JP2003510091A - 醸造関連微生物を検出する方法および核酸 - Google Patents

醸造関連微生物を検出する方法および核酸

Info

Publication number
JP2003510091A
JP2003510091A JP2001526987A JP2001526987A JP2003510091A JP 2003510091 A JP2003510091 A JP 2003510091A JP 2001526987 A JP2001526987 A JP 2001526987A JP 2001526987 A JP2001526987 A JP 2001526987A JP 2003510091 A JP2003510091 A JP 2003510091A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
seq
nucleic acid
nucleotides
acid molecule
detection
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2001526987A
Other languages
English (en)
Inventor
マルクス ファンデケ
アレキサンダー ガッシュ
コルネリア ベルグフ
Original Assignee
バイオテコン ダイアグノステック ゲーエムベーハー
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by バイオテコン ダイアグノステック ゲーエムベーハー filed Critical バイオテコン ダイアグノステック ゲーエムベーハー
Publication of JP2003510091A publication Critical patent/JP2003510091A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

(57)【要約】 本発明は、醸造関連微生物の検出法、更にはこの方法で使用することができる核酸およびそれらの組合せに関する。本発明は更に、醸造関連微生物の様々な属または種の検出および／または同定および／または特徴決定のための、本発明の核酸の使用またはそれらの組合せの使用に関する。従って、本発明により解決されるべき問題点は、微生物の汚染に対するビールおよび醸造原材料の迅速な試験を可能にする方法および手段を提供することであり、この試験は可能性のあるビール汚染微生物の全ての範囲の検出が必要である。この問題点は、下記の工程を含む方法により、本発明によって解決される：(a)試料を、醸造関連微生物において保存された微生物核酸領域とハイブリダイズする、少なくとも2種の第1の核酸分子(プライマー)の組合せと接触させる工程；(b)微生物核酸またはその一部を増幅し、少なくとも1種の増幅断片を作出する工程；(c)工程(b)で得られた増幅断片を、醸造関連微生物の全て、または醸造関連微生物の1種もしくは数種の科、属または種に特異的な微生物核酸配列を含む少なくとも1種の増幅断片と特異的にハイブリダイズする少なくとも1種の第2の核酸分子(プローブ)と接触させる工程；および、(d)増幅断片および工程(c)において導入された第2の核酸分子からなる少なくとも1種のハイブリッド核酸を検出する工程。更に本発明の方法において使用することができる核酸が提供される。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本発明は、醸造関連微生物の検出法に加え、この方法において使用することが
できる核酸およびそれらの組合せに関する。本発明は更に、醸造関連微生物の様
々な属または種を検出および／または同定および／または特徴決定するための本
発明の核酸またはそれらの組合せの使用に関する。
【０００２】 ビールは、微生物学的に非常に安定しているとみなすことができ、かつかなり
管理しやすい数の細菌によってのみ損なわれ得る。対策が迅速に行われなければ
ならないので、これらの生物の汚染をできる限り早期に発見するために、基質(m
atrix)ビール中の微生物の迅速な検出を可能にする分析システムを使用しなけれ
ばならない。
【０００３】 ビールに有害なあらゆる微生物に共通の特徴は、個別の容器(樽、瓶)の微量の
汚染およびそれらの緩慢な増殖である。特に嫌気性微生物の微生物培養は非常に
難しい。現在わかっているビールを腐敗する細菌は、ラクトバシラス属、ペディ
オコッカス属、ペクチナタス属およびメガスフェラ属に分類される。セレノモナ
ス属およびチモフィルス属のメンバーはまだビールの汚染物質として明らかにさ
れていないが、ビールの汚染およびその後のビール内でのそれらの増殖の可能性
を排除することはできない。
【０００４】 ラクトバシラス属は、グラム陽性無胞子型で、主に非運動性の、長く薄くかつ
時には湾曲している、連鎖形成型(chain-forming)桿菌であると説明されている
。球菌型も時には認められることがある。ラクトバシラス属のメンバーは、微好
気性であり、一部は嫌気性である。これらはシトクロム陰性およびカタラーゼ陰
性であり、それらの代謝は発酵性であり、かつそれらは複合栄養培地を必要とし
ている。そのDNAのモルG+C含量は、32〜53％の間である。
【０００５】 ラクトバシラスは、ビール中同様、乳製品およびシリアル製品中、肉類および
魚類製品中、水、下水、ワイン、果物およびフルーツジュース、酢漬け野菜、ザ
ウアークラウト、サイレージおよびパン生地中にも発見されている。これらは哺
乳類の健康な口腔、腸管および膣内叢の構成成分であるが、しかしこれらは希に
病原性となることがある(Bergeys Manual of Syst. Microbiology、1209〜1234(
1984))。ビールにおいては、それらの代謝産物のために、これらは混濁しかつ望
ましくない香味の変化を生じる。ビールの腐敗に関連した種は、ラクトバシラス
・ブレビス、ラクトバシラス・リンドネリ、ラクトバシラス・カセイ、ラクトバ
シラス・パラカセイ（Lactobacillus paracasei）、ラクトバシラス・コリニフ
ォルミス（Lactobacillus coryniformis）およびラクトバシラス・クルヴァトゥ
スである(Back Brauwelt、120:1562〜1569(1980))。
【０００６】 ペディオコッカス属は、グラム陽性非運動性無胞子型球菌を含む。これらは、
四つ組(tetrad)を形成するか、または対を生じる。これらは条件的嫌気性菌であ
り、かつそれらの酸素感受性は種毎に異なる。ペディオコッカスはシトクロムお
よびカタラーゼ陰性であり、かつ複合栄養培地を必要とする(Bergeys Manual of
Syst. Microbiology、1075〜1079(1984))。これらは生ソーセージ製品の製造の
ための出発培養物として使用され、これらは様々な種類の酢漬け野菜を発酵し、
かつ食品の腐敗をもたらす(Firnhaber, Baumgart：Mikrobiologische Untersuch
ung von Lebensmitteln、413〜419、115〜117(1993))。この属は、8種類の種を
含み、ペディオコッカス・ダムノサスおよびペディオコッカス・イノビナトス種
は、ビールにとって有害であると見なされる。
【０００７】 ペクチナタス属は、ペクチナタス・セレビシフィルス種、ペクチナタス・フリ
シンゲネシス種およびペクチナタス DSM 20764株を含み、更に系統学的に分類さ
れることはない。全ての株は、腐敗したビールから単離される(Schleiferら、In
t. J. of Syst. Bacteriology、19〜27(1990))。これらはわずかに湾曲状の無胞
子型、桿状形の細菌である。これらは、櫛様の鞭毛を有し、かつ運動能がある。
これらは、カタラーゼもシトクロムオキシダーゼも生成せず、かつ偏性嫌気性菌
である。モルG+C含量は、38〜41％である。ペクチナタス属、ならびに更にメガ
スフェラ属、セレノモナス属およびチモフィルス属において、細胞壁は、グラム
陰性菌よりもグラム陽性菌に似ている。グラム染色は陰性であるとしても、これ
らは系統学的にはグラム陽性菌に分類される(Haikara、The Prokaryotes、第2版
、第II巻、1993〜2004(1991))。
