JP3448639B2 - オリゴヌクレオチドおよびそれを用いた乳酸菌の菌種同定法 - Google Patents
オリゴヌクレオチドおよびそれを用いた乳酸菌の菌種同定法Info
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- JP3448639B2 JP3448639B2 JP2000154289A JP2000154289A JP3448639B2 JP 3448639 B2 JP3448639 B2 JP 3448639B2 JP 2000154289 A JP2000154289 A JP 2000154289A JP 2000154289 A JP2000154289 A JP 2000154289A JP 3448639 B2 JP3448639 B2 JP 3448639B2
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は乳酸菌の同定・検出
のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた乳酸菌
の同定・検出方法に関し、詳しくは乳酸菌のグルタミン
酸脱炭酸酵素遺伝子に特異的な塩基配列およびそれを用
いて特定の乳酸菌を正確、迅速、かつ簡便に同定・検出
する方法に関する。
のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた乳酸菌
の同定・検出方法に関し、詳しくは乳酸菌のグルタミン
酸脱炭酸酵素遺伝子に特異的な塩基配列およびそれを用
いて特定の乳酸菌を正確、迅速、かつ簡便に同定・検出
する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】乳酸菌ラクトコッカス・ラクチス（Lact
ococcus lactis) は乳製品製造、特にチーズ製造に必須
で、発酵スターターとして原料乳に接種される。乳に接
種された乳酸菌は乳酸発酵を行い、製造に必要なｐＨ環
境を作り出し、チーズの物性を改善し、雑菌による汚染
を防止する。また、様々な酵素を放出して熟成過程にも
関与している。ラクトコッカス・ラクチスは、その微生
物学的性状の違いからラクトコッカス・ラクチス サブ
スピーシーズ ラクチス（Lactococcus lactis subsp.
lactis) とラクトコッカス・ラクチス サブスピーシー
ズ クレモリス（Lactococcus lactis subsp. cremoris)
の二亜種に分類される。さらに、ラクトコッカス・ラ
クチス サブスピーシーズ ラクチスの中でジアセチル
を生成するものを、ラクトコッカス・ラクチス サブス
ピーシーズ ラクチス バイオバラエティー ジアセチ
ラクチス（Lactococcus lactis subsp. lactis biovar
diacetylactis)として区別している。
ococcus lactis) は乳製品製造、特にチーズ製造に必須
で、発酵スターターとして原料乳に接種される。乳に接
種された乳酸菌は乳酸発酵を行い、製造に必要なｐＨ環
境を作り出し、チーズの物性を改善し、雑菌による汚染
を防止する。また、様々な酵素を放出して熟成過程にも
関与している。ラクトコッカス・ラクチスは、その微生
物学的性状の違いからラクトコッカス・ラクチス サブ
スピーシーズ ラクチス（Lactococcus lactis subsp.
lactis) とラクトコッカス・ラクチス サブスピーシー
ズ クレモリス（Lactococcus lactis subsp. cremoris)
の二亜種に分類される。さらに、ラクトコッカス・ラ
クチス サブスピーシーズ ラクチスの中でジアセチル
を生成するものを、ラクトコッカス・ラクチス サブス
ピーシーズ ラクチス バイオバラエティー ジアセチ
ラクチス（Lactococcus lactis subsp. lactis biovar
diacetylactis)として区別している。
