KR101919190B1

KR101919190B1 - 미생물의 ２ 단계 분석 방법

Info

Publication number: KR101919190B1
Application number: KR1020160051813A
Authority: KR
Inventors: 김수연; 전장우; 이흥국; 김진국
Original assignee: 하이트진로 주식회사
Priority date: 2016-04-27
Filing date: 2016-04-27
Publication date: 2018-11-15
Also published as: KR20170122610A

Abstract

본 발명은 멀티플렉스 PCR 및 실시간 PCR을 순차적으로 수행함으로써 핵산의 동시 분석 및 교차 분석을 통하여, 맥주 내 유해 미생물의 종류 및 함량을 측정하는 방법에 대한 것이다.

Description

미생물의 ２ 단계 분석 방법{2 STEP ANALYSIS METHOD OF MICROORGANISM}

본 발명은 식품 내 미생물을 신속하게 정량 분석하는 방법에 대한 것이다.

식품의 제조, 유통 및 판매와 관련하여, 식품 내 유입된 이물은 식품의 안전성을 위협할 뿐 아니라, 기업의 품질 신뢰도에 위해를 미치는 중요한 요소이다. 식품에 유입되는 이물에는 동물, 식물, 광물 등 여러 종류가 있는데, 예컨대, 한국등록특허 10-1316702호에는 식품에서 발견된 곤충 이물에 대하여 사멸일로부터의 경과일을 계산하는 방법이 개시되어 있다.

한편, 각 식품 관련 기업에서는 이물의 검출, 분석, 추적 및 관리에 중점을 두고 있는데, 이러한 이물의 처리는 신속하면서도 정확한 이물의 검출 및 분석을 필요로 한다. 그러나 미생물의 경우 낮은 농도로 오염되어, 그 핵산 함량이 적어 정성 및 정량 분석이 어렵거나, 어떠한 종류의 미생물인지 분석을 하는데 시간 및 비용이 상당히 소모되는 경우가 많은 문제점이 있다.

특히, 맥주 유해 미생물의 경우 형태 및 발생 특성이 유사하여 유전학적 동정 분석이 필요하며, 같은 속의 미생물들이 혼합되어 유입되는 경우, 염기 서열들이 유사하여 동정 분석이 어려운 경우가 많다.

이에 본 발명자들은 신속 정확한 맥주 내 미생물 검출 및 분석 방법을 연구하던 중, 맥주에서 발생이 빈번한 미생물들을 선별하고, 이들을 대상으로 특정 프라이머 쌍으로 멀티플렉스 PCR을 수행하여 미생물들의 종류를 동시에 분석하여 확인한 후, 확인된 미생물들을 특정 프라이머 쌍 및 프로브로 실시간 PCR을 이용하여 정량분석함으로써 교차 검증하는 방법을 발명하였다.

본 발명의 목적은 식품 내 미생물을 신속하게 정성 및 정량 분석하는 방법에 대한 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은,

시료를 준비하는 단계;

상기 시료로부터 핵산을 추출하는 단계;

젖산 박테리아의 유전자 특이적인 제1 프라이머를 이용하여, 상기 추출된 핵산에 대하여 멀티플렉스 PCR을 수행하여 핵산이 유래한 미생물의 종을 확인하는 단계; 및

상기 미생물의 종의 유전자에 특이적인 제2 프라이머 및 프로브를 이용하여 실시간 PCR을 수행하여 상기 미생물의 양을 확인하는 단계를 포함하는 시료 내 미생물의 분석 방법을 제공한다.

본 발명의 분석 방법은 시료 내 미생물의 종류 및 양을 빠른 시간 내에 정확히 분석할 수 있다.

도 1은 락토바실러스 미생물들에 대하여 프라이머 쌍들의 특이성을 확인한 결과이다.
도 2는 페디오코커스 미생물들에 대하여 프라이머 쌍들의 특이성을 확인한 결과이다.
도 3은 락토바실러스 미생물들의 DNA 혼합물 및 페디오코커스 미생물들의 DNA 혼합물에 대하여 각각 Multiplex PCR을 수행한 결과를 나타낸다(a: 락토바실러스 b: 페디오코커스).
도 4는 한 종류의 락토바실러스 미생물의 DNA만 존재하는 경우 멀티플렉스 PCR의 수행 결과를 나타낸다.
도 5는 여러 종류의 락토바실러스 미생물의 DNA만 존재하는 경우 멀티플렉스 PCR의 수행 결과를 나타낸다.
도 6은 한 종류의 페디오코커스 미생물의 DNA만 존재하는 경우 멀티플렉스 PCR의 수행 결과를 나타낸다.
도 7은 여러 종류의 페디오코커스 미생물의 DNA만 존재하는 경우 멀티플렉스 PCR의 수행 결과를 나타낸다.
도 8은 인위적으로 미생물 혼탁을 유발한 맥주에 대하여 Multiplex PCR을 수행한 결과를 나타낸다.
도 9 내지 도 16은 Real-Time PCR에 대하여 프라이머 쌍 및 프로브의 특이성을 확인한 결과를 나타낸다.
도 17 내지 도 32는 미생물에 대한 Real-Time PCR의 각 Standard Curve를 나타낸다.
도 33 내지 35는 실시예 5의 제조예 1 내지 3의 멀티플렉스 PCR의 수행 결과를 나타낸다.
도 36 내지 38은 실시예 5의 제조예 1 내지 3의 Real-Time PCR의 각 Standard Curve를 나타낸다.

본 발명은,

시료를 준비하는 단계;

상기 시료로부터 핵산을 추출하는 단계;

상기 미생물의 종의 유전자에 특이적인 제2 프라이머 및 프로브를 이용하여 실시간 PCR을 수행하여 상기 미생물의 양을 확인하는 단계를 포함하는 시료 내 미생물의 분석 방법에 대한 것이다.

이하, 본 발명을 자세히 설명한다.

시료

본 발명의 시료 내 미생물의 분석 방법은 시료를 준비하는 단계를 포함한다. 상기 시료는 식품이 바람직하다. 상기 식품은 사람 또는 동물이 섭취하거나 섭취할 수 있는 일반적인 식품이면 되고 특별히 제한되는 것은 아니다. 바람직하게는 상기 식품은 일반적으로 가공, 유통되는 식품이다. 예컨대 상기 식품은 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 음료수, 주류 등의 음료, 파우더 제제 및 비타민 복합제, 가공식품, 레토르트 식품, 건강기능식품, 건강보조식품, 인스턴트 식품 등이 될 수 있으며, 바람직하게는 맥주, 소주, 와인, 과실주, 발효주, 막걸리, 동동주 등의 주류 등이 될 수 있고, 더욱 바람직하게는 맥주, 소주 등의 주류이며, 가장 바람직하게는 맥주이다.

핵산 추출 단계

본 발명의 시료 내 미생물의 분석 방법은 시료로부터 핵산을 추출하는 단계를 포함한다. 상기 핵산은 DNA 또는 RNA이며, 바람직하게는 gDNA이다. 핵산의 추출 방법은 특별히 제한되지 않는다. 즉, 당업자는 당업계에 공지된 방법들을 적절히 선택하여 핵산을 추출할 수 있다.

미생물의 종 확인 단계

본 발명의 시료 내 미생물의 분석 방법은 젖산 박테리아의 유전자 특이적인 제1 프라이머를 이용하여, 상기 추출된 핵산에 대하여 멀티플렉스 PCR을 수행하여 핵산이 유래한 미생물의 종을 확인하는 단계를 포함한다. 이로써 시료 내 여러 종류의 미생물들이 존재하더라도 한 번의 멀티플렉스 PCR로 미생물의 종을 확인할 수 있다.

상기 젖산 박테리아는 락토바실러스 및 페디오코커스 군으로부터 선택되는 어느 하나 또는 둘 다이다. 바람직하게는 상기 젖산 박테리아는 락토바실러스 린드네리(L. lindneri), 락토바실러스 카제이(L. casei), 락토바실러스 브레비스(L. brevis), 락토바실러스 플란타룸(L. plantarum), 락토바실러스 코리니포르미스(L. coryniformis), 페디오코커스 담노서스(P. damnosus), 페디오코커스 클라우세니(P. claussenii), 페디오코커스 이노피나투스(P. inopinatus)로부터 선택되는 하나 이상이다. 맥주에서 발견되는 미생물들의 대부분, 즉, 70 % 이상이 상기 8개 종에 속하기 때문에, 상기 8 종의 미생물에 해당하는지 여부를 확인하는 것이 효율적이다.

