JP4757402B2 - ビール混濁乳酸菌の検出用ポリヌクレオチドプローブおよびプライマー並びにビール混濁乳酸菌の検出法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の背景】
発明の分野
本発明は、ビールを混濁させて、その品質に影響を与える乳酸菌の検出手段に関する。本発明はまた、ビールを混濁させる乳酸菌に特異的なタンパク質およびそれをコードするポリヌクレオチドに関する。
【０００２】
背景技術
ビールは、炭素源が限定されており、アルコールや炭酸ガスを含有し、低ｐH、嫌気状態にあることに加えて、イソフムロン等、ホップ由来の抗菌活性を持つ物質を含むことから、微生物による汚染を受けにくく、また微生物が増殖しにくい飲料である。しかし、ある種のラクトバチルス属（Lactobacillus）あるいはペディオコッカス属（Pediococcus）乳酸菌は、これらの条件下でもビールに混入した場合には、増殖してビールを混濁させ、その品質に多大な影響を与えることが知られている。これらの乳酸菌としてはラクトバチルス ブレビス（L.brevis）、ペディオコッカス ダムノサス（P.damnosus）、ラクトバチルス リンドネリ（L.lindneri）等が代表的なものであるが、これら以外の乳酸菌も確認されている。しかし、ラクトバチルス ブレビス、ペディオコッカス ダムノサスでしばしば見出されることであるが、同じ種に属する乳酸菌でも、ビールにおいて増殖し、ビールを混濁させる乳酸菌株（以下「ビール混濁乳酸菌」という）と、そうでない乳酸菌株（以下「ビール非混濁乳酸菌」という）が存在することが知られており、単に属を判定しただけでは必ずしもビール混濁乳酸菌であると一義的に判断することはできない。
【０００３】
このビールの品質に影響を与える乳酸菌の検出、判定方法については従来から検討されており、その代表的な方法として、乳酸菌からＤＮＡを抽出して、ビール混濁乳酸菌の特定の遺伝子（以下「マーカー」と呼ぶ）の存在をサザンハイブリダイゼーション反応等によって確認する方法がある。特に近年ではオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）法を行い、ＤＮＡ配列を増幅させることにより、乳酸菌を判定する方法が用いられている（特開平６−１４１８９９号等）。この方法は判定に必要とされる菌体量が微量であること、操作が簡便であること、短時間で結果がわかるという利点がある。
【０００４】
この方法でビールを混濁させる乳酸菌を判定しようとする場合、その成否はマーカーおよびそれより作製されたプライマー配列に最も大きく左右される。すなわち、マーカーおよびそれより作製されたプライマー配列を保持するビール混濁乳酸菌の検出は容易に行えるが、当該配列を保持しないビール混濁乳酸菌が存在した場合はこれを検出することができない。逆に、当該配列を含むビール非混濁乳酸菌が存在した場合、これをビール混濁乳酸菌として誤って検出することになる。
【０００５】
従来のビール混濁乳酸菌のＰＣＲによる判定方法は、１６Ｓ リボゾーマルＲＮＡ遺伝子をマーカーとして、これをもとにプライマーを作製することにより、上記の問題を解決しようとしてきた。１６Ｓ リボゾーマルＲＮＡ遺伝子は細菌の生命維持に必須の遺伝子であり、保存性が高いが、その一部に可変領域と呼ばれる生物種によってＤＮＡ配列が異なる領域を有する。この可変領域は生物種の分類や進化の系統解析に広く利用されており、乳酸菌の場合もこの遺伝子をマーカーとして利用すれば、前述のラクトバチルス ブレビス、ペディオコッカス ダムノサス、ラクトバチルス リンドネリ等を検出および判別することが出来る。
【０００６】
しかし、この方法には２つの問題点があった。その一つはプライマーのＤＮＡ配列がビール混濁性と直接関係しない遺伝子に関わるものであるので、この部位に何らかの変異を持つビール混濁乳酸菌が存在した場合これを検出することが出来ない可能性が高いことである。１６Ｓ リボゾーマルＲＮＡ遺伝子の可変領域は変異が起き易い領域と考えられるが、ＰＣＲプライマーの短い領域内に変異を持つビール混濁乳酸菌が生じた場合、これを検出できないことが考えられる。
【０００７】
もう一つの問題点は、前述したように、ラクトバチルス ブレビス、ペディオコッカス ダムノサスではしばしば同じ種に属する乳酸菌であってもビール混濁乳酸菌とビール非混濁乳酸菌が存在することから、本質的に生物種の判別法であるこの手法によってこれらの乳酸菌につきビール混濁乳酸菌とビール非混濁乳酸菌を判別することはできないことである。
【０００８】
以上のことから、１６Ｓ リボゾーマルＲＮＡ遺伝子より正確にビール混濁乳酸菌を検出できるマーカー遺伝子が求められてきた。
【０００９】
１６Ｓ リボゾーマルＲＮＡ遺伝子より正確にビール混濁乳酸菌を検出できるマーカーとして、もっとも望ましいものとして、まずビール混濁能力を付与しうる原因遺伝子そのものが挙げられる。また、次に好ましいマーカーとしては、ビール混濁能力を付与しうる原因遺伝子の物理的に近傍に存在していることが明らかな塩基配列が挙げられる。
【００１０】
ビール混濁乳酸菌が、混濁能力を獲得するのに重要と思われる遺伝子についてはこれまでにいくつかの報告がある。例えば、乳酸菌を徐々にホップ濃度の高い培地に馴化し、高濃度ホップで耐性になった乳酸菌中で増加が認められたプラスミドより、ビール混濁乳酸菌判定用プローブを作製する方法（特許第３０５７５５２号）が報告されている。
【００１１】
しかしながら、この方法は乳酸菌を強制的にホップに耐性化するという処理をしているため、かならずしもビール混濁乳酸菌とビール非混濁乳酸菌の本来の違いを反映していないという問題点があった。
【００１２】
ビール混濁乳酸菌に特異的な遺伝子取得については、ラクトバチルス ブレビスからの取得例として、ホップ耐性遺伝子として取得されたｈｏｒＡや（ジャーナル オブ ザ アメリカン ソサイエティー オブ ブルーイング ケミストリー ５５巻 １３７−１４０頁、 １９９７年）、マンガン取りこみに関連する遺伝子と考えられているｈｉｔＡ（Federation of European Microbiological Societies and Netherlands Society for Microbiology 第６回乳酸菌シンポジウム要旨集1999年9月）の報告がある。これらは、ラクトバチルス ブレビスにおいてビール混濁乳酸菌判定マーカーとして一応の有効性を有すると思われるが、後述実施例に示すように、ｈｏｒＡはラクトバチルス ブレビスにおいて高率でビール非混濁乳酸菌をビール混濁乳酸菌と判定してしまうこと、および両遺伝子ともにペディオコッカス ダムノサスにおいてはビール混濁乳酸菌判定能力を持ち得ないことから、これらに比べ、より広い範囲且つ混濁能との相関性が高いビール混濁乳酸菌検出用マーカーが求められていた。
【００１３】
【発明の概要】
本発明は、ビール混濁乳酸菌をより正確に判別する方法、並びにその方法を実施するためのプローブ、プライマー、プライマーペア、および抗体の提供をその目的とする。
【００１４】
本発明はまた、ビール混濁能を有する乳酸菌に特異的なタンパク質、そのタンパク質の製造法、そのタンパク質をコードするポリヌクレオチド、そのポリヌクレオチドを担持してなるベクター、並びにそのベクターにより形質転換された宿主を提供することをその目的とする。
【００１５】
本発明者らは今般、ビール混濁乳酸菌に広く見出される特異的な遺伝子を含む領域（配列番号７９）を取得することに成功した（実施例１）。本発明者らはまた、この遺伝子に基づいて作製したプライマーを用いてＰＣＲ法によるビール混濁乳酸菌の判定を行ったところ、極めて高い頻度でビール混濁乳酸菌の判別が可能であることを見出した（実施例２）。
【００１６】
本発明によるビール混濁乳酸菌の検出用ポリヌクレオチドプローブは、配列番号１のヌクレオチド配列またはその相補配列にハイブリダイズする少なくとも１５個のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列を含んでなるものである。
【００１７】
本発明によるビール混濁乳酸菌の検出法は、本発明によるポリヌクレオチドプローブを、試料中のポリヌクレオチドとハイブリダイズさせ、次いでハイブリダイゼーション複合体を検出する工程を含んでなる方法である。
【００１８】
本発明による核酸増幅反応によるビール混濁乳酸菌の検出に用いられるポリヌクレオチドプライマーは、配列番号１のヌクレオチド配列またはその相補配列にハイブリダイズする少なくとも１５個のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列を含んでなるものである。
【００１９】
本発明によるプライマーペアは、二種類の本発明によるプライマーからなり、ビール混濁乳酸菌に特異的なゲノム配列を核酸増幅法により増幅できるものである。
【００２０】
本発明によるビール混濁乳酸菌の検出法は、本発明によるプライマーペアを用いて核酸増幅反応により試料中のポリヌクレオチドを増幅させ、次いで増幅されたポリヌクレオチドを検出する工程を含んでなる方法である。
【００２１】
本発明によるタンパク質は、配列番号３に記載のアミノ酸配列、配列番号５に記載のアミノ酸配列、または配列番号７に記載のアミノ酸配列を含んでなるものである。
【００２２】
本発明によるタンパク質はまた、後述のポリヌクレオチドを担持してなる組換えベクターを含んでなる宿主を培養し、培養物から該ポリヌクレオチドの発現産物たるタンパク質を採取する工程により得ることができる、タンパク質である。
【００２３】
本発明によるポリヌクレオチドは、配列番号３に記載のアミノ酸配列、配列番号５に記載のアミノ酸配列、または配列番号７に記載のアミノ酸配列をコードするものである。
【００２４】
本発明による組換えベクターは、本発明によるポリヌクレオチドを担持してなるものである。
【００２５】
本発明による形質転換された宿主は、本発明による組換えベクターを含んでなるものである。
【００２６】
本発明によるタンパク質の製造法は、本発明によるポリヌクレオチドを担持してなる組換えベクターを含んでなる宿主を培養し、培養物から該ポリヌクレオチドの発現産物たるタンパク質を採取する工程を含んでなるものである。
【００２７】
本発明による抗体は、本発明によるタンパク質に対するものである。
【００２８】
本発明によるビール混濁乳酸菌の検出法は、本発明による抗体を試料と反応させ、抗原抗体反応を検出する工程を含んでなるものである。
【００２９】
【発明の具体的説明】
ポリヌクレオチドプローブ
実施例１において示されるように、本発明者らはビール混濁乳酸菌に特異的な遺伝子領域（配列番号７９）を取得することに成功した。得られた領域には、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が１０箇所存在する（それぞれＯＲＦ１〜ＯＲＦ１０とする；図１参照）。特にＯＲＦ１〜３の遺伝子は一つのオペロンを形成し、ＯＲＦ１はグルコシルトランスフェラーゼあるいはドリコールリン酸マンノースシンセターゼの遺伝子、ＯＲＦ３はテイコ酸ガラクトシルトランスフェラーゼの遺伝子と考えられる。従って、このオペロンは細胞壁の糖鎖合成に関与するものであると考えられる。ビール混濁乳酸菌において細胞表層に特定の糖鎖が存在していることは、これまでに安井ら（ＦＥＭＳ マイクロバイオロジーレターズ １３３巻 １８１−１８６頁、１９９５年）や土屋ら（ジャーナルオブ ザ アメリカン ソサイエティー オブ ブルーイング ケミストリー５８巻 ８９−９３頁、 ２０００年）によって報告されている。また、後記実施例において示されるようにこれら遺伝子をマーカーとして用いて検定を行なったところ混濁能との間に極めて高い相関性が得られた。従って、少なくともこれら３つの遺伝子は、細胞表層の糖鎖合成に関与しビール中でのビール混濁乳酸菌の増殖能に寄与している、換言すれば混濁能に係る原因遺伝子の少なくとも一部である、可能性が高い。従ってこのオペロン領域は混濁能判定の為のマーカーとして有用であり、この領域中のヌクレオチド配列に基づく本発明によるポリヌクレオチドプローブは、ビール混濁乳酸菌の検出に用いることができる。
【００３０】
本発明者らは更に、オペロン領域の両側につきどの領域まで混濁判定用マーカーとして使用し得るか詳細に解析を行なったところ下記のような結果が得られた（実施例２参照）。
【００３１】
▲１▼ ＯＲＦ１〜４、８の領域をマーカーとして利用する場合には、ラクトバチルス ブレビス、ペディオコッカス ダムノサス等の乳酸菌において極めて高い頻度でビール混濁乳酸菌／ビール非混濁乳酸菌を識別できる。
【００３２】
▲２▼ ＯＲＦ９、１０の領域をマーカーとして利用する場合には、ラクトバチルスブレビスについて極めて高い頻度でビール混濁乳酸菌／ビール非混濁乳酸菌を識別できるが、ペディオコッカス ダムノサスの判定には有効ではない。
【００３３】
▲３▼ ＯＲＦ５、６、７の領域は、少なくとも調べた範囲でビール混濁乳酸菌／ビール非混濁乳酸菌の識別には使えない（但し、ＯＲＦ７は乳酸菌の種判定に使用し得る可能性がある）。
【００３４】
従って本発明によるプローブは、好ましくは、配列番号１のヌクレオチド配列またはその相補配列の連続する少なくとも１５個のヌクレオチドからなるプローブであることができる。
【００３５】
本発明によるポリヌクレオチドプローブは、好ましくは、連続する少なくとも１５個のヌクレオチドが配列番号１の２８１８位から８０５６位の配列またはその相補配列（ＯＲＦ１〜４、８にわたる配列、図１参照）の連続する少なくとも１５個のヌクレオチドからなるプローブ、更に好ましくは、連続する少なくとも１５個のヌクレオチドが配列番号１の４２０２位から７５１３位の配列またはその相補配列（ＯＲＦ１〜３にわたる配列、図１参照）の連続する少なくとも１５個のヌクレオチドからなるプローブ、最も好ましくは、連続する少なくとも１５個のヌクレオチドが、配列番号２（ＯＲＦ１）、配列番号４（ＯＲＦ２）、または配列番号６（ＯＲＦ３）のヌクレオチド配列あるいはその相補配列の連続する少なくとも１５個のヌクレオチドからなるプローブ、であることができる。
【００３６】
配列番号２（ＯＲＦ１）、配列番号４（ＯＲＦ２）、配列番号６（ＯＲＦ３）のいずれかの連続する少なくとも１５個のヌクレオチドからなるプローブは、同じＯＲＦ配列を有するがその並び方が異なっているビール混濁乳酸菌株が存在したとしても、ビール混濁乳酸菌を問題なく検出できる点で有利である。
【００３７】
本発明によるプローブには、配列番号１のヌクレオチド配列またはその相補配列の連続する１５個のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％、の同一性を有し、かつビール混濁乳酸菌に特異的なゲノム配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列からなるものも含まれる。
【００３８】
「ビール混濁乳酸菌に特異的なゲノム配列」としては、配列番号１のヌクレオチド配列およびその部分配列、配列番号２のヌクレオチド配列およびその部分配列、配列番号４のヌクレオチド配列およびその部分配列、並びに配列番号６のヌクレオチド配列およびその部分配列が挙げられる。
【００３９】
本発明において「ハイブリダイズする」とは、ストリンジェントな条件下で標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズし、標的ヌクレオチド以外のヌクレオチドにはハイブリダイズしないことを意味する。ストリンジェントな条件は、プローブ配列（あるいは後述するプライマー配列）とその相補鎖との二重鎖のＴｍ（℃）および必要な塩濃度などに依存して決定でき、プローブとなる配列を選択した後にそれに応じたストリンジェントな条件を設定することは当業者に周知の技術である（例えば、J. Sambrook, E. F. Frisch, T. Maniatis; Molecular Cloning 2nd edition,Cold Spring Harbor Laboratory(1989)等参照）。例えば１５個のヌクレオチドからなるプローブをそのプローブにとってのストリンジェントな条件（ヌクレオチド配列によって決定されるＴｍよりわずかに低い温度、および適切な塩濃度）下で使用してハイブリダイゼーションを行なえば、このヌクレオチド配列に相補的な配列に特異的にハイブリダイズし、このヌクレオチドに相補的ではない配列にはハイブリダイズしないことになる。