【０００３】チーズ用のスターターとしては、酸生成力
が適当である、チーズフレーバーを生成する、高温（４
０℃）で生育しない等の性質がチーズ製造に適している
ラクトコッカス・ラクチス サブスピーシーズ クレモ
リスが好適なものとして使用されている。また、ラクト
コッカス・ラクチス サブスピーシーズ ラクチスバイ
オバラエティー ジアセチラクチスも独特のフレーバー
を付与するために、スターターとして用いられる場合が
ある。微生物による風味の形成は同じ菌種であっても株
ごとに異なるため、さらなる利用価値の高い菌株を求め
て、現在でも世界各地の伝統的な発酵乳製造現場から乳
酸菌の分離が行われている。分離された菌株について
は、菌種の同定が必要不可欠である。
が適当である、チーズフレーバーを生成する、高温（４
０℃）で生育しない等の性質がチーズ製造に適している
ラクトコッカス・ラクチス サブスピーシーズ クレモ
リスが好適なものとして使用されている。また、ラクト
コッカス・ラクチス サブスピーシーズ ラクチスバイ
オバラエティー ジアセチラクチスも独特のフレーバー
を付与するために、スターターとして用いられる場合が
ある。微生物による風味の形成は同じ菌種であっても株
ごとに異なるため、さらなる利用価値の高い菌株を求め
て、現在でも世界各地の伝統的な発酵乳製造現場から乳
酸菌の分離が行われている。分離された菌株について
は、菌種の同定が必要不可欠である。
【０００４】通常、菌種の同定は、Bergy's manual of
systematic bacteriology にしたがって被検菌の鏡検に
よる形態観察および生理・生化学的試験、すなわち表現
形質によって行われている。しかしながら、表現形質を
基にした同定法は非常に煩雑で判定に熟練と技能を要
し、多大な時間と労力を要する。そのため、近年におい
ては微生物のＤＮＡ情報を解析する手法が開発されてき
た。１６Ｓ ｒＤＮＡの塩基配列が決定され、またＤＮ
Ａ−ＤＮＡホモロジーを調べるハイブリダイゼーション
プローブやポリメラーゼ連鎖反応法（以下、ＰＣＲと略
記することがある。）用のＤＮＡプライマーが開発され
た。ラクトコッカス・ラクチスにおいても、菌種特異的
なハイブリダイゼーションプローブやＤＮＡプライマー
が開発された。
systematic bacteriology にしたがって被検菌の鏡検に
よる形態観察および生理・生化学的試験、すなわち表現
形質によって行われている。しかしながら、表現形質を
基にした同定法は非常に煩雑で判定に熟練と技能を要
し、多大な時間と労力を要する。そのため、近年におい
ては微生物のＤＮＡ情報を解析する手法が開発されてき
た。１６Ｓ ｒＤＮＡの塩基配列が決定され、またＤＮ
Ａ−ＤＮＡホモロジーを調べるハイブリダイゼーション
プローブやポリメラーゼ連鎖反応法（以下、ＰＣＲと略
記することがある。）用のＤＮＡプライマーが開発され
た。ラクトコッカス・ラクチスにおいても、菌種特異的
なハイブリダイゼーションプローブやＤＮＡプライマー
が開発された。
【０００５】また、ラクトコッカス・ラクチスの亜種判
別には、アルギニンデイミナーゼ活性を検出するのが一
般的であるが、最近になってγーアミノ酪酸生成能の表
現型によって亜種が判別できることが明らかとなり、こ
の性質を用いた亜種判別法が開発された（特許第３０１
８１６５号）。γーアミノ酪酸は、Ｌ−グルタミン酸か
らグルタミン酸脱炭酸酵素の作用によって生成するアミ
ノ酸である。
別には、アルギニンデイミナーゼ活性を検出するのが一
般的であるが、最近になってγーアミノ酪酸生成能の表
現型によって亜種が判別できることが明らかとなり、こ
の性質を用いた亜種判別法が開発された（特許第３０１
８１６５号）。γーアミノ酪酸は、Ｌ−グルタミン酸か
らグルタミン酸脱炭酸酵素の作用によって生成するアミ
ノ酸である。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】ＤＮＡ−ＤＮＡハイブ
リダイゼーションは長時間を要する上に、操作が煩雑で