【０００８】 メガスフェラ属は、メガスフェラ・エルスデニ（Megasphaera elsdenii）種お
よびメガスフェラ・セレヴィシエ種を含む。メガスフェラ・セレヴィシエのみが
醸造に関連し、かつグラム陰性で、厳密に嫌気性であり、シトクロム陰性および
カタラーゼ陰性であり、非運動性でありかつ時にはわずかに伸長した球菌となり
、これは単独で、対でまたは短い連鎖を生じる。平均細胞直径は約1.4μmであり
、かつモルG+C含量は42.4〜44.8％である。主要代謝産物は、H2Sのようなイオウ
化合物および揮発性脂肪酸である。ビール中における、メガスフェラ・セレヴィ
シエによる汚染は、芳香および味覚の非常に著しい変化につながる(Haikara、Th
e Prokaryotes、第2版、第II巻、1993〜2004(1991))。
【０００９】 セレノモナス属の種は、偏性嫌気性グラム陰性無胞子型、わずかに湾曲状の運
動性桿菌と定義される。モルG+C含量は、約48〜58％である(Schleiferら、Int.
J of Syst Bacteriology、19〜27(1990))。セレノモナスは、哺乳類の胃および
腸管並びに糞から単離される。この属は、10種類の種を含む(Hespellら、The Pr
okaryotes、第2版、第II巻、2005〜2013(1991))。セレノモナス・ラクティシフ
ェクスのみが、出発酵母から単離されており、その結果これが醸造に関連付けら
れている。セレノモナス・ラクティシフェクスは、まだビール腐敗菌としては明
らかにされていないが、しかしそのビール内での増殖は可能であり、かつその結
果これはビール腐敗菌の定義を満たしている。
【００１０】 チモフィルス・パウシボランス種およびチモフィルス・ラフィノシボランス種
は、チモフィルス属に属し、グラム陰性の、わずかに湾曲した、運動性桿菌であ
り、これは単独で、対でまたは短い連鎖を形成する。モルG+C含量は約38〜41％
である。これらは偏性嫌気性菌であり、かつ発酵代謝産物を有する。両方の種と
も、出発酵母および醸造廃棄物から単離されており；ビール中での増殖は、チモ
フィルス・ラフィノシボランスにおいてのみ認められる(Schleiferら、Int. J.
of Syst. Bacteriology、19〜27(1990))。
【００１１】 16S rRNA遺伝子配列と比較した場合、試験される全ての属は、低いG+C含量を
伴うグラム陽性菌に分類される。ペディオコッカスおよびラクトバシラス属は、
ラクトバシラセエ（Lactobacillaceae）科に分類され、かつペクチナタス、メガ
スフェラ、セレノモナスおよびチモフィルス属は、スポロムサ（Sporomusa）群
に分類される。スポロムサ群は更に、グラム陰性細胞壁を有するグラム陽性真正
細菌群としても説明されている(Stackebrandtら、The Prokaryotes、第2版、第I
I巻、25〜26、33(1991))。
【００１２】 前述の微生物の古典的な微生物学的確定には、最大10日間を要する。しかし、
顕著に迅速な分析が望まれており、さもなければ不要な貯蔵経費が上昇するか、
または試験されるべきビールがすでに出荷されてしまう。これらの理由により、
いくつかの迅速な決定法がすでに開発されている。このようにして例えばビール
に有害な生物は、それらの代謝産物を基に検出することができる(Haikaraら、Mi
crobiology、141:1131〜1137(1995))。他の間接法は、濁度測定法(Haikaraら、A
SBC、92〜95(1990))およびATP生物発光の測定(Millerら、J. Inst. Brew.、95:3
17〜319(1989))である。抗体を使用する検出も、迅速かつ特異的である(Garesら
、ASBC、158〜163(1993)；Winnewisserら、Int. J. of Bacteriology、45:403〜
405(1995))。これらの方法には、非特異的パラメータが試験されるか、または各
状況において単に1つの種または属が検出されるかのいずれかの欠点がある。更
に、装置および人件費が高い。醸造に関連した汚染の迅速検出法の概略は、ドワ
ニック（Dowhanick）が示している(Cerevisia、20/4:40〜49(1995))。
【００１３】 ポリメラーゼ連鎖反応(PCR；Mullisら、米国特許第4,683,195号、米国特許第4
,683,202号および米国特許第4,965,188号)は、生物を特異的に検出する迅速かつ
効率的方法である。様々な核酸が公知であるが、それらをプライマーおよび／ま
たはプローブとして使用すると、醸造関連微生物の特異的検出が可能である。し
かし、その欠点は、これらの核酸分子を増幅または検出反応において使用するこ
とにより、常に可能性のある全ての醸造関連微生物画分の検出のみが可能である
ことである。これらのPCRシステムは、各状況において、ラクトバシラス属、ペ
ディオコッカス属、ペクチナタス属およびメガスフェラ属の増幅反応における個
々の種のみの特異的検出に役立つ(Sakamoto、米国特許第5,869,642号；Nietupsk
iら、米国特許第5,705,339号および米国特許第5,484,900号；Tsuchiaら、日本国
特開平06141899A号、特開平06113888A/ASBC J.、64〜67(1992)/ASBC J.、40〜41
(1993)；Yasui、日本国特開平07289295A/Can. J. Microbiol.、43:157〜163(199
7)；Shimadaら、日本国特開平06090793号；Alatossavaら、国際公開公報第97/09
448号；Doyleら、J. of Ind. Microbiology、15:67〜70(1995)；DiMicheleら、A
SBC J.、63〜66(1993)；Vogeserら、Brauwelt、24/25:1060〜1063(1998))。更に
、例えばアガロースゲル電気泳動のような増幅産物の可視化について説明された
方法には問題が存在し、これは発癌性および高度に毒性のある臭化エチジウムを
、増幅産物の染色に使用することである。これらの方法は、単に自動化が困難で
あるだけではなく、アガロースゲルの評価または増幅産物の長さを基にした微生
物の同定が、時には不明確であることがある。
【００１４】 従って本発明により解決される問題点は、微生物による汚染に関するビールお
よび醸造原材料の迅速な試験を可能にする方法および手段を提供することであり
、この試験は、可能性のあるビール汚染微生物の全ての範囲を検出することを必
要としている。
【００１５】 この問題点は、下記の工程を含む方法により、本発明に従い解決される： (a)試料を、醸造関連微生物において保存された微生物核酸領域とハイブリダ
イズするような少なくとも2種の第1の核酸分子(プライマー)の組合せと接触する
工程； (b)微生物核酸またはその一部を増幅し、少なくとも1種の増幅断片を作成する
工程； (c)工程(b)において得られた増幅断片を、醸造関連微生物の全て、または醸造
関連微生物の1種または数種の科、属もしくは種に特異的な微生物核酸配列を含
む少なくとも1種の増幅断片と特異的にハイブリダイズするような、少なくとも1
種の第2の核酸分子(プローブ)と接触させる工程； (d)増幅断片および工程(c)で導入された第2の核酸分子からなる少なくとも1種
のハイブリッド核酸を検出する工程； 並びに、核酸分子は下記から選択される： (i)配列番号：1〜107の配列を有する核酸、または少なくとも10ヌクレオチド
長、好ましくは15〜30ヌクレオチド長であるそれらの断片； (ii)(i)の核酸と特異的にハイブリダイズする核酸； (iii)(i)または(ii)の核酸と少なくとも70％、好ましくは少なくとも90％同じ
核酸；または (iv)(i)〜(iii)の核酸と相補的である核酸。
【００１６】 配列番号：1〜107の配列において、ヌクレオチドは、以下のように略される：
G = グアノシン、A =アデノシン、T =チミジン、C =シチジン、U =ウラシル、i
=イノシン。IUPACに従い、混合物は以下のように略される：R = GまたはA、Y =
CまたはT、K=GまたはT、W=AまたはT、S = CまたはG、M =AまたはC、B = C、Gま
たはT、D=A、GまたはT、H =A、CまたはT、V = A、CまたはG、ならびにN = A、C
、GまたはT。
【００１７】 (iii)の核酸配列との同一性(完全な一致の意味、100％同一性に相当)の決定の
