedlichen Sonden zunehmend bevorzugt nicht über 100, 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55 oder 50.
Dies entspricht dem oben ausgeführten Erfindungsgedanken, wonach mit den hier beschriebenen Chips ein spezieller Stoffwechselaspekt monitoriert werden soll, so daß eine größere Zahl von Sonden als zum Erfassen dieser Situation notwendig nicht auf den betreffenden Chips aufgebracht zu werden braucht. Davon bleibt die Situation unberührt, daß es in Einzelfällen sinnvoll sein kann, mehr als eine Sonde zur Detektion derselben mRNA einzusetzen und/oder einzelne Sonden aufzubringen, die mit der Herstellung eines interessierenden Wertstoffs in Verbindung stehen. Insgesamt bewegt sich die vorliegende Erfindung in dem genannten Rahmen, um Chips mit technisch bedingt nur wenigen Bindungsstellen in den Schutzbereich einschließen zu können.
In bevorzugten Ausführungsformen erfindungsgemäßer Nukleinsäure-bindender Chips handelt es sich bei den als erfindungsrelevant genannten Sonden um solche, die auf die betreffenden, beziehungsweise höchsthomologen, in vivo transkribierbaren Gene aus dem für den Bioprozeß gewählten Organismus ansprechen, vorzugsweise solche, die von den betreffenden, beziehungsweise höchsthomologen, in vivo transkribierbaren Genen eben dieses Organismus abgeleitet sind. Hierzu ist bereits oben ausgeführt worden, daß die in der vorliegenden Anmeldung offenbarten Sequenzen aus B. licheniformis erhalten worden sind und sich aufgrund der allgemein bekannten Verwandtschaftsverhältnisse insbesondere zum Überwachen von verwandten Spezies, insbesondere solchen der Gattung Bacillus eignen sollten. Dies gilt sowohl für die identifizierten Gene, denen aufgrund von Datenbankvergleichen konkrete Funktionen zugewiesen werden konnten und die in anderen Spezies prinzipiell für dieselbe Funktion codieren sollten, als auch für diejenigen, die nur über ihre Sequenzen definiert worden sind. Hierzu werden erfindungsgemäß die im betrachteten Organismus nächstverwandten Gene zur Ableitung entsprechender Sonden verwendet. Dabei ist jedoch darauf zu achten, daß keine Sonden zu Pseudogenen erzeugt werden, sondern zu solchen, die tatsächlich unter /n-wVo-Bedingungen in mRNA umgeschrieben werden, das heißt die zu einem im Cytoplasma meßbaren Nukleinsäure-Signal führen.
Statistisch gesehen sollte solch ein Chip jedoch umso erfolgreicher einsetzbar sein, je besser die gewählten Sonden mit den zu messenden Nukleinsäuren interagieren. Somit steigt vor allem bei abnehmendem Verwandtschaftsgrad zu B. licheniformis die Notwendigkeit, sich bei dieser Hybridisierung nicht auf die angegebenen Sequenzen zu verlassen sondern - sofern Sequenzunterschiede bestehen - die für die homologen Gene aus den betreffenden Spezies einzusetzen. Wie erläutert können diese über an sich bekannte Verfahren, insbesondere Genbank-Screening oder PCR mit Primern, die an den hier offenbarten Sequenzen orientiert sind (gegebenenfalls in Form sogenannter Mismatch-Primer mit gewissen, statistischen Sequenzvariationen), erhalten werden.
In bevorzugten Ausführungsformen erfindungsgemäßer Nukleinsäure-bindender Chips handelt es sich bei dem für den Bioprozeß ausgewählten Organismus um einen Vertreter einzelliger Eukaryonten, grampositiver oder gramnegativer Bakterien.
Denn in diese Gruppen fallen die kommerziell am stärksten eingesetzen Organismen, insbesondere wenn es sich bei dem zu beobachtenden Bioprozeß um eine Fermentation handelt. Hierzu zählen beispielsweise Gärprozesse, etwa zur Herstellung von Wein oder Bier, oder die biotechnologische Herstellung von Wertstoffen wie Proteinen oder niedermolekularen Verbindungen.
Abhängig von der Art des gewünschten Produkts werden für ein biotechnologisches Verfahren verschiedene Organismen gewählt. Hierunter sind im Sinne der Erfindung nicht allein die Produktionsstämme zu verstehen sondern auch alle dem Produktionsprozeß vorgeschalteten Organismen, beispielsweise zur Klonierung entsprechender Gene oder zur Auswahl geeigneter Expressionsvektoren. Der Bedarf, die Phosphatlimitation zu erfassen, besteht dabei prinzipell während jedes Teilprozesses.
In bevorzugten Ausführungsformen erfindungsgemäßer Nukleinsäure-bindender Chips handelt es sich bei den einzelligen Eukaryonten um Protozoen oder um Pilze, hierunter insbesondere Hefe, ganz besonders Saccharomyces oder Schizosaccharomyces.
Denn diese werden neben der Herstellung alkoholischer Getränke und weiterer durch Gärung erhaltener Lebensmittel intensiv als Wirtszellen insbesondere für die Genprodukte von Eukaryonten eingesetzt. Letzteres ist dann besonders vorteilhaft, wenn diese Genprodukte spezielle, nur durch diese Stämme durchführbare Modifikationen erfahren sollen, wie beispielsweise Glykosylierungen von Proteinen.
Unter diesen Gegenstand fallen auch erfindungsgemäße Chips, die auf die Überwachung des Verlaufs, insbesondere des Wachstums von Zellkulturen höherer Eukaryonten, etwa von Nagetieren oder von Menschen ausgerichtet sind. Sie können in gewisser Hinsicht ebenfalls als, zumindest weitgehend einzellige Eukaryonten verstanden werden, die insbesondere in der Immunologie eine erhebliche kommerzielle Bedeutung besitzen, beispielsweise für die Herstellung monoklonaler Antikörper.
In bevorzugten Ausführungsformen erfindungsgemäßer Nukleinsäure-bindender Chips handelt es sich bei den grampositiven Bakterien um Coryneforme Bakterien oder solche der Gattungen Staphylococcus, Corynebakterien oder Bacillus, insbesondere der Spezies Staphylococcus carnosus, Corynebacterium glutamicum, Bacillus subtilis, B. licheniformis, B. amyloliquefaciens, B. agaradherens, B. stearothermophilus, B. globigii oder B. lentus, und ganz besonders um B. licheniformis.
Denn dies sind technisch besonders wichtige Produktionsstämme. Sie werden insbesondere zur Produktion niedermolekularer chemischer Verbindungen, etwa von Vitaminen oder von Antibiotika oder zur Produktion von Proteinen, insbesondere Enzymen eingesetzt. Hierbei sind besonders Amylasen, Cellulasen, Lipasen, Oxidoreduktasen und Proteasen besonders hervorzuheben. Die besondere Ausrichtung auf B. licheniformis erklärt sich daraus, daß die im Sequenzprotokoll angegebenen Sequenzen aus dieser Spezies erhalten worden sind und wie in den Beispielen 2 und 3 beschrieben nachweislich mit dem Übergang in einen Phosphatmangel in Verbindung gebracht werden konnten.
In nicht minder bevorzugten Ausführungsformen erfindungsgemäßer Nukleinsäure- bindender Chips handelt es sich bei den gramnegativen Bakterien um solche der Gattungen E. coli oder Klebsiella, insbesondere um Derivate von Escherichia coli K12, von Escherichia coli B oder Klebsiella planticola, und ganz besonders um Derivate der Stämme Escherichia coli BL21 (DE3), E. coli RV308, E coli DH5α, E. coli JM109, E. coli XL-1 oder Klebsiella planticola (Rf).
Denn diese dienen sowohl im Labormaßstab beispielsweise der Klonierung und Expressionsanalyse als auch im großtechnischen Maßstab der Herstellung biologischer Wertstoffe.
In bevorzugten Ausführungsformen erfindungsgemäßer Nukleinsäure-bindender Chips ist/sind mindestens eine, zunehmend bevorzugt mehrere der im Zusammenhang mit der hier beschriebenen Erfindung genannten Sonden von den Sequenzen abgeleitet, die im Sequenzprotokoll unter den Nummern SEQ ID NO. 1 , 3, 5, 7, 9, 11 , 13, 15, 17, 19, 21 , 23, 25, 27, 29, 31 , 33, 35, 37, 39, 41 , 43, 45, 47, 49, 51 , 53, 55, 57, 59, 61 , 63, 65, 67, 69, 71 , 73, 75, 77, 79, 81 , 83, 85, 87, 89, 91 und 93 aufgeführt sind.
Denn diese Gene konnten bei B. licheniformis, wie in den Beispielen 2 und 3 beschrieben, nachweislich mit dem Übergang in einen Phosphatmangel in Verbindung gebracht werden. Insbesondere wenn B. licheniformis oder andere, vor allem verwandte Bacillus- Spezies überwacht werden sollen, sollte deshalb auf diese Sequenzen zurückgegriffen werden.
In bevorzugten Ausführungsformen erfindungsgemäßer Nukleinsäure-bindender Chips handelt es sich um solche, die zusätzlich mit mindestens einer Sonde für ein zusätzliches Gen dotiert ist/sind, insbesonderen einem solchen, das in einem Stoffwechsel-bedingten Zusammenhang zu dem oder den prozeßbedingt zusätzlich exprimierten Gen(en) steht, ganz besonders für eines von diesen oder dieses selbst. Wie oben ausgeführt dienen die beobachteten Prozesse einem technischen Interesse, das oft mit weiteren spezifischen Genen verbunden ist. Hierbei handelt es sich beispielsweise in dem Fall, daß ein Protein hergestellt werden soll, um das Gen für dieses Protein und in dem Fall, daß eine niedermolekulare Verbindung hergestellt werden soll, um ein oder mehrere Genprodukte, die auf dem Syntheseweg der betreffenden Verbindung liegen oder diesen regulieren. Es können auch andere zelleigene Gene betroffen sein, etwa Stoffwechselgene, die im Zuge der Produktherstellung verstärkt gebildet werden müssen, beispielsweise eine zelleigene Oxidoreduktase, wenn das Produkt aus einem Edukt oder einem Zwischenprodukt über Oxidation oder Reduktion erhalten werden soll.
Zudem werden für bestimmte biologische Prozesse, insbesondere die Bildung gewerblich relevanter Verbindungen durch Mikroorganismen in der Regel nicht die Wildtyp-Stämme eingesetzt, sondern solche, die auf den betreffenden Prozeß ausgerichtet sind. Hierzu gehört neben der Transformation mit den für die eigentliche Produktherstellung verantwortlichen Genen das Versehen mit Selektionsmarkem oder weitere Anpassungen des Stoffwechsels, bis hin zu Auxotrophien. Derartige Stämme besitzen ein besonderes Anforderungsprofil an die Wachstumsbedingungen und besitzen zum Teil Stoffwechselgene, die gegenüber den Wildtypgenen mutiert sind. Da erfindungsgemäße Chips vorteilhafterweise auf eben diese Stämme, ganz besonders den betrachteten Bioprozeß ausgerichtet sein sollen, sollten diese Stamm-spezifischen Eigenheiten berücksichtigt werden und können sich in der Wahl der betreffenden Sonden widerspiegeln.