ある等の問題点があった。また、ラクトコッカスの亜種
に特異的なＤＮＡプライマーは存在するが、表現形質の
違いを反映したものではないため、一部の菌株で表現形
質による分類とＤＮＡ情報による分類に違いが生じ、混
乱を生んでいる。
リダイゼーションは長時間を要する上に、操作が煩雑で
ある等の問題点があった。また、ラクトコッカスの亜種
に特異的なＤＮＡプライマーは存在するが、表現形質の
違いを反映したものではないため、一部の菌株で表現形
質による分類とＤＮＡ情報による分類に違いが生じ、混
乱を生んでいる。
【０００７】本発明の目的は、乳酸菌ラクトコッカス・
ラクチスを亜種レベルまで正確、迅速、かつ簡便に同定
・検出することができる菌種特異的プライマーを提供す
ることにある。さらに、本発明は該プライマーを用いた
乳酸菌菌種の同定・検出方法を提供することも目的とし
ている。
ラクチスを亜種レベルまで正確、迅速、かつ簡便に同定
・検出することができる菌種特異的プライマーを提供す
ることにある。さらに、本発明は該プライマーを用いた
乳酸菌菌種の同定・検出方法を提供することも目的とし
ている。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明は、乳酸菌ラクト
コッカス・ラクチスに特異的な塩基配列を有するＤＮＡ
プライマーと、これを用いてＰＣＲ反応を行うことによ
って、乳酸菌を簡便、迅速、かつ正確に同定・検出する
方法を提供するものである。すなわち、本発明者は、前
記のラクトコッカス・ラクチス サブスピーシーズラク
チスおよびラクトコッカス・ラクチス サブスピーシー
ズ クレモリスのグルタミン酸脱炭酸酵素遺伝子を解析
し、表現型の差異が遺伝子の変異に起因することを解明
した。本発明は、この遺伝子変異による菌種特異的な配
列を検出することができるＤＮＡプライマーと該プライ
マーを用いた乳酸菌菌種の同定・検出方法である。
コッカス・ラクチスに特異的な塩基配列を有するＤＮＡ
プライマーと、これを用いてＰＣＲ反応を行うことによ
って、乳酸菌を簡便、迅速、かつ正確に同定・検出する
方法を提供するものである。すなわち、本発明者は、前
記のラクトコッカス・ラクチス サブスピーシーズラク
チスおよびラクトコッカス・ラクチス サブスピーシー
ズ クレモリスのグルタミン酸脱炭酸酵素遺伝子を解析
し、表現型の差異が遺伝子の変異に起因することを解明
した。本発明は、この遺伝子変異による菌種特異的な配
列を検出することができるＤＮＡプライマーと該プライ
マーを用いた乳酸菌菌種の同定・検出方法である。
【０００９】請求項１に記載の発明は、配列表の配列番
号１および２に記載の塩基配列の組み合わせからなるオ
リゴヌクレオチドである。請求項２に記載の発明は、配
列表の配列番号３および４に記載の塩基配列の組み合わ
せからなるオリゴヌクレオチドである。請求項３に記載
の発明は、配列表の配列番号５および６に記載の塩基配
列の組み合わせからなるオリゴヌクレオチドである。
号１および２に記載の塩基配列の組み合わせからなるオ
リゴヌクレオチドである。請求項２に記載の発明は、配
列表の配列番号３および４に記載の塩基配列の組み合わ
せからなるオリゴヌクレオチドである。請求項３に記載
の発明は、配列表の配列番号５および６に記載の塩基配
列の組み合わせからなるオリゴヌクレオチドである。
【００１０】請求項４に記載の発明は、請求項１〜３の
いずれかに記載のオリゴヌクレオチドの組み合わせから
選択される１または２以上を使用することを特徴とする
乳酸菌の同定・検出方法である。請求項５に記載の発明
は、被検菌のゲノムＤＮＡを鋳型とし、請求項１〜３の
いずれかに記載のオリゴヌクレオチドの組み合わせから
選択される１または２以上をプライマーとして用いたポ
リメラーゼ連鎖反応を行う工程を含む請求項４記載の乳
酸菌の同定・検出方法である。請求項６に記載の発明
は、被検菌のゲノムＤＮＡを鋳型とし、請求項１〜３の
いずれかに記載のオリゴヌクレオチドの組み合わせから