【００４０】
本発明において「ポリヌクレオチドプローブ」とは、サザンハイブリダイゼーション、ノザンハイブリダイゼーション、コロニーハイブリダイゼーション等の核酸の検出手段に使用されるものをいう。
【００４１】
本発明において「ポリヌクレオチド」とはＤＮＡ、ＲＮＡ、およびＰＮＡ（peptide nucleic acid）を含む意味で用いられる。
【００４２】
本発明によるポリヌクレオチドプローブの長さは、少なくとも１５個のヌクレオチド、より好ましくは、少なくとも２０個のヌクレオチドからなる。
【００４３】
本発明によるポリヌクレオチドプローブは、例えばホスファイト・トリエステル法（Hunkapiller,M.et al., Nature, 310,105, 1984）等の通常の方法に準じて、核酸の化学合成を行うことにより調製してもよいし、後述する実施例に準じてラクトバチルス ブレビスに属するビール混濁乳酸菌の全ＤＮＡを取得し、本明細書に開示されるヌクレオチド配列に基づいて目的のヌクレオチド配列を含むＤＮＡ断片をＰＣＲ法等で適宜取得してもよい。
【００４４】
ポリヌクレオチドプローブを用いたビール混濁乳酸菌の検出法
プローブを用いた検出法においては、本発明によるポリヌクレオチドプローブを核酸試料とハイブリダイズさせ、ハイブリダイゼーション複合体、すなわちヌクレオチド二本鎖、を検出することにより行うことができる。本発明による検出法においてハイブリダイゼーション複合体の存在はビール混濁乳酸菌の存在を示す。
【００４５】
プローブを用いた検出法において「ハイブリダイズする」とは、前述のポリヌクレオチドプローブの項で述べた通りである。
【００４６】
プローブを用いた検出法においては、プローブを標識して用いることができる。標識としては例えば、放射能活性（例えば、３２Ｐ、１４Ｃ、および３５Ｓ）、蛍光（例えば、ＦＩＴＣ、ユーロピウム）、化学発色のような酵素反応（例えば、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ）等を利用した標識が挙げられる。
【００４７】
ハイブリダイゼーション複合体の検出は、サザンハイブリダイゼーション、コロニーハイブリダイゼーション等の周知の技術を用いて実施できる（例えば、J. Sambrook, E. F. Frisch, T. Maniatis:Molecular Cloning 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory(1989)参照）。
【００４８】
試験対象の試料は、ビール混濁乳酸菌が含まれることが疑われる試料であることができ、具体的には、ビールの微生物検査にて検出された細菌コロニーが挙げられる。
【００４９】
プライマーおよびプライマーペア
本発明によるプライマーおよびプライマーペアは、それぞれ、ビール混濁乳酸菌に特異的なゲノム配列とハイブリダイズすることができる。従って、本発明によるプライマーペアは、ＰＣＲ法等の核酸増幅法によるビール混濁乳酸菌の検出に用いることができる。
【００５０】
本発明によるプライマーは、好ましくは、配列番号１のヌクレオチド配列またはその相補配列の連続する少なくとも１５個のヌクレオチドからなるプライマーであることができる。
【００５１】
本発明において「プライマー」とはＰＣＲ法等の核酸増幅法に使用されるヌクレオチド配列をいう。
【００５２】
本発明において「プライマーペア」とはＰＣＲ法等の核酸増幅法に使用される一対のプライマーをいう。
【００５３】
本発明によるプライマーは、少なくとも１５個のヌクレオチド（好ましくは１５〜３０個のヌクレオチド）、好ましくは少なくとも２０個のヌクレオチド（より好ましくは２０〜３０個のヌクレオチド）からなることができる。
【００５４】
本発明によるプライマーペアはビール混濁乳酸菌に特異的なゲノム配列をＰＣＲ法等の核酸増幅法により増幅できるように選択することができる。核酸増幅法は周知であり、核酸増幅法におけるプライマーペアの選択は当業者に自明であろう。例えば、ＰＣＲ法においては、二つのプライマーの一方がビール混濁乳酸菌に特異的な二本鎖ＤＮＡの一方の鎖に対合し、他方のプライマーが二本鎖ＤＮＡのもう一方の鎖に対合し、かつ一方のプライマーにより伸長された伸長鎖にもう一方のプライマーが対合するようにプライマーを選択できる。
【００５５】
具体的には、一方のプライマーが配列番号１のヌクレオチド配列の連続する少なくとも１５個のヌクレオチドからなり、他方のプライマーが配列番号１のヌクレオチド配列の相補配列の連続する少なくとも１５個のヌクレオチドからなるようにプライマーを選択することができる。また、特にＯＲＦ１、２、３、４、および８の領域がビール混濁乳酸菌に特異的であると考えられるので、これらの領域を増幅できるようにプライマーを設計することができる（実施例２および３参照）。
【００５６】
本発明によるプライマーペアはまた、好ましくは一方のプライマーが配列番号１の２８１８位から８０５６位のヌクレオチド配列（ＯＲＦ１〜４、８にわたる配列）の連続する少なくとも１５個のヌクレオチドからなり、他方のプライマーが配列番号１の２８１８位から８０５６位のヌクレオチド配列の相補配列の連続する少なくとも１５個のヌクレオチドからなるプライマーペア、より好ましくは一方のプライマーが配列番号１の４２０２位から７５１３位のヌクレオチド配列（ＯＲＦ１〜３にわたる配列）の連続する少なくとも１５個のヌクレオチドからなり、他方のプライマーが配列番号１の４２０２位から７５１３位のヌクレオチド配列の相補配列の連続する少なくとも１５個のヌクレオチドからなるプライマーペア、最も好ましくは、一方のプライマーが配列番号２、配列番号４、または配列番号６のヌクレオチド配列の連続する少なくとも１５個のヌクレオチドからなり、他方のプライマーが配列番号２、配列番号４、または配列番号６のヌクレオチド配列の相補配列の連続する少なくとも１５個のヌクレオチドからなるプライマーペア、であることができる。
【００５７】
配列番号２（ＯＲＦ１）、配列番号４（ＯＲＦ２）、配列番号６（ＯＲＦ３）のいずれか一つの配列またはその部分配列を増幅するようなプライマーペアは、同じＯＲＦ配列を有するがその並び方が異なっているビール混濁乳酸菌株が存在したとしても、ビール混濁乳酸菌を問題なく検出できる点で有利である。
【００５８】
本発明によるプライマーには、配列番号１のヌクレオチド配列またはその相補配列の連続する１５個のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％、の同一性を有し、かつビール混濁乳酸菌に特異的なゲノム配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列からなるものも含まれる。
【００５９】
本発明によるプライマーは、本明細書に開示したヌクレオチド配列に基づき、例えばホスファイト・トリエステル法（Hunkapiller,M.et al., Nature, 310,105, 1984）等の通常の方法に準じて、化学合成できる。プライマーの調製は、例えば「バイオ実験イラストレイテッド ３ 本当にふえるＰＣＲ」(中山 広樹著、秀潤社)に従って実施できる。
【００６０】
プライマーペアを用いたビール混濁乳酸菌の検出法
プライマーペアを用いた検出法において「ハイブリダイズする」とは、前述のポリヌクレオチドプローブの項で述べた通りである。
【００６１】
プライマーペアを用いたビール混濁乳酸菌の検出は、後記実施例に開示しているように、試料よりＤＮＡを取得し、これを鋳型ＤＮＡとして本発明によるプライマーを用いて常法に従いＰＣＲ反応を行い、ビール混濁乳酸菌に特異的なＤＮＡ断片の増幅の有無を検出すればよい。ＰＣＲ技術自体は周知であり（例えば、「バイオ実験イラストレイテッド ３ 本当にふえるＰＣＲ」等を参照）、当業者であれば使用するプライマーに応じて適宜本発明による方法を実施できる。本発明によるプライマーペアを用いた検出法において、増幅産物の存在はビール混濁乳酸菌の存在を示す。
【００６２】
試験対象の試料は、ビール混濁乳酸菌が含まれることが疑われる試料であることができ、具体的には、ビールの微生物検査にて検出された細菌コロニーが挙げられる。
【００６３】
ビール混濁乳酸菌に特異的なタンパク質およびそれをコードするポリヌクレオチド
本発明によるタンパク質はビール混濁乳酸菌において特異的に発現されているため、ビール混濁乳酸菌の存在の指標となる。従って、本発明によるタンパク質は、例えば、後述する本発明による抗体の作製に有用である。
【００６４】
本発明によるタンパク質には、１以上の改変を有し、かつグルコシルトランスフェラーゼまたはドリコールリン酸マンノースシンセターゼ活性を有する配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、および１以上の改変を有し、かつテイコ酸ガラクトシルトランスフェラーゼ活性を有する配列番号７に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質が含まれる。
【００６５】
本明細書において「改変」とは置換、欠失、付加、および挿入を意味する。改変の数は、例えば１〜数個、より具体的には１〜６個であることができる。改変が複数個存在する場合、導入された改変の種類は同一でも異なっていてもよい。
【００６６】
また、本発明によるタンパク質は、本発明によるポリヌクレオチドを担持してなる組換えベクターを含んでなる宿主を培養して該ポリヌクレオチドの発現産物たるタンパク質を採取する工程により得ることができるものとして、特定し得る。
【００６７】
本発明によるポリヌクレオチドは、ビール混濁乳酸菌に特異的なタンパク質をコードするものであり、後述の本発明によるタンパク質を遺伝子組換え技術によって生産するのに有用である。
【００６８】
本発明によるポリヌクレオチドは、化学合成ＤＮＡおよび天然由来ＤＮＡ（染色体由来、プラスミド由来）であることができる。
【００６９】
本発明によるポリヌクレオチドの取得方法のうち、配列番号２、４、および６のヌクレオチド配列を有するＤＮＡを取得する場合には、例えば、後記実施例に準じてラクトバチルス ブレビスに属するビール混濁乳酸菌の全ＤＮＡを取得し、本明細書に開示されるヌクレオチド配列に基づき目的のヌクレオチド配列を含むＤＮＡ断片が得られるように適宜プライマーを作成し、ＰＣＲ法でＤＮＡ断片を増幅することにより取得してもよいし、あるいはホスファイト・トリエステル法（Hunkapiller,M.et al., Nature, 310,105, 1984）等の通常の方法に準じて、核酸の化学合成を行うことにより調製することもできる。本明細書に開示されるアミノ酸配列にもとづき、配列番号２、４、および６の塩基配列と縮重関係にあるヌクレオチド配列を有するＤＮＡは、核酸の化学合成により得ることができる。
【００７０】
得られたＤＮＡの配列は、Maxam Gilbert法 (例えば、Maxam,A.M &W.Gilbert, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 74, 560, 1977 等に記載される)やSanger法（例えばSanger,F. & A.R.Coulson, J.Mol.Biol., 94, 441, 1975、Sanger,F, & Nicklen and A.R.Coulson., Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 74, 5463, 1977等に記載される）に準じて解析することにより確認することができる。
【００７１】
組換えベクターおよび形質転換体
本発明による組換えベクターは、宿主内で複製可能であり、検出可能なマーカー遺伝子をもつベクターに、本発明によるポリヌクレオチドを通常の遺伝子工学的手法を用いて組込むことにより構築することができる。
【００７２】
本発明による組換えベクターは慣用されているベクター構築の手法に従って製造することができる。具体的には、微生物である大腸菌を宿主とする場合には、例えば、プラスミドｐＵＣ１１９（宝酒造（株）製）やファージミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ（ストラタジーン社製）等を用いることができる。酵母を宿主とする場合には、プラスミドｐＹＥＳ２（インビトロジェン社製）を用いることができる。哺乳類動物細胞を宿主とする場合は、ｐＲＣ／ＲＳＶ、ｐＲＣ／ＣＭＶ（インビトロジェン社製）等のプラスミド、ＥＢウイルスプラスミドＰｒｅｐ４、ｐＣＥＰ４（インビトロジェン社製）等のウイルス由来の自律複製起点を含むベクターを用いることができる。昆虫細胞を宿主とする場合は、バキュロウイルス等の昆虫ウイルスを用いることができる。バキュロウイルス等のウイルスにＤＮＡを組込む場合には、使用しようとするウイルスのゲノムと相同な塩基配列を含有するトランスファーベクターを用いることができる。このようなトランスファーベクターとしては、クローンテック社から市販されているｐＢａｃＰＡＫ８、ｐＡｃＵＷ３１などのプラスミドをあげることができる。本発明によるポリヌクレオチドをトランスファーベクターに挿入し、トランスファーベクターとウイルスゲノムとを同時に宿主に導入すると、トランスファーベクターとウイルスゲノムとの間で相同組換えが起こり、本発明によるポリヌクレオチドがゲノム上に組み込まれたウイルスを得ることができる。
【００７３】
本発明によるタンパク質を宿主で発現させることができるベクターは、本発明によるポリヌクレオチドと、宿主で作動可能な制御配列（例えば、プロモーター配列およびターミネーター配列）とを作動可能に連結させ、これをベクターに組み込むことにより構築することができる。
【００７４】
本明細書において「作動可能に連結する」とは、本発明によるポリヌクレオチドが導入される宿主において制御配列のコントロール下で発現するように、制御配列と本発明によるポリヌクレオチドを結合させることを意味する。通常は、プロモーターを遺伝子の上流に、ターミネーターを遺伝子の下流に、それぞれ連結することができる。
【００７５】
使用できるプロモーターは、形質転換する宿主内でプロモーター活性を示すものであれば特に制限はなく、例えば、宿主細胞が動物細胞や分裂酵母である場合は、例えば、アデノウイルス（Ａｄ）の初期もしくは後期プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、シミアンウイルス（ＳＶ４０）の初期もしくは後期プロモーター、マウス乳頭腫ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）のチミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子プロモーター等をあげることができ、宿主が出芽酵母である場合はＡＤＨ１、ＧＡＬ１プロモーターなどをあげることができ、宿主が昆虫細胞である場合はバキュロウイルスのポリヘドロンプロモーターやショウジョウバエのメタロチオネインプロモーターであることができる。
【００７６】
宿主において機能するプロモーターをあらかじめ保有するベクターを使用する場合は、ベクター保有のプロモーターと本発明によるポリヌクレオチドとを作動可能に連結することができる。
【００７７】
例えば、プラスミドｐＲＣ／ＲＳＶ，ｐＲＣ／ＣＭＶ等は、動物細胞で作動可能なプロモーターの下流にクローニング部位が設けられており、クローニング部位に本発明によるポリヌクレオチドを挿入し、動物細胞へ導入すれば、本発明によるタンパク質を発現させることができる。これらのプラスミドにはあらかじめＳＶ４０の自律複製起点（ｏｒｉ）が組み込まれているため、ｏｒｉ（−）のＳＶ４０ゲノムで形質転換された培養細胞、例えばＣＯＳ細胞等に該プラスミドを導入すると、細胞内でプラスミドのコピー数が非常に増大し、結果として該プラスミドに組み込まれた本発明によるポリヌクレオチドを大量発現させることもできる。また、酵母用プラスミドｐＹＥＳ２はＧＡＬ１プロモーターを有しており、このプラスミドまたはその誘導体のＧＡＬ１プロモーターの下流に本発明によるＤＮＡを挿入すれば、本発明によるタンパク質を例えばＩＮＶＳｃ１（インビトロジェン社製）等の出芽酵母内で大量発現させることが可能なベクターを構築できる。
【００７８】
本発明による組換えベクターは、形質転換体を選択するためのマーカー遺伝子が更に連結されていてもよい。