ために、比較的大きいポリヌクレオチドの部分配列が考慮される。これらの部分
配列は、10個のヌクレオチドを含み、かつ10個の構成ブロックの全てが比較した
2種の配列において同じである場合に同一である。この場合のヌクレオチドチミ
ジンおよびウリジンは、同じであると見なされる。比較的大きいポリヌクレオチ
ドの全ての可能性のある断片は、部分配列とみなされる。
【００１８】 比較した2種の配列において、1セクション内で10個中9個の、20個中18個のヌ
クレオチドが同一である場合は、90％同一性が存在する。
【００１９】 例として、20個のヌクレオチドを含みかつ第5番目のエレメントが異なるよう
な2個のポリヌクレオチドについて考えてみよう。従って配列比較において、6個
の10ヌクレオチド体は同一であり、かつ1個のエレメントが異なるので、その5個
は同一でないことがわかる。
【００２０】 さもなければ、この同一性は、程度によっても決定することができ、単位は％
で示される。同一性を決定するために、同じく部分配列は、これは例えば、プラ
イマーとして実際に使用される配列の長さ、または他の20個のヌクレオチドを最
低含むと考えられる。
【００２１】 例として、100個のヌクレオチド長を有するポリヌクレオチドAおよび200個の
ヌクレオチド長のBを比較してみる。ポリヌクレオチドBから、14ヌクレオチド長
のプライマーを得る。同一度の決定のために、ポリヌクレオチドAは、その全長
についてプライマーと比較される。このプライマー配列がポリヌクレオチドAに
おいて生じるが、1エレメント異なるならば、従ってこれは同一度13/14→92.3％
の断片である。
【００２２】 第二の例において、前述のポリヌクレオチドAおよびBの全体が比較される。こ
の場合、20 ヌクレオチド長の可能性のある比較ウインドウ全てが適応され、か
つそれらについての同一性が決定される。従って、ポリヌクレオチドAおよびBの
ヌクレオチド50〜69番は、ヌクレオチド55番目を除いて同一であり、従ってこれ
らの断片について同一度は19/20→95％であることがわかる。
【００２３】 本発明の方法は、先行する微生物検出法よりもより迅速に実施することができ
、かつ試料中に存在するいくつかの、好ましくは全ての醸造に関連する可能性の
ある微生物、例えば、これまでは検出法がないような、ラクトバシラス種または
汚染物として生じることは稀であるセレノモナス属もしくはZymophius属の一員
でさえもを検出することが可能である。この検出は包括的であり、かつ全ての醸
造における汚染の危険性を示している。本発明の方法により、汚染している微生
物数が依然低い場合であっても、醸造関連微生物は、ビール試料中およびさらに
は生材料試料(大麦、酵母、ホップ、水)またはビール製造の中間産物試料(例え
ば、マッシュ、麦芽汁)の両方で検出することができる。
【００２４】 この状況において、醸造に関連した微生物は、主に細菌、および特に前述の細
菌ラクトバシラス・ブレビス、ラクトバシラス・リンドネリ、ラクトバシラス・
カセイ、ラクトバシラス・パラカセイ、ラクトバシラス・コリニフォルミス、ラ
クトバシラス・クルヴァトゥス、ペディオコッカス・ダムノサス、ペディオコッ
カス・イノビナトス、ペクチナタス・セレビシフィルス、ペクチナタス・フリシ
ンゲネシス、ペクチナタス DSM 20764、メガスフェラ・セレヴィシエ、セレノモ
ナス・ラクティシフェクス、チモフィルス・パウシボランスおよびチモフィルス
・ラフィノシボランスを意味すると理解され、並びに更に、前述の種に属さない
としても、ビールにおいて見出される全ての微生物を意味すると理解される。例
えば希には、ラクトバシラセエ科のメンバー、例えばラクトバシラス・マレファ
ーメンタンス（Lactobacillus malefermentans）、ラクトバシラス・ブヒネリ（
Lactobacillus buchneri）、ラクトバシラス・パラブヒネリ（Lactobacillus pa
rabuchneri）、ラクトバシラス・サンフランシスコ（Lactobacillus sanfrancis
co）、ラクトバシラス・デルブリュッキイ（Lactobacillus delbrueckii）、リ
ゥコノストック・メゼンテロイデス（Leuconostoc mesenteroides）、ペディオ
コッカス・ペントサカエウス（Pediococcus pentosacaeus）およびラクトコッカ
ス・ラクチス（Lactococcus lactis）がビールの中で繁殖することができる。
【００２５】 従って本発明の方法で検出可能な微生物は、ビール汚染物質としてこれまで説
明された微生物に限定されない。むしろ、本発明の核酸分子および方法の使用は
、これまでにビール汚染物質として説明されていないようなその他の醸造関連微
生物の存在を認識する可能性を提供する。醸造に関連することがわかっている比
較的低次の分類単位(例えば、種、亜種、株)のレベルでの陰性の結果と組合わせ
た比較的高次の分類単位(例えば、目、科、属)のレベルでの陽性結果は、典型的
でない醸造関連微生物などによる汚染を示している。
【００２６】 本発明の第一の方法の工程において、被験試料は、少なくとも2個の第1の核酸
分子(プライマー)の組合せと接触される。これらの核酸分子は、醸造関連微生物
において保存されている微生物核酸領域とハイブリダイズする。このハイブリダ
イゼーションは、プライマーの、少なくとも部分的に相補性の塩基配列を有する
微生物核酸領域との対形成を通じて生じる。「保存(conserved)」という用語は
、様々な分類単位の種についてのヌクレオチド配列の進化の多様性を特徴として
いる。少なくとも2種の醸造関連微生物由来の対応する配列セクションを比較し
た場合、この配列は、可変（variable）または保存とみなされ得る。少なくとも
95％同一である比較配列は、保存と表現され、かつ95％未満同一のものは可変と
みなされる。従って、醸造関連微生物中に保存された核酸領域は、全ての醸造関
連微生物(先に定義した)が少なくとも95％同じである領域を意味する。
【００２７】 本発明の好ましい態様において、保存領域は、細菌の23Sおよび5S遺伝子を含
むゲノムセクションに生じる。この領域は、23S rRNA遺伝子および5S rRNAのの
遺伝子間スペーサーならびに23S rDNAおよび5S rDNA遺伝子の境界を含み、かつ
保存配列領域および超可変(hypervariable)(すなわち非常に生物特異的)配列領
域をも共に含む。概して原核細胞リボソームは、3個の個別の核酸成分を含み、
これは一般に5S、16S および23S rRNA (リボソーム核酸)として知られている。
これらのリボ核酸(rDNA)に関する遺伝子情報は、典型的には縦列としてゲノム内
に配置される。このようなユニットの典型的な組織化は、16S-23S-5Sであり、こ
こでこれらの遺伝子は、短い超可変遺伝子間領域、いわゆるスペーサーにより互
いに連結される。これらのユニットはゲノム内に数回存在し、かつオペロンの数
は種毎に異なっている。細菌界全体にわたってリボソームDNAの特定のセクショ
ンに高度に保存されたDNA配列は、研究される生物の個々のDNA配列の正確な知識
がなくとも、非特異的オリゴヌクレオチドを設計することを可能にする。本発明
の配列番号：1〜20記載の配列(表1)は、醸造関連微生物の23S-5S遺伝子間スペー
サーの配列であり、本発明の方法において使用するための核酸分子はこれに由来
することができる。
【００２８】 本発明の方法の第一工程において使用される少なくとも2種の第1の核酸分子の
組合せは、これらがプライマーとして増幅反応において利用できるよう、すなわ
ち1つの核酸分子が標的DNAの第1鎖の第1の保存領域にハイブリダイズし、かつ他
の核酸が、所望のDNAの標的領域が含まれる第1のものと相補的なDNA鎖の第2の保
存領域にハイブリダイズするように選択される。両核酸分子は、少なくとも10bp
の長さ、好ましくは15〜30bpを有する。本発明の好ましい態様において、本発明
の少なくとも2個の核酸分子の組合せが使用される。特に好ましい本発明の態様
において、配列番号：40〜47(表2)の配列を有する少なくとも1種の核酸分子およ
び配列番号：48〜54または配列番号：55〜59または配列番号：60〜72(表2)の配
列を有する少なくとも1種の核酸分子の組合せが使用される。