상기 제1 프라이머는 각 종에 특이적인 프라이머인 것이 바람직하며, 종 별로 상동성이 낮은 유전자에 대하여 특이적인 프라이머인 것이 더욱 바람직하다. 한층 더 바람직하게는 락토바실러스 린드네리(L. lindneri)의 pheS 유전자, 락토바실러스 카제이(L. casei)의 trxB 유전자, 락토바실러스 브레비스(L. brevis)의 abf2 유전자, 락토바실러스 플란타룸(L. plantarum)의 luxS 유전자, 락토바실러스 코리니포르미스(L. coryniformis)의 hsp60 유전자, 페디오코커스 담노서스(P. damnosus)의 leuS 유전자, 페디오코커스 클라우세니(P. claussenii)의 pheS 유전자 또는 페디오코커스 이노피나투스(P. inopinatus)의 atpA 유전자에 대하여 특이적이어서, 이들 유전자들을 증폭시킬 수 있는 프라이머이다. 상기 제1 프라이머는 서열번호 1 내지 16로 구성되는 군으로부터 선택되는 프라이머를 포함할 수 있으며, 바람직하게는 하기 (a) 내지 (h)로부터 선택되는 프라이머 쌍을 포함한다:

(a) 서열번호 1 및 2의 프라이머 쌍

(b) 서열번호 3 및 4의 프라이머 쌍

(c) 서열번호 5 및 6의 프라이머 쌍

(d) 서열번호 7 및 8의 프라이머 쌍

(e) 서열번호 9 및 10의 프라이머 쌍

(f) 서열번호 11 및 12의 프라이머 쌍

(g) 서열번호 13 및 14의 프라이머 쌍

(h) 서열번호 15 및 16의 프라이머 쌍.

상기 제1 프라이머는 락토바실러스 속에 특이적인 프라이머 쌍 또는 페디오코커스 속에 특이적인 프라이머 쌍을 포함하는 것이 바람직하다. 이는, 락토바실러스 속과 페디오코커스 속의 유전자 구조가 매우 유사하기 때문에 이들 두 속을 구별하기 위한 마커로써 사용된다. 예컨대, 페디오코커스 담노서스, 페디오코커스 클라우세니 및 페디오코커스 이노피나투스 모두에 특이적인 pheS 유전자를 증폭시킬 수 있는 프라이머를 마커로써 포함할 수 있는데, 상기 마커로는 서열번호 17 및 18로 구성되는 프라이머 쌍을 이용할 수 있다.

즉, 상기 제1 프라이머는,

1) 종 별로 상동성이 낮은 유전자에 대하여 특이적인 프라이머 쌍, 및

2) 락토바실러스 속에 특이적인 프라이머 쌍 또는 페디오코커스 속에 특이적인 프라이머 쌍

을 포함하는 것이 바람직하다.

이 때, 1)의 종 별로 상동성이 낮은 유전자에 대하여 특이적인 프라이머 쌍 은 예컨대, 서열번호 1 내지 16의 프라이머들로부터 선택되는 프라이머 쌍이 될 수 있다. 또한 2) 락토바실러스 속에 특이적인 프라이머 쌍 또는 페디오코커스 속에 특이적인 프라이머 쌍은 예컨대, 서열번호 17 또는 18의 프라이머들로부터 선택되는 프라이머 쌍이 될 수 있다. 그러므로 상기 제1 프라이머는 둘 이상의 프라이머 쌍을 포함하는 것이 미생물의 종 및 속을 구별하는데 유리하다.

상기 멀티플렉스 PCR은 상기 프라이머 쌍들을 사용하여 수행한다. 상기 멀티플렉스 PCR을 통하여 시료 내 미생물이 락토바실러스 린드네리(L. lindneri), 락토바실러스 카제이(L. casei), 락토바실러스 브레비스(L. brevis), 락토바실러스 플란타룸(L. plantarum), 락토바실러스 코리니포르미스(L. coryniformis), 페디오코커스 담노서스(P. damnosus), 페디오코커스 클라우세니(P. claussenii), 페디오코커스 이노피나투스(P. inopinatus)로부터 선택되는 미생물인지 여부를 한 번에 확인할 수 있다.

미생물의 양 확인 단계

본 발명의 시료 내 미생물의 분석 방법은 상기 미생물의 종의 유전자에 특이적인 제2 프라이머 및 프로브를 이용하여 실시간 PCR을 수행하여 상기 미생물의 양을 확인하는 단계를 포함한다.

시료 내 미생물의 양을 확인함으로써 이들 미생물들이 시료에 미치는 영향, 예컨대 시료가 맥주인 경우 맥주의 pH 변화, 맥주의 변질 등에 미치는 영향을 평가할 수 있다. 또한 시료 내 미생물의 양을 확인함으로써 미생물의 유입(즉, 시료 내 발생) 시기 및 유입 지점을 추정할 수 있어, 미생물에 의한 오염이 발생 시 그 원인을 파악하고 해결함에 있어 신속한 처리가 가능하다.

상기 실시간 PCR은 제2 프라이머 및 프로브를 이용하여 수행한다. 상기 제2 프라이머는 각 종에 특이적인 프라이머인 것이 바람직하며, 종 별로 상동성이 낮은 유전자에 대하여 특이적인 프라이머인 것이 더욱 바람직하다. 한층 더 바람직하게는 락토바실러스 린드네리(L. lindneri)의 pheS 유전자, 락토바실러스 카제이(L. casei)의 trxB 유전자, 락토바실러스 브레비스(L. brevis)의 abf2 유전자, 락토바실러스 플란타룸(L. plantarum)의 luxS 유전자, 락토바실러스 코리니포르미스(L. coryniformis)의 hsp60 유전자, 페디오코커스 담노서스(P. damnosus)의 leuS 유전자, 페디오코커스 클라우세니(P. claussenii)의 pheS 유전자 또는 페디오코커스 이노피나투스(P. inopinatus)의 atpA 유전자에 대하여 특이적이어서, 이들 유전자들을 증폭시킬 수 있는 프라이머이다.

상기 프로브는 함께 사용하는 제2프라이머와의 GC 결합이 40 내지 60% 가 되는 것이 결합력 측면에서 유리하며, 바람직하게는 제2프라이머와의 GC 결합이 50 내지 60% 이다. 상기 프로브의 길이는 15 내지 30 bp이며, 바람직하게는 18 내지 28 bp이다. 프로브의 길이가 15 bp 미만인 경우 프로브와 타겟 유전자 간 상보적으로 결합하는 결합(bond)들의 수가 너무 적어져 결합력이 낮아지며, 짧은 염기서열은 비특정 부위에 잘못 결합할 확률이 높아, 오결합으로 인한 과다 정량이 이루어져 정확도가 낮아질 수 있다. 또한 프로브의 길이가 30 bp를 초과하는 경우 결합력은 증가하나 상보적 결합의 수가 너무 증가하여 결합 효율이 낮아져 미결합에 의한 미정량이 일어나, 정량성이 낮아질 수 있다.

바람직하게는 상기 제2 프라이머 및 프로브는 하기 (a) 내지 (h)로부터 선택되는 프라이머 쌍 및 프로브를 포함한다:

(a) 서열번호 19 및 20의 프라이머 쌍 및 서열번호 21의 프로브

(b) 서열번호 22 및 23의 프라이머 쌍 및 서열번호 24의 프로브

(c) 서열번호 25 및 26의 프라이머 쌍 및 서열번호 27의 프로브

(d) 서열번호 28 및 29의 프라이머 쌍 및 서열번호 30의 프로브

(e) 서열번호 31 및 32의 프라이머 쌍 및 서열번호 33의 프로브

(f) 서열번호 34 및 35의 프라이머 쌍 및 서열번호 36의 프로브

(g) 서열번호 37 및 38의 프라이머 쌍 및 서열번호 39의 프로브

(h) 서열번호 40 및 41의 프라이머 쌍 및 서열번호 42의 프로브.