In bevorzugten Ausführungsformen derartiger erfindungsgemäßer Nukleinsäure- bindender Chips handelt es sich bei dem prozeßbedingt zusätzlich exprimierten Gen um das für ein gewerblich einsetzbares Protein, insbesondere um eine Amylase, Cellulase, Lipase, Oxidoreduktase, eine Hemicellulase oder Protease, oder um eines, das auf einem Syntheseweg für eine niedermolekulare chemische Verbindung liegt oder diesen wenigstens zum Teil reguliert.
Diese sind dann besonders auf diejenigen Bioprozesse, vor allem Fermentationen ausgerichtet, in denen die genannten Proteine hergestellt werden. Bei diesen handelt es sich um kommerziell besonders wichtige Enzyme, die beispielsweise in der Lebensmittelindustrie oder der Waschmittelindustrie Verwendung finden. Im zuletztgenannten Fall insbesondere zur Entfernung von Anschmutzungen, die von Amylasen, Cellulasen, Lipasen, Hemicellulasen und/oder Proteasen hydrolysierbar sind, zur Behandlung der betreffenden Materialien, insbesondere durch Cellulasen beziehungsweise zur Bereitstellung eines auf einer Oxidoreduktase beruhenden enzymatischen Bleichsystems.
Die zuletzt genannte Variante fällt in den Bereich der Biotransformation, wonach bestimmte, gegebenenfalls zusätzlich eingeführte Stoffwechselaktivitäten von Mikroorganismen zur Synthese chemischer Verbindungen ausgenutzt werden.
In bevorzugten Ausführungsformen erfindungsgemäßer Nukleinsäure-bindender Chips wird/werden eine, bevorzugt mehrere der im Zusammenhang mit der hier beschriebenen Erfindung genannten Sonden einzelsträngig, in Form des codogenen Strangs bereitgestellt.
Diese Ausführungsform verfolgt das Ziel, die Hybridisierung zwischen der Sonde und der zu detektierenden Probe zu verbessern. Dies gilt insbesondere für den Fall, daß aus der Probe tatsächlich der Gehalt an der relevanten mRNA bestimmt wird. Da diese einzelsträngig ist und in ihrer Sequenz mit dem codierenden Strang der DNA übereinstimmt, sollte eine optimale Hybridisierung mit dem komplementären, das heißt dem codogenen Strang erfolgen.
In bevorzugten Ausführungsformen erfindungsgemäßer Nukleinsäure-bindender Chips wird/werden eine, bevorzugt mehrere der im Zusammenhang mit der hier beschriebenen Erfindung genannten Sonden einzelsträngig, in Form des codogenen Strangs bereitgestellt.
Diese Ausführungsform verfolgt das Ziel, die Hybridisierung zwischen der Sonde und der zu detektierenden Probe zu verbessern. Dies gilt insbesondere für den Fall, daß aus der Probe tatsächlich der Gehalt an der relevanten mRNA bestimmt wird. Da diese einzelsträngig ist und in ihrer Sequenz mit dem codierenden Strang der DNA übereinstimmt, sollte eine optimale Hybridisierung mit dem komplementären, das heißt dem codogenen Strang erfolgen.
In bevorzugten Ausführungsformen erfindungsgemäßer Nukleinsäure-bindender Chips wird/werden eine, bevorzugt mehrere der als erfindungsrelevant genannten Sonden in Form einer DNA oder eines Nukleinsäureanalogs, vorzugsweise eines Nukleinsäureanalogs zur Verfügung gestellt. Diese Ausführungsform verfolgt das Ziel, die Haltbarkeit und mehrmalige Verwendbarkeit der erfindungsgemäßen Chips zu verbessern. Dieses Bedürfnis ergibt sich insbesondere während eines einzelnen beobachteten Prozesses, in dessen Verlauf eine ständige Überwachung erstrebenswert ist. Die Haltbarkeit erfindungsgemäßer Chips, insbesondere gegenüber Nukleinsäure-hydrolysierenden Enzymen wird bereits durch die Bereitstellung der Sonden in Form einer DNA erhöht, da diese an sich weniger hydrolyseempfindlich als etwa eine RNA ist. Noch haltbarer sind Nukleinsäureanaloga, in denen beispielsweise das Phosphat des Zucker-Phosphatsrückgrats gegen einen chemisch anderen Baustein ersetzt ist, welcher beispielsweise durch natürliche Nukleasen nicht hydrolysierbar ist. Derartige Verbindungen sind prinzipiell im Stand der Technik bekannt und werden für gewünschte, jeweils anzugebende Sequenzen von hierauf spezialisierten Firmen auf Wunsch kommerziell synthetisiert. Die betreffenden Sonden sind etwa nach dem Vorbild der im Sequenzprotokoll angegebenen Seqzenzen zu synthetisieren.
In bevorzugten Ausführungsformen erfindungsgemäßer Nukleinsäure-bindender Chips umfaßt/umfassen eine, bevorzugt mehrere der als erfindungsrelevant genannten Sonden Genbereiche, die von dem zu untersuchenden Organismus in mRNA umgeschrieben werden, insbesondere die Genbereiche, die nahe dem 5'-Ende der mRNA liegen.
Hiermit wird dem Aspekt Rechnung getragen, daß vielfach auch die regulatorischen DNA- Abschnitte einem speziellen Gen zugeordnet werden. In der Tat soll der erfindungsgemäße Chip jedoch dem Nachweis der in den beobachteten Zellen tatsächlich vorhandenen mRNA eingesetzt werden, so daß für den hier betrachteten Zweck erst der Genabschnitt von Bedeutung ist, der tatsächlich in mRNA übersetzt wird. Zum anderen ist zu berücksichtigen, daß insbesondere bei Eukaryonten Introns auftreten, das heißt der codierende Bereich von Abschnitten unterbrochen ist, die nicht in mRNA übersetzt werden. Sonden, die Introns enthalten, dürften deshalb nicht oder nur schlecht auf die betreffenden mRNA ansprechen. Zur Realisierung dieses Aspekts ist es ratsam, nicht auf genomische DNA-Sequenzen sondern auf cDNA-Seqenzen zurückzugreifen, das heißt auf solche, die anhand der tatsächlichen mRNA erhalten worden sind.
Des weiteren ist zum Nachweis einer mRNA oft keine Hybridisierung über die ganze Seqzuenzlänge erforderlich. Die spezifischen Sonden brauchen deshalb in der Regel nur einen kleineren des in mRNA umgeschriebenen Gens zu umfassen. Vorteilhaft ist hierfür eine Auswahl eines Bereichs, der nahe dem 5'-Ende der mRNA liegt, da dieser zuerst in mRNA transkribiert wird und somit nach Aktivitierung des Gens als erstes nachweisbar ist. Dies kommt einem zeitnahen Nachweis entgegen.
In bevorzugten Ausführungsformen erfindungsgemäßer Nukleinsäure-bindender Chips spricht/sprechen eine, bevorzugt mehrere der als erfindungsrelevant genannten Sonden auf Fragmente der betreffenden Nukleinsäuren an, insbesondere auf solche, die in der betreffenden mRNA, bezogen auf die jeweilige Gesamt-mRNA ein geringes Maß an Sekundärfaltung aufweisen.
Dies ist ein weiterer Aspekt, um die Hybridisierung zwischen den Sonden und den zu detektierenden mRNA zu optimieren. Denn mRNA-Moleküle liegen oft in einer Sekundärstruktur vor, die auf Hybridisierung einzelner mRNA-Bereiche mit eigenen, anderen Bereichen beruht. So kommt es beispielsweise zu Loop- oder Stem-Ioop- Strukturen. Solche Bereiche hybridisieren in der Regel jedoch weniger leicht mit anderen Nukleinsäuremolekülen, auch wenn diese homolog sind. Derartige Bereiche können recht genau von hierauf ausgerichteten Computerprogrammen (siehe unten) errechnet werden. Zur Realisierung dieses Aspekts sollte man also das Gen, dessen Aktivität man für einem interessierenden Organismus bestimmen möchte, von solch einem Programm analysieren lassen und zur Gewinnung einer geeigneten - in der Regel nur einen Teilbereich umfassenden (siehe unten) - Sonde auf Abschnitte zurückgreifen, für die ein nur geringes Maß an mRNA-Sekundärstrukturen vorhergesagt wird.
In bevorzugten Ausführungsformen erfindungsgemäßer Nukleinsäure-bindender Chips weist/weisen eine, bevorzugt mehrere der als erfindungsrelevant genannten Sonden eine Länge von zunehmend bevorzugt weniger als 200, 150, 125 oder 100 Nukleotiden, vorzugsweise von 20 bis 60 Nukleotiden, besonders bevorzugt von 45 bis 55 Nukleotiden auf.
Denn die für die Nachweisreaktion eingesetzten Sonden brauchen nur Teile der zu detektierenden mRNA zu umfassen, sofern das über sie erhältliche Signal noch spezifisch genug ist. Diese Spezifität, die Unterscheidbarkeit verschiedener mRNA setzt die untere Grenze für die Länge der betreffenden Sonden und muß gegebenenfalls in Vorversuchen experimentell ermittelt werden. Die Identifizierung von geeigneten Sondenlängen und -Bereichen ist dem Fachmann an sich bekannt und wird normalerweise unter Zuhilfenahme spezialisierter Software durchgeführt. Beispiele für solche Software sind die Programme Array Designer der Fa. Premier Biosoft International, USA, und Vector NTI® Suite, V. 7, erhältlich von der Firma InforMax, Inc., Bethesda, USA. Neben den schon erwähnten Sekundärstrukturen berücksichtigen diese Softwareprogramme beispielsweise auch vorgegebene Sondenlängen sowie Schmelztemperaturen.
In bevorzugten Ausführungsformen erfindungsgemäßer Nukleinsäure-bindender Chips wird durch die Bindung der mRNA an die betreffende als erfindungsrelevant genannte Sonde ein elektrisches Signal ausgelöst.
In dem bereits erwähnten Artikel J. Wang (Acc. Chem. Res.; ISSN 0001-4842; Rec. Sept. 12, 2001 , S. A-F) werden die Vorteile eines elektrisch auswertbaren Systems gegenüber einem optischen System diskutiert. Ferner wird auf verschiedene im Stand der Technik entwickelte Ausführungsformen solcher Sensoren verwiesen.