【００７９】
本発明による組換えベクターは更に、本発明によるポリヌクレオチドの５’側または３’側に他のタンパク質またはその一部のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを直接あるいは特定のプロテアーゼに特異的な切断部位に対応するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを介して、インフレームで連結されていてもよい。他のタンパク質またはその一部のアミノ酸配列は、そのＮ末端に分泌の為のシグナルペプチド有していてもよく、この場合は５’側への連結が好ましい。
【００８０】
本発明による組換えベクターを宿主へ導入する方法は、形質転換される宿主に応じて通常用いられる方法に従うことができる。
【００８１】
例えば、大腸菌を宿主とする場合は、Molecular Cloning, J.Sambrook et al., Cold Spring Harbor (1989)等に記載される塩化カルシウム法やエレクトロポレーション法を用いることができる。酵母菌を宿主とする場合は、例えばリチウム法に基づくYeast transformation kit(インビトロジェン社製)などを用いてベクターを導入することができる。哺乳類動物細胞や昆虫細胞等を宿主とする場合は、例えば、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥデキストラン法、エレクトロポレーション法、またはリポフェクション法を用いることができる。ウイルスをベクターに用いる場合は、上述のような一般的な遺伝子導入法によりウイルスゲノムを宿主に導入できるほか、ウイルスゲノムを含有するウイルス粒子を宿主へ感染させることによってもウイルスゲノムを宿主に導入することができる。
【００８２】
形質転換体の選抜は、導入された本発明による組換えベクターが有するマーカー遺伝子の性質に応じた方法を用いればよい。
【００８３】
例えば、マーカー遺伝子が細胞致死活性を示す薬剤に対する耐性遺伝子である場合には、この薬剤を添加した培地を用いて本発明による組換えベクターを導入した細胞を培養すればよい。薬剤耐性遺伝子と選抜薬剤との組み合わせとしては、例えば、ネオマイシン耐性遺伝子とネオマイシン、ハイグロマイシン耐性遺伝子とハイグロマイシン、ブラストサイジンＳ耐性遺伝子とブラストサイジンＳが挙げられる。また、マーカー遺伝子が、宿主の栄養要求性を相補する遺伝子である場合には、この栄養素を含まない最少培地を用いて本発明による組換えベクターを導入した細胞を培養すればよい。本発明による遺伝子が宿主の染色体に導入されてなる形質転換体を取得するには、例えば、本発明による組換えベクターを制限酵素等で消化することにより直鎖状にした後、これを前述の方法で宿主へ導入して該細胞を通常数週間培養し、導入された検出マーカーを指標にして目的とする形質転換細胞を選抜すればよい。例えば、上記のような選択薬剤に対する耐性遺伝子をマーカー遺伝子として持つ本発明による組換えベクターを前述の方法で宿主に導入し、選択薬剤を添加した培地で数週間以上を継代培養し、コロニー状に生き残った選択薬剤耐性クローンをピペットで吸い上げ純化することにより、本発明による遺伝子が宿主の染色体に導入されてなる形質転換体を取得することができる。このような形質転換体は、凍結保存が可能であり、必要に応じて起眠させて使用することできるので、一過性の遺伝子導入株と比較して形質転換体作製の手間を省くことができ、形質転換細胞の性能を一定に保つこともできる点で有利である。
【００８４】
本発明によるタンパク質は、本発明による形質転換された宿主を培養し、培養物から本発明によるタンパク質を採取することにより製造できる。
【００８５】
宿主におけるプロセシング等によりＮ末端および／またはＣ末端が１または複数個欠損したタンパク質も、本発明による抗体を得るための抗原として十分利用できる。また、本発明による組換えベクターが、組換えベクターおよび宿主の項で述べたように、本発明による遺伝子の５’側または３’側に他のタンパク質またはその一部のアミノ酸配列をコードするＤＮＡを直接あるいは特定のプロテアーゼに特異的な切断部位に対応するアミノ酸配列をコードするＤＮＡを介して、インフレームで連結されている場合には、本発明によるタンパク質は他のタンパク質またはその一部との融合タンパク質の形で発現されるが、これも本発明によるタンパク質に含まれるものとする。
【００８６】
宿主が微生物である場合、この微生物の通常の培養に使用される炭素源、窒素源、有機塩類、および無機塩類等を適宜含む各種の培地を用いて培養できる。培養は、微生物の通常の培養方法に準じて行うことができ、例えば、固体培養、液体培養（攪拌培養（試験管振とう式培養、往復式振とう培養、ジャーファーメンター（Jar Fermenter）培養等）、静置培養（タンク培養等）を含む）により培養できる。培養温度は、微生物が生育する範囲で適宜変更でき、例えば、約１５℃〜約４０℃の培養温度、ｐＨ約６〜ｐＨ約８の培地で培養するとよい。培養時間は、培養条件に従って決定できるが、通常は約１日〜約５日間であることができる。
【００８７】
宿主が動物細胞である場合、この動物細胞の通常の培養に使用される培地を用いて培養できる。例えば、１０ｖ／ｖ％となるようＦＢＳを添加したＤＭＥＭ培地等の培地を用いて、３７℃、５ｖ／ｖ％ＣＯ２存在下にて、培地を数日ごとに交換しながら培養することができる。細胞がコンフルエントになるまで増殖したら、０．２５ｗ／ｖ％程度のトリプシンＰＢＳ溶液を用いて個々の細胞に分散させ、数倍に希釈して新しい培養容器に播種し培養を続け、目的とする量まで細胞が増殖したら細胞を集める。このように継代培養を行なうことにより培養スケールを任意のサイズまで拡大できる。
【００８８】
宿主が昆虫細胞の場合も同様に、例えば、１０ｖ／ｖ％ＦＢＳおよび２ｗ／ｖ％Yeastlateを含むGrace's medium等の昆虫細胞用培地を用いて２５℃〜３５℃で継代培養することにより得ることができる。ただし、Ｓｆ２１細胞などの培養容器からはがれやすい細胞の場合は、トリプシン液ではなくピペッテイングにより細胞を分散させ継代を行なうのが好ましい。また、Baculovirus等のウイルスベクターを含む形質転換細胞の場合は、細胞質効果により細胞が死滅する前、例えば培養開始から７２時間目までに培養を終了することが好ましい。
【００８９】
培養の後、公知の単離、精製手段を用いて、本発明によるタンパク質を精製・単離することができる。例えば、本発明によるタンパク質の精製は、それが細胞内に産生される場合は、例えば、培養終了後、細胞を遠心分離等で集め、細胞を通常のバッファー、例えば、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７，１ｍＭ ＥＤＴＡ，１ｍＭ ＤＴＴ，０．５ｍＭ ＰＭＳＦからなるバッファー等に懸濁した後、ポリトロン、超音波、ダウンスホモジナイザー等を用いて細胞を破砕し、破砕液を数万×ｇで数十分から１時間程度超遠心分離し、上清画分を回収することにより、本発明によるタンパク質を含む画分を得ることができる。
【００９０】
また、本発明によるタンパク質を培地中に分泌生産させる場合には、培養終了後遠心分離により上清画分として本発明によるタンパク質を含む画分を得ることができる。これら上清画分を、塩析法、溶媒沈殿法、透析法、限外ろ過法、ゲル電気泳動法、あるいはイオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー等の精製手段を適宜組み合わせることにより、精製された本発明タンパク質を回収することができる。
【００９１】
抗体および抗体を用いたビール混濁乳酸菌の検出法
本発明による抗体はビール混濁乳酸菌に特異的なタンパク質を認識することができる。従って、本発明による抗体は抗体抗原反応によるビール混濁乳酸菌の検出に用いることができる。
【００９２】
本発明による抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体の両方を含む。抗体の作製技術は周知であり、従って、本発明によるポリクローナル抗体であれ、モノクローナル抗体であれ、本発明によるタンパク質を免疫原として用い、当業者であればそれぞれの常法に従い容易に調製することができる。
【００９３】
例えば、本発明による抗体は、本発明によるタンパク質を抗原として、ウサギ、マウス、ラット、ヤギ、ヒツジ、ニワトリ、ハムスター、ウマ、モルモットなど一般に抗体を作らせるために利用される哺乳動物、鳥類などにアジュバンドなどとともに投与し、これらの動物より抗血清を取得してそのまま或は必要に応じ後述のように分画・精製を行ないポリクローナル抗体を取得することができる。モノクローナル抗体の場合は、例えば前記哺乳動物としてマウスを用い、免疫されたマウスの脾臓を摘出しこの脾臓より調製したリンパ球とマウスミエローマ（例えば、ｐ３Ｘ６３ ６．５．３ ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＲＬ−１５８０）をポリエチレングリコール１５００（ベリンガー社）を用いて細胞融合を行い、この融合細胞から限界希釈法により陽性株のスクリーニングを行なうことにより、目的とする抗体を産生するハイブリドーマを得ることができる（C. Milstein & G. Kohler, Nature, Vol.256,p495(1975)参照）。更に、抗体を発現しているハイブリドーマ細胞から抗体遺伝子、またはその一部の遺伝子をクローニングすることにより、遺伝子工学的に発現させた抗体分子を得ることもできる。
【００９４】
この様にして得られた抗体を含む材料即ち、抗血清あるいはハイブリドーマ等の培養上清から抗体を精製する方法としては、一般にタンパク質の精製に用いる工程（プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー、プロテインＧアフィニティークロマトグラフィー、Ａｖｉｄゲルクロマトグラフィー、抗イムノグロブリン固定化ゲルクロマトグラフィーなどのアフィニティークロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、レクチンアフィニティークロマトグラフィー、色素吸着クロマトグラフィー、疎水相互クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、ハイドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、フルオロアパタイトクロマトグラフィー、金属キレーティングクロマトグラフィー、等電点クロマトグラフィー、分取電気泳動法、および等電点電気泳動法など）の一つ以上を組み合わせた方法がある。また、これらの方法以外にも、本発明にかかるタンパク質を化学的に結合させたゲル担体あるいは膜を調製し、抗体を含む材料をこれに添加することにより、目的の抗体を吸着させ、これを適当な条件にて溶離、回収する方法、即ち抗原アフィニティ精製を利用することもできる。
【００９５】
抗体抗原反応の検出は周知の方法に従ってでき、例えば、次のようにして実施できる。標的乳酸菌体を４０mM Ｔｒｉｓ‐ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ溶液に懸濁したのち、十分量のガラスビーズとともに、数分間激しく攪拌しすることにより、菌体を完全に破砕する。最終濃度が０．１％となるようＳＤＳを添加して再び攪拌し、これを遠心分離して上清画分を回収する。該抗体あるいは該抗体由来のＦａｂ’フラグメントに西洋ワサビ・ペルオキシダーゼ等の標識酵素、蛍光物質，ビオチン、アイソトープ等を結合させたものを用意する。該標識抗体を標的乳酸菌体抽出液と混和して、抗原に抗体を十分吸着させたのち、過剰な標識抗体を洗浄除去したものに、抗体を標識した酵素の活性等を測定することにより、ビール混濁乳酸菌を検出することが出来る。このような検出方法はエンザイム・リンクト・イムノソルベント・アッセイ（ＥＬＩＳＡ）法、ウエスタンブロット解析法、ラジオイムノアッセイ法等数多く知られており、詳細な手順はAntibodies，A laboratory Manual ,Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory 1988等を参考にすることができる。
【００９６】
【実施例】
以下に本発明を実施例によって説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００９７】
実施例１：ビール混濁乳酸菌遺伝子の取得
ラクトバチルス ブレビスの混濁乳酸菌３株および非混濁乳酸菌２株をＭＲＳ培地（Ｏｘｏｉｄ社）１００ｍｌで定常期まで静置培養し、集菌後、Douglasらの方法 (Applied and Environmental Microbiology, 46:549-552(1983))でそれぞれの菌体より全ＤＮＡを取得した。ＤＮＡの最終濃度を約１０〜２０ｍｇ／ｍｌに調整し、このＤＮＡ ２ｍｌを鋳型ＤＮＡとし、ランダム ポリモルフィックＤＮＡ ＰＣＲ（ＲＡＰＤ ＰＣＲ）（NucleicAcid Research 22:6531-6535(1990)）を行なった。即ち、ランダムな１０ ｍｅｒの合成ＤＮＡである遺伝子マッピング用プライマー、Ｏｐｅｒｏｎ １０−ｍｅｒ Ｋｉｔｓ〈Operon社製〉のうち、Kit AAからAZまでの５４０種をプライマーとするＰＣＲを行った。プライマーは２０ｍＭのものを２ｍｌ使用し、反応液全容量を５０ｍｌ に調製した。ＰＣＲ反応試薬には宝酒造社のTakara Ex Taq kitを用い、反応機器はPerkin Elmer社のGene Amp PCR System9600を用いた。反応プログラムは９４℃ １分、３６℃ １分、７２℃ ２分の４５サイクルとした。反応終了後の反応液を１％のアガロースゲルで電気泳動し、エチジウムブロマイド溶液で染色して、増幅されたバンドを解析し、前記５４０種のプライマーのうちでビール混濁乳酸菌特異的遺伝子を認識するプライマー、即ち、ビール混濁乳酸菌３種の鋳型ＤＮＡより共通の大きさのバンドを生じさせ、ビール非混濁乳酸菌２種よりは同じ大きさのバンドを生じせしめないようなプライマーを選抜した。こうして１次選抜されたプライマーをさらに、ビール混濁乳酸菌１２株、ビール非混濁乳酸菌８株より抽出したＤＮＡを鋳型ＤＮＡとして用いて同様にＰＣＲを行い、ビール混濁乳酸菌に特異的なバンドを生じせしめるプライマーを更に絞り込んだ。
【００９８】
最終的に選抜されたプライマーの塩基配列は以下の通りであった。
【００９９】
OPAT 07 5’-ACTGCGACCA-3’ （配列番号８）
OPAR 12 5’-GGATCGTCGG-3’ （配列番号９）
OPAX 05 5’-AGTGCACACC-3’ （配列番号１０）
次に上記のＰＣＲによって生じたビール混濁乳酸菌特異的なバンドをアガロースゲルより切り出し、東洋紡績社のMag Extractor PCR and Gel Clean upを用いて回収後、Invitogen社のpCRIIベクターにクローニングした。
【０１００】
クローニングされたビール混濁乳酸菌特異的なバンドの塩基配列を決定したところ、御互いに共通の配列が認められた。３つの異なるプライマーによって増幅された領域が、実は染色体上では１つの領域であったことが確認された。
【０１０１】
そこで、ラクトバチルス ブレビスの混濁乳酸菌、Ｌ５０株よりDouglasらの方法(Applied and Environmental Microbiology, 46:549-552(1983))を用いて全ＤＮＡを調製し、このＤＮＡを制限酵素ＭｂｏＩで部分消化して、１５から２０ｋｂの断片を回収し、コスミドベクターｐＪＢ８にライゲーションしたものを大腸菌ＤＨ１に形質転換して、ゲノムライブラリーを完成させた。上記のＯＰＡＴ07primerにより増幅されたバンドをプローブとして、このゲノムライブラリーのスクリーニングを行うことにより、図１に示した制限酵素地図を持つＤＮＡフラグメントを取得した。この塩基配列を決定した（配列番号７９）。ＯＲＦ１〜１０の配列番号７９のヌクレオチド配列中の位置は下記の通りである。
【０１０２】
ＯＲＦ１：４４０６位から５３５３位
ＯＲＦ２：５３６３位から７２９７位
ＯＲＦ３：７３１３位から７７１７位
ＯＲＦ４：８２６０位から７７６６位