본 발명의 미생물의 분석 방법

본 발명의 시료 내 미생물의 분석 방법은 멀티플렉스 PCR을 통하여 시료 내 존재하는 미생물의 종류를 한 번에 확인한 후, 실시간 PCR을 이용하여 확인된 미생물의 양을 분석하는 2 단계 분석 방법이다. 본 발명의 방법을 이용하여, 시료 내 미생물의 종류 및 양을 신속하면서도 높은 정확성으로 분석하는 것이 가능하다.

<재료 및 방법>

DNA의 추출 및 정량

모든 미생물의 genomic DNA는 BioFACT™ Genomic DNA Prep Kit (biofact, Korea)를 이용하여 추출하였으며, 추출방법은 제조사에서 제공한 실험방법과 동일한 방법을 사용하였다. 추출 전 미생물은 MRS Broth에서 배양하였으며, 혼탁이 유발 된 맥주 샘플의 경우에는 원심분리 하여 침전물에서 바로 genomic DNA를 추출하여 본 연구에 적용이 가능하였다. 혼탁이 발생하지 않은 맥주 샘플의 경우에는 맥주 100 ml를 0.25 μm filter에 여과 한 후 여과지를 MRS Broth에 첨가하여 미생물을 24시간 배양하여 genomic DNA를 추출하였다. 최종적으로 추출 column 내 silica gel membrane에 증류수를 첨가하고 centrifuge (Micro17TR, Hanil science, Korea)를 이용하여 13,000×g로 원심 분리함으로써, 추출 column 내의 silica gel membrane에 결합된 genomic DNA를 분리하였다.

DNA의 정량은 NanoVue™ Plus Spectrophotometer (GE healthcare, England)를 이용하여 농도를 측정함으로써 수행하였다.

<실시예 1> 맥주 오염을 유발하는 유해 미생물 선정

전 세계적으로 맥주 오염을 유발하는 70% 이상의 미생물은 LAB(Lactic Acid Bacteria)로 알려져 있는데, 이들은 알코올 존재 시, 낮은 pH와 혐기 조건에서도 생육이 가능하며 hop 내성 유전자를 대부분 가지므로 발효 공정부터 병입 공정까지 가장 광범위하게 오염을 유발한다. 그러므로 이를 고려하여, 하기 표 1과 같은 맥주 오염을 가장 빈번하게 유발하는 대표적인 유해 미생물들을 8종 선정하였다.

상기 8종의 미생물들은 모두 한국생명공학연구원 미생물자원센터로부터 분양 받았다(표 2). 분양 받은 미생물들을 30 ℃ 혐기 조건에서 약 3 내지 5일간 MRS Agar plate에서 배양하고, 그 후 single colony isolation을 거쳐 MRS broth배지에서 증량 배양하여 하기 실험들에 사용하였다. 그리고 상기 미생물 8종에 대하여 NCBI(National Center for Biotechnology Information) gene bank data를 토대로 각 미생물 마다 특이적인 유전자 정보를 확보 하여, 이를 프라이머 쌍들 및 프로브들의 타겟 유전자로 사용하였다.

또한 이하, 본 명세서에서 사용하는 약어는 하기와 같다: LL: L. lindneri, LB: L. brevis, LC: L. casei, LP: L. plantarum, LCo: L. coryniformis, PC: P. claussenii, PD: P. damnosus, PI: P. inopinatus, PU: Pediococcus universal primer.

<실시예 2> 프라이머 및 프로브의 제작

상기 8종의 미생물들의 검출을 위하여 NCBI(National Center for Biotechnology Information)에 등록 된 염기서열 정보를 토대로 프라이머들 및 프로브들을 제작하였다. 본 발명의 프라이머들은 hair-pin, loop, dimer 등의 현상이 없으며 GC contents는 45-60% 사이이다. 또한 본 발명의 Forward 및 reverse primer 쌍은 모두 20-mer의 oligonucleotide로 구성되도록 제작하여 450bp 미만, 바람직하게는 100 bp 이상 450 bp 미만의 비교적 짧은 증폭 산물을 얻을 수 있는데, 이로써 맥주에 혼입 된 미생물의 DNA가 분해되었더라도 정확한 target에 primer가 결합되어 쉽게 증폭시키는 것이 가능하다.

구체적인 프라이머들 및 프로브들의 특성은 하기 표 3 및 표 4와 같다. 이를 살펴보면, 우선 락토바실러스 5종에 특이적인 primer 5쌍과 페디오코커스 3종에 특이적인 primer 3쌍을 제작하였다. 그리고 추가적으로 페디오코커스 속에 특이적인 primer 1쌍(pediococcus universal)을 제작하였는데, 이는 락토바실러스와 페디오코커스의 유전자 구조가 매우 유사하기 때문에 두 종류의 미생물을 구분할 수 있는 marker로써 페디오코커스 속에만 결합하여 PCR 증폭 산물을 생성하기 위한 프라이머이다.

Multiplex PCR의 경우 primer 간의 상호 경쟁으로 인하여 발현되는 증폭산물의 양이 다르므로 하기 표 3과 같이 primer 농도를 모두 다르게 사용하였고, Real-Time PCR의 경우에는 primer 및 probe 모두 동일하게 10 pM/μl 를 사용하여 PCR을 진행하였다. Real-Time PCR primer의 경우 특이성을 높이기 위해 증폭산물의 길이를 약 100 내지 150 bp 이내가 되도록 Primer design program을 이용하여 제작하였다. 또한 Real-Time PCR을 위해 증폭산물의 시작점인 forward primer와 종점인 reverse primer 사이가 약 20 내지 25 bp 가량인 probe를 제작하였다. Primer와 probe의 GC 결합은 50 내지 60% 사이로 제작하여 결합력을 높였다(표 4). 타겟 유전자들의 서열은 표 5와 같다.

Multiplex PCR 프라이머 서열 및 사용 농도

Real-Time PCR 프라이머 및 프로브

<실시예 3> Multiplex PCR 수행

<3-1> Multiplex PCR 수행 조건

상기 표 3의 프라이머 쌍들을 이용하여 멀티플렉스 PCR을 수행하였다. 프라이머 수가 너무 많아지면 프라이머들끼리 서로 경쟁적으로 작용하여 증폭 효율이 떨어지고, primer끼리 dimer를 형성하거나 서로 다른 target의 primer가 잘못 작용하여 비 특이적인 증폭산물을 생성하는 등의 오차가 발생되어 실험의 정확성이 낮아지기 때문에, 본 실험에서는 락토바실러스와 페디오코커스 multiplex PCR로 나누어 수행하였다.

PCR은 T-Gradient thermoblock (Biometra, German) 장비로 수행하였다. Multiplex PCR 조건은 pre-incubation을 94 ℃에서 5분간 진행하고 난 후 denaturation을 94℃ 에서 30초, annealing을 60 ℃에서 30초, extension을 72℃ 에서 30초씩 각각 진행하여 총 40cycles 반복하였다. 그리고 마지막으로 terminal elongation을 72 ℃에서 10분 동안 진행하였다. Template DNA는 50ng/μl가 되도록 정량하여 사용하였으며, PCR에 필요한 Mixture는 Tap polymerase, dNTP, MgCl2, 및 전기영동 시 필요한 loading dye가 모두 혼합되어 있는 SolGent사의 2× Multiplex PCR Pre-Mix(Solgent, Korea) 제품을 사용하였다.

PCR 증폭결과는 전기영동을 통하여 확인하였다. 전기영동 장비는 Mupid-21(Cosmo bio, Japan)을 사용하였으며, 3% agarose gel에 100V로 약 30분간 전기영동 하여 결과를 확인하였다.

<3-2> 프라이머의 특이성 확인

프라이머 특이성이란, 특정 target에만 primer가 결합하여 PCR 증폭 산물을 생성하는 것이다. 본 실험에서는 특정 미생물 종에 대해서만 프라이머가 증폭 산물을 생성하여, 프라이머 설계 시 타겟으로 한 유전자의 증폭 산물과 동일한 크기의 증폭 산물을 생산하는 경우를 프라이머의 특이성이 있다고 판단하였다. 참고로, 본 발명의 multiplex PCR 실험에서는 PCR 증폭 산물의 size를 미생물 종마다 다르게 제작하였기 때문에 증폭산물의 전기영동결과에서 size에 따라 미생물 종의 구분이 가능하다.