So beträgt zum gegenwärtigen Zeitpunkt die Zeitspanne von der Probennahme bis zum Messen des Signals für optisch auswertbare Chips ungefähr 24 h. Mithilfe eines elektrischen Systems liegt der Zeitbedarf momentan bei weniger als 2 h (vergleiche Figur 1). Demgegenüber liegt die Zahl der gleichzeitig analysierbaren Proben bei elektrisch auswertbaren Chips derzeit im zweistelligen Bereich, wobei jedoch eine rasche Entwicklung dafür spricht, daß diese Größenordnung in Kürze überschritten werden kann. Limitierend hierfür sind die elektronischen Auswerte-Einheiten für die verschiedenen Signale.
Eine im Stand der Technik etablierte Methode zur mRNA-Quantifizierung stellt beispielsweise die RT-PCT dar. Diese wird in dem Artikel „Quantification of Bacterial mRNA by One-Step RT-PCR Using the LightCycler System" (2003) von S.Tobisch, T.Koburger, B.Jürgen, S.Leja, M. Hecker und T.Schweder in BIOCHEMICA, Band 3, Seiten 5 bis 8 beschrieben. Demgegenüber besitzt die Detektion über Elektro-Chips einen weiteren Vorteil, nämlich die höhere Zuverlässigkeit der Daten, da diese gegenüber der RT-PCR deutlich geringere Schwankungsbreiten aufweisen.
Die Herstellung entsprechender elektronisch auswertbarer Chips wird beispielsweise in den Patentanmeldungen WO 00/62048 A2, WO 00/67026 A1 und WO 02/41992 beschrieben, deren Offenbarungsgehalt vollständig in die vorliegende Anmeldung einbezogen wird.
Die Funktionsweise elektrisch auslesbarer Chips einer besonders bevorzugten Ausführungsform kann wie folgt beschrieben werden: Die genspezifischen Sonden sind auf an sich bekannte Weise kovalent an magnetische Beads gebunden, die sich in hierfür vorgesehenen Kammern der Chips befinden. Die spezifische Hybridisierung der entsprechenden mRNA an die jeweiligen Beads erfolgt in dieser Hybridisierungskammer, die temperierbar ist und von den betreffenden Lösungen durchspült werden kann. Die Beads werden in dieser Kammer durch einen Magneten festgehalten. Nach der Hybridisierung der RNA-Proben an die Beads-gebundenen DNA-Sonden erfolgt ein Waschschritt zur Beseitigung der nicht-gebundenen RNA, so daß in der Inkubationskammer nur noch spezifische Hybride vorhanden sind, und zwar gebunden an den magetischen Beads.
Nach dem Waschen wird eine Detektionssonde in die Inkubationskammer eingeleitet, die über eine Biotin-Extravidin-gebundene alkalische Phosphatase markiert ist. Diese Sonde bindet an eine zweite freie Region der hybridisierten mRNA. Dieses Hybrid wird anschließend erneut gewaschen und mit dem Substrat der alkalischen Phosphatase Para-Aminophenolphosphat (pAPP) inkubiert. Die enzymatische Reaktion in der Inkubationskammer führt zur Freisetzung des redoxaktiven Produkts para-Aminophenol (pAP). Dieses wird nun über den Red/Ox-Elektrode auf dem elektrischen Chip geleitet und das Signal zu einem Potentiostaten gesendet.
Eine System-spezifische Software (zum Beispiel MCDDE32) liest die erhaltenen Daten und die Ergebnisse können mit Hilfe eines weiteren Programms (zum Beispiel Origin) auf einem Computer ausgewertet und dargestellt werden.
Selbstverständlich ist dieser Prozeß sowohl hinsichtlich der technischen Gestaltung der Chips als auch der Auswertung variierbar. So kann beispielsweise die Nachweisreaktion auch durch eine andere, wegen des elektrischen Meßprinzips vorzugsweise jedoch eine Redoxreaktion erfolgen.
Eine Leistung der vorliegenden Erfindung besteht darin, Phosphatstoffwechsel- spezifische und insofern prozeßkritische Gene identifiziert und der Analyse über entsprechend gestaltete Biochips zugänglich gemacht zu haben. Der Vorteil von Chips gegenüber konventionellen Nachweismethoden besteht neben dem Zeitgewinn und der höheren Genauigkeit darin, daß mit der Bereitstellung mehrerer Sonden auf einem Träger gleichzeitig in derselben Probe die Aktivitäten von mehreren verschiedenen Genen nachgewiesen werden können und bei der hier beschriebenen Anwendung auf ein spezielles Problem ein solideres und detaillierteres Bild ergeben können, beispielsweise hisichtlich des Zeitpunkts, zu dem ein Phosphatmangel eingetreten ist.
Ein eigener Erfindungsgegenstand ist somit die gleichzeitige Verwendung von Nukleinsäure- oder Nukleinsäure-Analogon-Sonden für mindestens drei der folgenden 47 Gene: yhcR, tatCD, ctaC, Gen für eine vermutliche Acetoin-Reductase (Homolog zu SEQ ID NO. 53), spollGA, nasE, pstA, spollAA, Gen für ein hypothetisches Protein (Homolog zu SEQ ID NO. 65), yhbD, cotE, Gen für ein konserviertes hypothetisches Potein (Homolog zu SEQ ID NO. 59), yurl, spoVID, Gen für eine vermutliche Aromaten- spezifische Dioxygenase (Homolog zu SEQ ID NO. 55), yhbE, Gen für ein vermutliches Benzoat-Transportprotein (Homolog zu SEQ ID NO. 49), pstBB, spolllAH, Gen für ein hypothetisches Protein (Homolog zu SEQ ID NO. 63), spollQ, spolllAG, yvmA, Gen für eine vermutliche Ribonuclease (Homolog zu SEQ ID NO. 93), dhaS, yrbE, Gen für eine vermutliche Decarboxylase/Dehydratase (Homolog zu SEQ ID NO. 57), MpG, yfkH, spollAB, spolllAF, alsD, gdh, yfkN, pstC, yfmQ, pstBA, Homolog zu dhaS (Homolog zur Aldehyd-Dehydrogenase DhaS; Homolog zu SEQ ID NO. 17), Gen für eine vermutliche Phosphatase (Homolog zu SEQ ID NO. 61), phy, cypX, alsS, phoD, pstS, phoB, yvnA, yvmC, gebunden an einen Nukleinsäure-bindenden Chip, vorzugsweise an denselben, zur Bestimmung des physiologischen Zustands eines einen biologischen Prozeß durchlaufenden Organismus.
Wie oben erläutert sind diese 47 Gene so ausgewählt, daß sie ein Bild über die Situation des Phosphatstoffwechels des betrachteten Organismus liefern, weil sie wie in den Beispielen 1 bis 3 beschrieben bei dem Übergang des grampositiven Bakteriums ß. licheniformis in den Phosphatmangelzustand signifikant und vergleichsweise spezifisch induziert werden. Eine vergleichbare Aussage ist auch für andere Organismen zu erwarten, die über die homologen Gene beziehungsweise Proteine mit im wesentlichen denselben stoffwechselrelevanten Eigenschaften verfügen.
Wie ebenfalls bereits ausführlich beschrieben, können derartige Genaktivitäten prinzipiell auf verschiedene Arten bestimmt werden, beispielsweise durch Northern-Hybridisierung. Die Analyse mithilfe eines Nukleinsäure-bindenden Chip, insbesondere eines oben beschriebenen, eröffnet jedoch die Möglichkeit, auf sehr effiziente Weise gleichzeitig mehrere Genaktivitäten zu bestimmen und dies zudem sehr zeitnah. Dadurch können die Stoffwechselveränderungen eines Organismus, der einen biologischen Prozeß durchläuft, zeitnah beobachtet und gegebenenfalls regulatorisch eingegriffen werden.
Die oben gemachten Ausführungen zu Nukleinsäure-bindenden Chips gelten für die hier bezeichneten Verwendungen der betreffenden Sonden entsprechend.
Vorzugsweise handelt es sich dabei dementsprechend um solche Verwendungen, wobei die Gesamtzahl aller Phosphatstoffwechsel-spezifischen unterschiedlichen Sonden nicht über 100 liegt.
Zunehmend bevorzugt ist es, wenn die Gesamtzahl aller Phosphatstoffwechsel- spezifischen unterschiedlichen Sonden nicht über 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55 oder 50 liegt, wobei wiederum Positiv-Kontrollen aus dem sonstigen Phosphatstoffwechsel eingeschlossen sind.
Weiterhin bevorzugt handelt es sich dabei dementsprechend um solche Verwendungen, wobei die zuvor als erfindungsgemäß angegebenen Sonden in der zuvor als bevorzugt angegebenen Reihenfolge (umgekehrt zur Reihenfolge in Tabelle 3) zunehmend bevorzugt eingesetzt werden.
Entsprechend den oben gemachten Ausführungen sind folgende der soeben bezeichneten Verwendungen von Nukleinsäure- oder Nukleinsäure-Analogon-Sonden zunehmend bevorzugt:
- Verwendung, wobei mindestens drei der Nukleinsäure- oder Nukleinsäure-Analogon- Sonden für Gene aus den folgenden 39 Genen spezifisch ist/sind: Gen für ein hypothetisches Protein (Homolog zu SEQ ID NO. 65), yhbD, cotE, Gen für ein konserviertes hypothetisches Potein (Homolog zu SEQ ID NO. 59), yurl, spoVID, Gen für eine vermutliche Aromaten-spezifische Dioxygenase (Homolog zu SEQ ID NO. 55), yhbE, Gen für ein vermutliches Benzoat-Transportprotein (Homolog zu SEQ ID NO. 49), pstBB, spolllAH, Gen für ein hypothetisches Protein (Homolog zu SEQ ID NO. 63), spollQ, spolllAG, yvmA, Gen für eine vermutliche Ribonuclease (Homolog zu SEQ ID NO. 93), dhaS, yrbE, Gen für eine vermutliche Decarboxylase/Dehydratase (Homolog zu SEQ ID NO. 57), MpG, yfkH, spollAB, spolllAF, alsD, gdh, yfkN, pstC, yfmQ, pstBA, Homolog zu dhaS (Homolog zur Aldehyd-Dehydrogenase DhaS; Homolog zu SEQ ID NO. 17), Gen für eine vermutliche Phosphatase (Homolog zu SEQ ID NO. 61), phy, cypX, alsS, phoD, pstS, phoB, yvnA, yvmC;
- hierunter vorzugsweise für mindestens drei der folgenden 14 Gene: yfkN, pstC, yfmQ, pstBA, Homolog zu dhaS (Homolog zur Aldehyd-Dehydrogenase DhaS; Homolog zu SEQ ID NO. 17), Gen für eine vermutliche Phosphatase (Homolog zu SEQ ID NO. 61), phy, cypX, alsS, phoD, pstS, phoB, yvnA, yvmC;
- hierunter besonders bevorzugt für mindestens drei der folgenden 8 Gene: phy, cypX, alsS, phoD, pstS, phoB, yvnA, yvmC; und
- hierunter ganz besonders bevorzugt für mindestens eines der folgenden 3 Gene: phoB, yvnA, yvmC.