ＯＲＦ５：８７７８位から９０５６位
ＯＲＦ６：８５４６位から８７５５位
ＯＲＦ７：９４９６位から９８６７位
ＯＲＦ８：３９３９位から３０２２位
ＯＲＦ９：９１８位から２２０４位
ＯＲＦ１０：７２３位から２０５位
前記塩基配列中に認められたＯＲＦにつき、ＧＥＮＢＡＮＫ等のＤＮＡ配列データベースとの比較を行ない機能推定を行なった。結果は以下の通りであった。
【０１０３】
ＯＲＦ１：３１５個のアミノ酸（配列番号３）からなり、Bacillus subtilisのドリコールマンノースシンセターゼに類似する推定３８．５ｋＤａのタンパク質に対して６９％の相同性を有することから、グルコシルトランスフェラーゼあるいはドリコールリン酸マンノースシンセターゼの機能を持つタンパク質をコードすると考えられる。
【０１０４】
ＯＲＦ２：６４４個のアミノ酸（配列番号５）からなり、データベースとの比較からは相同性を有するタンパク質は存在しなかった。
【０１０５】
ＯＲＦ３：１３４個のアミノ酸（配列番号７）からなり、Listeria monocytogenesのｇｔｃＡ、テイコ酸グリコシル化タンパク質に対して６３％の相同性を有することから、テイコ酸ガラクトシルトランスフェラーゼの機能を持つタンパク質をコードすると考えられる。
【０１０６】
ＯＲＦ４：１７６個のアミノ酸からなり、Lactococcus lactisのｔｒａＡに対して８６％の相同性を有することから、ニッキング酵素の機能を有するタンパク質をコードすると考えられる。
【０１０７】
ＯＲＦ５：６９個のアミノ酸からなり、Lactococcus lactisのプラスミドｐＭＲＣ０１（Molecular Micro Biology,4:1029-1038(1998)）の推定タンパク質ＯＲＦ０００４に対して７６％の相同性を有する。
【０１０８】
ＯＲＦ６：９２個のアミノ酸からなり、Lactococcus lactisのプラスミドｐＭＲＣ０１（Molecular Micro Biology,4:1029-1038(1998)）の推定タンパク質ＯＲＦ０００３に対して７７％の相同性を有する。
【０１０９】
ＯＲＦ７：１２３個のアミノ酸からなり、Caulobacter crescentusのＩＳ２９８が持つＯｒｆＡに対して６２％の相同性を有することから、トランズポザーゼの機能を持つタンパク質をコードすると考えられる。
【０１１０】
ＯＲＦ８：３０５個のアミノ酸からなり、Leuconostoc lactisのＩＳ１０７０が持つ推定トランスポザーゼに対して９６％の相同性を有することから、トランズポザーゼの機能を持つタンパク質をコードすると考えられる。
【０１１１】
ＯＲＦ9：４２８個のアミノ酸からなり、データベースとの比較からは相同性を有するタンパク質は存在しなかった。
【０１１２】
ＯＲＦ１０：１７２個のアミノ酸からなり、Lactococcus lactisの ｙｘｃＢに対して４９％の相同性を有することから、転写調節因子の機能を持つタンパク質をコードすると考えられる。
【０１１３】
これらのうちＯＲＦ１、２、および３は１つのオペロン内にあることから、これら３個のＯＲＦは何らかの糖鎖の合成に関係しているものであると考えられる。
【０１１４】
実施例２：ＰＣＲによるビール混濁乳酸菌の判定
図１に開示した各ＯＲＦより、以下のプライマーを設計した。
【０１１５】
ＯＲＦ１−１ 5’-GTCAGCGTGCCGACATCCTG-3’（配列番号１１）
ＯＲＦ１−２ 5’-TGTATTCACCAATCACCCCG-3’（配列番号１２）
ＯＲＦ２−１ 5’-GCCCCGACTTGACCATTTGT-3’（配列番号１３）
ＯＲＦ２−２ 5’-TTAGCGGGTGAGCAGCGAGC-3’（配列番号１４）
ＯＲＦ３−１ 5’-ACAGCCTTGCGCTACCTGAT-3’（配列番号１５）
ＯＲＦ３−２ 5’-TTCACAATCAGCGGCGAACC-3’（配列番号１６）
ＯＲＦ４−１ 5’-TGAGTTTTAGTAATATTAGT-3’（配列番号１７）
ＯＲＦ４−２ 5’-AGCCAAGCTTGATGCCGGCA-3’（配列番号１８）
ＯＲＦ５−１ 5’-AAAGTAACTTAGAAAAACAA-3’（配列番号１９）
ＯＲＦ５−２ 5’-ATGATCTACGGACTTTACCT-3’（配列番号２０）
ＯＲＦ６−１ 5’-TCAATATGAAAAACTAGTCGAGCAG-3’（配列番号２１）
ＯＲＦ６−２ 5’-TTATGGACGTTAACATAGTCAGCA-3’（配列番号２２）
ＯＲＦ７−１ 5’-GGAAGATGCTCAGTGGGACCGAATC-3’（配列番号２３）
ＯＲＦ７−２ 5’-GCCTTTTGATGCGCTCGAACGAT-3’（配列番号２４）
ＯＲＦ８−１ 5’-TCACAGAAAGATTAAGTCGGCAACA-3’（配列番号２５）
ＯＲＦ８−２ 5’-TCTAATTCTTTGGCGCTAACCGTC-3’（配列番号２６）
ＯＲＦ９−１ 5’-AATTGAAAGTAAGTTGCGAAAGAAA-3’（配列番号２７）
ＯＲＦ９−２ 5’-GGCGAACCGTGAACAAATAG-3’（配列番号２８）
ＯＲＦ１０−１ 5’-TACAATTAGTAAGACAACAGGGATT-3’（配列番号２９）
ＯＲＦ１０−２ 5’-TCAGGCAATTCTTGTTCATC-3’（配列番号３０）
表１、２、および３にそれぞれ示したラクトバチルス ブレビス、ペディオコッカス ダムノサス、および正確な分類学上の種が不明な乳酸菌の単一種を培養し、Douglasらの方法(Applied and Environmental Microbiology, 46:549-552(1983))で全ＤＮＡを取得した。これらのＤＮＡ約0.1mgを鋳型ＤＮＡとし、上記の各ＯＲＦに対するプライマーを用いて、ＰＣＲを行った。反応試薬は宝酒造社のTakara Ex Taq を、反応機器はPerkin Elmer社のGene Amp PCR System9600を用いた。反応プログラムは９４℃ ３０秒、６０℃ ３０秒、７２℃ １分の２５サイクルとした。反応後の反応液を１．５％アガロースゲルで電気泳動し、ビール混濁乳酸菌特異的バンドの有無を検定した。また本発明以前にビール混濁乳酸菌判定のマーカー遺伝子として報告されていたｈｉｔＡおよびｈｏｒＡ遺伝子よりプライマーを合成し、同様の実験を行い、結果を比較した。結果は表１、２、および３に示される通りであった。
【０１１６】
【表１】
【０１１７】
【表２】
【０１１８】
【表３】
【０１１９】
その結果、各表に示すように、ＯＲＦ１、２、および３からなるオペロンをマーカーとして利用した場合、ラクトバチルス ブレビス、ペディオコッカス ダムノサスのいずれにおいても、極めて高い頻度でビール混濁乳酸菌の識別が可能であった。さらに分類学上の種が不明の単一種乳酸菌においても、やや頻度が低くなるものの、多くのビール混濁乳酸菌を識別できることが示された。
【０１２０】
次に、このオペロン領域の両隣に存在しているＯＲＦ４およびＯＲＦ８をマーカーとして利用した場合、オペロン内の遺伝子と全く同様の頻度でビール混濁乳酸菌の識別が可能であった。
【０１２１】
一方、ｈｏｒＡ遺伝子をマーカーとして利用した場合は、供試したラクトバチルス ブレビス、ペディオコッカス ダムノサスのすべての株でバンドが検出される一方、分類学上の種が不明な単一種乳酸菌では全くバンドが検出されなかった。
【０１２２】
また、ｈｉｔＡ遺伝子をマーカーとして利用した場合は、ラクトバチルス ブレビスではＯＲＦ１、２、３、４、および８と全く同様の頻度でビール混濁乳酸菌の識別が可能であったが、ペディオコッカス ダムノサスのすべての株でバンドが検出され、分類学上の種が不明な単一種乳酸菌では全くバンドが検出されなかった。
【０１２３】
以上の結果から、本発明によって開示されたＯＲＦ１、２、３、４、および８の遺伝子が、これまでに報告されている遺伝子よりも、ビール混濁乳酸菌のマーカーとして優れていることが明らかとなった。
【０１２４】
さらに、ＯＲＦの９および１０をマーカーとして利用した場合もラクトバチルス ブレビスにかぎれば極めて高い頻度でビール混濁乳酸菌の識別が可能であった。ＯＲＦ５、６、および７をマーカーとして利用した場合はビール混濁乳酸菌の識別はできなかった。
【０１２５】
実施例３：ビール混濁乳酸菌に対する特異性が高い領域に関する他のプライマーおよびプローブ用オリゴヌクレオチドの作製
ビール混濁乳酸菌に対する特異性が特に高いＯＲＦ１、２、３、４、および８の領域の塩基配列をもとにプライマーペアを設計した。必要であればプライマー設計用ソフト（例えばＯＬＩＧＯ primer analysis software ver.6.0 : National Biosciences, Inc. 製）等を利用してプライマーペアを設計してもよい。
【０１２６】
化学合成によりオリゴヌクレオチドを調製し、得られたプライマーペアをＰＣＲ法に用いる。各ＯＲＦ領域に関するＰＣＲプライマーペアとハイブリダイズの条件は以下の通りである。なお、これらのオリゴヌクレオチドは、単独ではプローブとして使用できる。
【０１２７】
（１）ＯＲＦ１に係るＰＣＲプライマー
5’-TTACTGGCCGTTGAAG-3’（配列番号３１）
5’-TGAGCTTGCCGATGT-3’（配列番号３２）
ＰＣＲの反応条件は９４℃ ３０秒、５０℃ ３０秒、７２℃ １分の２５サイクルとする。
5’-GATGCCGACCTCCAAGATGA-3’（配列番号３３）
5’-CATGCCCACCGCCAGTAG-3’（配列番号３４）
ＰＣＲの反応条件は９４℃ ３０秒、６０℃ ３０秒、７２℃ １分の２５サイクルとする。
5’-CCGACTTCCGCCTGATG-3’（配列番号３５）
5’-GGTGAGCTTGCCGATGTATT-3’（配列番号３６）
ＰＣＲの反応条件は９４℃ ３０秒、６０℃ ３０秒、７２℃ １分の２５サイクルとする。
5’-CGCGCA AACCGTCCTC-3’（配列番号３７）
5’-AGCTTGCCGATGTATTCACC-3’（配列番号３８）
ＰＣＲの反応条件は９４℃ ３０秒、６０℃ ３０秒、７２℃ １分の２５サイクルとする。
5’- TCGCCGGCATGAGTGAAGTCGTGAA-3’（配列番号３９）
5’- CGGCGCAATCGTTAGGCTGGTGAT-3’（配列番号４０）
ＰＣＲの反応条件は９４℃ ３０秒、６５℃ ３０秒、７２℃ １分の２５サイクルとする。
【０１２８】
（２）ＯＲＦ２に係るＰＣＲプライマー
5’- GCGCTGTTGGTGGTAG-3’（配列番号４１）
5’- CTGGGCTGCTTGATG-3’（配列番号４２）
ＰＣＲの反応条件は９４℃ ３０秒、５０℃ ３０秒、７２℃ １分の２５サイクルとする。
5’- TTACTGGCGATGCTGA-3’（配列番号４３）
5’- CTTGGGGATGGTTTTC-3’（配列番号４４）
ＰＣＲの反応条件は９４℃ ３０秒、５０℃ ３０秒、７２℃ １分の２５サイクルとする。
5’-GTCGCCGTTTGCCATC-3’（配列番号４５）
5’-CGCTTGGGGATGGTTT-3’（配列番号４６）
ＰＣＲの反応条件は９４℃ ３０秒、５５℃ ３０秒、７２℃ １分の２５サイクルとする。
5’-TCGTGGCCTTCGGTTTCTTT-3’（配列番号４７）
5’-CGCTTGGGGATGGTTTTCA-3’（配列番号４８）
ＰＣＲの反応条件は９４℃ ３０秒、６５℃ ３０秒、７２℃ １分の２５サイクルとする。
5’-CATCCGGTTGTGGGTAGTGAAGTTA-3’（配列番号４９）
5’-GTGGCAAGGTTAGTGAGGGTGAC-3’（配列番号５０）
ＰＣＲの反応条件は９４℃ ３０秒、６５℃ ３０秒、７２℃ １分の２５サイクルとする。
【０１２９】
（３）ＯＲＦ３に係るＰＣＲプライマー
5’-GCCTTGCGCTACCTG-3’（配列番号５１）
5’-GTGTCCGCCAGCAGT-3’（配列番号５２）
ＰＣＲの反応条件は９４℃ ３０秒、５０℃ ３０秒、７２℃ １分の２５サイクルとする。
5’-TCTTCGGCCTGACTCACCTC-3’（配列番号５３）
5’-GCACGATGACGACGACCTG-3’（配列番号５４）
ＰＣＲの反応条件は９４℃ ３０秒、６０℃ ３０秒、７２℃ １分の２５サイクルとする。
5’-CTCGCG ATGCCGTGGTTCTG-3’（配列番号５５）
5’-CCGTGTCCGCCAGCAGTGA-3’（配列番号５６）
ＰＣＲの反応条件は９４℃ ３０秒、６５℃ ３０秒、７２℃ １分の２５サイクルとする。
5’-CCTTGCGCTACCTGATTGTTGGAG -3’（配列番号５７）
5’-CATAATTGAGCACGATGACGACGAC-3’（配列番号５８）
ＰＣＲの反応条件は９４℃ ３０秒、６５℃ ３０秒、７２℃ １分の２５サイクルとする。
【０１３０】
（４）ＯＲＦ４に係るＰＣＲプライマー
5’-TGAATGGGCGAGTGAT-3’（配列番号５９）
5’-GGCAGCCAAATCGTG-3’（配列番号６０）
ＰＣＲの反応条件は９４℃ ３０秒、５０℃ ３０秒、７２℃ １分の２５サイクルとする。
5’-GCCAGTGCCGCTTAT-3’（配列番号６１）
5’-TTCTTTCTGTTCGGATTCAC-3’（配列番号６２）
ＰＣＲの反応条件は９４℃ ３０秒、５０℃ ３０秒、７２℃ １分の２５サイクルとする。
5’-GTGAATCCGAACAGAAAGAA-3’（配列番号６３）
5’-ACAGCCAGCGAATGC-3’（配列番号６４）
ＰＣＲの反応条件は９４℃ ３０秒、５０℃ ３０秒、７２℃ １分の２５サイクルとする。
5’-GATAAGGAAGGTCGCCACTA-3’（配列番号６５）
5’-GCAGCCAAATCGTGATG-3’（配列番号６６）
ＰＣＲの反応条件は９４℃ ３０秒、５５℃ ３０秒、７２℃ １分の２５サイクルとする。
5’-AAAGGACGAAGTGCGATTGCCAGTG-3’（配列番号６７）
5’-CGTTCATCACAGCCAGCGAATGC-3’（配列番号６８）
ＰＣＲの反応条件は９４℃ ３０秒、６５℃ ３０秒、７２℃ １分の２５サイクルとする。
【０１３１】
（５）ＯＲＦ８に係るＰＣＲプライマー
5’-GCGACGGTCTCTGTT-3’（配列番号６９）
5’-GTTTCTTACCCGATTGC-3’（配列番号７０）
ＰＣＲの反応条件は９４℃ ３０秒、５０℃ ３０秒、７２℃ １分の２５サイクルとする。
5’-CGACGGTCTCTGTTGAA-3’（配列番号７１）
5’-CCACTAACTTGCCTCACAAT-3’（配列番号７２）
ＰＣＲの反応条件は９４℃ ３０秒、５０℃ ３０秒、７２℃ １分の２５サイクルとする。
5’-GCTATCGCTGTCTTTTTGAA-3’（配列番号７３）
5’-AATTTTTCGCTCCTTTGGT-3’（配列番号７４）
ＰＣＲの反応条件は９４℃ ３０秒、６０℃ ３０秒、７２℃ １分の２５サイクルとする。
5’-TGGCAGACGTCAAGTATTTGTTCAC-3’（配列番号７５）
5’-TCAATTTTTCGCTCCTTTGGTATGA-3’（配列番号７６）
ＰＣＲの反応条件は９４℃ ３０秒、６５℃ ３０秒、７２℃ １分の２５サイクルとする。
5’-GAAATTCATCAAGTCACGCCCTAT-3’（配列番号７７）
5’-TCTCAATTTTTCGCTCCTTTGGTAT-3’（配列番号７８）
ＰＣＲの反応条件は９４℃ ３０秒、６５℃ ３０秒、７２℃ １分の２５サイクルとする。
【０１３２】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】ビール混濁乳酸菌に特異的な遺伝子領域（配列番号７９）におけるオープンリーディングフレームの位置と制限部位を示した図である。
【発明の背景】
発明の分野
本発明は、ビールを混濁させて、その品質に影響を与える乳酸菌の検出手段に関する。本発明はまた、ビールを混濁させる乳酸菌に特異的なタンパク質およびそれをコードするポリヌクレオチドに関する。
【０００２】
背景技術