락토바실러스에 대한 프라이머의 특이성 확인

각 레인 별로 서로 다른 종류의 락토바실러스 미생물들을 걸고 서열번호 1 내지 10의 프라이머 쌍들을 처리하여 PCR을 수행한 결과, i) 타겟 유전자에서 디자인한 사이즈와 동일한 사이즈의 증폭산물이, ii) 해당 미생물의 타겟 유전자에서만 증폭을 했는지 여부를 확인하여 타겟 특이성을 확인하였다. 그러므로 본 발명의 프라이머들은 락토바실러스에 대하여 특이성을 갖는 것으로 확인되었다(도 1, Lane M: 100 bp DNA ladder, Lane 1 : 락토바실러스 브레비스, Lane 2 : 락토바실러스 카제이, Lane 3 : 락토바실러스 코리니포르미스, Lane 4 : 락토바실러스 린드네리, Lane 5 : 락토바실러스 플란타룸, Lane N : 음성 대조군).

이를 구체적으로 살펴보면, 도 1 (a)는 락토바실러스 브레비스로, 타겟은 abf2 유전자이다. 멀티플렉스 PCR의 결과, 197bp의 증폭 산물 생성하였는바, 락토바실러스 브레비스에서 특이성이 있는 것이 확인되었다. 도 1 (b)는 락토바실러스 카제이로 타겟은 trxB 유전자이며, 240bp의 증폭 산물 생성하였는바, 락토바실러스 카제이에서 특이성이 확인되었다. 도 1 (c)는 락토바실러스 코리니포르미스로 타겟은 hsp60 유전자이며, 441bp의 증폭 산물을 생성하였는바 락토바실러스 코리니포르미스 에서 특이성이 확인되었다. 도 1 (d)는 락토바실러스 린드네리로 타겟은 pheS 유전자이며, 120bp의 증폭 산물을 생성하였는바, 락토바실러스 린드네리 에서 특이성이 확인되었다. 도 1 (e) 는 락토바실러스 플란타룸으로 타겟은 luxS 유전자로, 310bp의 증폭 산물을 생성하였는바, 락토바실러스 플란타룸 에서 특이성이 확인되었다.

페디오코커스에 대한 프라이머의 특이성 확인

각 레인 별로 서로 다른 종류의 페디오코커스(Pediococcus) 미생물들을 걸고 서열번호 11 내지 16의 프라이머 쌍들을 처리하여 PCR을 수행한 결과, i) 타겟 유전자에서 디자인한 사이즈와 동일한 사이즈의 증폭산물이, ii) 해당 미생물의 타겟 유전자에서만 증폭을 했는지 여부를 확인하여 타겟 특이성을 확인하였다. 또한 비 타겟 유전자에서는 증폭산물을 생성하지 않았다. 그러므로 본 발명의 프라이머들은 페디오코커스에 대하여 특이성을 갖는 것으로 확인되었다(도 2 (a) 내지 (c), Lane M: 100 bp DNA ladder, Lane 1: 페디오코커스 클라우세니, Lane 2: 페디오코커스 담노서스, Lane 3: 페디오코커스 이노피나투스, Lane N: Negative Control)

이를 구체적으로 살펴보면, 도 2 (a)는 페디오코커스 클라우세니로, 타겟은 pheS 유전자이며, 191 bp의 증폭 산물을 생성하였는바, 페디오코커스 클라우세니에서 특이성이 확인되었다. 도 2 (b)는 페디오코커스 담노서스로 타겟은 leuS 유전자이며, 121 bp의 증폭 산물을 생성하였는바, 페디오코커스 담노서스에서 특이성이 확인되었다. 도 2 (c)는 페디오코커스 이노피나투스로 타겟은 atpA 유전자이며, 305 bp의 증폭 산물이 생성되었는바, 페디오코커스 이노피나투스 에서 특이성이 확인되었다.

한편, 상기 <실시예 2>에서 락토바실러스와 페디오코커스의 구분 마커로 페디오코커스 속에 특이적인 프라이머쌍(pediococcus universal)을 제작하였는데(서열번호 17 및 18), 이를 이용하여 락토바실러스 속 및 페디오코커스 속 모두에 대하여 멀티플렉스 PCR을 수행하였다.

그 결과, pheS 유전자를 타겟으로 하여 페디오코커스 속에서만 157 bp의 증폭 산물이 생성되었는바, 락토바실러스와 페디오코커스를 구별하는 마커로 이용가능한 것이 확인되었다(도 2 (d), Lane M : 100 bp DNA ladder, Lane 1 : 락토바실러스 브레비스, Lane 2 : 락토바실러스 카제이, Lane 3 : 락토바실러스 코리니포르미스, Lane 4 : 락토바실러스 린드네리, Lane 5 : 락토바실러스 플란타룸, Lane 6: 페디오코커스 클라우세니, Lane 7: 페디오코커스 담노서스, Lane 8: 페디오코커스 이노피나투스, Lane N: Negative Control).

<3-3> 유해 미생물 혼합물에 대한 멀티플렉스 PCR

표 2의 5 종류의 락토바실러스 미생물들의 genomic DNA들을 추출하여 농도를 측정한 후, 이들을 동일한 농도로(50 ng/ul)로 혼합하여 락토바실러스 양성 대조군(Lactobacillus positive control)을 제조하였다. 그리고 여기에 서열번호 1 내지 10의 프라이머 쌍들을 이용하여 표 3의 사용 농도로 멀티플렉스 PCR을 진행하였다.

또한 표 2의 3 종류의 페디오코커스 미생물들의 genomic DNA들을 추출하여 농도를 측정한 후, 이들을 동일한 농도로(50 ng/ul)로 혼합하여 페디오코커스 양성 대조군(pediococcus positive control)을 제조하였다. 그리고 여기에 서열번호 11 내지 18의 프라이머 쌍들을 이용하여 표 3의 사용 농도로 멀티플렉스 PCR을 진행하였다.

그 결과, 락토바실러스 5 종과 페디오코커스 3 종에 대하여 서로 다른 크기의 증폭산물들이 비슷한 감도로 한 번에 증폭되는 것이 확인되었다(도 3 (a) 락토바실러스의 멀티플렉스 PCR 결과, (b) 페디오코커스의 멀티플렉스 PCR 결과).

<3-4> 무작위로 혼합된 유해 미생물 혼합물에 대한 멀티플렉스 PCR

<3-4-1> 한 종류의 락토바실러스 미생물의 DNA만 존재하는 경우

먼저, 서열번호 1 내지 10의 프라이머 쌍들을 표 2의 5 종류의 락토바실러스 미생물들 각각에 처리하여 멀티플렉스 PCR을 수행하였다. 그 결과, 프라이머 쌍들을 제작 시 의도한 크기(size)로 표적의 증폭 산물들이 확인되었다. 그러므로 각각의 다른 크기의 증폭 산물들을 확인함으로써 어떠한 미생물 종인지 검출이 가능하였다(도 4, Lane M : 100 bp DNA ladder, Lane 1 : 락토바실러스 브레비스, Lane 2 : 락토바실러스 카제이, Lane 3 : 락토바실러스 코리니포르미스, Lane 4 : 락토바실러스 린드네리,).

<3-4-2> 복수 종류의 락토바실러스 미생물의 DNA가 존재하는 경우

표 2의 5 종류의 락토바실러스 미생물들의 DNA들을 하기 표 6과 같이 혼합하고, 이들에 대하여 멀티플렉스 PCR을 수행하였다. 이 때, 서열번호 1 내지 10의 프라이머 쌍들을 이용하였다.

그 결과, 혼합되는 미생물의 종류가 늘어날수록 타겟의 증폭 산물들이 하나씩 증가하였으며, DNA들이 혼합되어 있어도 어떠한 미생물의 DNA가 존재하는지 구분할 수 있었다(도 5).