Entsprechend dem oben Gesagten handelt es sich vorzugsweise um erfindungsgemäße Verwendungen von gleichzeitig mindestens 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 22, 24, 26 28, 30, 35, 40, 45 oder 47 der genannten Sonden.
Entsprechend dem oben Gesagten handelt es sich vorzugsweise um erfindungsgemäße Verwendungen, wobei die Gesamtzahl aller unterschiedlichen Sonden zunehmend bevorzugt nicht über 100, 95, 90, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 40, 30, 20 oder 10 liegt.
Entsprechend dem oben Gesagten handelt es sich weiterhin bevorzugt um erfindungsgemäße Verwendungen zur Bestimmung einer Änderung im Phosphatstoffwechsel des den biologischen Prozeß durchlaufenden Organismus, vorzugsweise zur Detektion eines Phosphatmangelzustands.
Entsprechend dem oben Gesagten handelt es sich weiterhin bevorzugt um erfindungsgemäße Verwendungen, wobei mindestens eine, zunehmend bevorzugt mehrere der genannten Sonden von den Sequenzen abgeleitet ist/sind, die im Sequenzprotokoll unter den Nummern SEQ ID NO. 1 , 3, 5, 7, 9, 11 , 13, 15, 17, 19, 21 , 23, 25, 27, 29, 31 , 33, 35, 37, 39, 41 , 43, 45, 47, 49, 51 , 53, 55, 57, 59, 61 , 63, 65, 67, 69, 71 , 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91 und 93 aufgeführt sind. Einen eigenen Erfindungsgegenstand bilden Verfahren der Bestimmung des physiologischen Zustands eines einen biologischen Prozeß durchlaufenden Organismus durch Einsatz eines erfindungsgemäßen Nukleinsäure-bindenden Chips.
Diese Verfahren sehen prinzipiell so aus, daß während des Prozesses und ohne ihn zu unterbrechen, Proben des betrachteten Organismus entnommen und daraus die mRNA isoliert werden. Diese oder gegebenenfalls hiervon abgleitete Verbindungen wie beispielsweise cDNA werden über einen oben beschriebenen Nukleinsäure-bindenden Chip geleitet, welcher unter Berücksichtigung der oben angegebenen Verfahrensschritte - wie etwa ausreichende Inkubationszeit oder Abwaschen unspezifisch bindender Nukleinsäuren - behandelt und schließlich dem Detektionsgerät zugeführt wird. Solch ein Verfahrensprotokoll ist anhand des Beispiels elektrisch auswertbarer Chips prinzipiell in Figur 1 dargestellt.
Die oben gemachten Ausführungen zu Nukleinsäure-bindenden Chips gelten für die hier bezeichneten Verfahren der Bestimmung des physiologischen Zustands eines einen biologischen Prozeß durchlaufenden Organismus entsprechend.
Vorzugsweise handelt es sich um erfindungsgemäße Verfahren, wobei eine Änderung im Phosphatstoffwechsel des den biologischen Prozeß durchlaufenden Organismus bestimmt wird, vorzugsweise ein Phosphatmangelzustand.
Denn bezüglich dieses Einsatzgebiets sind die in den Beispielen beschriebenen und oben aufgeführten Gene ausgewählt worden. Ihre signifikante Induktion geht zumindest bei ß. licheniformis mit dem Eintreten eines Phosphatmangelzustands einher, so daß diese mit den genannten Verfahren besonders zuverlässig detektiert werden können, und zwar nicht nur bei B. licheniformis sondern mit zunehmend besseren Erfolgsaussichten auch bei zunehmend verwandten Spezies (siehe oben). Zudem stellt diese Stoffwechselsituation im Lebenszyklus vieler Mikroorganismen einen kritischen Zeitpunkt dar. So war wie in den Beispielen erläutert mit dem jeweiligen Eintritt des Phosphatmangels immer auch ein Übergang in die stationäre Wachstumsphase verbunden. Verfahren, die diesen Zeitpunkt frühzeitig zu erkennen helfen, dienen dazu, diesen Übergang zu verzögern und insbesondere bei großtechnisch genutzten Fermentationen die Phase der Produktion eines Wertstoffs zu verlängern. Entsprechend dem oben Gesagten sind solche erfindungsgemäßen Verfahren bevorzugt, wobei es sich bei dem für den Bioprozeß ausgewählten Organismus um einen Vertreter einzelliger Eukaryonten, grampositiver oder gramnegativer Bakterien handelt.
Entsprechend dem oben Gesagten sind hierunter solche erfindungsgemäßen Verfahren bevorzugt, wobei es sich bei den einzelligen Eukaryonten um Protozoen oder um Pilze handelt, hierunter insbesondere Hefe, ganz besonders Saccharomyces oder Schizosaccharomyces.
Entsprechend dem oben Gesagten sind darunter auch solche erfindungsgemäßen Verfahren bevorzugt, wobei es sich bei den grampositiven Bakterien um Coryneforme Bakterien oder solche der Gattungen Staphylococcus, Corynebakterien oder Bacillus handelt, insbesondere der Spezies Staphylococcus carnosus,
Corynebacterium glutamicum, Bacillus subtilis, B. licheniformis, B. amyloliquefaciens, B. agaradherens, B. stearothermophilus, B. globigii oder B. lentus, und ganz besonders um B. licheniformis.
Entsprechend dem oben Gesagten sind darunter auch solche erfindungsgemäßen Verfahren nicht minder bevorzugt, wobei es sich bei den gramnegativen Bakterien um solche der Gattungen E. coli oder Klebsiella handelt, insbesondere um Derivate von Escherichia coli K12, von Escherichia coli B oder Klebsiella planticola, und ganz besonders um Derivate der Stämme Escherichia coli BL21 (DE3), E. coli RV308, E. coli DH5α, E. coli JM 109, E. coli XL-1 oder Klebsiella planticola (Rf).
Entsprechend dem oben Gesagten sind solche erfindungsgemäßen Verfahren bevorzugt, wobei solche der genannten Sonden zum Einsatz kommen, die von den im Sequenzprotokoll angegebenen SEQ ID NO. 1, 3, 5, 7, 9, 11, 15, 19, 23, 25, 29, 31 , 33, 37, 43, 45, 49, 51 , 53, 55, 59, 61 , 65, 67, 69, 71 , 73, 75, 77, 81 , 83, 85, 87, 89, 91 oder 93 abgeleitet sind.
Hierunter sind wiederum diejenigen Verfahren bevorzugt, bei denen die hier genannten Sonden für die zuvor aufgeführten grampositiven Bakterien, insbesondere B. licheniformis eingesetzt werden, da diese Sequenzen aus eben diesem Organismus isoliert worden sind und somit am erfolgreichsten auf diese Spezies angewendet werden können. Entsprechend dem oben Gesagten sind solche erfindungsgemäßen Verfahren bevorzugt, wobei die Bestimmung des physiologischen Zustands zu verschiedenen Zeitpunkten desselben Prozesses durchgeführt wird, vorzugsweise unter Einsatz mehrerer baugleicher Nukleinsäure-bindender Chips, besonders bevorzugt desselben Nukleinsäure-bindenden Chips.
Entsprechend dem oben Gesagten sind weiterhin solche erfindungsgemäßen Verfahren bevorzugt, wobei es sich bei dem Prozeß um eine Fermentation, insbesondere um die fermentative Herstellung eines gewerblich einsetzbaren Produkts, besonders bevorzugt um die Herstellung eines Proteins oder einer niedermolekularen chemischen Verbindung handelt.
Entsprechend dem oben Gesagten sind hierunter solche erfindungsgemäßen Verfahren bevorzugt, wobei es sich bei der niedermolekularen chemischen Verbindung um einen Naturstoff, einen Nahrungsmittelergänzungsstoff oder um eine pharmazeutisch relevante Verbindung handelt.
Entsprechend dem oben Gesagten sind alternativ auch solche erfindungsgemäßen Verfahren bevorzugt, wobei es sich bei dem Protein um ein Enzym handelt, insbesondere eines aus der Gruppe der α-Amylasen, Proteasen, Cellulasen, Lipasen, Oxidoreduktasen, Peroxidasen, Laccasen, Oxidasen und Hemicellulasen.
Einen eigenständigen Erfindungsgegenstand stellen auch die Verwendungsmöglichkeiten erfindungsgemäßer Nukleinsäure-bindender Chips, wie sie oben eingehend beschrieben sind, zur Bestimmung des physiologischen Zustands eines einen biologischen Prozeß durchlaufenden Organismus dar.
Die oben gemachten Ausführungen zu Nukleinsäure-bindenden Chips gelten für die hier bezeichneten Verwendungen der Bestimmung des physiologischen Zustands eines einen biologischen Prozeß durchlaufenden Organismus entsprechend.
Entsprechend dem oben Gesagten sind solche erfindungsgemäßen Verwendungen bevorzugt, wobei eine Änderung im Phosphatstoffwechsel des den biologischen Prozeß durchlaufenden Organismus bestimmt wird, vorzugsweise ein Phosphatmangelzustand. Entsprechend dem oben Gesagten sind weiterhin solche erfindungsgemäßen Verwendungen bevorzugt, wobei es sich bei dem für den Bioprozeß ausgewählten Organismus um einen Vertreter einzelliger Eukaryonten, grampositiver oder gramnegativer Bakterien handelt.
Entsprechend dem oben Gesagten sind hierunter solche erfindungsgemäßen Verwendungen bevorzugt, wobei es sich bei den einzelligen Eukaryonten um Protozoen oder um Pilze handelt, hierunter insbesondere Hefe, ganz besonders Saccharomyces oder Schizosaccharomyces.
Entsprechend dem oben Gesagten sind alternativ hierzu solche erfindungsgemäßen Verwendungen nicht minder bevorzugt, wobei es sich bei den grampositiven Bakterien um Coryneforme Bakterien oder solche der Gattungen Staphylococcus, Corynebakterien oder Bacillus handelt, insbesondere der Spezies Staphylococcus carnosus, Corynebacterium glutamicum, Bacillus subtilis, B. licheniformis, B. amyloliquefaciens, B. agaradherens, B. stearothermophilus, B. globigii oder B. lentus, und ganz besonders um ß. licheniformis.
Entsprechend dem oben Gesagten sind solche erfindungsgemäßen Verwendungen nicht minder bevorzugt, wobei es sich bei den gramnegativen Bakterien um solche der Gattungen E. coli oder Klebsiella handelt, insbesondere um Derivate von Escherichia coli K12, von Escherichia coli B oder Klebsiella planticola, und ganz besonders um Derivate der Stämme Escherichia coli BL21 (DE3), E. coli RV308, E. coli DH5α, E. coli JM109, E. CO// XL-1 oder Klebsiella planticola (Rf).