ビールは、炭素源が限定されており、アルコールや炭酸ガスを含有し、低ｐH、嫌気状態にあることに加えて、イソフムロン等、ホップ由来の抗菌活性を持つ物質を含むことから、微生物による汚染を受けにくく、また微生物が増殖しにくい飲料である。しかし、ある種のラクトバチルス属（Lactobacillus）あるいはペディオコッカス属（Pediococcus）乳酸菌は、これらの条件下でもビールに混入した場合には、増殖してビールを混濁させ、その品質に多大な影響を与えることが知られている。これらの乳酸菌としてはラクトバチルス ブレビス（L.brevis）、ペディオコッカス ダムノサス（P.damnosus）、ラクトバチルス リンドネリ（L.lindneri）等が代表的なものであるが、これら以外の乳酸菌も確認されている。しかし、ラクトバチルス ブレビス、ペディオコッカス ダムノサスでしばしば見出されることであるが、同じ種に属する乳酸菌でも、ビールにおいて増殖し、ビールを混濁させる乳酸菌株（以下「ビール混濁乳酸菌」という）と、そうでない乳酸菌株（以下「ビール非混濁乳酸菌」という）が存在することが知られており、単に属を判定しただけでは必ずしもビール混濁乳酸菌であると一義的に判断することはできない。
【０００３】
このビールの品質に影響を与える乳酸菌の検出、判定方法については従来から検討されており、その代表的な方法として、乳酸菌からＤＮＡを抽出して、ビール混濁乳酸菌の特定の遺伝子（以下「マーカー」と呼ぶ）の存在をサザンハイブリダイゼーション反応等によって確認する方法がある。特に近年ではオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）法を行い、ＤＮＡ配列を増幅させることにより、乳酸菌を判定する方法が用いられている（特開平６−１４１８９９号等）。この方法は判定に必要とされる菌体量が微量であること、操作が簡便であること、短時間で結果がわかるという利点がある。
【０００４】
この方法でビールを混濁させる乳酸菌を判定しようとする場合、その成否はマーカーおよびそれより作製されたプライマー配列に最も大きく左右される。すなわち、マーカーおよびそれより作製されたプライマー配列を保持するビール混濁乳酸菌の検出は容易に行えるが、当該配列を保持しないビール混濁乳酸菌が存在した場合はこれを検出することができない。逆に、当該配列を含むビール非混濁乳酸菌が存在した場合、これをビール混濁乳酸菌として誤って検出することになる。
【０００５】
従来のビール混濁乳酸菌のＰＣＲによる判定方法は、１６Ｓ リボゾーマルＲＮＡ遺伝子をマーカーとして、これをもとにプライマーを作製することにより、上記の問題を解決しようとしてきた。１６Ｓ リボゾーマルＲＮＡ遺伝子は細菌の生命維持に必須の遺伝子であり、保存性が高いが、その一部に可変領域と呼ばれる生物種によってＤＮＡ配列が異なる領域を有する。この可変領域は生物種の分類や進化の系統解析に広く利用されており、乳酸菌の場合もこの遺伝子をマーカーとして利用すれば、前述のラクトバチルス ブレビス、ペディオコッカス ダムノサス、ラクトバチルス リンドネリ等を検出および判別することが出来る。
【０００６】
しかし、この方法には２つの問題点があった。その一つはプライマーのＤＮＡ配列がビール混濁性と直接関係しない遺伝子に関わるものであるので、この部位に何らかの変異を持つビール混濁乳酸菌が存在した場合これを検出することが出来ない可能性が高いことである。１６Ｓ リボゾーマルＲＮＡ遺伝子の可変領域は変異が起き易い領域と考えられるが、ＰＣＲプライマーの短い領域内に変異を持つビール混濁乳酸菌が生じた場合、これを検出できないことが考えられる。
【０００７】
もう一つの問題点は、前述したように、ラクトバチルス ブレビス、ペディオコッカス ダムノサスではしばしば同じ種に属する乳酸菌であってもビール混濁乳酸菌とビール非混濁乳酸菌が存在することから、本質的に生物種の判別法であるこの手法によってこれらの乳酸菌につきビール混濁乳酸菌とビール非混濁乳酸菌を判別することはできないことである。
【０００８】
以上のことから、１６Ｓ リボゾーマルＲＮＡ遺伝子より正確にビール混濁乳酸菌を検出できるマーカー遺伝子が求められてきた。
【０００９】
１６Ｓ リボゾーマルＲＮＡ遺伝子より正確にビール混濁乳酸菌を検出できるマーカーとして、もっとも望ましいものとして、まずビール混濁能力を付与しうる原因遺伝子そのものが挙げられる。また、次に好ましいマーカーとしては、ビール混濁能力を付与しうる原因遺伝子の物理的に近傍に存在していることが明らかな塩基配列が挙げられる。
【００１０】
ビール混濁乳酸菌が、混濁能力を獲得するのに重要と思われる遺伝子についてはこれまでにいくつかの報告がある。例えば、乳酸菌を徐々にホップ濃度の高い培地に馴化し、高濃度ホップで耐性になった乳酸菌中で増加が認められたプラスミドより、ビール混濁乳酸菌判定用プローブを作製する方法（特許第３０５７５５２号）が報告されている。
【００１１】
しかしながら、この方法は乳酸菌を強制的にホップに耐性化するという処理をしているため、かならずしもビール混濁乳酸菌とビール非混濁乳酸菌の本来の違いを反映していないという問題点があった。
【００１２】
ビール混濁乳酸菌に特異的な遺伝子取得については、ラクトバチルス ブレビスからの取得例として、ホップ耐性遺伝子として取得されたｈｏｒＡや（ジャーナル オブ ザ アメリカン ソサイエティー オブ ブルーイング ケミストリー ５５巻 １３７−１４０頁、 １９９７年）、マンガン取りこみに関連する遺伝子と考えられているｈｉｔＡ（Federation of European Microbiological Societies and Netherlands Society for Microbiology 第６回乳酸菌シンポジウム要旨集1999年9月）の報告がある。これらは、ラクトバチルス ブレビスにおいてビール混濁乳酸菌判定マーカーとして一応の有効性を有すると思われるが、後述実施例に示すように、ｈｏｒＡはラクトバチルス ブレビスにおいて高率でビール非混濁乳酸菌をビール混濁乳酸菌と判定してしまうこと、および両遺伝子ともにペディオコッカス ダムノサスにおいてはビール混濁乳酸菌判定能力を持ち得ないことから、これらに比べ、より広い範囲且つ混濁能との相関性が高いビール混濁乳酸菌検出用マーカーが求められていた。
【００１３】
【発明の概要】
本発明は、ビール混濁乳酸菌をより正確に判別する方法、並びにその方法を実施するためのプローブ、プライマー、プライマーペア、および抗体の提供をその目的とする。
【００１４】
本発明はまた、ビール混濁能を有する乳酸菌に特異的なタンパク質、そのタンパク質の製造法、そのタンパク質をコードするポリヌクレオチド、そのポリヌクレオチドを担持してなるベクター、並びにそのベクターにより形質転換された宿主を提供することをその目的とする。
【００１５】
本発明者らは今般、ビール混濁乳酸菌に広く見出される特異的な遺伝子を含む領域（配列番号７９）を取得することに成功した（実施例１）。本発明者らはまた、この遺伝子に基づいて作製したプライマーを用いてＰＣＲ法によるビール混濁乳酸菌の判定を行ったところ、極めて高い頻度でビール混濁乳酸菌の判別が可能であることを見出した（実施例２）。
【００１６】
本発明によるビール混濁乳酸菌の検出用ポリヌクレオチドプローブは、配列番号１のヌクレオチド配列またはその相補配列にハイブリダイズする少なくとも１５個のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列を含んでなるものである。
【００１７】
本発明によるビール混濁乳酸菌の検出法は、本発明によるポリヌクレオチドプローブを、試料中のポリヌクレオチドとハイブリダイズさせ、次いでハイブリダイゼーション複合体を検出する工程を含んでなる方法である。
【００１８】
本発明による核酸増幅反応によるビール混濁乳酸菌の検出に用いられるポリヌクレオチドプライマーは、配列番号１のヌクレオチド配列またはその相補配列にハイブリダイズする少なくとも１５個のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列を含んでなるものである。
【００１９】
本発明によるプライマーペアは、二種類の本発明によるプライマーからなり、ビール混濁乳酸菌に特異的なゲノム配列を核酸増幅法により増幅できるものである。
【００２０】
本発明によるビール混濁乳酸菌の検出法は、本発明によるプライマーペアを用いて核酸増幅反応により試料中のポリヌクレオチドを増幅させ、次いで増幅されたポリヌクレオチドを検出する工程を含んでなる方法である。
【００２１】
本発明によるタンパク質は、配列番号３に記載のアミノ酸配列、配列番号５に記載のアミノ酸配列、または配列番号７に記載のアミノ酸配列を含んでなるものである。
【００２２】
本発明によるタンパク質はまた、後述のポリヌクレオチドを担持してなる組換えベクターを含んでなる宿主を培養し、培養物から該ポリヌクレオチドの発現産物たるタンパク質を採取する工程により得ることができる、タンパク質である。
【００２３】
本発明によるポリヌクレオチドは、配列番号３に記載のアミノ酸配列、配列番号５に記載のアミノ酸配列、または配列番号７に記載のアミノ酸配列をコードするものである。
【００２４】
本発明による組換えベクターは、本発明によるポリヌクレオチドを担持してなるものである。
【００２５】
本発明による形質転換された宿主は、本発明による組換えベクターを含んでなるものである。
【００２６】
本発明によるタンパク質の製造法は、本発明によるポリヌクレオチドを担持してなる組換えベクターを含んでなる宿主を培養し、培養物から該ポリヌクレオチドの発現産物たるタンパク質を採取する工程を含んでなるものである。
【００２７】
本発明による抗体は、本発明によるタンパク質に対するものである。
【００２８】
本発明によるビール混濁乳酸菌の検出法は、本発明による抗体を試料と反応させ、抗原抗体反応を検出する工程を含んでなるものである。
【００２９】
【発明の具体的説明】
ポリヌクレオチドプローブ
実施例１において示されるように、本発明者らはビール混濁乳酸菌に特異的な遺伝子領域（配列番号７９）を取得することに成功した。得られた領域には、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が１０箇所存在する（それぞれＯＲＦ１〜ＯＲＦ１０とする；図１参照）。特にＯＲＦ１〜３の遺伝子は一つのオペロンを形成し、ＯＲＦ１はグルコシルトランスフェラーゼあるいはドリコールリン酸マンノースシンセターゼの遺伝子、ＯＲＦ３はテイコ酸ガラクトシルトランスフェラーゼの遺伝子と考えられる。従って、このオペロンは細胞壁の糖鎖合成に関与するものであると考えられる。ビール混濁乳酸菌において細胞表層に特定の糖鎖が存在していることは、これまでに安井ら（ＦＥＭＳ マイクロバイオロジーレターズ １３３巻 １８１−１８６頁、１９９５年）や土屋ら（ジャーナルオブ ザ アメリカン ソサイエティー オブ ブルーイング ケミストリー５８巻 ８９−９３頁、 ２０００年）によって報告されている。また、後記実施例において示されるようにこれら遺伝子をマーカーとして用いて検定を行なったところ混濁能との間に極めて高い相関性が得られた。従って、少なくともこれら３つの遺伝子は、細胞表層の糖鎖合成に関与しビール中でのビール混濁乳酸菌の増殖能に寄与している、換言すれば混濁能に係る原因遺伝子の少なくとも一部である、可能性が高い。従ってこのオペロン領域は混濁能判定の為のマーカーとして有用であり、この領域中のヌクレオチド配列に基づく本発明によるポリヌクレオチドプローブは、ビール混濁乳酸菌の検出に用いることができる。
【００３０】
本発明者らは更に、オペロン領域の両側につきどの領域まで混濁判定用マーカーとして使用し得るか詳細に解析を行なったところ下記のような結果が得られた（実施例２参照）。
【００３１】
▲１▼ ＯＲＦ１〜４、８の領域をマーカーとして利用する場合には、ラクトバチルス ブレビス、ペディオコッカス ダムノサス等の乳酸菌において極めて高い頻度でビール混濁乳酸菌／ビール非混濁乳酸菌を識別できる。
【００３２】
▲２▼ ＯＲＦ９、１０の領域をマーカーとして利用する場合には、ラクトバチルスブレビスについて極めて高い頻度でビール混濁乳酸菌／ビール非混濁乳酸菌を識別できるが、ペディオコッカス ダムノサスの判定には有効ではない。
【００３３】
▲３▼ ＯＲＦ５、６、７の領域は、少なくとも調べた範囲でビール混濁乳酸菌／ビール非混濁乳酸菌の識別には使えない（但し、ＯＲＦ７は乳酸菌の種判定に使用し得る可能性がある）。
【００３４】
従って本発明によるプローブは、好ましくは、配列番号１のヌクレオチド配列またはその相補配列の連続する少なくとも１５個のヌクレオチドからなるプローブであることができる。
【００３５】
本発明によるポリヌクレオチドプローブは、好ましくは、連続する少なくとも１５個のヌクレオチドが配列番号１の２８１８位から８０５６位の配列またはその相補配列（ＯＲＦ１〜４、８にわたる配列、図１参照）の連続する少なくとも１５個のヌクレオチドからなるプローブ、更に好ましくは、連続する少なくとも１５個のヌクレオチドが配列番号１の４２０２位から７５１３位の配列またはその相補配列（ＯＲＦ１〜３にわたる配列、図１参照）の連続する少なくとも１５個のヌクレオチドからなるプローブ、最も好ましくは、連続する少なくとも１５個のヌクレオチドが、配列番号２（ＯＲＦ１）、配列番号４（ＯＲＦ２）、または配列番号６（ＯＲＦ３）のヌクレオチド配列あるいはその相補配列の連続する少なくとも１５個のヌクレオチドからなるプローブ、であることができる。
【００３６】
配列番号２（ＯＲＦ１）、配列番号４（ＯＲＦ２）、配列番号６（ＯＲＦ３）のいずれかの連続する少なくとも１５個のヌクレオチドからなるプローブは、同じＯＲＦ配列を有するがその並び方が異なっているビール混濁乳酸菌株が存在したとしても、ビール混濁乳酸菌を問題なく検出できる点で有利である。
【００３７】
本発明によるプローブには、配列番号１のヌクレオチド配列またはその相補配列の連続する１５個のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％、の同一性を有し、かつビール混濁乳酸菌に特異的なゲノム配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列からなるものも含まれる。
【００３８】
「ビール混濁乳酸菌に特異的なゲノム配列」としては、配列番号１のヌクレオチド配列およびその部分配列、配列番号２のヌクレオチド配列およびその部分配列、配列番号４のヌクレオチド配列およびその部分配列、並びに配列番号６のヌクレオチド配列およびその部分配列が挙げられる。
【００３９】
本発明において「ハイブリダイズする」とは、ストリンジェントな条件下で標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズし、標的ヌクレオチド以外のヌクレオチドにはハイブリダイズしないことを意味する。ストリンジェントな条件は、プローブ配列（あるいは後述するプライマー配列）とその相補鎖との二重鎖のＴｍ（℃）および必要な塩濃度などに依存して決定でき、プローブとなる配列を選択した後にそれに応じたストリンジェントな条件を設定することは当業者に周知の技術である（例えば、J. Sambrook, E. F. Frisch, T. Maniatis; Molecular Cloning 2nd edition,Cold Spring Harbor Laboratory(1989)等参照）。例えば１５個のヌクレオチドからなるプローブをそのプローブにとってのストリンジェントな条件（ヌクレオチド配列によって決定されるＴｍよりわずかに低い温度、および適切な塩濃度）下で使用してハイブリダイゼーションを行なえば、このヌクレオチド配列に相補的な配列に特異的にハイブリダイズし、このヌクレオチドに相補的ではない配列にはハイブリダイズしないことになる。
【００４０】
本発明において「ポリヌクレオチドプローブ」とは、サザンハイブリダイゼーション、ノザンハイブリダイゼーション、コロニーハイブリダイゼーション等の核酸の検出手段に使用されるものをいう。
【００４１】
本発明において「ポリヌクレオチド」とはＤＮＡ、ＲＮＡ、およびＰＮＡ（peptide nucleic acid）を含む意味で用いられる。
【００４２】
本発明によるポリヌクレオチドプローブの長さは、少なくとも１５個のヌクレオチド、より好ましくは、少なくとも２０個のヌクレオチドからなる。
【００４３】
本発明によるポリヌクレオチドプローブは、例えばホスファイト・トリエステル法（Hunkapiller,M.et al., Nature, 310,105, 1984）等の通常の方法に準じて、核酸の化学合成を行うことにより調製してもよいし、後述する実施例に準じてラクトバチルス ブレビスに属するビール混濁乳酸菌の全ＤＮＡを取得し、本明細書に開示されるヌクレオチド配列に基づいて目的のヌクレオチド配列を含むＤＮＡ断片をＰＣＲ法等で適宜取得してもよい。