<3-4-3> 한 종류의 페디오코커스 미생물의 DNA만 존재하는 경우

먼저, 서열번호 11 내지 18의 프라이머 쌍들을 표 2의 3 종류의 페디오코커스 미생물들 각각에 처리하여 멀티플렉스 PCR을 수행하였다. 그 결과, 프라이머 쌍들을 제작 시 의도한 크기(size)로 표적의 증폭 산물들이 확인되었다. 그러므로 각각의 다른 크기의 증폭 산물들을 확인함으로써 어떠한 미생물 종인지 검출이 가능하였다(도 6, Lane M: 100 bp DNA ladder, Lane 1: 페디오코커스 담노서스, Lane 2: 페디오코커스 클라우세니, Lane 3: 페디오코커스 이노피나투스, Lane N: Negative Control)

<3-4-4> 복수 종류의 페디오코커스 미생물의 DNA가 존재하는 경우

표 2의 3 종류의 페디오코커스 미생물들의 DNA들을 하기 표 7과 같이 혼합하고, 이들에 대하여 멀티플렉스 PCR을 수행하였다. 이 때, 서열번호 11 내지 18의 프라이머 쌍들을 이용하였다.

그 결과, 혼합되는 미생물의 종류가 늘어날수록 타겟의 증폭 산물들이 하나씩 증가하였으며, DNA들이 혼합되어 있어도 어떠한 미생물의 DNA가 존재하는지 구분할 수 있었다(도 7).

<3-4-5> 인위적인 미생물 오염에 의한 혼탁 발생 맥주의 분석

상기 표 2의 8 종의 미생물들을 각각 broth 배양하여 배양액을 제조하였다. 상기 배양액 1 ml을 맥주 50 ml에 첨가한 후 36시간 동안 배양하여 혼탁을 유발하였다. 그리고 혼탁 침전물을 수득하여 여기에서 DNA를 추출 한 후 Multiplex PCR을 적용하여 분석하였다. 추출한 8종의 DNA를 모두 락토바실러스 멀티플렉스 PCR과 페디오코커스 멀티플렉스 PCR에 적용하였다. 또한 5종의 락토바실러스 미생물들의 DNA들을 모두 첨가한 락토바실러스 양성 대조군(Lactobacillus Positive) 및 3종의 페디오코커스 양성 대조군(Pediococcus Positive)를 제조하여, 이것들 역시 락토바실러스 멀티플렉스 PCR과 페디오코커스 멀티플렉스 PCR을 수행하였다. 이 때, 서열번호 1 내지 18의 프라이머 쌍들을 모두 첨가하여 멀티플렉스 PCR을 수행하였다.

그 결과, 타겟인 미생물 유전자와 특정 프라이머가 특이적으로 결합하여 고유의 특이적인 증폭 산물을 형성하는 것이 확인되었다. 또한 락토바실러스 양성 대조군 및 페디오코커스 양성 대조군의 멀티플렉스 PCR 결과, 8종의 미생물들 모두가 동시에 분석이 가능한 것을 알 수 있었다(도 8, Lane M : 100 bp DNA ladder, Lane LP : Lactobacillus positive, Lane PP : Pediococcus positive, Lane 1 : 락토바실러스 브레비스, Lane 2 : 락토바실러스 카제이, Lane 3 : 락토바실러스 코리니포르미스, Lane 4 : 락토바실러스 린드네리, Lane 5 : 락토바실러스 플란타룸, Lane 6: 페디오코커스 클라우세니, Lane 7: 페디오코커스 담노서스, Lane 8: 페디오코커스 이노피나투스, Lane N: Negative Control).

<실시예 4> Real-Time PCR 수행

<4-1> Real-Time PCR 프라이머 및 프로브의 특이성 확인

표 4의 실시간(Real-Time) PCR의 프라이머 및 프로브들을 이용하여, 일반적인 PCR을 수행하여 제작한 크기의 증폭산물을 형성하는지, 타겟 유전자에서만 증폭산물을 형성하는 지의 결과를 확인하여 프라이머의 특이성을 확인하였다. 그리고 여기에 프로브로 추가로 첨가하여 Real-Time PCR을 수행하고, 타겟 유전자에서만 증폭 곡선을 형성하는지 여부를 통하여 프로브의 특이성을 확인하였다. 또한 반복실험을 통해 분석법의 재현성을 검증하였다.

특이성이란, 타겟(target) DNA에 해당하는 미생물에서만 유전자를 증폭시켜 발생되는 형광에 의해 증폭곡선을 나타내는 것이다. Real-Time PCR의 경우 PCR을 위한 혼합물에 프라이머 한 쌍과 해당 프로브를 첨가하는 반응으로 증폭곡선이 형성되는 것은 타겟 미생물이라는 것을 의미하며, 타겟 미생물이 아닐 경우 증폭곡선을 형성하지 않는다.

그 결과, 표 4의 8종의 프라이머 쌍들 및 프로브들 모두 각각 특이적인 미생물에서 해당하는 target에서만 증폭곡선을 나타내었으므로 특이성이 있는 것으로 확인되었다(도 9 내지 16).

<4-2> Real-Time PCR 검출한계 확인 및 Standard curve 작성

각 미생물 별로 추출한 DNA를 serial dilution하여 DNA 농도를 100, 50, 10, 5, 1, 0.5, 0.1, 0.05, 0.01, 0.005, 0.001ng/μl까지 희석하여 Real-Time PCR을 진행한 후 Cp value로 standard curve를 작성하였다.

그 결과, 실시간 PCR에 의하여 0.001 ng/μl의 극미량 농도까지 분석이 가능한 것이 확인되었다. 그러므로 맥주 내에 유해 미생물이 아주 소량 혼입되어 있을 시에도 DNA 추출을 통하여, 본 발명의 프라이머들을 이용한 실시간 PCR을 수행함으로써 미생물의 정성이 가능할 것으로 판단되었다. 또한 Standard curve를 통하여 혼입된 미생물의 DNA양 또한 정량이 가능하였다(도 17 내지 도 32). 이 때, 분석법의 오차율은 0.1% 미만으로 확인되었는바, 오차율 결과를 통해 분석법의 신뢰도가 높음을 알 수 있었다.

Real-Time PCR은 Roche 사의 LC480(Roche, Switzerland) 장비를 이용하여 진행하였다. Real-Time PCR 조건은 initial denaturation을 50℃ 2분 및 95℃ 10분간 진행하고 난 후 amplification을 95℃ 15초 및 61℃ 40초로 총 50cycles 반복하여 수행하였다. 결과의 확인은 LC480 program을 이용하여 쉽게 확인이 가능하다.

<실시예 5> 멀티플렉스 PCR 및 Real-Time PCR의 순차적 분석

특정 락토바실러스와 페디오코커스들을 각각 MRS broth 배지에 배양하여 배양액을 제조하였다. 제조예 1에는 락토바실러스 브레비스와 락토바실러스 카제이 및 페디오코커스 클라우세니의 배양액들을 혼합하였고, 제조예 2에는 락토바실러스 카제이와 락토바실러스 코리니포르미스 및 락토바실러스 플란타룸의 배양액을 혼합하였으며 제조예 3에는 락토바실러스 브레비스, 락토바실러스 카제이 락토바실러스 코리니포르미스, 락토바실러스 린드네리 및 페디오코커스 담노서스와 페디오코커스 이노피나투스의 배양액들을 동량으로 혼합한 후 혼합된 배양액들(제조예 1 내지 3) 100㎕를 각각 500㎖ 일반맥주에 첨가한 후 병을 타전하여 24시간 동안 상온에 방치하였다. 24시간 후 맥주를 0.45㎛ 필터로 여과하였다. 그리고 여과된 필터를 MRS broth 배지에 다시 배양한 후 배양 된 배지를 원심분리하여 침전물에서 DNA를 추출 한 후 멀티플렉스 PCR 및 실시간 PCR을 적용하여 분석하였다. 이 때, 멀티플렉스 PCR에는 서열번호 1 내지 18의 프라이머 쌍들을 모두 첨가하여 멀티플렉스 PCR을 수행하였다.

그 결과, 모두 첨가한 미생물에 대한 유전자만 존재하는 것을 확인하여 실험의 정확성을 확인하였다(도 33: 제조예 1, 도 34: 제조예 2, 도 35: 제조예 3).