Entsprechend dem oben Gesagten sind solche erfindungsgemäßen Verwendungen bevorzugt, wobei solche der genannten Sonden zum Einsatz kommen, die von den im Sequenzprotokoll angegebenen SEQ ID NO. 1 , 3, 5, 7, 9, 11 , 15, 19, 23, 25, 29, 31 , 33, 37, 43, 45, 49, 51 , 53, 55, 59, 61 , 65, 67, 69, 71 , 73, 75, 77, 81 , 83, 85, 87, 89, 91 oder 93 abgeleitet sind.
Hierunter sind wiederum aus dem bereits genannten Grund diejenigen Verwendungen bevorzugt, bei denen die hier genannten Sonden für die zuvor aufgeführten grampositiven Bakterien, insbesondere B. licheniformis eingesetzt werden. Entsprechend dem oben Gesagten sind solche erfindungsgemäßen Verwendungen bevorzugt, wobei die Bestimmung des physiologischen Zustande zu verschiedenen Zeitpunkten desselben Prozesses durchgeführt wird, vorzugsweise unter Einsatz mehrerer baugleicher Nukleinsäure-bindender Chips, besonders bevorzugt desselben Nukleinsäure-bindenden Chips.
Entsprechend dem oben Gesagten sind weiterhin solche erfindungsgemäßen Verwendungen bevorzugt, wobei es sich bei dem Prozeß um eine Fermentation, insbesondere um die fermentative Herstellung eines gewerblich einsetzbaren Produkts, besonders bevorzugt um die Herstellung eines Proteins oder einer niedermolekularen chemischen Verbindung handelt.
Entsprechend dem oben Gesagten sind hierunter solche erfindungsgemäßen Verwendungen bevorzugt, wobei es sich bei der niedermolekularen chemischen Verbindung um einen Naturstoff, einen Nahrungsmittelergänzungsstoff oder um eine pharmazeutisch relevante Verbindung handelt.
Entsprechend dem oben Gesagten sind alternativ dazu solche erfindungsgemäßen Verwendungen bevorzugt, wobei es sich bei dem Protein um ein Enzym handelt, insbesondere eines aus der Gruppe der α-Amylasen, Proteasen, Cellulasen, Lipasen, Oxidoreduktasen, Peroxidasen, Laccasen, Oxidasen und Hemicellulasen.
Der vorliegenden Erfindung wird zusätzlich durch die nachfolgenden Beispiele erläutert.
Beispiele
Alle molekularbiologischen Arbeitsschritte folgen Standardmethoden, wie sie beispielsweise in dem Handbuch von Fritsch, Sambrook und Maniatis „Molecular cloning: a laboratory manual", CoId Spring Harbour Laboratory Press, New York, 1989, oder vergleichbaren einschlägigen Werken angegeben sind. Enzyme und Baukästen (Kits) werden nach den Angaben der jeweiligen Hersteller eingesetzt.
Beispiel 1
Identifizierung der Gensonden durch Chipanalysen
Kultivierung von Bakterien und Probengewinnung
Zellen des Stamms Bacillus licheniformis DSM13 (erhältlich von der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, 38124 Braunschweig; http://www.dsmz.de) wurden in Phosphat-Iimitiertem, synthetischem Belitsky-Minimalmedium (0,28 mM Endkonzentration) bei 37°C unter konstantem Schütteln bei 270 rpm kultiviert. Dieses Medium weist folgende Zusammensetzung auf: (1.) Grundmedium (pH 7,5): 0,015 M (NH4)2SO4, 0,008 M MgSO4 x 7H2O, 0,027 M KCl, 0,007 M Na3Citrat x 2H2O, 0,050 M Tris-HCI und 0,009 M Glutaminsäure; (2.) Supplemente: 0,2 M KH2PO4, 0,039 M L-Tϊyptophan-HCL, 1 M CaCI2 x 2H2O, 0,0005 M FeSO4 x 7H2O, 0,025 M MnSO4 x 4H2O und 20% (w/v) Glukose; und als (3.) Mediumsupplementierungsschema: 0,14 ml KH2PO4, 0,2 ml CaCI2, 0,2 ml FeSO4, 0,04 ml MnSO4, 1 ml Glukose. Alle Werte sind beziehen sich auf 100 ml Grundmedium.
Im Verlauf der Wachstumskurve wurden bei einer optischen Dichte bei 500 nm (OD50o) von 0,4 bis 0,5 die Kontrollprobe und in der transienten Wachstumsphase bei einer OD50O von 0,8 bis 0,9 eine weitere Probe („Übergang") entnommen. Das oben angegebene Supplementierungsschema für das Belitzky-Minimalmedium ist so eingestellt, daß ab einer OD50O von 0,8 bis 1 ,0 Phosphatmangel eintritt und somit die stationäre Phase eingeleitet wird. Weitere Probennahmen erfolgten nach weiteren 30, 60 und 120 min. Die Proben wurden nach Entnahme sofort mit demselben Volumen, auf 00C gekühlten Killing Puffer (20 mM NaN3; 20 mM Tris-HCI, pH 7,5; 5 mM MgCI2) versetzt. Nach sofortigem Abzentrifugieren des Zellpellets für 5 min bei 4°C und 15.000 rpm wurde der Überstand verworfen und das Pellet entweder bei -8O0C eingefroren oder sofort weiter aufgearbeitet. Zellaufschluß
Der Zellaufschluß erfolgte mit dem „Hybaid RiboLyser™ Cell Disruptor" (Fa. Thermo Electron Corporation, Dreieich, Deutschland). Diese Methode basiert auf der mechanischen Zerstörung der Zellwand und der Zellmembran mit Hilfe von ca. 0,1 mm kleinen Glasperlen (Fa. Sartorius BBI, Melsungen, Deutschland). Die aufzuschließenden Zellen, die zuvor in Lysis-Puffer Il (3 mM EDTA; 200 mM NaCI) resuspendiert worden waren, wurden zusammen mit den Glasperlen in ein Glas- (Stammhaltungs-)röhrchen gegeben. Zusätzlich wurde saures Phenol dazugegeben, um die Degradation der RNA durch RNasen zu vermeiden. Dieses Röhrchen wurde daraufhin in den RiboLyser eingespannt, wobei unter starkem Schütteln die Glassperlen mit den Zellen kollidierten, was den Zellaufschluß bewirkte.
Gesamt-RNA-Isolierung
Nach dem Zellaufschluß wird die RNA-haltige wäßrige Phase durch Zentrifugation von den Protein- und Zellfragmenten, der chromosomalen DNA und den Glassperlen getrennt und daraus die RNA mit Hilfe des Geräts KingFisher ml_ (Fa. Thermo Electron Corporation, Dreieich, Deutschland) unter Verwendung des MagNA Pure LC RNA Isolation Kit I (Fa. Roche Diagnostics, Penzberg, Deutschland) isoliert. Diese Aufreinigung basiert auf der Bindung der RNA an magnetische Glaspartikel in der Gegenwart von chaotropen Salzen, welche auch die Inaktivierung von RNasen bewirken. Dabei dienen die magnetischen Partikel als Transportmittel der RNA zwischen verschiedenen Reaktionsgefäßen, die mit Bindungs-, Wasch- und Elutionspuffem befüllt sind. Der hierfür genutzte KingFisher mL ist eine Art Pipettierroboter, der mit Hilfe von Magneten die Partikel mit der gebundenen RNA zwischen den Gefäßen hin- und hertransportiert und auch zum Mischen der Proben genutzt wird. Abschließend wird die RNA von den magnetischen Partikeln gelöst und liegt gereinigt vor.
RNA-Qualitäts- und -Quantitätskontrolle
An die Aufreinigung der RNA schließt sich die Qualitäts- und Quantitätskontrolle an. Der hierfür genutzte Apparat Agilent Bioanalyzer 2100 (Fa. Agilent Technologies, Berlin, Deutschland) ermöglicht die Analyse von RNA im Lab-on-a-Chip-Maßstaß. Zusammen mit dem „RNA 6000 Nano Kit" von Agilent wird die Gesamt-RNA gelelektrophoretisch aufgetrennt und bietet somit die Möglichkeit der Untersuchung der Qualität in Hinblick auf Teilabbau und Verunreinigungen. Hierbei wird ribosomale RNA (16 S- und 23 S-rRNA) detektiert. Stellen diese sich als klare Banden dar, kann man davon ausgehen, daß die RNA im Verlauf der Bearbeitung nicht abgebaut wurde und somit intakt ist und in die nachfolgenden Untrsuchungen eingebracht werden kann. Zusätzlich wird dabei auch die genaue Konzentration bestimmt.
Transkriptomanalysen
Die Transkriptomanalysen wurden mit gesamtgenomischen B. licheniformis DSM13-DNA- Microarrays durchgeführt, die auf herkömmliche Weise (beispielsweise gemäß WO 95/11995 A1) hergestellt worden waren und über ein optisches System auswertbar sind. Auf diesen DNA-Microarrays lag nahezu jedes Gen aus B. licheniformis in doppelter Ausführung vor, so daß zwei Proben parallel auf demselben Chip analysiert und die erhaltenen Werte gemittelt werden konnten.
Das Prinzip der vorgenommenen Messung besteht darin, daß die jeweiligen mRNA- Moleküle aus der entnommenen Probe in vitro über eine reverse Transkription in DNA umgeschrieben werden, wobei eines der zugesetzten Desoxyribonukleotide einen Farbmarker trägt. Diese markierten Moleküle werden dann mit den bekannten, auf bekannten Stellen des Chip liegenden Sonden hybridisiert und die jeweilige Stärke des an den betreffenden Stellen auf den Fluoreszenzmarker zurückzuführenden Signals optisch erfaßt. Bei Verwendung zweier verschiedener Fluoreszenzmarker für eine Kontrolle und für eine eigentlich zu untersuchende Probe, die gleichzeitig zur Hybridisierung gebracht werden und somit um die Bindung an die vorgelegte Sonde konkurrieren, gelangt man zu unterschiedlichen Farbwerten, die ein Maß für das Verhältnis der Konzentration der Kontrolle zur Konzentration der Probe liefern.