【００４４】
ポリヌクレオチドプローブを用いたビール混濁乳酸菌の検出法
プローブを用いた検出法においては、本発明によるポリヌクレオチドプローブを核酸試料とハイブリダイズさせ、ハイブリダイゼーション複合体、すなわちヌクレオチド二本鎖、を検出することにより行うことができる。本発明による検出法においてハイブリダイゼーション複合体の存在はビール混濁乳酸菌の存在を示す。
【００４５】
プローブを用いた検出法において「ハイブリダイズする」とは、前述のポリヌクレオチドプローブの項で述べた通りである。
【００４６】
プローブを用いた検出法においては、プローブを標識して用いることができる。標識としては例えば、放射能活性（例えば、３２Ｐ、１４Ｃ、および３５Ｓ）、蛍光（例えば、ＦＩＴＣ、ユーロピウム）、化学発色のような酵素反応（例えば、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ）等を利用した標識が挙げられる。
【００４７】
ハイブリダイゼーション複合体の検出は、サザンハイブリダイゼーション、コロニーハイブリダイゼーション等の周知の技術を用いて実施できる（例えば、J. Sambrook, E. F. Frisch, T. Maniatis:Molecular Cloning 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory(1989)参照）。
【００４８】
試験対象の試料は、ビール混濁乳酸菌が含まれることが疑われる試料であることができ、具体的には、ビールの微生物検査にて検出された細菌コロニーが挙げられる。
【００４９】
プライマーおよびプライマーペア
本発明によるプライマーおよびプライマーペアは、それぞれ、ビール混濁乳酸菌に特異的なゲノム配列とハイブリダイズすることができる。従って、本発明によるプライマーペアは、ＰＣＲ法等の核酸増幅法によるビール混濁乳酸菌の検出に用いることができる。
【００５０】
本発明によるプライマーは、好ましくは、配列番号１のヌクレオチド配列またはその相補配列の連続する少なくとも１５個のヌクレオチドからなるプライマーであることができる。
【００５１】
本発明において「プライマー」とはＰＣＲ法等の核酸増幅法に使用されるヌクレオチド配列をいう。
【００５２】
本発明において「プライマーペア」とはＰＣＲ法等の核酸増幅法に使用される一対のプライマーをいう。
【００５３】
本発明によるプライマーは、少なくとも１５個のヌクレオチド（好ましくは１５〜３０個のヌクレオチド）、好ましくは少なくとも２０個のヌクレオチド（より好ましくは２０〜３０個のヌクレオチド）からなることができる。
【００５４】
本発明によるプライマーペアはビール混濁乳酸菌に特異的なゲノム配列をＰＣＲ法等の核酸増幅法により増幅できるように選択することができる。核酸増幅法は周知であり、核酸増幅法におけるプライマーペアの選択は当業者に自明であろう。例えば、ＰＣＲ法においては、二つのプライマーの一方がビール混濁乳酸菌に特異的な二本鎖ＤＮＡの一方の鎖に対合し、他方のプライマーが二本鎖ＤＮＡのもう一方の鎖に対合し、かつ一方のプライマーにより伸長された伸長鎖にもう一方のプライマーが対合するようにプライマーを選択できる。
【００５５】
具体的には、一方のプライマーが配列番号１のヌクレオチド配列の連続する少なくとも１５個のヌクレオチドからなり、他方のプライマーが配列番号１のヌクレオチド配列の相補配列の連続する少なくとも１５個のヌクレオチドからなるようにプライマーを選択することができる。また、特にＯＲＦ１、２、３、４、および８の領域がビール混濁乳酸菌に特異的であると考えられるので、これらの領域を増幅できるようにプライマーを設計することができる（実施例２および３参照）。
【００５６】
本発明によるプライマーペアはまた、好ましくは一方のプライマーが配列番号１の２８１８位から８０５６位のヌクレオチド配列（ＯＲＦ１〜４、８にわたる配列）の連続する少なくとも１５個のヌクレオチドからなり、他方のプライマーが配列番号１の２８１８位から８０５６位のヌクレオチド配列の相補配列の連続する少なくとも１５個のヌクレオチドからなるプライマーペア、より好ましくは一方のプライマーが配列番号１の４２０２位から７５１３位のヌクレオチド配列（ＯＲＦ１〜３にわたる配列）の連続する少なくとも１５個のヌクレオチドからなり、他方のプライマーが配列番号１の４２０２位から７５１３位のヌクレオチド配列の相補配列の連続する少なくとも１５個のヌクレオチドからなるプライマーペア、最も好ましくは、一方のプライマーが配列番号２、配列番号４、または配列番号６のヌクレオチド配列の連続する少なくとも１５個のヌクレオチドからなり、他方のプライマーが配列番号２、配列番号４、または配列番号６のヌクレオチド配列の相補配列の連続する少なくとも１５個のヌクレオチドからなるプライマーペア、であることができる。
【００５７】
配列番号２（ＯＲＦ１）、配列番号４（ＯＲＦ２）、配列番号６（ＯＲＦ３）のいずれか一つの配列またはその部分配列を増幅するようなプライマーペアは、同じＯＲＦ配列を有するがその並び方が異なっているビール混濁乳酸菌株が存在したとしても、ビール混濁乳酸菌を問題なく検出できる点で有利である。
【００５８】
本発明によるプライマーには、配列番号１のヌクレオチド配列またはその相補配列の連続する１５個のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％、の同一性を有し、かつビール混濁乳酸菌に特異的なゲノム配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列からなるものも含まれる。
【００５９】
本発明によるプライマーは、本明細書に開示したヌクレオチド配列に基づき、例えばホスファイト・トリエステル法（Hunkapiller,M.et al., Nature, 310,105, 1984）等の通常の方法に準じて、化学合成できる。プライマーの調製は、例えば「バイオ実験イラストレイテッド ３ 本当にふえるＰＣＲ」(中山 広樹著、秀潤社)に従って実施できる。
【００６０】
プライマーペアを用いたビール混濁乳酸菌の検出法
プライマーペアを用いた検出法において「ハイブリダイズする」とは、前述のポリヌクレオチドプローブの項で述べた通りである。
【００６１】
プライマーペアを用いたビール混濁乳酸菌の検出は、後記実施例に開示しているように、試料よりＤＮＡを取得し、これを鋳型ＤＮＡとして本発明によるプライマーを用いて常法に従いＰＣＲ反応を行い、ビール混濁乳酸菌に特異的なＤＮＡ断片の増幅の有無を検出すればよい。ＰＣＲ技術自体は周知であり（例えば、「バイオ実験イラストレイテッド ３ 本当にふえるＰＣＲ」等を参照）、当業者であれば使用するプライマーに応じて適宜本発明による方法を実施できる。本発明によるプライマーペアを用いた検出法において、増幅産物の存在はビール混濁乳酸菌の存在を示す。
【００６２】
試験対象の試料は、ビール混濁乳酸菌が含まれることが疑われる試料であることができ、具体的には、ビールの微生物検査にて検出された細菌コロニーが挙げられる。
【００６３】
ビール混濁乳酸菌に特異的なタンパク質およびそれをコードするポリヌクレオチド
本発明によるタンパク質はビール混濁乳酸菌において特異的に発現されているため、ビール混濁乳酸菌の存在の指標となる。従って、本発明によるタンパク質は、例えば、後述する本発明による抗体の作製に有用である。
【００６４】
本発明によるタンパク質には、１以上の改変を有し、かつグルコシルトランスフェラーゼまたはドリコールリン酸マンノースシンセターゼ活性を有する配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、および１以上の改変を有し、かつテイコ酸ガラクトシルトランスフェラーゼ活性を有する配列番号７に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質が含まれる。
【００６５】
本明細書において「改変」とは置換、欠失、付加、および挿入を意味する。改変の数は、例えば１〜数個、より具体的には１〜６個であることができる。改変が複数個存在する場合、導入された改変の種類は同一でも異なっていてもよい。
【００６６】
また、本発明によるタンパク質は、本発明によるポリヌクレオチドを担持してなる組換えベクターを含んでなる宿主を培養して該ポリヌクレオチドの発現産物たるタンパク質を採取する工程により得ることができるものとして、特定し得る。
【００６７】
本発明によるポリヌクレオチドは、ビール混濁乳酸菌に特異的なタンパク質をコードするものであり、後述の本発明によるタンパク質を遺伝子組換え技術によって生産するのに有用である。
【００６８】
本発明によるポリヌクレオチドは、化学合成ＤＮＡおよび天然由来ＤＮＡ（染色体由来、プラスミド由来）であることができる。
【００６９】
本発明によるポリヌクレオチドの取得方法のうち、配列番号２、４、および６のヌクレオチド配列を有するＤＮＡを取得する場合には、例えば、後記実施例に準じてラクトバチルス ブレビスに属するビール混濁乳酸菌の全ＤＮＡを取得し、本明細書に開示されるヌクレオチド配列に基づき目的のヌクレオチド配列を含むＤＮＡ断片が得られるように適宜プライマーを作成し、ＰＣＲ法でＤＮＡ断片を増幅することにより取得してもよいし、あるいはホスファイト・トリエステル法（Hunkapiller,M.et al., Nature, 310,105, 1984）等の通常の方法に準じて、核酸の化学合成を行うことにより調製することもできる。本明細書に開示されるアミノ酸配列にもとづき、配列番号２、４、および６の塩基配列と縮重関係にあるヌクレオチド配列を有するＤＮＡは、核酸の化学合成により得ることができる。
【００７０】
得られたＤＮＡの配列は、Maxam Gilbert法 (例えば、Maxam,A.M &W.Gilbert, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 74, 560, 1977 等に記載される)やSanger法（例えばSanger,F. & A.R.Coulson, J.Mol.Biol., 94, 441, 1975、Sanger,F, & Nicklen and A.R.Coulson., Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 74, 5463, 1977等に記載される）に準じて解析することにより確認することができる。
【００７１】
組換えベクターおよび形質転換体
本発明による組換えベクターは、宿主内で複製可能であり、検出可能なマーカー遺伝子をもつベクターに、本発明によるポリヌクレオチドを通常の遺伝子工学的手法を用いて組込むことにより構築することができる。
【００７２】
本発明による組換えベクターは慣用されているベクター構築の手法に従って製造することができる。具体的には、微生物である大腸菌を宿主とする場合には、例えば、プラスミドｐＵＣ１１９（宝酒造（株）製）やファージミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ（ストラタジーン社製）等を用いることができる。酵母を宿主とする場合には、プラスミドｐＹＥＳ２（インビトロジェン社製）を用いることができる。哺乳類動物細胞を宿主とする場合は、ｐＲＣ／ＲＳＶ、ｐＲＣ／ＣＭＶ（インビトロジェン社製）等のプラスミド、ＥＢウイルスプラスミドＰｒｅｐ４、ｐＣＥＰ４（インビトロジェン社製）等のウイルス由来の自律複製起点を含むベクターを用いることができる。昆虫細胞を宿主とする場合は、バキュロウイルス等の昆虫ウイルスを用いることができる。バキュロウイルス等のウイルスにＤＮＡを組込む場合には、使用しようとするウイルスのゲノムと相同な塩基配列を含有するトランスファーベクターを用いることができる。このようなトランスファーベクターとしては、クローンテック社から市販されているｐＢａｃＰＡＫ８、ｐＡｃＵＷ３１などのプラスミドをあげることができる。本発明によるポリヌクレオチドをトランスファーベクターに挿入し、トランスファーベクターとウイルスゲノムとを同時に宿主に導入すると、トランスファーベクターとウイルスゲノムとの間で相同組換えが起こり、本発明によるポリヌクレオチドがゲノム上に組み込まれたウイルスを得ることができる。
【００７３】
本発明によるタンパク質を宿主で発現させることができるベクターは、本発明によるポリヌクレオチドと、宿主で作動可能な制御配列（例えば、プロモーター配列およびターミネーター配列）とを作動可能に連結させ、これをベクターに組み込むことにより構築することができる。
【００７４】
本明細書において「作動可能に連結する」とは、本発明によるポリヌクレオチドが導入される宿主において制御配列のコントロール下で発現するように、制御配列と本発明によるポリヌクレオチドを結合させることを意味する。通常は、プロモーターを遺伝子の上流に、ターミネーターを遺伝子の下流に、それぞれ連結することができる。
【００７５】
使用できるプロモーターは、形質転換する宿主内でプロモーター活性を示すものであれば特に制限はなく、例えば、宿主細胞が動物細胞や分裂酵母である場合は、例えば、アデノウイルス（Ａｄ）の初期もしくは後期プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、シミアンウイルス（ＳＶ４０）の初期もしくは後期プロモーター、マウス乳頭腫ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）のチミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子プロモーター等をあげることができ、宿主が出芽酵母である場合はＡＤＨ１、ＧＡＬ１プロモーターなどをあげることができ、宿主が昆虫細胞である場合はバキュロウイルスのポリヘドロンプロモーターやショウジョウバエのメタロチオネインプロモーターであることができる。
【００７６】
宿主において機能するプロモーターをあらかじめ保有するベクターを使用する場合は、ベクター保有のプロモーターと本発明によるポリヌクレオチドとを作動可能に連結することができる。
【００７７】
例えば、プラスミドｐＲＣ／ＲＳＶ，ｐＲＣ／ＣＭＶ等は、動物細胞で作動可能なプロモーターの下流にクローニング部位が設けられており、クローニング部位に本発明によるポリヌクレオチドを挿入し、動物細胞へ導入すれば、本発明によるタンパク質を発現させることができる。これらのプラスミドにはあらかじめＳＶ４０の自律複製起点（ｏｒｉ）が組み込まれているため、ｏｒｉ（−）のＳＶ４０ゲノムで形質転換された培養細胞、例えばＣＯＳ細胞等に該プラスミドを導入すると、細胞内でプラスミドのコピー数が非常に増大し、結果として該プラスミドに組み込まれた本発明によるポリヌクレオチドを大量発現させることもできる。また、酵母用プラスミドｐＹＥＳ２はＧＡＬ１プロモーターを有しており、このプラスミドまたはその誘導体のＧＡＬ１プロモーターの下流に本発明によるＤＮＡを挿入すれば、本発明によるタンパク質を例えばＩＮＶＳｃ１（インビトロジェン社製）等の出芽酵母内で大量発現させることが可能なベクターを構築できる。
【００７８】
本発明による組換えベクターは、形質転換体を選択するためのマーカー遺伝子が更に連結されていてもよい。
【００７９】
本発明による組換えベクターは更に、本発明によるポリヌクレオチドの５’側または３’側に他のタンパク質またはその一部のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを直接あるいは特定のプロテアーゼに特異的な切断部位に対応するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを介して、インフレームで連結されていてもよい。他のタンパク質またはその一部のアミノ酸配列は、そのＮ末端に分泌の為のシグナルペプチド有していてもよく、この場合は５’側への連結が好ましい。
【００８０】
本発明による組換えベクターを宿主へ導入する方法は、形質転換される宿主に応じて通常用いられる方法に従うことができる。
【００８１】