【００２９】 本発明の方法の第二工程において、微生物核酸またはその一部が増幅され、こ
れにより少なくとも1種の増幅断片が作成される。増幅は、核酸またはその一部
の濃度の上昇が反応混合液中に存在することを意味すると理解される。核酸の増
幅に使用される方法は、例えばPCR法(米国特許第4,683,195号、米国特許第4,683
,202号および米国特許第4,965,188号)、「自己維持型(self-sustained)配列複製
」(欧州特許第329,822号)、および「転写ベースの増幅システム」(欧州特許第31
0,229号)および「β-RNAレプリカーゼシステム」(米国特許第4,956,858号)があ
る。好ましい本発明の態様において、増幅はポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を含む
。さらなる本発明の態様において、増幅はリガーゼ連鎖反応または等温核酸増幅
を含む。
【００３０】 本発明の方法の第三工程において、得られた増幅断片が、少なくとも1個の第2
の核酸分子(プローブ)と接触される。この核酸分子またはこれらの核酸分子は、
醸造関連微生物の全て、もしくは醸造関連微生物の1種または数種の科、属また
は種に特異的である微生物核酸配列を含む、すなわちこれらの科もしくは属また
はこれらの種のメンバーのみを生じる、少なくとも1個の増幅断片と特異的にハ
イブリダイズされる。
【００３１】 2個の同一または類似のヌクレオチド断片(DNA、RNA、PNA)の2本鎖形成は、ハ
イブリダイゼーションとして説明される。「特異的ハイブリダイゼーション」と
いう用語は、オリゴヌクレオチドとオリゴヌクレオチドに対応する標的DNAとの
間に安定したハイブリッド核酸が存在するが、標的DNA以外の他のDNAに対しては
存在しない場合に使用される。本発明の目的のためには、「(i)の配列と特異的
にハイブリダイズする配列」という特徴は、ストリンジェント条件下で(i)の配
列とハイブリダイズする配列を意味する。例えば、このハイブリダイゼーション
は、2.5xSSC、2xデンハルト溶液、10mM Tris、1mM EDTA pH7.5を含有するハイブ
リダイゼーション溶液中、50℃で進行することができる。適当な洗浄条件は、例
えば0.1xSSC〜1.0xSSCまで、2xデンハルト、10mM Tris、1mM EDTA、pH7.5の中で
の、20〜50℃での1分間の洗浄を4回繰り返すことである。
【００３２】 本発明の好ましい態様において、1種または数種の本発明の核酸分子が、第2の
核酸分子(プローブ)として使用される。コンセンサスプローブは、微生物の核酸
の高度に保存された領域とハイブリダイズし、かつ全ての醸造関連微生物の増幅
産物と反応するような核酸分子を意味すると理解される。コンセンサスプローブ
として利用される本発明の核酸分子は、配列番号：40〜72(表2)の配列を有する
。
【００３３】 醸造関連微生物の特異的な属の検出のために、配列番号：35〜39または配列番
号：104〜107(表2)の1つの配列を有する核酸分子が使用されることが好ましい。
プローブの属特異性は、このプローブの、検出されるべき特定の属のメンバーの
できる限り大きい群の全ての単離体のDNAとハイブリダイズする能力と定義され
る。
【００３４】 種特異的核酸プローブは、同じストリンジェント条件下で検出される特定の種
の全ての単離体のDNAとハイブリダイズする核酸分子を意味すると理解される。
配列番号：21〜22、配列番号：25〜34、配列番号：73〜78、配列番号：80〜85ま
たは配列番号：87〜97(表2)を有する本発明の種特異的核酸分子を使用すること
ができる。
【００３５】 配列番号：23〜24、配列番号：79、配列番号：86および配列番号：98〜103の
プローブは特別な場合である。ラクトバシラス・カセイおよびラクトバシラス・
パラカセイ 亜種パラカセイ株は、配列番号：23および配列番号：79のプローブ
で検出することができる。配列番号：24のプローブは、ラクトバシラス・コリニ
フォルミスの2亜種(ラクトバシラス・コリニフォルミス 亜種コリニフォルミス
およびラクトバシラス・コリニフォルミス 亜種トルケンス)の検出を可能にする
。配列番号：86のプローブにより、ペディオコッカス・ダムノサス、ペディオコ
ッカス・イノビナトスおよびPediococcus parvulus種の株を検出することができ
る。これらのプローブの使用により、他の醸造関連微生物は検出されない。同様
に、配列番号：98〜103のプローブにより、検出される醸造に関連したラクトバ
シラセエ科の全ての種が検出され、かつ醸造に関連したその他の種および属に対
し区別される。
【００３６】 本発明の方法の最終工程において、増幅断片及び先の工程で導入された第2の
核酸分子からなる少なくとも1種のハイブリッド核酸の検出が行われる。
【００３７】 好ましくは、第1の核酸分子(プライマー)および／または第2の核酸分子(プロ
ーブ)の長さは、少なくとも10ヌクレオチド長、好ましくは15〜30ヌクレオチド
長である。ある本発明の態様において、第1および／または第2の核酸分子が、10
個の連続ヌクレオチドにおいて、ヌクレオチドの最大20％まで修飾され、特に10
個のブロックの1または2個のヌクレオチドが、細菌において自然には生じないヌ
クレオチドで置換される。
【００３８】 本発明の方法は、いわゆるコンセンサスPCRを含むことが好ましい。この方法
において、微生物の核酸またはその一部の増殖、及び標識された特異的プローブ
とのハイブリダイゼーションによるこれらの分子のその後の検出が行われる。コ
ンセンサスPCRにおいて、いくつかのまたは実際には全ての関連した株、亜種、
種もしくは属から増幅産物を得ることを可能にする核酸分子が用いられる。この
増幅は、微生物の識別にはつながらない。この検出の特異性は、その後の特異的
プローブとのハイブリダイゼーションを通じて達成される。この方法において、
醸造関連微生物は、増幅および検出反応の単純な組合せにおいて同時に検出する
ことができる。
【００３９】 この種の増幅および検出は、検出反応の自動化を可能にし、その結果高い試料
処理量が可能になる。例えば、各プローブがマイクロタイタープレートの異なる
ウェルに結合され、そこで標識された増幅産物のハイブリダイゼーションおよび
検出反応が実行されるような、PCR-ELISA検出法を用いることができる。この検
出は更にマイクロアレイを使用し達成され、そこではいくつかのプローブが固定
され、その結果検出反応を迅速かつ余り経費をかけずに実行することができる。
【００４０】 本発明の好ましい態様において、第2の核酸分子(プローブ)は、検出可能なシ
グナルを生じることができる様な方法で、修飾または標識される。この修飾また
は標識は、(i)放射活性基、(ii)呈色基、(iii)蛍光基、(iv)固相へ固定する基、
および(v)特に抗体、抗原、酵素および／または酵素または酵素複合体に親和性
を有する基質の補助する、間接的または直接的反応をもたらす基から選択される
。
【００４１】 本発明の目的のための標識は、核酸分子に結合される、直接的または間接的に
検出可能な基もしくは固相に固定するための基を示している。直接的に検出可能
なものは、金属原子、放射活性基、呈色基または蛍光基である。間接的に検出可
能なものは、免疫学的または酵素的に検出可能な基であり、例えば抗原および抗
体、ハプテンまたは酵素もしくは酵素の酵素活性部分である。これらの間接的基
は、後の反応により検出される。好ましくは、オリゴヌクレオチドに結合され、
かつ後の抗体反応により検出されるようなハプテンである。
【００４２】 本発明の核酸分子は、醸造関連細菌の検出および／または同定および／または
特徴決定に使用することができる。本明細書に記したプライマーおよび／または
プローブは、ビール以外の飲料中、醸造部門の他の試料、例えば原材料、出発酵
母、環境試料中、他の食品試料中または臨床検体中などにおける、記載の微生物
の検出においても使用することができる。
【００４３】実施例 実施例１：ビールに有害な細菌および密に関連した種のDNA標的配列の決定 公知の23S rDNAおよび5S rDNA配列(GenBank Sequence Database of the Natio
nal Center of Biotechnology Information：NCBI)の配列比較により、配列決定