Für diese Markierung wurde dUTP gewählt, welches mit dem Fluoreszenzfarbstoff Cyanin 3 oder mit Cyanin 5 markiert war. So wurden jeweils 25 μg Gesamt-RNA der Kontrolle (OD500 0,4) mit dem Fluoreszenzfarbstoff Cyanin 3 (Fa. Amersham Biosciences Europe GmbH, Freiburg, Deutschland) und 25 μg Gesamt-RNA der jeweiligen Streßprobe (transiente Phase, 30, 60 und 120 min) mit dem Fluoreszenzfarbstoff Cyanin 5 (Fa. GE Healthcare, Freiburg, Deutschland) markiert. Die kompetitive Hybridisierung der beiden Proben auf dem herkömmlichen, gesamtgenomischen B. //c/7en/7br/77/s-DSM13-DNA- Microarray erfolgte für mindestens 16 Stunden bei 42°C. Nach dem Waschen der Arrays zur Entfernung unspezifischer Bindungen erfolgte die optische Auslesung der Arrays mit Hilfe des ScanArray® Express Laser Scanners (Fa. PerkinElmer Life and Analytical Sciences, Rodgau-Jügesheim, Deutschland). Alle Hybridisierungen wurden wiederholt, wobei die Proben mit dem jeweiligen anderen Farbstoff markiert wurden (Dye-Swap-Verfahren). Die quantitative Auswertung der Arrays wurde unter Verwendung der Software ScanArray® Express (erhältlich von der Fa. PerkinElmer Life and Analytical Sciences Rodgau-Jügesheim, Deutschland) nach Herstellerangaben und unter Standard-Parametern durchgeführt.
Unter Zuhilfenahme der Kontrollen der Lucidea Score Card (Fa. GE Healthcare, Freiburg, Deutschland) wurden die Arrays normalisiert und evaluiert. Mit Hilfe dieser „Score Card", welche zur Kontrolle der Effizienz und Qualität der Hybridisierung dient, waren entsprechend den Herstellerangaben bekannte Kontroll-DNA und sogenannte Spikes in Form von Oligos auf das Array aufgebracht und in der Hybridisierung mit komplementären Sequenzen versetzt worden. Somit konnte man nach dem Scannen den Erfolg der Hybridisierung und des Einbaus der Farbstoffe kontrollieren. Die Kontrollen sollten in beiden Proben in gleicher Menge vorhanden sein und somit nach dem Scannen gelb erscheinen beziehungsweise eine Ratio zwischen beiden Kanälen von 1 aufweisen. Die Spikes sind für die jeweilige Probe spezifisch, und werden in verschiedenen Verdünnungen aufgebracht, das heißt sie erscheinen nach dem Scannen für die jeweilige Probe rot oder grün.
Für die Expression der Gene wurden Mittelwerte aus den zwei Hybridisierungen sowie die jeweiligen Standardabweichungen errechnet. Für eine signifikante Induktion oder eine signifikante Repression werden folgende Schwellenwerte für das Verhältnis der RNA Menge des jeweiligen Gens gegenüber dem Kontrollwert betrachtet: Als induziert gelten die Gene, deren RNA ein Verhältnis > 3 (das heißt mindestens eine Verdreifachung) aufweist; deutlich reprimiert sind Gene mit einem RNA-Verhältnis < 0,3 (das heißt einem Absenken auf weniger als 30%). Diese Resultate werden in Beispiel 2 aufgelistet. Beispiel 2
Unter Phosphatmangel induzierte Gene
In folgender Tabelle 1 sind alle in Beispiel 1 ermittelten 235 Gene von Bacillus licheniformis DSM13 aufgeführt, deren (mindestens den Faktor 3 betragende) Induzierung unter den Bedingungen des in Beispiel 1 beschriebenen Phosphatmangels beobachtet wurde. In den ersten beiden Spalten sind der jeweilige Name des abgeleiteten Proteins beziehungsweise (soweit vorhanden) dessen Abkürzung abgegeben; die „Bli-Nummer" entspricht dem „locus_tag" des unter dem Eintrag AE017333 (Basen 1 bis 4.222.645) in der Datenbank GenBank (National Center for Biotechnology Information NCBI, National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA; http://www.ncbi.nlm.nih.gov; Stand 2.12.2004) zugänglichen Gesamtgenoms von β. licheniformis; anschließend folgen die zu den oben angegebenen Zeitpunkten beobachteten Faktoren zur Steigerung der Konzentration der jeweils zugehörigen mRNAs.
Tabelle 1 : Die in Beispiel 1 ermittelten 235 Gene von Bacillus licheniformis DSM13, deren (mindestens den Faktor 3 betragende) Induzierung unter Phosphatmangel beobachtet wurde (Erläuterungen: siehe Text).
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Beispiel 3
Speziell unter Phosphatmagel deutlich induzierte Gene
In folgender Tabelle 2 sind alle in Beispiel 1 ermittelten Gene von Bacillus licheniformis DSM13 aufgeführt, deren Induzierung unter den Bedingungen des in Beispiel 1 beschriebenen Phosphatmangels zu irgendeinem der gemessenen Zeitpunkte mindestens den Faktor 10 betragen hat und die aufgrund von Vergleichsversuchen (Daten nicht gezeigt) als vergleichsweise spezifisch für Phosphatmangel eingestuft werden können. Dies sind insgesamt 47.
Die Spaltenbezeichnungen sind dieselben wie im vorangegangenen Beispiel. Zusätzlich sind in der ersten Spalte die Sequenznummern angegeben, die die jeweiligen DNA- beziehungsweise Aminosäuresequenzen in dem zur vorliegenden Anmeldung gehörenden Sequenzprotokoll tragen. Besonderheiten der jeweiligen Sequenzen, die im Sequenzprotokoll als freier Text auftauchen, sind unter der Rubrik Genname / Genfunktion ergänzt.
Tabelle 2: Die in Beispiel 1 ermittelten 47 Gene von Bacillus licheniformis DSM13, deren speziell durch Phosphatmangel hervorgerufene Induzierung zu irgendeinem der gemessenen Zeitpunkte mindestens den Faktor 10 betragen hat (Erläuterungen: siehe Text).
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In folgender Tabelle 3 sind dieselben 47 Gene noch einmal in der Reihenfolge der beobachtenen Stärke der Induktion aufgelistet. In dieser Reihenfolge werden im Beschreibungsteil die zugehörigen Bezeichnungen in deutscher Sprache angegeben. An der umgekehrten Reihenfolge orientiert sich die Staffelung der Anspruchsgegenstände.
Tabelle 3: Die in Beispiel 1 ermittelten 47 Gene von Bacillus licheniformis DSM13, deren speziell durch Phosphatmangel hervorgerufene Induzierung zu irgendeinem der gemessenen Zeitpunkte mindestens den Faktor 10 betragen hat, in absteigender Reihenfolge des jeweils gemessenen Maximalwerts (letzte Spalte).
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Beispiel 4
Real-Time-RT-PCR-Quantifizierung ausgewählter Gene
Mit Hilfe der Real-Time-RT-PCR ist es möglich, die absoluten Molekülzahlen von spezifischen Transkripten in einer Probe zu ermitteln. Es wurde der LightCycler (Fa. Roche Diagnostics, Penzberg, Deutschland) in Verbindung mit dem "SYBR Green I" Kit (Fa. Roche Diagnostics) genutzt. Diese Methode basiert auf der Detektion der Bindung des fluoreszierenden Farbstoffs an doppelsträngige DNA. Die Quantifizierung der spezifischen mRNA-Moleküle erfolgte wie in Tobisch et al. (2003; Quantification of Bacterial mRNA by One-Step RT-PCR Using the LightCycler System; BIOCHEMICA, Band 3. Seiten 5 bis 8) beschrieben, wobei für jede zu untersuchende mRNA eine externe Standardkurve erstellt wurde.
Dazu wurden Verdünnungen bekannter Konzentrationen von //>v#ro-Transkripten der in Beispiel 1 ermittelten und Beispiel 2 aufgelisteten mRNA mit Hilfe des LightCyclers gemessen und dann unter Verwendung der gerätespezifischen Software die Standardkurve erstellt. Dazu mußten im Vorfeld für jede zu untersuchende mRNA spezifische Primer ausgewählt werden (mit Hilfe der Software „Array Designer"; erhältlich von der Firma PREMIER Biosoft International, PaIo Alto, USA), die eine Synthese von In- wϊro-Transkripten sowie die PCR-Amplifikation im LightCycler ermöglichen.
Nach Herstellung der externen Standardkurve konnte mit der Messung im LightCycler begonnen werden. Für die Messungen wurden zwei unterschiedliche Verdünnungen für jede zu analysierende Probe eingesetzt. Im LightCycler-Lauf wurde dann mit den jeweiligen Primern das spezifische Transcript amplifiziert und die Einlagerung des Farbstoffs gemessen.
Unter Verwendung der LightCycler-Software sowie des auf der Webseite http://molbiol.ru/ger/scripts/01_07.html zugänglichen Skripts (2.12.2004) konnte die genaue Molekülzahl für ausgewählte Transkripte ermittelt werden. Mit den auf diese Weise erhaltenen Werten und deren Relationen zueinander wurden für die ausgewählten Transkripte die in den Tabellen 1 und 2 angegebenen Induktionswerte bestätigt.
Beschreibung der Figuren
Figur 1 : Schematische Darstellung des yAM/ne-Monitoring eines Bioprozesses mit erfindungsgemäßen elektrischen DNA-Chips
Die zeitnahe Überwachung des Bioprozesses geschieht vorteilhafterweise über folgende Arbeitsschritte:
1. Probennahme, beispielsweise aus der Fermentation eines Mikroorganismus;
2. Zellaufschluß über Routine-Methoden;
3. RNA-Isolierung über Routine-Methoden;
4. Hybridisierung auf einem erfindungsgemäß mit Nukleinsäuren (beispielsweise DNA) oder Nukleinsäure-Analoga (beispielsweise schwer hydrolysierbaren, analog aufgebauten Verbindungen) beladenen Chip;
5. Erfassung der elektrischen Signale eines entsprechend konstruierten Elektro- Chips; alternativ wäre auch die Aufnahme optischer Signale von einem optischen DNA-Chip möglich;
6. Vorzugsweise Rechner-gestützte Datenauswertung.
Bei Einsatz elektrischer Chips ergibt sich nach derzeitigem Entwicklungsstand eine ungefähre Gesamtanalysenzeit von weniger als 2 h, bei Einsatz konventioneller optischer DNA-Chips von ca. 12 h.

Claims

Patentansprüche
1. Nukleinsäure-bindender Chip, dotiert mit Sonden für mindestens drei der folgenden 47 Gene: yhcR, tatCD, ctaC, Gen für eine vermutliche Acetoin-Reductase (Homolog zu SEQ ID NO. 53), spollGA, nasE, pstA, spollAA, Gen für ein hypothetisches Protein (Homolog zu SEQ ID NO. 65), yhbD, cotE, Gen für ein konserviertes hypothetisches Potein (Homolog zu SEQ ID NO. 59), yurl, spoVID, Gen für eine vermutliche Aromaten-spezifische Dioxygenase (Homolog zu SEQ ID NO. 55), yhbE, Gen für ein vermutliches Benzoat-Transportprotein (Homolog zu SEQ ID NO. 49), pstBB, spolllAH, Gen für ein hypothetisches Protein (Homolog zu SEQ ID NO. 63), spollQ, spolllAG, yvmA, Gen für eine vermutliche Ribonuclease (Homolog zu SEQ ID NO. 93), dhaS, yrbE, Gen für eine vermutliche Decarboxylase/Dehydratase (Homolog zu SEQ ID NO. 57), htpG, yfkH, spollAB, spolllAF, alsD, gdh, yfkN, pstC, yfmQ, pstBA, Homolog zu dhaS (Homolog zur Aldehyd-Dehydrogenase DhaS; Homolog zu SEQ ID NO. 17), Gen für eine vermutliche Phosphatase (Homolog zu SEQ ID NO. 61), phy, cypX, alsS, phoD, pstS, phoB, yvnA, yvmC, wobei die Gesamtzahl aller Phosphatstoffwechsel-spezifischen unterschiedlichen Sonden nicht über 100 liegt.