例えば、大腸菌を宿主とする場合は、Molecular Cloning, J.Sambrook et al., Cold Spring Harbor (1989)等に記載される塩化カルシウム法やエレクトロポレーション法を用いることができる。酵母菌を宿主とする場合は、例えばリチウム法に基づくYeast transformation kit(インビトロジェン社製)などを用いてベクターを導入することができる。哺乳類動物細胞や昆虫細胞等を宿主とする場合は、例えば、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥデキストラン法、エレクトロポレーション法、またはリポフェクション法を用いることができる。ウイルスをベクターに用いる場合は、上述のような一般的な遺伝子導入法によりウイルスゲノムを宿主に導入できるほか、ウイルスゲノムを含有するウイルス粒子を宿主へ感染させることによってもウイルスゲノムを宿主に導入することができる。
【００８２】
形質転換体の選抜は、導入された本発明による組換えベクターが有するマーカー遺伝子の性質に応じた方法を用いればよい。
【００８３】
例えば、マーカー遺伝子が細胞致死活性を示す薬剤に対する耐性遺伝子である場合には、この薬剤を添加した培地を用いて本発明による組換えベクターを導入した細胞を培養すればよい。薬剤耐性遺伝子と選抜薬剤との組み合わせとしては、例えば、ネオマイシン耐性遺伝子とネオマイシン、ハイグロマイシン耐性遺伝子とハイグロマイシン、ブラストサイジンＳ耐性遺伝子とブラストサイジンＳが挙げられる。また、マーカー遺伝子が、宿主の栄養要求性を相補する遺伝子である場合には、この栄養素を含まない最少培地を用いて本発明による組換えベクターを導入した細胞を培養すればよい。本発明による遺伝子が宿主の染色体に導入されてなる形質転換体を取得するには、例えば、本発明による組換えベクターを制限酵素等で消化することにより直鎖状にした後、これを前述の方法で宿主へ導入して該細胞を通常数週間培養し、導入された検出マーカーを指標にして目的とする形質転換細胞を選抜すればよい。例えば、上記のような選択薬剤に対する耐性遺伝子をマーカー遺伝子として持つ本発明による組換えベクターを前述の方法で宿主に導入し、選択薬剤を添加した培地で数週間以上を継代培養し、コロニー状に生き残った選択薬剤耐性クローンをピペットで吸い上げ純化することにより、本発明による遺伝子が宿主の染色体に導入されてなる形質転換体を取得することができる。このような形質転換体は、凍結保存が可能であり、必要に応じて起眠させて使用することできるので、一過性の遺伝子導入株と比較して形質転換体作製の手間を省くことができ、形質転換細胞の性能を一定に保つこともできる点で有利である。
【００８４】
本発明によるタンパク質は、本発明による形質転換された宿主を培養し、培養物から本発明によるタンパク質を採取することにより製造できる。
【００８５】
宿主におけるプロセシング等によりＮ末端および／またはＣ末端が１または複数個欠損したタンパク質も、本発明による抗体を得るための抗原として十分利用できる。また、本発明による組換えベクターが、組換えベクターおよび宿主の項で述べたように、本発明による遺伝子の５’側または３’側に他のタンパク質またはその一部のアミノ酸配列をコードするＤＮＡを直接あるいは特定のプロテアーゼに特異的な切断部位に対応するアミノ酸配列をコードするＤＮＡを介して、インフレームで連結されている場合には、本発明によるタンパク質は他のタンパク質またはその一部との融合タンパク質の形で発現されるが、これも本発明によるタンパク質に含まれるものとする。
【００８６】
宿主が微生物である場合、この微生物の通常の培養に使用される炭素源、窒素源、有機塩類、および無機塩類等を適宜含む各種の培地を用いて培養できる。培養は、微生物の通常の培養方法に準じて行うことができ、例えば、固体培養、液体培養（攪拌培養（試験管振とう式培養、往復式振とう培養、ジャーファーメンター（Jar Fermenter）培養等）、静置培養（タンク培養等）を含む）により培養できる。培養温度は、微生物が生育する範囲で適宜変更でき、例えば、約１５℃〜約４０℃の培養温度、ｐＨ約６〜ｐＨ約８の培地で培養するとよい。培養時間は、培養条件に従って決定できるが、通常は約１日〜約５日間であることができる。
【００８７】
宿主が動物細胞である場合、この動物細胞の通常の培養に使用される培地を用いて培養できる。例えば、１０ｖ／ｖ％となるようＦＢＳを添加したＤＭＥＭ培地等の培地を用いて、３７℃、５ｖ／ｖ％ＣＯ２存在下にて、培地を数日ごとに交換しながら培養することができる。細胞がコンフルエントになるまで増殖したら、０．２５ｗ／ｖ％程度のトリプシンＰＢＳ溶液を用いて個々の細胞に分散させ、数倍に希釈して新しい培養容器に播種し培養を続け、目的とする量まで細胞が増殖したら細胞を集める。このように継代培養を行なうことにより培養スケールを任意のサイズまで拡大できる。
【００８８】
宿主が昆虫細胞の場合も同様に、例えば、１０ｖ／ｖ％ＦＢＳおよび２ｗ／ｖ％Yeastlateを含むGrace's medium等の昆虫細胞用培地を用いて２５℃〜３５℃で継代培養することにより得ることができる。ただし、Ｓｆ２１細胞などの培養容器からはがれやすい細胞の場合は、トリプシン液ではなくピペッテイングにより細胞を分散させ継代を行なうのが好ましい。また、Baculovirus等のウイルスベクターを含む形質転換細胞の場合は、細胞質効果により細胞が死滅する前、例えば培養開始から７２時間目までに培養を終了することが好ましい。
【００８９】
培養の後、公知の単離、精製手段を用いて、本発明によるタンパク質を精製・単離することができる。例えば、本発明によるタンパク質の精製は、それが細胞内に産生される場合は、例えば、培養終了後、細胞を遠心分離等で集め、細胞を通常のバッファー、例えば、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７，１ｍＭ ＥＤＴＡ，１ｍＭ ＤＴＴ，０．５ｍＭ ＰＭＳＦからなるバッファー等に懸濁した後、ポリトロン、超音波、ダウンスホモジナイザー等を用いて細胞を破砕し、破砕液を数万×ｇで数十分から１時間程度超遠心分離し、上清画分を回収することにより、本発明によるタンパク質を含む画分を得ることができる。
【００９０】
また、本発明によるタンパク質を培地中に分泌生産させる場合には、培養終了後遠心分離により上清画分として本発明によるタンパク質を含む画分を得ることができる。これら上清画分を、塩析法、溶媒沈殿法、透析法、限外ろ過法、ゲル電気泳動法、あるいはイオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー等の精製手段を適宜組み合わせることにより、精製された本発明タンパク質を回収することができる。
【００９１】
抗体および抗体を用いたビール混濁乳酸菌の検出法
本発明による抗体はビール混濁乳酸菌に特異的なタンパク質を認識することができる。従って、本発明による抗体は抗体抗原反応によるビール混濁乳酸菌の検出に用いることができる。
【００９２】
本発明による抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体の両方を含む。抗体の作製技術は周知であり、従って、本発明によるポリクローナル抗体であれ、モノクローナル抗体であれ、本発明によるタンパク質を免疫原として用い、当業者であればそれぞれの常法に従い容易に調製することができる。
【００９３】
例えば、本発明による抗体は、本発明によるタンパク質を抗原として、ウサギ、マウス、ラット、ヤギ、ヒツジ、ニワトリ、ハムスター、ウマ、モルモットなど一般に抗体を作らせるために利用される哺乳動物、鳥類などにアジュバンドなどとともに投与し、これらの動物より抗血清を取得してそのまま或は必要に応じ後述のように分画・精製を行ないポリクローナル抗体を取得することができる。モノクローナル抗体の場合は、例えば前記哺乳動物としてマウスを用い、免疫されたマウスの脾臓を摘出しこの脾臓より調製したリンパ球とマウスミエローマ（例えば、ｐ３Ｘ６３ ６．５．３ ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＲＬ−１５８０）をポリエチレングリコール１５００（ベリンガー社）を用いて細胞融合を行い、この融合細胞から限界希釈法により陽性株のスクリーニングを行なうことにより、目的とする抗体を産生するハイブリドーマを得ることができる（C. Milstein & G. Kohler, Nature, Vol.256,p495(1975)参照）。更に、抗体を発現しているハイブリドーマ細胞から抗体遺伝子、またはその一部の遺伝子をクローニングすることにより、遺伝子工学的に発現させた抗体分子を得ることもできる。
【００９４】
この様にして得られた抗体を含む材料即ち、抗血清あるいはハイブリドーマ等の培養上清から抗体を精製する方法としては、一般にタンパク質の精製に用いる工程（プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー、プロテインＧアフィニティークロマトグラフィー、Ａｖｉｄゲルクロマトグラフィー、抗イムノグロブリン固定化ゲルクロマトグラフィーなどのアフィニティークロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、レクチンアフィニティークロマトグラフィー、色素吸着クロマトグラフィー、疎水相互クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、ハイドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、フルオロアパタイトクロマトグラフィー、金属キレーティングクロマトグラフィー、等電点クロマトグラフィー、分取電気泳動法、および等電点電気泳動法など）の一つ以上を組み合わせた方法がある。また、これらの方法以外にも、本発明にかかるタンパク質を化学的に結合させたゲル担体あるいは膜を調製し、抗体を含む材料をこれに添加することにより、目的の抗体を吸着させ、これを適当な条件にて溶離、回収する方法、即ち抗原アフィニティ精製を利用することもできる。
【００９５】
抗体抗原反応の検出は周知の方法に従ってでき、例えば、次のようにして実施できる。標的乳酸菌体を４０mM Ｔｒｉｓ‐ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ溶液に懸濁したのち、十分量のガラスビーズとともに、数分間激しく攪拌しすることにより、菌体を完全に破砕する。最終濃度が０．１％となるようＳＤＳを添加して再び攪拌し、これを遠心分離して上清画分を回収する。該抗体あるいは該抗体由来のＦａｂ’フラグメントに西洋ワサビ・ペルオキシダーゼ等の標識酵素、蛍光物質，ビオチン、アイソトープ等を結合させたものを用意する。該標識抗体を標的乳酸菌体抽出液と混和して、抗原に抗体を十分吸着させたのち、過剰な標識抗体を洗浄除去したものに、抗体を標識した酵素の活性等を測定することにより、ビール混濁乳酸菌を検出することが出来る。このような検出方法はエンザイム・リンクト・イムノソルベント・アッセイ（ＥＬＩＳＡ）法、ウエスタンブロット解析法、ラジオイムノアッセイ法等数多く知られており、詳細な手順はAntibodies，A laboratory Manual ,Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory 1988等を参考にすることができる。
【００９６】
【実施例】
以下に本発明を実施例によって説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００９７】
実施例１：ビール混濁乳酸菌遺伝子の取得
ラクトバチルス ブレビスの混濁乳酸菌３株および非混濁乳酸菌２株をＭＲＳ培地（Ｏｘｏｉｄ社）１００ｍｌで定常期まで静置培養し、集菌後、Douglasらの方法 (Applied and Environmental Microbiology, 46:549-552(1983))でそれぞれの菌体より全ＤＮＡを取得した。ＤＮＡの最終濃度を約１０〜２０ｍｇ／ｍｌに調整し、このＤＮＡ ２ｍｌを鋳型ＤＮＡとし、ランダム ポリモルフィックＤＮＡ ＰＣＲ（ＲＡＰＤ ＰＣＲ）（NucleicAcid Research 22:6531-6535(1990)）を行なった。即ち、ランダムな１０ ｍｅｒの合成ＤＮＡである遺伝子マッピング用プライマー、Ｏｐｅｒｏｎ １０−ｍｅｒ Ｋｉｔｓ〈Operon社製〉のうち、Kit AAからAZまでの５４０種をプライマーとするＰＣＲを行った。プライマーは２０ｍＭのものを２ｍｌ使用し、反応液全容量を５０ｍｌ に調製した。ＰＣＲ反応試薬には宝酒造社のTakara Ex Taq kitを用い、反応機器はPerkin Elmer社のGene Amp PCR System9600を用いた。反応プログラムは９４℃ １分、３６℃ １分、７２℃ ２分の４５サイクルとした。反応終了後の反応液を１％のアガロースゲルで電気泳動し、エチジウムブロマイド溶液で染色して、増幅されたバンドを解析し、前記５４０種のプライマーのうちでビール混濁乳酸菌特異的遺伝子を認識するプライマー、即ち、ビール混濁乳酸菌３種の鋳型ＤＮＡより共通の大きさのバンドを生じさせ、ビール非混濁乳酸菌２種よりは同じ大きさのバンドを生じせしめないようなプライマーを選抜した。こうして１次選抜されたプライマーをさらに、ビール混濁乳酸菌１２株、ビール非混濁乳酸菌８株より抽出したＤＮＡを鋳型ＤＮＡとして用いて同様にＰＣＲを行い、ビール混濁乳酸菌に特異的なバンドを生じせしめるプライマーを更に絞り込んだ。
【００９８】
最終的に選抜されたプライマーの塩基配列は以下の通りであった。
【００９９】
OPAT 07 5’-ACTGCGACCA-3’ （配列番号８）
OPAR 12 5’-GGATCGTCGG-3’ （配列番号９）
OPAX 05 5’-AGTGCACACC-3’ （配列番号１０）
次に上記のＰＣＲによって生じたビール混濁乳酸菌特異的なバンドをアガロースゲルより切り出し、東洋紡績社のMag Extractor PCR and Gel Clean upを用いて回収後、Invitogen社のpCRIIベクターにクローニングした。
【０１００】
クローニングされたビール混濁乳酸菌特異的なバンドの塩基配列を決定したところ、御互いに共通の配列が認められた。３つの異なるプライマーによって増幅された領域が、実は染色体上では１つの領域であったことが確認された。
【０１０１】
そこで、ラクトバチルス ブレビスの混濁乳酸菌、Ｌ５０株よりDouglasらの方法(Applied and Environmental Microbiology, 46:549-552(1983))を用いて全ＤＮＡを調製し、このＤＮＡを制限酵素ＭｂｏＩで部分消化して、１５から２０ｋｂの断片を回収し、コスミドベクターｐＪＢ８にライゲーションしたものを大腸菌ＤＨ１に形質転換して、ゲノムライブラリーを完成させた。上記のＯＰＡＴ07primerにより増幅されたバンドをプローブとして、このゲノムライブラリーのスクリーニングを行うことにより、図１に示した制限酵素地図を持つＤＮＡフラグメントを取得した。この塩基配列を決定した（配列番号７９）。ＯＲＦ１〜１０の配列番号７９のヌクレオチド配列中の位置は下記の通りである。
【０１０２】
ＯＲＦ１：４４０６位から５３５３位
ＯＲＦ２：５３６３位から７２９７位
ＯＲＦ３：７３１３位から７７１７位
ＯＲＦ４：８２６０位から７７６６位
ＯＲＦ５：８７７８位から９０５６位
ＯＲＦ６：８５４６位から８７５５位
ＯＲＦ７：９４９６位から９８６７位
ＯＲＦ８：３９３９位から３０２２位
ＯＲＦ９：９１８位から２２０４位
ＯＲＦ１０：７２３位から２０５位
前記塩基配列中に認められたＯＲＦにつき、ＧＥＮＢＡＮＫ等のＤＮＡ配列データベースとの比較を行ない機能推定を行なった。結果は以下の通りであった。
【０１０３】
ＯＲＦ１：３１５個のアミノ酸（配列番号３）からなり、Bacillus subtilisのドリコールマンノースシンセターゼに類似する推定３８．５ｋＤａのタンパク質に対して６９％の相同性を有することから、グルコシルトランスフェラーゼあるいはドリコールリン酸マンノースシンセターゼの機能を持つタンパク質をコードすると考えられる。
【０１０４】
ＯＲＦ２：６４４個のアミノ酸（配列番号５）からなり、データベースとの比較からは相同性を有するタンパク質は存在しなかった。
【０１０５】