に使用したプライマーのためのハイブリダイゼーション部位として使用される保
存された遺伝子領域を同定した。表1に列記した細菌の純粋培養物から、ゲノムD
NAを、公知の標準法により単離した。高度に保存された領域とハイブリダイズす
るプライマーにより、検出されるべき全ての細菌の増幅産物を、PCRにより入手
した。増幅およびその後の配列決定には、下記のプライマーを使用した： プライマー1 = 配列番号：47： プライマー2＝配列番号：55： PCR組成： 温度プロフィール：
【００４４】 これらの増幅産物は、アガロースゲルおよびその後のQIAquick PCRゲル抽出キ
ット (Quiagen社)処理により精製し、かつロングリードシークエンサー（Long R
ead Sequencer）モデル4000L (LI-COR社)において、IRD-800標識を備えた前述の
プライマー用い配列決定した。得られる醸造関連細菌及び進化系統的に密に関連
した種の23S/5S rDNAスペーサー領域の配列を、互いに比較し、かつ下記の配列
領域を同定した： 1.)検出される特定の属の全ての種において認められ、かつ同時に他の属または
種とは異なる領域； 2.)検出される特定の種においてのみ認められるが、検出されるおよび検出され
ない他の細菌とは異なる領域。
【００４５】 1.)に説明された配列領域において、属特異的オリゴヌクレオチドのハイブリ
ダイゼーション部位が定義され、かつ2.)に説明された配列領域において、種特
異的オリゴヌクレオチドの結合部位が定義された。
【００４６】 実施例２：ポリメラーゼ連鎖反応によるビールに有害な細菌の検出I. 増幅 ゲノムDNAは、公知の標準法により、表1に列記した細菌の純粋培養物から単離
した。次にこれらの調製物の1 fg/μl〜1pg/μlまでの十倍希釈液(decimal dilu
tion)を、下記の組成によるPCRに使用した：
【００４７】 プライマー3 = 配列番号：46： プライマー4 = 配列番号：48：
【００４８】 PCRは、Mastercycler(登録商標)(Eppendorf社)において下記の条件、下記の温
度プロフィールに従い行った：
【００４９】 プライマー3 (配列番号：46)は、23S rDNA配列(GenBank Sequence Database o
f NCBI)として公知の配列との比較により決定した。これは、23S rDNA遺伝子領
域において高度に保存された配列セクションとハイブリダイズした。結合部位は
、プライマー配列番号：48および49により配列決定されたこの領域の外側に位置
した。
【００５０】 プライマー4 (配列番号：48)は、本発明者独自の配列データを基に決定した。
プライマー2のハイブリダイゼーション部位は、5S rDNA領域において遺伝子間23
S/5Sスペーサーに隣接して位置した。
【００５１】II. PCR-ELISA法による検出 この検出は、PCR-ELISA法により達成される。このために、使用される1個のプ
ローブにつき、増幅産物5μlを、変性緩衝液(125mM NaOH、20mM EDTA、pH14)5μ
lで処理し、かつ室温で15分間インキュベーションした。各時点で、特にビオチ
ン化したプローブ2pmolを、ハイブリダイゼーション緩衝液(2.5xSSC、2xデンハ
ルト液、10mM Tris、1mM EDTA、pH7.5)100μl中にピペットで注入し、かつスト
レプトアビジンで被覆したマイクロタイタープレートのウェルに移し、かつハイ
ブリダイゼーション温度50℃でプレインキュベーションした。変性後、この変性
混合液をハイブリダイゼーション混合液にピペットで注入した。次にこの混合液
を、ハイブリダイゼーション温度で30分間インキュベーションした。ハイブリダ
イゼーションが完了したならば、ハイブリダイゼーション混合液を取除き、かつ
プレートを洗浄緩衝液1(WB1：0.1xSSC、2xデンハルト液、10mM Tris、1mM EDTA
、pH7.6)の200μlで、ハイブリダイゼーション温度の各時点で1分間4回洗浄した
。次に、製造業者(Boehringer Mannheim社)の指示に従い、希釈したホースラデ
ィッシュペルオキシダーゼが複合した抗ジゴキシゲニン抗体の溶液100μlを添加
した。この複合体を、洗浄緩衝液2(WB2：100mM Tris、150mM NaCl、0.05％ Twee
n 20、0.5％ブロック剤、100μg/mlニシン精子、pH7.6)中で希釈した。次に抗体
のインキュベーションを、37℃で30分間行った。この後、プレートを、WB2(室温
)の200μlで4回洗浄した。洗浄後、POD基質(Boehringer Mannheim社)100μlを添
加し、かつ混合液を室温で20分間インキュベーションした。次に呈色反応を、0.
5M H2SO4の100μlで停止し、かつ450nmで評価した。
【００５２】III.評価 前述の検出プロトコールに従い、対応する属特異的プローブおよび種特異的プ
ローブを用い、調査した全ての細菌および細菌群について検出を行った。属特異
的プローブは、ペディオコッカスについて配列番号：35、ペクチナタスについて
配列番号：36、メガスフェラについて配列番号：37、セレノモナスについて配列
番号：38およびチモフィルスについて配列番号：39である。種特異的プローブは
、ラクトバシラス・ブレビスについて配列番号：21、ラクトバシラス・リンドネ
リについて配列番号：22、ラクトバシラス・カセイ + パラカセイについて配列
番号：23、ラクトバシラス・コリニフォルミスについて配列番号：24、ラクトバ
シラス・クルヴァトゥスについて配列番号：25、ペディオコッカス・ダムノサス
について配列番号：26、ペディオコッカス・イノビナトスについて配列番号：27
、ペクチナタス・セレビシフィルスについて配列番号：28、ペクチナタス・フリ
シンゲネシスについて配列番号：29、ペクチナタス 種DSM20764について配列番
号：30、メガスフェラ・セレヴィシエについて配列番号：31、セレノモナス・ラ
クティシフェクスについて配列番号：32、チモフィルス・パウシボランスについ
て配列番号：33、およびチモフィルス・ラフィノシボランスについて配列番号：
34である。
【００５３】 対照として、コンセンサスプローブ配列番号：40および41を使用し、これらは
検出されるべき全ての種の増幅産物とハイブリダイズした。更に可能性のあるコ
ンセンサスプローブの結合部位は、配列番号：42〜45である。配列番号：40〜45
のプローブは、公知の23S rDNAおよび5S rDNA配列(GenBank Sequence Database
、NCBI)の配列比較により決定した。
【００５４】 本PCRに使用したゲノムDNAの量1fgに対して測定した吸光度が1より大きいなら
ば、この結果は陽性と評価される。PCR-ELISA法の結果を表3に示した。
【表１】
【表２】
【表３】
【配列表】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/569 Ｇ０１Ｎ 33/58 Ａ 33/58 Ｃ１２Ｒ 1:01 //(Ｃ１２Ｑ 1/02 1:225 Ｃ１２Ｒ 1:01） Ｃ１２Ｒ 1:24 (Ｃ１２Ｑ 1/02 1:245 Ｃ１２Ｒ 1:225） Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｒ 1:24） (Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｒ 1:245） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ， ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ， ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ベルグフ コルネリア ドイツ連邦共和国 ベルリン ローデラン デル ウェグ 85 Ｆターム(参考） 2G045 AA28 CB21 DA12 DA13 DA14 FA11 FB02 FB03 FB07 4B024 AA05 AA11 CA01 CA09 CA11 CA20 HA12 HA13 HA20 4B063 QA01 QQ06 QQ16 QQ42 QQ52 QR32 QR56 QR62 QR66 QR82 QS25 QS34 QS36 QX02