2. Nukleinsäure-bindender Chip nach Anpruch 1 , zunehmend bevorzugt dotiert mit den dort angegebenen Sonden in der dort angegebenen Reihenfolge.
3. Nukleinsäure-bindender Chip nach Anpruch 1 oder 2, dotiert mit Sonden für mindestens drei der folgenden 39 Gene: Gen für ein hypothetisches Protein (Homolog zu SEQ ID NO. 65), yhbD, cotE, Gen für ein konserviertes hypothetisches Potein (Homolog zu SEQ ID NO. 59), yurl, spoVID, Gen für eine vermutliche Aromaten- spezifische Dioxygenase (Homolog zu SEQ ID NO. 55), yhbE, Gen für ein vermutliches Benzoat-Transportprotein (Homolog zu SEQ ID NO. 49), pstBB, spolllAH, Gen für ein hypothetisches Protein (Homolog zu SEQ ID NO. 63), spollQ, spolllAG, yvmA, Gen für eine vermutliche Ribonuclease (Homolog zu SEQ ID NO. 93), dhaS, yrbE, Gen für eine vermutliche Decarboxylase/Dehydratase (Homolog zu SEQ ID NO. 57), htpG, yfkH, spollAB, spolllAF, alsD, gdh, yfkN, pstC, yfmQ, pstBA, Homolog zu dhaS (Homolog zur Aldehyd-Dehydrogenase DhaS; Homolog zu SEQ ID NO. 17), Gen für eine vermutliche Phosphatase (Homolog zu SEQ ID NO. 61), phy, cypX, alsS, phoD, pstS, phoB, yvnA, yvmC, vorzugsweise für mindestens drei der folgenden 14 Gene: yfkN, pstC, yfmQ, pstBA, Homolog zu dhaS (Homolog zur Aldehyd-Dehydrogenase DhaS; Homolog zu SEQ ID NO. 17), Gen für eine vermutliche Phosphatase (Homolog zu SEQ ID NO. 61), phy, cypX, alsS, phoD, pstS, phoB, yvnA, yvmC, besonders bevorzugt für mindestens drei der folgenden 8 Gene: phy, cypX, alsS, phoD, pstS, phoB, yvnA, yvmC, ganz besonders bevorzugt für mindestens eines der folgenden 3 Gene: phoB, yvnA, yvmC.
4. Nukleinsäure-bindender Chip nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dotiert mit mindestens 4, 5, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26 28, 30, 35, 40, 45 oder 47 der genannten Sonden.
5. Nukleinsäure-bindender Chip nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Gesamtzahl aller unterschiedlichen Sonden zunehmend bevorzugt nicht über 100, 90, 80, 70, 60 oder 50 liegt.
6. Nukleinsäure-bindender Chip nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei es sich bei den genannten Sonden um solche handelt, die auf die betreffenden, beziehungsweise höchsthomologen, in vivo transkribierbaren Gene aus dem für den Bioprozeß gewählten Organismus ansprechen, vorzugsweise solche, die von den betreffenden, beziehungsweise höchsthomologen, in vivo transkribierbaren Genen eben dieses Organismus abgeleitet sind.
7. Nukleinsäure-bindender Chip nach Anspruch 6, wobei es sich bei dem für den Bioprozeß ausgewählten Organismus um einen Vertreter einzelliger Eukaryonten, grampositiver oder gramnegativer Bakterien handelt.
8. Nukleinsäure-bindender Chip nach Anspruch 7, wobei es sich bei den einzelligen Eukaryonten um Protozoen oder um Pilze handelt, hierunter insbesondere Hefe, ganz besonders Saccharomyces oder Schizosaccharomyces.
9. Nukleinsäure-bindender Chip nach Anspruch 7, wobei es sich bei den grampositiven Bakterien um Coryneforme Bakterien oder solche der Gattungen Staphylococcus, Corynebakterien oder Bacillus handelt, insbesondere der Spezies Staphylococcus carnosus, Corynebacterium glutamicum, Bacillus subtilis, B. licheniformis, B. amyloliquefaciens, B. agaradherens, B. stearothermophilus, B. globigii oder S. lentus, und ganz besonders um β. licheniformis.
10. Nukleinsäure-bindender Chip nach Anspruch 7, wobei es sich bei den gramnegativen Bakterien um solche der Gattungen E. coli oder Klebsiella handelt, insbesondere um Derivate von Escherichia coli K12, von Escherichia coli B oder Klebsiella planticola, und ganz besonders um Derivate der Stämme Escherichia coli BL21 (DE3), E. coli RV308, E. coli DH5α, E. coli J M 109, E. coli XL-1 oder Klebsiella planticola (Rf).
11. Nukleinsäure-bindender Chip nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei mindestens eine, zunehmend bevorzugt mehrere der genannten Sonden von den Sequenzen abgeleitet ist/sind, die im Sequenzprotokoll unter den Nummern SEQ ID NO. 1 , 3, 5, 7, 9, 11 , 13, 15, 17, 19, 21 , 23, 25, 27, 29, 31 , 33, 35, 37, 39, 41 , 43, 45, 47, 49, 51 , 53, 55, 57, 59, 61 , 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81 , 83, 85, 87, 89, 91 und 93 aufgeführt sind.
12. Nukleinsäure-bindender Chip nach einem der Ansprüche 1 bis 11 , zusätzlich dotiert mit mindestens einer Sonde für ein zusätzliches Gen, insbesonderen einem solchen, das in einem Stoffwechsel-bedingten Zusammenhang zu dem oder den prozeßbedingt zusätzlich exprimierten Gen(en) steht, ganz besonders für eines von diesen oder dieses selbst.
13. Nukleinsäure-bindender Chip nach Anspruch 12, wobei es sich bei dem prozeßbedingt zusätzlich exprimierten Gen um das für ein gewerblich einsetzbares Protein handelt, insbesondere um eine Amylase, Cellulase, Lipase, Oxidoreduktase, eine Hemicellulase oder Protease, oder um eines, das auf einem Syntheseweg für eine niedermolekulare chemische Verbindung liegt oder diesen wenigstens zum Teil reguliert.
14. Nukleinsäure-bindender Chip nach einem der Ansprüche 1 bis 13, wobei eine, bevorzugt mehrere der genannten Sonden einzelsträngig, in Form des codogenen Strangs bereitgestellt wird/werden.
15. Nukleinsäure-bindender Chip nach einem der Ansprüche 1 bis 14, wobei eine, bevorzugt mehrere der genannten Sonden in Form einer DNA oder eines Nukleinsäureanalogs, vorzugsweise eines Nukleinsäureanalogs zur Verfügung gestellt wird/werden.
16. Nukleinsäure-bindender Chip nach einem der Ansprüche 1 bis 15, wobei eine, bevorzugt mehrere der genannten Sonden Genbereiche umfaßt/umfassen, die von dem zu untersuchenden Organismus in mRNA umgeschrieben werden, insbesondere die Genbereiche, die nahe dem 5'-Ende der mRNA liegen.
17. Nukleinsäure-bindender Chip nach einem der Ansprüche 1 bis 16, wobei eine, bevorzugt mehrere der genannten Sonden auf Fragmente der betreffenden Nukleinsäuren anspricht/ansprechen, insbesondere auf solche, die in der betreffenden mRNA, bezogen auf die jeweilige Gesamt-mRNA ein geringes Maß an Sekundärfaltung aufweisen.
18. Nukleinsäure-bindender Chip nach einem der Ansprüche 1 bis 17, wobei eine, bevorzugt mehrere der genannten Sonden eine Länge von weniger als 200 Nukleotiden, vorzugsweise von weniger als 100 Nukleotiden, besonders bevorzugt von 20 bis 60 Nukleotiden, ganz besonders bevorzugt von 45 bis 55 Nukleotiden aufweist/aufweisen.
19. Nukleinsäure-bindender Chip nach einem der Ansprüche 1 bis 18, wobei durch die Bindung der mRNA an die betreffende genannte Sonde ein elektrisches Signal ausgelöst wird.
20. Gleichzeitige Verwendung von Nukleinsäure- oder Nukleinsäure-Analogon-Sonden für mindestens drei der folgenden 47 Gene: yhcR, tatCD, ctaC, Gen für eine vermutliche Acetoin-Reductase (Homolog zu SEQ ID NO. 53), spollGA, nasE, pstA, spollAA, Gen für ein hypothetisches Protein (Homolog zu SEQ ID NO. 65), yhbD, cotE, Gen für ein konserviertes hypothetisches Potein (Homolog zu SEQ ID NO. 59), yurl, spoVID, Gen für eine vermutliche Aromaten-spezifische Dioxygenase (Homolog zu SEQ ID NO. 55), yhbE, Gen für ein vermutliches Benzoat-Transportprotein (Homolog zu SEQ ID NO. 49), pstBB, spolllAH, Gen für ein hypothetisches Protein (Homolog zu SEQ ID NO. 63), spollQ, spolllAG, yvmA, Gen für eine vermutliche Ribonuclease (Homolog zu SEQ ID NO. 93), dhaS, yrbE, Gen für eine vermutliche Decarboxylase/Dehydratase (Homolog zu SEQ ID NO. 57), MpG, yfkH, spollAB, spolllAF, alsD, gdh, yfkN, pstC, yfmQ, pstBA, Homolog zu dhaS (Homolog zur Aldehyd-Dehydrogenase DhaS; Homolog zu SEQ ID NO. 17), Gen für eine vermutliche Phosphatase (Homolog zu SEQ ID NO. 61), phy, cypX, alsS, phoD, pstS, phoB, yvnA, yvmC, gebunden an einen Nukleinsäure-bindenden Chip, vorzugsweise an denselben, zur Bestimmung des physiologischen Zustande eines einen biologischen Prozeß durchlaufenden Organismus.
21. Verwendung nach Anspruch 20, wobei die Gesamtzahl aller Phosphatstoffwechsel- spezifischen unterschiedlichen Sonden nicht über 100 liegt.
22. Verwendung nach Anspruch 20 oder 21 , wobei die in Anspruch 20 angegebenen Sonden in der dort angegebenen Reihenfolge zunehmend bevorzugt eingesetzt werden.