ＯＲＦ３：１３４個のアミノ酸（配列番号７）からなり、Listeria monocytogenesのｇｔｃＡ、テイコ酸グリコシル化タンパク質に対して６３％の相同性を有することから、テイコ酸ガラクトシルトランスフェラーゼの機能を持つタンパク質をコードすると考えられる。
【０１０６】
ＯＲＦ４：１７６個のアミノ酸からなり、Lactococcus lactisのｔｒａＡに対して８６％の相同性を有することから、ニッキング酵素の機能を有するタンパク質をコードすると考えられる。
【０１０７】
ＯＲＦ５：６９個のアミノ酸からなり、Lactococcus lactisのプラスミドｐＭＲＣ０１（Molecular Micro Biology,4:1029-1038(1998)）の推定タンパク質ＯＲＦ０００４に対して７６％の相同性を有する。
【０１０８】
ＯＲＦ６：９２個のアミノ酸からなり、Lactococcus lactisのプラスミドｐＭＲＣ０１（Molecular Micro Biology,4:1029-1038(1998)）の推定タンパク質ＯＲＦ０００３に対して７７％の相同性を有する。
【０１０９】
ＯＲＦ７：１２３個のアミノ酸からなり、Caulobacter crescentusのＩＳ２９８が持つＯｒｆＡに対して６２％の相同性を有することから、トランズポザーゼの機能を持つタンパク質をコードすると考えられる。
【０１１０】
ＯＲＦ８：３０５個のアミノ酸からなり、Leuconostoc lactisのＩＳ１０７０が持つ推定トランスポザーゼに対して９６％の相同性を有することから、トランズポザーゼの機能を持つタンパク質をコードすると考えられる。
【０１１１】
ＯＲＦ9：４２８個のアミノ酸からなり、データベースとの比較からは相同性を有するタンパク質は存在しなかった。
【０１１２】
ＯＲＦ１０：１７２個のアミノ酸からなり、Lactococcus lactisの ｙｘｃＢに対して４９％の相同性を有することから、転写調節因子の機能を持つタンパク質をコードすると考えられる。
【０１１３】
これらのうちＯＲＦ１、２、および３は１つのオペロン内にあることから、これら３個のＯＲＦは何らかの糖鎖の合成に関係しているものであると考えられる。
【０１１４】
実施例２：ＰＣＲによるビール混濁乳酸菌の判定
図１に開示した各ＯＲＦより、以下のプライマーを設計した。
【０１１５】
ＯＲＦ１−１ 5’-GTCAGCGTGCCGACATCCTG-3’（配列番号１１）
ＯＲＦ１−２ 5’-TGTATTCACCAATCACCCCG-3’（配列番号１２）
ＯＲＦ２−１ 5’-GCCCCGACTTGACCATTTGT-3’（配列番号１３）
ＯＲＦ２−２ 5’-TTAGCGGGTGAGCAGCGAGC-3’（配列番号１４）
ＯＲＦ３−１ 5’-ACAGCCTTGCGCTACCTGAT-3’（配列番号１５）
ＯＲＦ３−２ 5’-TTCACAATCAGCGGCGAACC-3’（配列番号１６）
ＯＲＦ４−１ 5’-TGAGTTTTAGTAATATTAGT-3’（配列番号１７）
ＯＲＦ４−２ 5’-AGCCAAGCTTGATGCCGGCA-3’（配列番号１８）
ＯＲＦ５−１ 5’-AAAGTAACTTAGAAAAACAA-3’（配列番号１９）
ＯＲＦ５−２ 5’-ATGATCTACGGACTTTACCT-3’（配列番号２０）
ＯＲＦ６−１ 5’-TCAATATGAAAAACTAGTCGAGCAG-3’（配列番号２１）
ＯＲＦ６−２ 5’-TTATGGACGTTAACATAGTCAGCA-3’（配列番号２２）
ＯＲＦ７−１ 5’-GGAAGATGCTCAGTGGGACCGAATC-3’（配列番号２３）
ＯＲＦ７−２ 5’-GCCTTTTGATGCGCTCGAACGAT-3’（配列番号２４）
ＯＲＦ８−１ 5’-TCACAGAAAGATTAAGTCGGCAACA-3’（配列番号２５）
ＯＲＦ８−２ 5’-TCTAATTCTTTGGCGCTAACCGTC-3’（配列番号２６）
ＯＲＦ９−１ 5’-AATTGAAAGTAAGTTGCGAAAGAAA-3’（配列番号２７）
ＯＲＦ９−２ 5’-GGCGAACCGTGAACAAATAG-3’（配列番号２８）
ＯＲＦ１０−１ 5’-TACAATTAGTAAGACAACAGGGATT-3’（配列番号２９）
ＯＲＦ１０−２ 5’-TCAGGCAATTCTTGTTCATC-3’（配列番号３０）
表１、２、および３にそれぞれ示したラクトバチルス ブレビス、ペディオコッカス ダムノサス、および正確な分類学上の種が不明な乳酸菌の単一種を培養し、Douglasらの方法(Applied and Environmental Microbiology, 46:549-552(1983))で全ＤＮＡを取得した。これらのＤＮＡ約0.1mgを鋳型ＤＮＡとし、上記の各ＯＲＦに対するプライマーを用いて、ＰＣＲを行った。反応試薬は宝酒造社のTakara Ex Taq を、反応機器はPerkin Elmer社のGene Amp PCR System9600を用いた。反応プログラムは９４℃ ３０秒、６０℃ ３０秒、７２℃ １分の２５サイクルとした。反応後の反応液を１．５％アガロースゲルで電気泳動し、ビール混濁乳酸菌特異的バンドの有無を検定した。また本発明以前にビール混濁乳酸菌判定のマーカー遺伝子として報告されていたｈｉｔＡおよびｈｏｒＡ遺伝子よりプライマーを合成し、同様の実験を行い、結果を比較した。結果は表１、２、および３に示される通りであった。
【０１１６】
【表１】
【表２】
【表３】
その結果、各表に示すように、ＯＲＦ１、２、および３からなるオペロンをマーカーとして利用した場合、ラクトバチルス ブレビス、ペディオコッカス ダムノサスのいずれにおいても、極めて高い頻度でビール混濁乳酸菌の識別が可能であった。さらに分類学上の種が不明の単一種乳酸菌においても、やや頻度が低くなるものの、多くのビール混濁乳酸菌を識別できることが示された。
【０１２０】
次に、このオペロン領域の両隣に存在しているＯＲＦ４およびＯＲＦ８をマーカーとして利用した場合、オペロン内の遺伝子と全く同様の頻度でビール混濁乳酸菌の識別が可能であった。
【０１２１】
一方、ｈｏｒＡ遺伝子をマーカーとして利用した場合は、供試したラクトバチルス ブレビス、ペディオコッカス ダムノサスのすべての株でバンドが検出される一方、分類学上の種が不明な単一種乳酸菌では全くバンドが検出されなかった。
【０１２２】
また、ｈｉｔＡ遺伝子をマーカーとして利用した場合は、ラクトバチルス ブレビスではＯＲＦ１、２、３、４、および８と全く同様の頻度でビール混濁乳酸菌の識別が可能であったが、ペディオコッカス ダムノサスのすべての株でバンドが検出され、分類学上の種が不明な単一種乳酸菌では全くバンドが検出されなかった。
【０１２３】
以上の結果から、本発明によって開示されたＯＲＦ１、２、３、４、および８の遺伝子が、これまでに報告されている遺伝子よりも、ビール混濁乳酸菌のマーカーとして優れていることが明らかとなった。
【０１２４】
さらに、ＯＲＦの９および１０をマーカーとして利用した場合もラクトバチルス ブレビスにかぎれば極めて高い頻度でビール混濁乳酸菌の識別が可能であった。ＯＲＦ５、６、および７をマーカーとして利用した場合はビール混濁乳酸菌の識別はできなかった。
【０１２５】
実施例３：ビール混濁乳酸菌に対する特異性が高い領域に関する他のプライマーおよびプローブ用オリゴヌクレオチドの作製
ビール混濁乳酸菌に対する特異性が特に高いＯＲＦ１、２、３、４、および８の領域の塩基配列をもとにプライマーペアを設計した。必要であればプライマー設計用ソフト（例えばＯＬＩＧＯ primer analysis software ver.6.0 : National Biosciences, Inc. 製）等を利用してプライマーペアを設計してもよい。
【０１２６】
化学合成によりオリゴヌクレオチドを調製し、得られたプライマーペアをＰＣＲ法に用いる。各ＯＲＦ領域に関するＰＣＲプライマーペアとハイブリダイズの条件は以下の通りである。なお、これらのオリゴヌクレオチドは、単独ではプローブとして使用できる。
【０１２７】
（１）ＯＲＦ１に係るＰＣＲプライマー
5’-TTACTGGCCGTTGAAG-3’（配列番号３１）
5’-TGAGCTTGCCGATGT-3’（配列番号３２）
ＰＣＲの反応条件は９４℃ ３０秒、５０℃ ３０秒、７２℃ １分の２５サイクルとする。
5’-GATGCCGACCTCCAAGATGA-3’（配列番号３３）
5’-CATGCCCACCGCCAGTAG-3’（配列番号３４）
ＰＣＲの反応条件は９４℃ ３０秒、６０℃ ３０秒、７２℃ １分の２５サイクルとする。
5’-CCGACTTCCGCCTGATG-3’（配列番号３５）
5’-GGTGAGCTTGCCGATGTATT-3’（配列番号３６）
ＰＣＲの反応条件は９４℃ ３０秒、６０℃ ３０秒、７２℃ １分の２５サイクルとする。
5’-CGCGCA AACCGTCCTC-3’（配列番号３７）
5’-AGCTTGCCGATGTATTCACC-3’（配列番号３８）
ＰＣＲの反応条件は９４℃ ３０秒、６０℃ ３０秒、７２℃ １分の２５サイクルとする。
5’- TCGCCGGCATGAGTGAAGTCGTGAA-3’（配列番号３９）
5’- CGGCGCAATCGTTAGGCTGGTGAT-3’（配列番号４０）
ＰＣＲの反応条件は９４℃ ３０秒、６５℃ ３０秒、７２℃ １分の２５サイクルとする。
【０１２８】
（２）ＯＲＦ２に係るＰＣＲプライマー
5’- GCGCTGTTGGTGGTAG-3’（配列番号４１）
5’- CTGGGCTGCTTGATG-3’（配列番号４２）
ＰＣＲの反応条件は９４℃ ３０秒、５０℃ ３０秒、７２℃ １分の２５サイクルとする。
5’- TTACTGGCGATGCTGA-3’（配列番号４３）
5’- CTTGGGGATGGTTTTC-3’（配列番号４４）
ＰＣＲの反応条件は９４℃ ３０秒、５０℃ ３０秒、７２℃ １分の２５サイクルとする。
5’-GTCGCCGTTTGCCATC-3’（配列番号４５）
5’-CGCTTGGGGATGGTTT-3’（配列番号４６）
ＰＣＲの反応条件は９４℃ ３０秒、５５℃ ３０秒、７２℃ １分の２５サイクルとする。
5’-TCGTGGCCTTCGGTTTCTTT-3’（配列番号４７）
5’-CGCTTGGGGATGGTTTTCA-3’（配列番号４８）
ＰＣＲの反応条件は９４℃ ３０秒、６５℃ ３０秒、７２℃ １分の２５サイクルとする。
5’-CATCCGGTTGTGGGTAGTGAAGTTA-3’（配列番号４９）
5’-GTGGCAAGGTTAGTGAGGGTGAC-3’（配列番号５０）
ＰＣＲの反応条件は９４℃ ３０秒、６５℃ ３０秒、７２℃ １分の２５サイクルとする。
【０１２９】
（３）ＯＲＦ３に係るＰＣＲプライマー
5’-GCCTTGCGCTACCTG-3’（配列番号５１）
5’-GTGTCCGCCAGCAGT-3’（配列番号５２）
ＰＣＲの反応条件は９４℃ ３０秒、５０℃ ３０秒、７２℃ １分の２５サイクルとする。
5’-TCTTCGGCCTGACTCACCTC-3’（配列番号５３）
5’-GCACGATGACGACGACCTG-3’（配列番号５４）
ＰＣＲの反応条件は９４℃ ３０秒、６０℃ ３０秒、７２℃ １分の２５サイクルとする。
5’-CTCGCG ATGCCGTGGTTCTG-3’（配列番号５５）
5’-CCGTGTCCGCCAGCAGTGA-3’（配列番号５６）
ＰＣＲの反応条件は９４℃ ３０秒、６５℃ ３０秒、７２℃ １分の２５サイクルとする。
5’-CCTTGCGCTACCTGATTGTTGGAG -3’（配列番号５７）
5’-CATAATTGAGCACGATGACGACGAC-3’（配列番号５８）
ＰＣＲの反応条件は９４℃ ３０秒、６５℃ ３０秒、７２℃ １分の２５サイクルとする。
【０１３０】
（４）ＯＲＦ４に係るＰＣＲプライマー
5’-TGAATGGGCGAGTGAT-3’（配列番号５９）
5’-GGCAGCCAAATCGTG-3’（配列番号６０）
ＰＣＲの反応条件は９４℃ ３０秒、５０℃ ３０秒、７２℃ １分の２５サイクルとする。
5’-GCCAGTGCCGCTTAT-3’（配列番号６１）
5’-TTCTTTCTGTTCGGATTCAC-3’（配列番号６２）
ＰＣＲの反応条件は９４℃ ３０秒、５０℃ ３０秒、７２℃ １分の２５サイクルとする。
5’-GTGAATCCGAACAGAAAGAA-3’（配列番号６３）
5’-ACAGCCAGCGAATGC-3’（配列番号６４）
ＰＣＲの反応条件は９４℃ ３０秒、５０℃ ３０秒、７２℃ １分の２５サイクルとする。
5’-GATAAGGAAGGTCGCCACTA-3’（配列番号６５）
5’-GCAGCCAAATCGTGATG-3’（配列番号６６）
ＰＣＲの反応条件は９４℃ ３０秒、５５℃ ３０秒、７２℃ １分の２５サイクルとする。
5’-AAAGGACGAAGTGCGATTGCCAGTG-3’（配列番号６７）
5’-CGTTCATCACAGCCAGCGAATGC-3’（配列番号６８）
ＰＣＲの反応条件は９４℃ ３０秒、６５℃ ３０秒、７２℃ １分の２５サイクルとする。
【０１３１】
（５）ＯＲＦ８に係るＰＣＲプライマー
5’-GCGACGGTCTCTGTT-3’（配列番号６９）
5’-GTTTCTTACCCGATTGC-3’（配列番号７０）
ＰＣＲの反応条件は９４℃ ３０秒、５０℃ ３０秒、７２℃ １分の２５サイクルとする。
5’-CGACGGTCTCTGTTGAA-3’（配列番号７１）
5’-CCACTAACTTGCCTCACAAT-3’（配列番号７２）
ＰＣＲの反応条件は９４℃ ３０秒、５０℃ ３０秒、７２℃ １分の２５サイクルとする。
5’-GCTATCGCTGTCTTTTTGAA-3’（配列番号７３）
5’-AATTTTTCGCTCCTTTGGT-3’（配列番号７４）
ＰＣＲの反応条件は９４℃ ３０秒、６０℃ ３０秒、７２℃ １分の２５サイクルとする。
5’-TGGCAGACGTCAAGTATTTGTTCAC-3’（配列番号７５）
5’-TCAATTTTTCGCTCCTTTGGTATGA-3’（配列番号７６）
ＰＣＲの反応条件は９４℃ ３０秒、６５℃ ３０秒、７２℃ １分の２５サイクルとする。
5’-GAAATTCATCAAGTCACGCCCTAT-3’（配列番号７７）
5’-TCTCAATTTTTCGCTCCTTTGGTAT-3’（配列番号７８）
ＰＣＲの反応条件は９４℃ ３０秒、６５℃ ３０秒、７２℃ １分の２５サイクルとする。
【０１３２】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】ビール混濁乳酸菌に特異的な遺伝子領域（配列番号７９）におけるオープンリーディングフレームの位置と制限部位を示した図である。
Claims (6)
- 配列番号１の４２０２位から７５１３位のヌクレオチド配列またはその相補配列の連続する少なくとも１５個のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列を含んでなる、ビール混濁乳酸菌の検出に用いられるポリヌクレオチドプローブ。
- ヌクレオチド配列が、配列番号２、配列番号４、または配列番号６のヌクレオチド配列あるいはその相補配列の連続する少なくとも１５個のヌクレオチドからなる、請求項１に記載のプローブ。
- ビール混濁乳酸菌の検出法であって、請求項１または２に記載のポリヌクレオチドプローブを試料中のポリヌクレオチドとハイブリダイズさせ、次いでハイブリダイゼーション複合体を検出する工程を含んでなる方法。
- 配列番号１の４２０２位から７５１３位のヌクレオチド配列またはその相補配列の連続する少なくとも１５個のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列を含んでなる、核酸増幅反応によるビール混濁乳酸菌の検出に用いられるポリヌクレオチドプライマー。
- 請求項４に記載の二種類のプライマーからなる、ビール混濁乳酸菌の検出に用いられるプライマーペアであって、ビール混濁乳酸菌に特異的なゲノム配列を核酸増幅法により増幅できるプライマーペア。
- ビール混濁乳酸菌を検出する方法であって、請求項５に記載のプライマーペアを用いて核酸増幅反応により試料中のポリヌクレオチドを増幅し、次いで増幅されたポリヌクレオチドを検出する工程を含んでなる方法。
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