그 후, 서열번호 19 내지 42의 프라이머 쌍들 및 프로브들을 모두 이용하여 실시간 PCR을 수행하여 각 미생물들의 DNA 양을 정량 분석하였다.

그 결과, 시료에 첨가 된 미생물의 증폭산물 및 증폭곡선만을 확인하였고, 시료 내에는 미생물들이 극미량 포함되어 있음에도 불구하고, 정확하게 정성분석 및 정량분석이 된 것으로 확인되었다(도 36: 제조예 1, 도 37: 제조예 2, 도 38: 제조예 3). 구체적인 정량결과는 하기 <표 8>과 같다.

CP^*:crossing point로 반응을 일으키는 최소의 역가 (Threshold)와 증폭 곡선의 교차점. PCR 시 사이클 반복(n)에 따라 2ⁿ으로 유전자가 증가하게 되어, 유전자가 기하급수적으로 증가되는 시점의 사이클 수를 나타낸다.

<110> HITEJINRO <120> 2 STEP ANALYSIS METHOD OF MICROORGANISM <130> DNP160049 <160> 52 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward Primer for pheS of L. lindneri <400> 1 aggttcgtgt tcgtcctagt 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse Primer for pheS of L. lindneri <400> 2 cttcaatcca accggatcct 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward Primer for trxB of LCtrxB <400> 3 tgctggatcg cggcgtctat 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse Primer for trxB of L. casei <400> 4 cgcctgtcgc aatgacaatc 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward Primer for abf2 of L. brevis <400> 5 cgtaccgctc attcgctatc 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse Primer for abf2 of L. brevis <400> 6 ttctggcgac gaagatcact 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward Primer for LuxS of L. plantarum <400> 7 ttacggtgga aaatgggcct 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse Primer for LuxS of L. plantarum <400> 8 ccacagctat cgatggtcgt 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward Primer for hsp60 of L. coryniformis <400> 9 gaacgtcact gccggtgcta 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse Primer for hsp60 of L. coryniformis <400> 10 tcgtcggcga tgatcaacaa 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward Primer for leuS of P. damnosus <400> 11 caatggatgc ttaagattac 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse Primer for leuS of P. damnosus <400> 12 cgttgaacgg ccaatccagt 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward Primer for pheS of P. claussenii <400> 13 tcgacgtgat acggatgatg 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse Primer for pheS of P. claussenii <400> 14 cttcaactga tggttcagta 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward Primer for atpA of P. inopinatus <400> 15 ccagttggtg acgccttagt 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse Primer for atpA of P. inopinatus <400> 16 ccgatcgcca catagataca 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward Primer for pheS of Pediococcus <400> 17 tcgacgtgat acggatgatg 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse Primer for pheS of Pediococcus <400> 18 tggacgaaga cgtacttcaa 20 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward Primer for Real-Time PCR of pheS of L. lindneri <400> 19 aggttcgtgt tcgtcctagt 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse Primer for Real-Time PCR of pheS of L. lindneri <400> 20 ccttcacagt tcatgcaagt 20 <210> 21 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for Real-Time PCR of pheS of L. lindneri <400> 21 accgaacctt cagtagaagc agatg 25 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for Real-Time PCR of trxB of L. casei <400> 22 cctatggcaa tgtcgttagc 20 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for Real-Time PCR of trxB of L. casei <400> 23 cgcctgtcgc aatgacaatc 20 <210> 24 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for Real-Time PCR of trxB of L. casei <400> 24 aactgacgag gatgagtacg aggct 25 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for Real-Time PCR of abf2 of L. brevis <400> 25 tccggttgga cttggcttgg 20 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for Real-Time PCR of abf2 of L. brevis <400> 26 cgagattgac ggccatattg 20 <210> 27 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for Real-Time PCR of abf2 of L. brevis <400> 27 cttggcttgg cgggaactcg aaacc 25 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for Real-Time PCR of luxS of L. plantarum <400> 28 atggatggcg tgattgactg 20 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for Real-Time PCR of luxS of L. plantarum <400> 29 ttcaatgcct tagcaacttc 20 <210> 30 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for Real-Time PCR of luxS of L. plantarum <400> 30 tcatttgatt acctggggtg aacat 25 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for Real-Time PCR of 16S rRNA of L. coryniformis <400> 31 gcggctgtct ggtctgtaac 20 <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for Real-Time PCR of 16S rRNA of L. coryniformis <400> 32 ttgcgtaatt cgtaaggcgg 20 <210> 33 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for Real-Time PCR of 16S rRNA of L. coryniformis <400> 33 agtaacggac aagaagatct ctaac 25 <210> 34 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for Real-Time PCR of leuS of P. damnosus <400> 34 caatggatgc ttaagattac 20 <210> 35 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for Real-Time PCR of leuS of P. damnosus <400> 35 cgttgaacgg ccaatccagt 20 <210> 36 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for Real-Time PCR of leuS of P. damnosus <400> 36 ggcccgacag tatcaaggaa atgca 25 <210> 37 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for Real-Time PCR of pheS of P. claussenii <400> 37 tcgacgtgat acggatgatg 20 <210> 38 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for Real-Time PCR of pheS of P. claussenii <400> 38 cttcaactga tggttcagta 20 <210> 39 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for Real-Time PCR of pheS of P. claussenii <400> 39 tgaagtacgt cttcgtccaa gttat 25 <210> 40 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for Real-Time PCR of atpA of P. inopinatus <400> 40 actggacgga tcatggaagt 20 <210> 41 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for Real-Time PCR of atpA of P. inopinatus <400> 41 ttcgttcaac tggccgtgtg 20 <210> 42 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for Real-Time PCR of atpA of P. inopinatus <400> 42 tggtgacgcc ttagttggtc gagtt 25 <210> 43 <211> 455 <212> DNA <213> Lactobacillus lindneri <400> 43 aagatacttt ttatattact aaagaaattt taatgcgcac tcacacgtca cctatgcaag 60 ctcgtgcttt acaacagcat gatttcaata aaggaccatt aaaaatgatt tctcctggag 120 ttgtttttag aagagataca gatgacccaa ctcattcaca ccaatttcat caagttgagg 180 gaattgtaat cgataagcac attacgatgg ctgatttaaa aggaacctta gaggtaatgt 240 cgcataaatt atttggcgat aaattcaagg ttcgtgttcg tcctagttat tttccattta 300 ccgaaccttc agtagaagca gatgtaactt gcatgaactg tgaaggaaaa ggttgtgaag 360 tttgtaaagg atccggttgg attgaagtat taggggctgg tatggttcat cccaatgttt 420 tgaaaatggc aggcgttgac agtcaagaat atggt 455 <210> 44 <211> 954 <212> DNA <213> Lactobacillus casei <400> 44 atggcaaaaa aatatgatgt aatcgtgatc ggtgccggcc caggtggtat gacggctgca 60 ctttatgcat cgcgtgccaa tttatctgtg ctgatgctgg atcgcggcgt ctatggcggg 120 cagatgaaca acaccgctga agttgaaaac tatccgggtt tcaagtcaat cctcgggcca 180 gatcttggtc agaaaatgta tgatggtgcc acccaatttg gtgctgagta tgcctatggc 240 aatgtcgtta gcgttcaaaa ccgcggtgcc gtcaagctag tgaaaactga cgaggatgag 300 tacgaggcta aagcgattgt cattgcgaca ggcgcagagc ataagaagtt gggcgtaccg 360 ggcgaagaag cctacagtgg tcgtggcgtt tcatactgtg ctgtctgcga tggcgccttc 420 tttaaggatc gcgagttggc cgttattggt ggtggcgatt ccgcgattga agaaggcctt 480 tacctgacac aaatggccaa gaaggtcaca gttattcatc gccgtgatca attgcgtgct 540 cagcagatta tccagaagcg agcatttgcc aatgataaga tgcatttcgt ctggaatgct 600 caggttcagg aaatccaagg tgacgatatg aaagtcaccg gcgtgaaata ccgtgatcgt 660 gataaggaaa ctggcgagga acatattttg ccagtcgctg gggttttcat ttatgttggc 720 attatgccaa tgactgaagc cttccaagat ttaggtgttc tggatgagca tggttggatt 780 ccaaccgacg agcatatgcg gacaaaggtt ccaggcgttt tcgcgatcgg cgatgttcgc 840 gccaaggact tgcggcagat taccacagct gttggtgaag gtggcacagc tggacaaggc 900 gtcttcaact atattcagag tttgaatgat acgaatattg agattaaagc ttga 954 <210> 45 <211> 1506 <212> DNA <213> Lactobacillus brevis <400> 45 atgcaaggtt ctacaaagat tcaaatccaa gacgttgtcg ccccaatcga ccgccggcta 