Claims (41)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 下記の工程を含む、試料中の醸造関連微生物を検出する方法
    ： (a)試料を、醸造関連微生物において保存された微生物核酸領域とハイブリダ
    イズするような少なくとも2種の第1の核酸分子(プライマー)の組合せと接触させ
    る工程； (b)微生物核酸またはその一部を増幅し、少なくとも1種の増幅断片を作成する
    工程； (c)工程(b)で得られた増幅断片を、醸造関連微生物の全て、または醸造関連微
    生物の1種もしくは数種の科、属または種に特異的な微生物核酸配列を含む少な
    くとも1種の増幅断片と特異的にハイブリダイズする、少なくとも1種の第2の核
    酸分子(プローブ)と接触させる工程； (d)増幅断片および工程(c)において導入された第2の核酸分子からなる少なく
    とも1種のハイブリッド核酸を検出する工程。
  2. 【請求項２】 増幅がポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を含む、請求項１記載の
    方法。
  3. 【請求項３】 増幅がリガーゼ連鎖反応を含む、請求項１記載の方法。
  4. 【請求項４】 増幅が等温核酸増幅を含む、請求項１記載の方法。
  5. 【請求項５】 第2の核酸分子が、修飾または標識され、検出可能なシグナ
    ルを形成し、この修飾または標識が、(i)放射活性基、(ii)呈色基、(iii)蛍光基
    、(iv)固相上に固定化するための基、および(v)特に抗体、抗原、酵素および／
    または酵素もしくは酵素複合体と親和性がある物質による、間接的または直接的
    反応を可能にするような基から選択される、請求項１〜４のいずれか１項記載の
    方法。
  6. 【請求項６】 第1の核酸分子および／または第2の核酸分子が、少なくと
    も10クレオチド長、好ましくは15〜30ヌクレオチド長である、請求項１〜５のい
    ずれか１項記載の方法。
  7. 【請求項７】 第1の核酸分子および／または第2の核酸分子が、10個の連続
    するヌクレオチド中の最大20％のヌクレオチドまで修飾され、特に10のブロック
    からの1または2個のヌクレオチドが、細菌において自然には生じないようなヌク
    レオチドにより置換される、請求項１〜６のいずれか１項記載の方法。
  8. 【請求項８】 保存領域が、細菌の23Sおよび5S遺伝子を含むゲノムセクシ
    ョンに生じる、請求項１〜７のいずれか１項記載の方法。
  9. 【請求項９】 醸造関連微生物を検出するためのプローブおよび／またはプ
    ライマーとしての核酸分子であり、下記から選択される核酸分子： (i)配列番号：1〜107の配列を有する核酸またはその少なくとも10ヌクレオチ
    ド長、好ましくは15〜30ヌクレオチド長の断片； (ii)(i)の核酸と特異的にハイブリダイズする核酸； (iii)(i)または(ii)の核酸と少なくとも70％、好ましくは少なくとも90％同一
    である核酸；または (iv)(i)〜(iii)の核酸と相補的である核酸。
  10. 【請求項１０】 DNAまたはRNAである、請求項９記載の核酸分子。
  11. 【請求項１１】 PNAである、請求項９記載の核酸分子。
  12. 【請求項１２】 10個の連続ヌクレオチド中の最大20％のヌクレオチド、特
    に10のブロックからの1または2個のヌクレオチドが、細菌において自然には生じ
    ないようなヌクレオチドにより置換される、請求項９〜11記載の核酸分子。
  13. 【請求項１３】 下記から選択される、少なくとも2種の核酸分子の組合せ
    ： (1)請求項９〜12のいずれか１項記載の少なくとも2種の核酸分子の組合せ；お
    よび (2)配列番号：40〜47の1つの配列を有する少なくとも1種の核酸分子および配
    列番号：48〜54または配列番号：55〜59または配列番号：60〜72の配列を有する
    少なくとも1種の核酸分子を含む組合せ。
  14. 【請求項１４】 請求項９〜12のいずれか１項記載の核酸分子および／また
    は請求項13記載の組合せを含むキット。
  15. 【請求項１５】 工程(a)において、請求項13記載の核酸分子の少なくとも2
    種の組合せが使用される、請求項１〜８のいずれか１項記載の方法。
  16. 【請求項１６】 第2の核酸分子(プローブ)として、請求項９〜12のいずれ
    か１項記載の少なくとも1種の核酸分子が使用される、請求項１〜８および15の
    いずれか１項記載の方法。
  17. 【請求項１７】 第2の核酸分子(プローブ)として、配列番号：35〜39また
    は97〜107の1つの配列を有する少なくとも1種の核酸分子が使用される、請求項1
    6記載の方法。
  18. 【請求項１８】 第2のまたは更なる核酸分子(プローブ)として、配列番号
    ：21〜34または配列番号：73〜97の1つの配列を有する少なくとも1種の核酸分子
    が使用される、請求項16または17記載の方法。
  19. 【請求項１９】 醸造関連細菌の検出のための請求項９〜12のいずれか１項
    記載の核酸分子の使用および／または請求項13記載の組合せの使用。
  20. 【請求項２０】 醸造関連細菌の同定および／または特徴決定のための請求
    項９〜12のいずれか１項記載の核酸分子の使用。
  21. 【請求項２１】 ペディオコッカス（Pediococcus）属の細菌の検出および
    ／または同定および／または特徴決定のための、配列番号：35または配列番号：
    86の配列を有する核酸分子の使用。
  22. 【請求項２２】 ペクチナタス（Pectinatus）属の細菌の検出および／また
    は同定および／または特徴決定のための、配列番号：36または配列番号：104の
    配列を有する核酸分子の使用。
  23. 【請求項２３】 メガスフェラ（Megasphaera）属の細菌の検出および／ま
    たは同定および／または特徴決定のための、配列番号：37または配列番号：107
    の配列を有する核酸分子の使用。
  24. 【請求項２４】 セレノモナス（Selenomonas）属の細菌の検出および／ま
    たは同定および／または特徴決定のための、配列番号：38または配列番号：105
    の配列を有する核酸分子の使用。
  25. 【請求項２５】 チモフィルス（Zymophilus）属の細菌の検出および／また
    は同定および／または特徴決定のための、配列番号：39または配列番号：106の
    配列を有する核酸分子の使用。
  26. 【請求項２６】 ラクトバシラス・ブレビス（Lactobacillus brevis）種の
    細菌の検出および／または同定および／または特徴決定のための、配列番号：1
    、配列番号：21もしくは配列番号73〜74の配列、または少なくとも10ヌクレオチ
    ド、好ましくは15〜30ヌクレオチドを伴うそれらの断片、を有する核酸分子の使
    用。
  27. 【請求項２７】 ラクトバシラス・リンドネリ（Lactobacillus lindneri）
    種の細菌の検出および／または同定および／または特徴決定のための、配列番号
    ：2、配列番号：22もしくは配列番号：75〜76の配列、または少なくとも10ヌク