23. Verwendung nach einem der Ansprüche 20 bis 22, wobei es sich um Nukleinsäure- oder Nukleinsäure-Analogon-Sonden für mindestens drei der folgenden 39 Gene handelt: Gen für ein hypothetisches Protein (Homolog zu SEQ ID NO. 65), yhbD, cotE, Gen für ein konserviertes hypothetisches Potein (Homolog zu SEQ ID NO. 59), yurl, spoVID, Gen für eine vermutliche Aromaten-spezifische Dioxygenase (Homolog zu SEQ ID NO. 55), yhbE, Gen für ein vermutliches Benzoat-Transportprotein (Homolog zu SEQ ID NO. 49), pstBB, spolllAH, Gen für ein hypothetisches Protein (Homolog zu SEQ ID NO. 63), spollQ, spolllAG, yvmA, Gen für eine vermutliche Ribonuclease (Homolog zu SEQ ID NO. 93), dhaS, yrbE, Gen für eine vermutliche Decarboxylase/Dehydratase (Homolog zu SEQ ID NO. 57), WpG1 yfkH, spollAB, spolllAF, alsD, gdh, yfkN, pstC, yfmQ, pstBA, Homolog zu dhaS (Homolog zur Aldehyd-Dehydrogenase DhaS; Homolog zu SEQ ID NO. 17), Gen für eine vermutliche Phosphatase (Homolog zu SEQ ID NO. 61), phy, cypX, alsS, phoD, pstS, phoB, yvnA, yvmC, vorzugsweise für mindestens drei der folgenden 14 Gene: yfkN, pstC, yfmQ, pstBA, Homolog zu dhaS (Homolog zur Aldehyd-Dehydrogenase DhaS; Homolog zu SEQ ID NO. 17), Gen für eine vermutliche Phosphatase (Homolog zu SEQ ID NO. 61), phy, cypX, alsS, phoD, pstS, phoB, yvnA, yvmC, besonders bevorzugt für mindestens drei der folgenden 8 Gene: phy, cypX, alsS, phoD, pstS, phoB, yvnA, yvmC, ganz besonders bevorzugt für mindestens eines der folgenden 3 Gene: phoB, yvnA, yvmC.
24. Verwendung nach einem der Ansprüche 20 bis 23 von mindestens 4, 5, 6, 8, 10, 12,
14, 16, 18, 20, 22, 24, 26 28, 30, 35, 40, 45 oder 47 der genannten Sonden.
25. Verwendung nach einem der Ansprüche 20 bis 24, wobei die Gesamtzahl aller unterschiedlichen Sonden zunehmend bevorzugt nicht über 100, 90, 80, 75, 70, 65,
60, 55, 50, 40, 30, 20 oder 10 liegt.
26. Verwendung nach einem der Ansprüche 20 bis 25 zur Bestimmung einer Änderung im Phosphatstoffwechsel des den biologischen Prozeß durchlaufenden Organismus, vorzugsweise zur Detektion eines Phosphatmangelzustands.
27. Verwendung nach einem der Ansprüche 20 bis 26, wobei mindestens eine, zunehmend bevorzugt mehrere der genannten Sonden von den Sequenzen abgeleitet ist/sind, die im Sequenzprotokoll unter den Nummern SEQ ID NO. 1 , 3, 5, 7, 9, 11 , 13,
15, 17, 19, 21 , 23, 25, 27, 29, 31 , 33, 35, 37, 39, 41 , 43, 45, 47, 49, 51 , 53, 55, 57, 59,
61 , 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81 , 83, 85, 87, 89, 91 und 93 aufgeführt sind.
28. Verfahren der Bestimmung des physiologischen Zustands eines einen biologischen Prozeß durchlaufenden Organismus durch Einsatz eines Nukleinsäure-bindenden Chips nach einem der Ansprüche 1 bis 19.
29. Verfahren nach Anspruch 28, wobei eine Änderung im Phosphatstoffwechsel des den biologischen Prozeß durchlaufenden Organismus bestimmt wird, vorzugsweise ein Phosphatmangelzustand.
30. Verfahren nach Anspruch 28 oder 29, wobei es sich bei dem für den Bioprozeß ausgewählten Organismus um einen Vertreter einzelliger Eukaryonten, grampositiver oder gramnegativer Bakterien handelt.
31. Verfahren nach Anspruch 30, wobei es sich bei den einzelligen Eukaryonten um Protozoen oder um Pilze handelt, hierunter insbesondere Hefe, ganz besonders Saccharomyces oder Schizosaccharomyces.
32. Verfahren nach Anspruch 30, wobei es sich bei den grampositiven Bakterien um Coryneforme Bakterien oder solche der Gattungen Staphylococcus, Corynebakterien oder Bacillus handelt, insbesondere der Spezies Staphylococcus carnosus, Corynebacterium glutamicum, Bacillus subtilis, B. licheniformis, B. amyloliquefaciens, B. agaradherens, B. stearothermophilus, B. globigii oder ß. lentus, und ganz besonders um B. licheniformis.
33. Verfahren nach Anspruch 30, wobei es sich bei den gramnegativen Bakterien um solche der Gattungen E. coli oder Klebsiella handelt, insbesondere um Derivate von Escherichia coli K12, von Escherichia coli B oder Klebsiella planticola, und ganz besonders um Derivate der Stämme Escherichia coli BL21 (DE3), E. coli RV308, E. coli DH5α, E. coli JM109, E coli XL-1 oder Klebsiella planticola (Rf).
34. Verfahren nach Anspruch 33 oder vorzugsweise 32, wobei solche der genannten Sonden zum Einsatz kommen, die von den im Sequenzprotokoll angegebenen SEQ ID NO. 1 , 3, 5, 7, 9, 11 , 15, 19, 23, 25, 29, 31 , 33, 37, 43, 45, 49, 51 , 53, 55, 59, 61 , 65, 67, 69, 71 , 73, 75, 77, 81 , 83, 85, 87, 89, 91 oder 93 abgeleitet sind.
35. Verfahren nach einem der Ansprüche 28 bis 34, wobei die Bestimmung des physiologischen Zustands zu verschiedenen Zeitpunkten desselben Prozesses durchgeführt wird, vorzugsweise unter Einsatz mehrerer baugleicher Nukleinsäure- bindender Chips, besonders bevorzugt desselben Nukleinsäure-bindenden Chips.
36. Verfahren nach einem der Ansprüche 28 bis 35, wobei es sich bei dem Prozeß um eine Fermentation, insbesondere um die fermentative Herstellung eines gewerblich einsetzbaren Produkts, besonders bevorzugt um die Herstellung eines Proteins oder einer niedermolekularen chemischen Verbindung handelt.
37. Verfahren nach Anspruch 36, wobei es sich bei der niedermolekularen chemischen Verbindung um einen Naturstoff, einen Nahrungsmittelergänzungsstoff oder um eine pharmazeutisch relevante Verbindung handelt.
38. Verfahren nach Anspruch 36, wobei es sich bei dem Protein um ein Enzym handelt, insbesondere eines aus der Gruppe der α-Amylasen, Proteasen, Cellulasen, Lipasen, Oxidoreduktasen, Peroxidasen, Laccasen, Oxidasen und Hemicellulasen.
39. Verwendung eines Nukleinsäure-bindenden Chips nach einem der Ansprüche 1 bis 19 zur Bestimmung des physiologischen Zustande eines einen biologischen Prozeß durchlaufenden Organismus.
40. Verwendung nach Anspruch 39, wobei eine Änderung im Phosphatstoffwechsel des den biologischen Prozeß durchlaufenden Organismus bestimmt wird, vorzugsweise ein Phosphatmangelzustand.
41. Verwendung nach Anspruch 39 oder 40, wobei es sich bei dem für den Bioprozeß ausgewählten Organismus um einen Vertreter einzelliger Eukaryonten, grampositiver oder gramnegativer Bakterien handelt.
42. Verwendung nach Anspruch 41 , wobei es sich bei den einzelligen Eukaryonten um Protozoen oder um Pilze handelt, hierunter insbesondere Hefe, ganz besonders Saccharomyces oder Schizosaccharomyces.
43. Verwendung nach Anspruch 41 , wobei es sich bei den grampositiven Bakterien um Coryneforme Bakterien oder solche der Gattungen Staphylococcus, Corynebakterien oder Bacillus handelt, insbesondere der Spezies Staphylococcus carnosus, Corynehacterium glutamicum, Bacillus subtilis, B. licheniformis, B. amyloliquefaciens, B. agaradherens, B. stearothermophilus, B. globigii oder B. lentus, und ganz besonders um ß. licheniformis.
44. Verwendung nach Anspruch 41 , wobei es sich bei den gramnegativen Bakterien um solche der Gattungen E. coli oder Klebsiella handelt, insbesondere um Derivate von Escherichia coli K12, von Escherichia coli B oder Klebsiella planticola, und ganz besonders um Derivate der Stämme Escherichia coli BL21 (DE3), £ coli RV308, E. coli DH5α, E. coli JM109, E. coli XL-1 oder Klebsiella planticola (Rf).
45. Verwendung nach Anspruch 44 oder vorzugsweise 43, wobei solche der genannten Sonden zum Einsatz kommen, die von den im Sequenzprotokoll angegebenen SEQ ID NO. 1 , 3, 5, 7, 9, 11 , 15, 19, 23, 25, 29, 31 , 33, 37, 43, 45, 49, 51 , 53, 55, 59, 61 , 65, 67, 69, 71 , 73, 75, 77, 81 , 83, 85, 87, 89, 91 oder 93 abgeleitet sind.
46. Verwendung nach einem der Ansprüche 39 bis 45, wobei die Bestimmung des physiologischen Zustande zu verschiedenen Zeitpunkten desselben Prozesses durchgeführt wird, vorzugsweise unter Einsatz mehrerer baugleicher Nukleinsäure- bindender Chips, besonders bevorzugt desselben Nukleinsäure-bindenden Chips.
47. Verwendung nach einem der Ansprüche 39 bis 46, wobei es sich bei dem Prozeß um eine Fermentation, insbesondere um die fermentative Herstellung eines gewerblich einsetzbaren Produkts, besonders bevorzugt um die Herstellung eines Proteins oder einer niedermolekularen chemischen Verbindung handelt.
48. Verwendung nach Anspruch 47, wobei es sich bei der niedermolekularen chemischen Verbindung um einen Naturstoff, einen Nahrungsmittelergänzungsstoff oder um eine pharmazeutisch relevante Verbindung handelt.
49. Verwendung nach Anspruch 47, wobei es sich bei dem Protein um ein Enzym handelt, insbesondere eines aus der Gruppe der α-Amylasen, Proteasen, Cellulasen, Lipasen, Oxidoreduktasen, Peroxidasen, Laccasen, Oxidasen und Hemicellulasen.
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