60 tatggctcct ttatcgagca attaggacgt gccgtttaca ccggtatcta tcaacctgat 120 catcccaccg ccgactcaga tggcttccgg accgatgtca ttgatgccgt aaaaactctg 180 aacgtaccgc tcattcgcta tcctggtggg aactttcttt cgcaatatcg atgggaggat 240 ggcattggtc ccaaaagcca gcgccccgtc cggttggact tggcttggcg ggaactcgaa 300 accaaccagt ttggccttca cgagtttatg cgttgggcag ataaagtcaa tgctgtcccc 360 aatatggccg tcaatctcgg cactcgggga attcaagcgg ctgctgactt agtcgaatat 420 tgtaattttc ctaaaggcac ttatttaagt gatcttcgtc gccagaatgg tgctgagcac 480 ccctttgcca ttaaaacgtg gtgtttgggt aatgaaatgg acgggccatg ggaaattggt 540 gcgaaatcgg caggcgaata tgcccacttg gctaacgaga ccgctaaggc catgcgtcgc 600 gttgatgaca ctctggaact ggtcgcctgt ggcagctcgt caatggacaa tcccaccttt 660 ggtaattggg aagaaaccgt ccttgatgct tgctacgata acgtcgatta cctgtcgctc 720 catcgttact acggctacta caatgatgac gacccaaccg aactagataa tttcttaggt 780 aaaaatcatg acttagatga ctttatcaag ggcgtcgttg ctatgtgcga tgccgttaag 840 gcccgtaaac ggtcaactaa gacgattaac ttatcctttg acgaatggaa tgtctggtat 900 cattccaacg acgctgatac ccaggttacc ccatggcaag tcggccccca tctcttagag 960 gatatctata atttcgaaga cgcgctatta attggcagtc tcctcatgac cctcttgcgc 1020 aatgctgatc gcgtcaagat cgcttgtttg gcacaactcg ttaacgtgat tgcgcccatc 1080 atgacggatg aaaatggtgg tatctggcgg caatccatct tctatccatt tatgcaggtg 1140 gccaactacg gtcaaggggt cgtcctcacc gatcacagca catcatccac ctacaattcc 1200 cgtgagttca ccgatgtggc ttatctggat accgtcacca cctatgacgc ggctacccag 1260 accgtcaccg tctttgccga aaataaacac caaacagaaa cgcttgactt tgagcttaat 1320 ttcggcgagc tgatgattga tcggctactt gatgccacgc aattttacgg ttacgatgtc 1380 aaagctgata atcgcgatgg tcatatgcag ctacaaccat tgcctgctag gactgacacc 1440 catcatgcga acactaaatt acaaccacta tcttggaacg tcttgcggtt taagctccga 1500 gattga 1506 <210> 46 <211> 477 <212> DNA <213> Lactobacillus plantarum <400> 46 atggctaaag tagaaagttt tacattagat cataccaagg ttttagcacc ttacgttcgt 60 aaaattacgg tggaaaatgg gcctaagggt gatgccatca ctaattttga tttgcggtta 120 gttcaaccta acaagaccgc tattgatacg gcgggcttac acacgattga acatatgttg 180 gctgggttat tacgtgatcg tatggatggc gtgattgact gctcaccatt tggttgtcgg 240 actggttttc atttgattac ctggggtgaa catgacaccg ttgaagttgc taaggcattg 300 aagtcctcat tagaattcat tgctggccca gctaagtggg aagacgtaca agggacgacc 360 atcgatagct gtgggaatta caaggatcat tctttattct cagctaagga atgggccaag 420 ttgattttat cgcaaggaat ttcatcggat ccatttgtac gcaaagtcgt tgaatag 477 <210> 47 <211> 506 <212> DNA <213> Lactobacillus coryniformis <400> 47 gaaggcatga agaacgtcac tgccggtgct aacccagttg gtatccgtga cgggatcgaa 60 aaagcaacta aggctgccgt tgatgaatta cacaagattt cgcataaagt taacggtaaa 120 ggtgatattg ctcaaatcgc ggctgtttct tcagctaacc aagaagttgg taaattaatt 180 gctgatgcta tggaaaaagt tggcaacgac ggtgtcatca caattgaaga atctaaagga 240 atcgatactt ctttagacgt tgttgaaggg atgcaattcg atcgtggtta tttgtcacaa 300 tacatggtta ctgacaatga caagatggaa gctgatctgg acaatccata catcttagta 360 acggacaaga agatctctaa cattcaagaa gttttaccat tactacaaaa gatcgtagaa 420 caaggtaaag cattgttgat catcgccgac gatgtagacg gtgaagcctt accaactctt 480 gttttgaaca agatccgtgg gacatt 506 <210> 48 <211> 1354 <212> DNA <213> Lactobacillus coryniformis <400> 48 ggcggcgtgc taatacatgc agtcgaacgc actgacgtcg accgaagctg cttgcagtgg 60 acgttgattg acgtgagtgg cggacgggtg agtaacacgt gggtaaccta cccttaagtg 120 ggggataaca tttggaaaca gatgctaata ccgcataacc attcagacca catggtctga 180 atgtaaaaga cggcctttgg ctgtcacttt tggacggacc cgcggcgtat tagttagttg 240 gtaaggtaac ggcttaccaa gacaatgata cgtagccgac ctgagagggt aatcggccac 300 attgggactg agacacggcc caaactccta cgggaggcag cagtagggaa tcttccacaa 360 tggacgaaag tctgatggag caacgccgcg tgagtgaaga aggttttagg atcgtaaaac 420 tctgttgttg gagaagaaca gggactagag taactgttag tcctttgacg gtatccaacc 480 agaaagccac ggctaactac gtgccagcag ccgcggtaat acgtaggtgg caagcgttgt 540 ccggatttat tgggcgtaaa gcgagcgcag gcggtttttt aagtctgatg tgaaagcctt 600 cggcttaacc gaagaagtgc attagaaact gggaaacttg agtgcagaag aggacagtgg 660 aactccatgt gtagcggtga aatgcgtaga tatatggaag aacaccagtg gcgaaggcgg 720 ctgtctggtc tgtaactgac gctgaggctc gaaagtatgg ggagcgaaca ggattagata 780 ccctggtagt ccataccgta aacgatgaat gctaagtgtt ggagggtttc cgcccttcag 840 tgctgcagct aacgcattaa gcattccgcc tggggagtac gaccgcaagg ttgaaactca 900 aaggaattga cgggggcccg cacaagcggt ggagcatgtg gtttaattcg aagcaacgcg 960 aagaacctta ccaggtcttg acatcctttg accactgtag agatacagct ttcccttcgg 1020 ggacaaagtg acaggtggtg catggttgtc gtcagctcgt gtcgtgagat gttgggttaa 1080 gtcccgcaac gagcgcaacc cttatgacta gttgccagca tttagttggg cactctagta 1140 agactgccgg tgacaaaccg gaggaaggtg gggatgacgt caaatcagca tgccccttat 1200 gacctgggct acacacgtgc tacaatggtc ggtacaacga gttgcgaacc cgcgagggta 1260 agctaatctc ttaaagccga tctcagttcg gattgtaggc tgcaactcgc ctacatgaag 1320 ccggaatcgc tagtaatcgc ggatcagcac gccg 1354 <210> 49 <211> 677 <212> DNA <213> Pediococcus damnosus <400> 49 aaatcacttg gtttttctta tgactgggat cgcgaaatta atacaactga tcctaagtat 60 tacaagtgga cccaatggat ttttgagcaa atgtacaaaa aagggttagc ttacgaaaaa 120 gaaactttag ttaactgggc tcctgatatg atgggaggca cagtggttgc taacgaagaa 180 gtaattaatg gaaagacaga acggggtggt tacccagttt atcgggtccc catgaagcaa 240 tggatgctta agattacggc atatgctgat cgtttgctag atgatttaga cttgattgat 300 tggcccgaca gtatcaagga aatgcaacga aactggattg gccgttcaac gggggccagt 360 gttaacttta aagttgctgg gactgatgat gaaattgaga tctatacaac ccgccctgac 420 acgctgtttg gtgcaagcta catggttatc gcaccagaac actcactggt aaaaaagatt 480 acgacagacg ctcaaaaagc agctgtggaa gcttatgaga agaagattga aactaaatca 540 gatttggaac gaacagattt aaataaagat aaaactggtg tgtttaccgg agcttacgga 600 attaatccag ttaatggtga aaaattgcca atctggattg ctgattacgt cttggcttca 660 tatggaactg gcgcaat 677 <210> 50 <211> 401 <212> DNA <213> Pediococcus claussenii <400> 50 gcaagatacg ttttatatta ctaaggatat tttaatgcgt tctcaaacgt cacctgtaca 60 ggcacgaacg atggaaaagc acgatttttc taagggacca ttgaagatga tttcgccggg 120 ggttgtttat cgacgtgata cggatgatgc aacacattcg catcaatttc atcaagttga 180 gggtctcgta atcgataaaa acattactat gggtgattta aagggtaccc tagaaacact 240 tgcccaggaa ttatttggag atcgttttga agtacgtctt cgtccaagtt attttccttt 300 tactgaacca tcagttgaag cagacgtgac ctgttttaat tgtatgggaa agggatgctc 360 agtatgtaag tatactggat ggatcgaagt gttaggagcc g 401 <210> 51 <211> 1016 <212> DNA <213> Pediococcus inopinatus <400> 51 gattgcccgt gctcacggcc tggataatgc attggctggt gaacttctag agttttctaa 60 tggtgtctac ggaatggttc agaaccttga atcaaatgac gtcggaattg ttattcttgg 120 cggttacgat gatattcgtg aaggcgatac tgttaagaga actggacgga tcatggaagt 180 tccagttggt gacgccttag ttggtcgagt tgtgaataca cttggacaac cgattgatgg 240 taaaggcgaa attaaaacgg accacacacg gccagttgaa cgaaaagcac ctggcgtcat 300 ggaacgtcaa tcagttagcg aacctttaca aactgggatc aaggccattg atgccttagt 360 tccaattggt cgtggtcagc gtgagttgat cattggggac cgtaaaactg gtaaaacatc 420 tttagcaatc gatacaattt tgaatcaaaa agatcaaaat ataatttgta tctatgtggc 480 gatcggccaa aaggaatcaa ctgtgcgtac gcaggttgat accctcgaaa agtatggtgc 540 tatggactac acaatcgttt taagtgctgg cccatctgaa ccagctccaa tgttgtactt 600 ggcaccatat gctggtgcag caatgggtga ggagttcatg tttaacggca agcatgtttt 660 gattgtgtat gatgatcttt caaaacaagc agatgcttat cgtgaacttt ccttgatttt 720 gagacgtccg cctggtcgtg aagcttatcc tggtgatatc ttctatactc attcacgttt 780 actagaacgt gcagctaaat taaatgacga acttggggct ggttcaatga cagctttacc 840 attcgttgaa acaaaggctg gagatattgc cgcttatatt ccaacaaacg taatttctat 900 tactgatgga cagattttct tggatagtga tctattctat tcaggaacac gtccagcgat 960 tgatgccgga tcttctgtat cccgagttgg tggggatgcc caaatcaaag ccatga 1016 <210> 52 <211> 399 <212> DNA <213> Pediococcus <400> 52 gcaagatacg ttttatatta ctaaggatat tttaatgcgt tctcaaacgt cacctgtaca 60 ggcacgaacg atggaaaagc acgatttttc taagggacca ttgaagatga tttcgccggg 120 ggttgtttat cgacgtgata cggatgatgc aacacattcg catcaatttc atcaagttga 180 gggtctcgta atcgataaaa acattactat gggtgattta aagggtaccc tagaaacact 240 tgcccaggaa ttatttggag atcgttttga agtacgtctt cgtccaagtt attttccttt 300 tactgaacca tcagttgaag cagacgtgac ctgttttaat tgtatgggaa agggatgctc 360 agtatgtaag tatactggat ggatcgaagt gttaggagc 399