    レオチド、好ましくは15〜30ヌクレオチドを伴うそれらの断片、を有する核酸分
    子の使用。
  28. 【請求項２８】 ラクトバシラス・カセイ（Lactobacillus casei）種の細
    菌の検出および／または同定および／または特徴決定のための、配列番号：3、
    もしくは配列番号：23もしくは配列番号：77〜79の配列、または少なくとも10ヌ
    クレオチド、好ましくは15〜30ヌクレオチドを伴うそれらの断片、を有する核酸
    分子の使用。
  29. 【請求項２９】 ラクトバシラス・パラカセイ 亜種パラカセイ（Lactobaci
    llus paracasei ssp. paracasei）種の細菌の検出および／または同定および／
    または特徴決定のための、配列番号：4、配列番号：5、もしくは配列番号：23も
    しくは配列番号：79〜81の配列、または少なくとも10ヌクレオチド、好ましくは
    15〜30ヌクレオチドを伴うそれらの断片、を有する核酸分子の使用。
  30. 【請求項３０】 ラクトバシラス・コリニフォルミス 亜種コリニフォルミ
    ス（Lactobacillus coryniformis ssp. coryniformis）種の細菌の検出および／
    または同定および／または特徴決定のための、配列番号：6、配列番号：24もし
    くは配列番号：82の配列、または少なくとも10ヌクレオチド、好ましくは15〜30
    ヌクレオチドを伴うそれらの断片、を有する核酸分子の使用。
  31. 【請求項３１】 ラクトバシラス・コリニフォルミス 亜種トルケンス（Lac
    tobacillus coryniformis ssp. torquens）種の細菌の検出および／または同定
    および／または特徴決定のための、配列番号：7、もしくは配列番号：24もしく
    は配列番号：82の配列、または少なくとも10ヌクレオチド、好ましくは15〜30ヌ
    クレオチドを伴うそれらの断片、を有する核酸分子の使用。
  32. 【請求項３２】 ラクトバシラス・クルヴァトゥス（Lactobacillus curvat
    us）種の細菌の検出および／または同定および／または特徴決定のための、配列
    番号：8、配列番号：25もしくは配列番号：83の配列、または少なくとも10ヌク
    レオチド、好ましくは15〜30ヌクレオチドを伴うそれらの断片、を有する核酸分
    子の使用。
  33. 【請求項３３】 ペディオコッカス・ダムノサス（Pediococcus damnosus）
    種の細菌の検出および／または同定および／または特徴決定のための、配列番号
    ：9、配列番号：26、配列番号：84もしくは配列番号：86の配列、または少なく
    とも10ヌクレオチド、好ましくは15〜30ヌクレオチドを伴うそれらの断片、を有
    する核酸分子の使用。
  34. 【請求項３４】 ペディオコッカス・イノビナトス（Pediococcus inopinat
    us）種の細菌の検出および／または同定および／または特徴決定のための、配列
    番号：10、配列番号：27、配列番号：85もしくは配列番号：86の配列、または少
    なくとも10ヌクレオチド、好ましくは15〜30ヌクレオチドを伴うそれらの断片、
    を有する核酸分子の使用。
  35. 【請求項３５】 ペクチナタス・セレビシフィルス（Pectinatus cerevisii
    philus）種の細菌の検出および／または同定および／または特徴決定のための、
    配列番号：11、配列番号：28もしくは配列番号：87〜88の配列、または少なくと
    も10ヌクレオチド、好ましくは15〜30ヌクレオチドを伴うそれらの断片、を有す
    る核酸分子の使用。
  36. 【請求項３６】 ペクチナタス・フリシンゲネシス（Pectinatus frisingie
    nsis）種の細菌の検出および／または同定および／または特徴決定のための、配
    列番号：12、配列番号：29もしくは配列番号：89〜90の配列、または少なくとも
    10ヌクレオチド、好ましくは15〜30ヌクレオチドを伴うそれらの断片、を有する
    核酸分子の使用。
  37. 【請求項３７】 ペクチナタス（Pectinatus）種DSM20764株の細菌の検出お
    よび／または同定および／または特徴決定のための、配列番号：13、配列番号：
    14、配列番号：30もしくは配列番号：91〜93の配列、または少なくとも10ヌクレ
    オチド、好ましくは15〜30ヌクレオチドを伴うそれらの断片、を有する核酸分子
    の使用。
  38. 【請求項３８】 メガスフェラ・セレヴィシエ（Megasphaera cerevisiae）
    株の細菌の検出および／または同定および／または特徴決定のための、配列番号
    ：15、配列番号：16、配列番号：31もしくは配列番号：97の配列、または少なく
    とも10ヌクレオチド、好ましくは15〜30ヌクレオチドを伴うそれらの断片、を有
    する核酸分子の使用。
  39. 【請求項３９】 セレノモナス・ラクティシフェクス（Selenomonas lactic
    ifex）株の細菌の検出および／または同定および／または特徴決定のための、配
    列番号：17、配列番号：18、配列番号：32もしくは配列番号：94の配列、または
    少なくとも10ヌクレオチド、好ましくは15〜30ヌクレオチドを伴うそれらの断片
    、を有する核酸分子の使用。
  40. 【請求項４０】 チモフィルス・ラフィノシボランス（Zymophilus raffino
    sivorans）株の細菌の検出および／または同定および／または特徴決定のための
    、配列番号：19、配列番号：33もしくは配列番号：95の配列、または少なくとも
    10ヌクレオチド、好ましくは15〜30ヌクレオチドを伴うそれらの断片、を有する
    核酸分子の使用。
  41. 【請求項４１】 チモフィルス・パウシボランス（Zymophilus paucivorans
    ）株の細菌の検出および／または同定および／または特徴決定のための、配列番
    号：20、配列番号：34もしくは配列番号：96の配列、または少なくとも10ヌクレ
    オチド、好ましくは15〜30ヌクレオチドを伴うそれらの断片、を有する核酸分子
    の使用。
JP2001526987A 1999-09-24 2000-09-08 醸造関連微生物を検出する方法および核酸 Pending JP2003510091A (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE19945964.9 1999-09-24
DE19945964A DE19945964A1 (de) 1999-09-24 1999-09-24 Verfahren und Nukleinsäuren zum Nachweis von brauereirelevanten Mikroorganismen
PCT/EP2000/008808 WO2001023605A2 (de) 1999-09-24 2000-09-08 Verfahren und nukleinsäuren zum nachweis von brauereirelevanten mikroorganismen