Claims

시료를 준비하는 단계;
상기 시료로부터 핵산을 추출하는 단계;
젖산 박테리아의 유전자 특이적인 제1 프라이머를 이용하여, 상기 추출된 핵산에 대하여 멀티플렉스 PCR을 수행하여, 증폭 산물의 크기를 비교하여 핵산이 유래한 미생물의 종을 확인하는 단계; 및
상기 미생물의 종의 유전자에 특이적인 제2 프라이머 및 프로브를 이용하여 실시간 PCR을 수행하여, 증폭곡선을 이용하여 상기 미생물의 양을 확인하는 단계를 포함하며,
상기 시료는 맥주이고,
상기 제1 프라이머는 하기 (a) 내지 (h)의 프라이머 쌍들을 포함하며
(a) 서열번호 1 및 2의 프라이머 쌍
(b) 서열번호 3 및 4의 프라이머 쌍
(c) 서열번호 5 및 6의 프라이머 쌍
(d) 서열번호 7 및 8의 프라이머 쌍
(e) 서열번호 9 및 10의 프라이머 쌍
(f) 서열번호 11 및 12의 프라이머 쌍
(g) 서열번호 13 및 14의 프라이머 쌍
(h) 서열번호 15 및 16의 프라이머 쌍
상기 제2 프라이머 및 프로브는 하기 (a) 내지 (h)의 프라이머 쌍들 및 프로브들을 포함하고
(a) 서열번호 19 및 20의 프라이머 쌍 및 서열번호 21의 프로브
(b) 서열번호 22 및 23의 프라이머 쌍 및 서열번호 24의 프로브
(c) 서열번호 25 및 26의 프라이머 쌍 및 서열번호 27의 프로브
(d) 서열번호 28 및 29의 프라이머 쌍 및 서열번호 30의 프로브
(e) 서열번호 31 및 32의 프라이머 쌍 및 서열번호 33의 프로브
(f) 서열번호 34 및 35의 프라이머 쌍 및 서열번호 36의 프로브
(g) 서열번호 37 및 38의 프라이머 쌍 및 서열번호 39의 프로브
(h) 서열번호 40 및 41의 프라이머 쌍 및 서열번호 42의 프로브
상기 미생물의 종을 확인하는 단계 및 상기 미생물의 양을 확인하는 단계에 의하여, 상기 미생물의 종 및 양을 확인할 수 있는,
2단계 증폭에 의한 시료 내 미생물의 분석 방법.
삭제
제 1항에 있어서,
상기 젖산 박테리아는 락토바실러스 및 페디오코커스 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 2단계 증폭에 의한 시료 내 미생물의 분석 방법.
삭제
삭제
제 1항에 있어서,
상기 제1 프라이머는 락토바실러스 속에 특이적인 프라이머 쌍 또는 페디오코커스 속에 특이적인 프라이머 쌍을 포함하는 것을 특징으로 하는, 2단계 증폭에 의한 시료 내 미생물의 분석 방법.
삭제
제 1항에 있어서,
상기 제1 프라이머는 락토바실러스 린드네리(L. lindneri)의 pheS 유전자, 락토바실러스 카제이(L. casei)의 trxB 유전자, 락토바실러스 브레비스(L. brevis)의 abf2 유전자, 락토바실러스 플란타룸(L. plantarum)의 luxS 유전자, 락토바실러스 코리니포르미스(L. coryniformis)의 hsp60 유전자, 페디오코커스 담노서스(P. damnosus)의 leuS 유전자, 페디오코커스 클라우세니(P. claussenii)의 pheS 유전자 및 페디오코커스 이노피나투스(P. inopinatus)의 atpA 유전자로 구성되는 군으로부터 선택되는 유전자를 증폭시킬 수 있는 프라이머를 포함하는 것을 특징으로 하는, 2단계 증폭에 의한 시료 내 미생물의 분석 방법.
삭제
삭제
삭제