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2003510091A true JP2003510091A (ja) 2003-03-18

Family

ID=7923267

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2001526987A Pending JP2003510091A (ja) 1999-09-24 2000-09-08 醸造関連微生物を検出する方法および核酸

Country Status (11)

Country Link
US (1) US7183085B1 (ja)
EP (1) EP1214450B1 (ja)
JP (1) JP2003510091A (ja)
CN (1) CN100569952C (ja)
AT (1) ATE335849T1 (ja)
AU (1) AU781702C (ja)
BR (1) BR0014518A (ja)
CA (1) CA2385652C (ja)
DE (2) DE19945964A1 (ja)
MX (1) MXPA02003134A (ja)
WO (1) WO2001023605A2 (ja)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPWO2005080599A1 (ja) * 2004-02-25 2007-08-02 サントリー株式会社 細菌検出器具、細菌検出方法および細菌検出キット
KR101919190B1 (ko) * 2016-04-27 2018-11-15 하이트진로 주식회사 미생물의 ２ 단계 분석 방법

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP4757402B2 (ja) 2001-05-23 2011-08-24 キリンホールディングス株式会社 ビール混濁乳酸菌の検出用ポリヌクレオチドプローブおよびプライマー並びにビール混濁乳酸菌の検出法
DE10129410A1 (de) * 2001-06-19 2003-01-02 Vermicon Ag Verfahren zum spezifischen Schnellnachweis bierschädlicher Bakterien
US9303281B2 (en) 2012-07-23 2016-04-05 Pall Corporation Compositions for detecting foodstuff spoilage microorganisms
CN103397092B (zh) * 2013-07-30 2015-02-04 青岛啤酒股份有限公司 一种啤酒污染菌的快速筛查方法
CN103361439B (zh) * 2013-07-30 2014-11-26 青岛啤酒股份有限公司 一种集成检测9种啤酒污染菌的方法
CN105603081B (zh) * 2016-01-29 2019-12-06 北京工商大学 一种非诊断目的的肠道微生物定性与定量的检测方法
CN105740650B (zh) * 2016-03-02 2019-04-05 广西作物遗传改良生物技术重点开放实验室 一种快速准确鉴定高通量基因组数据污染源的方法
CN113077845A (zh) * 2021-04-13 2021-07-06 中国科学院大气物理研究所 一种大气气溶胶微生物群落组成的分析方法

Family Cites Families (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE6902218U (de) * 1969-01-20 1969-07-17 P R I C Patent Res Internat Co Vorrichtung zur aufhaengung von lampen, insbesondere strassenlaternen.
US4203444A (en) 1977-11-07 1980-05-20 Dyonics, Inc. Surgical instrument suitable for closed surgery such as of the knee
US4274414A (en) 1979-02-21 1981-06-23 Dyonics, Inc. Surgical instrument
US4705038A (en) 1985-01-23 1987-11-10 Dyonics, Inc. Surgical system for powered instruments
US4842578A (en) 1986-03-12 1989-06-27 Dyonics, Inc. Surgical abrading instrument
US4834729A (en) 1986-12-30 1989-05-30 Dyonics, Inc. Arthroscopic surgical instrument
US4983179A (en) 1986-12-30 1991-01-08 Smith & Nephew Dyonics Inc. Arthroscopic surgical instrument
IE81145B1 (en) 1989-04-20 2000-05-03 Thomas Gerard Barry Generation of specific probes for target nucleotide sequences
CA2031499A1 (en) 1989-05-31 1990-12-01 David J. Lane Universal eubacteria nucleic acid probes and methods
EP0439182B1 (en) * 1990-01-26 1996-04-24 Abbott Laboratories Improved method of amplifying target nucleic acids applicable to both polymerase and ligase chain reactions
US5152744A (en) 1990-02-07 1992-10-06 Smith & Nephew Dyonics Surgical instrument
JP3067850B2 (ja) * 1991-07-05 2000-07-24 サッポロビール株式会社 オリゴヌクレオチド及びそれを用いた乳酸菌の検出法
JPH06141899A (ja) * 1992-11-04 1994-05-24 Sapporo Breweries Ltd 乳酸菌の高感度検出法
US5484909A (en) * 1993-09-10 1996-01-16 Amoco Corporation Nucleic acid probes for the detection of bacteria of the genera Pediococcus and Lactobacillus and methods for the detection of the bacterial agents causing spoilage of beer
DE69516325T2 (de) * 1994-02-22 2001-01-18 Mitsubishi Chem Corp Oligonukleotid und Verfahren zur Analyse der Basensequenz der Nukleinsäure
US5648211A (en) * 1994-04-18 1997-07-15 Becton, Dickinson And Company Strand displacement amplification using thermophilic enzymes
EP0796064A4 (en) 1994-10-24 2002-01-30 Smith & Nephew Inc SURGICAL CUTTING TOOL WITH OPENING GROOVES
JP3525259B2 (ja) * 1995-11-28 2004-05-10 アサヒビール株式会社 ペクチネータス属菌の検出
DE19616750A1 (de) * 1996-04-26 1997-11-06 Newlab Diagnostic Systems Gmbh Verfahren zum Nachweis von Mikroorganismen in Gemischen
US5913867A (en) 1996-12-23 1999-06-22 Smith & Nephew, Inc. Surgical instrument
AU1337099A (en) 1997-10-29 1999-05-17 Mira Diagnostica Gmbh Method for identifying micro-organisms

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPWO2005080599A1 (ja) * 2004-02-25 2007-08-02 サントリー株式会社 細菌検出器具、細菌検出方法および細菌検出キット
JP4791958B2 (ja) * 2004-02-25 2011-10-12 サントリーホールディングス株式会社 細菌検出器具、細菌検出方法および細菌検出キット
KR101919190B1 (ko) * 2016-04-27 2018-11-15 하이트진로 주식회사 미생물의 ２ 단계 분석 방법

Also Published As

Publication number Publication date
DE50013309D1 (de) 2006-09-21
CA2385652A1 (en) 2001-04-05
BR0014518A (pt) 2002-06-11
AU781702C (en) 2006-04-06
EP1214450A2 (de) 2002-06-19
CA2385652C (en) 2011-11-15
DE19945964A1 (de) 2001-04-05
WO2001023605A3 (de) 2002-02-21
WO2001023605A2 (de) 2001-04-05
AU7285900A (en) 2001-04-30
CN1376206A (zh) 2002-10-23
EP1214450B1 (de) 2006-08-09
MXPA02003134A (es) 2003-08-20
CN100569952C (zh) 2009-12-16
US7183085B1 (en) 2007-02-27
ATE335849T1 (de) 2006-09-15
AU781702B2 (en) 2005-06-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Chen et al. Microbiological study of lactic acid bacteria in kefir grains by culture-dependent and culture-independent methods
Rantsiou et al. The rpoB gene as a target for PCR-DGGE analysis to follow lactic acid bacterial population dynamics during food fermentations
FI102298B (fi) Menetelmä maitohappobakteerilajien määrittämiseksi ja menetelmään sove ltuvia oligonukleotideja
Vandamme et al. Classification of Centers for Disease Control Group Eugonic Fermenter (EF)-4a and EF-4b as Neisseria animaloris sp. nov. and Neisseria zoodegmatis sp. nov., respectively
JP2003534770A (ja) バクテリア検出とバクテリア系統発生学的単位の検出のための核酸分子
JP2003510091A (ja) 醸造関連微生物を検出する方法および核酸
JP2007505638A (ja) 飲料腐敗性微生物の特異的な迅速検出方法
US20040219574A1 (en) Method for the specific fast detection of bacteria which are harmful to beer
KR101931578B1 (ko) 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) 특이적 프라이머 및 이를 이용한 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) 검출방법
US5869642A (en) Detection of the genus pectinatus
JP3338924B2 (ja) 乳酸菌検出用オリゴヌクレオチド及びそれを用いた判定法
US7439022B2 (en) Nucleic acids for detection of Listeria
Yin et al. Characterization of a cryptic plasmid pM4 from Lactobacillus plantarum M4
Lick et al. Identification of Lactobacillus delbrueckii and subspecies by hybridization probes and PCR
Delaherche et al. Intraspecific diversity of Oenococcus oeni strains determined by sequence analysis of target genes
WO2000009683A1 (fr) Genes pour la detection de bacteries et procede de detection utilisant ce gene
KR102084862B1 (ko) 실시간 중합효소연쇄반응을 이용한 초산균의 검출 및 정량 방법
WO1998010093A1 (en) Oligonucleotide probes for the detection of bifidobacteria
Van Beek et al. Bacterial diversity in scotch whisky fermentations as revealed by denaturing gradient gel electrophoresis
JP7252606B2 (ja) 乳酸菌検出プライマーセットおよび該プライマーセットを用いた検出方法
JP2005006556A (ja) ビール有害菌の検出方法
WO2023214588A1 (ja) 芽胞形成細菌の検出方法
Massonet et al. Direct identification of bacteria in clinical respiratory samples using fluorescent amplicon length analysis of 16S–23S rRNA spacer-region
JP4463592B2 (ja) 酢酸耐性乳酸菌検出用核酸
Ramanuj et al. Lactic Acid Bacteria: Dna Isolation And Molecular Characterization