選択される１または２以上をプライマーとして用いたポ
リメラーゼ連鎖反応によって増幅したＤＮＡ断片中にお
ける配列表の配列番号７記載の塩基配列の有無を検出す
ることを特徴とする請求項４記載の乳酸菌の同定・検出
方法である。
いずれかに記載のオリゴヌクレオチドの組み合わせから
選択される１または２以上を使用することを特徴とする
乳酸菌の同定・検出方法である。請求項５に記載の発明
は、被検菌のゲノムＤＮＡを鋳型とし、請求項１〜３の
いずれかに記載のオリゴヌクレオチドの組み合わせから
選択される１または２以上をプライマーとして用いたポ
リメラーゼ連鎖反応を行う工程を含む請求項４記載の乳
酸菌の同定・検出方法である。請求項６に記載の発明
は、被検菌のゲノムＤＮＡを鋳型とし、請求項１〜３の
いずれかに記載のオリゴヌクレオチドの組み合わせから
選択される１または２以上をプライマーとして用いたポ
リメラーゼ連鎖反応によって増幅したＤＮＡ断片中にお
ける配列表の配列番号７記載の塩基配列の有無を検出す
ることを特徴とする請求項４記載の乳酸菌の同定・検出
方法である。
【００１１】
【発明の実施の形態】以下に、本発明を詳しく説明す
る。本発明による乳酸菌の菌種同定・検出方法の対象と
なる被検菌は、乳酸菌ラクトコッカス・ラクチスの亜種
であるラクトコッカス・ラクチス サブスピーシーズ
ラクチスおよびラクトコッカス・ラクチス サブスピー
シーズ クレモリスである。本発明の方法においては、
これらの菌種を同定・検出するために、３組のオリゴヌ
クレオチドの組み合わせの中から選択したものをプライ
マーとして用いる。
る。本発明による乳酸菌の菌種同定・検出方法の対象と
なる被検菌は、乳酸菌ラクトコッカス・ラクチスの亜種
であるラクトコッカス・ラクチス サブスピーシーズ
ラクチスおよびラクトコッカス・ラクチス サブスピー
シーズ クレモリスである。本発明の方法においては、
これらの菌種を同定・検出するために、３組のオリゴヌ
クレオチドの組み合わせの中から選択したものをプライ
マーとして用いる。
【００１２】配列表の配列番号１〜２に記載の塩基配列
からなるオリゴヌクレオチドは、ラクトコッカス・ラク
チス サブスピーシーズ ラクチスの菌種同定に用いる
オリゴヌクレオチドプライマーであり、該菌種のグルタ
ミン酸脱炭酸酵素遺伝子に特異的な配列を含んでおり、
被検菌がラクトコッカス・ラクチス サブスピーシーズ
ラクチスである場合にのみＤＮＡが増幅される。増幅
されるＤＮＡは９９６ｂｐである。配列番号１記載の塩
基配列からなるオリゴヌクレオチドをｇａｄＢＬＦＷ
（以下、ＬＦＷと略記することがある。）と、配列番号
２記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをｇａｄ
ＢＬＲＶ（以下、ＬＲＶと略記することがある。）と、
それぞれ名付けた。なお、ＬＦＷとＬＲＶは、データ―
ベースであるＤＤＢＪにAccession No.AB010789 として
登録されているグルタミン酸脱炭酸酵素遺伝子配列の１
１２２〜１１４９、２１１７〜２０９２をそれぞれ基に
して設計したものである。
からなるオリゴヌクレオチドは、ラクトコッカス・ラク
チス サブスピーシーズ ラクチスの菌種同定に用いる
オリゴヌクレオチドプライマーであり、該菌種のグルタ
ミン酸脱炭酸酵素遺伝子に特異的な配列を含んでおり、
被検菌がラクトコッカス・ラクチス サブスピーシーズ
ラクチスである場合にのみＤＮＡが増幅される。増幅
されるＤＮＡは９９６ｂｐである。配列番号１記載の塩
基配列からなるオリゴヌクレオチドをｇａｄＢＬＦＷ
（以下、ＬＦＷと略記することがある。）と、配列番号
２記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをｇａｄ
ＢＬＲＶ（以下、ＬＲＶと略記することがある。）と、
それぞれ名付けた。なお、ＬＦＷとＬＲＶは、データ―
ベースであるＤＤＢＪにAccession No.AB010789 として
登録されているグルタミン酸脱炭酸酵素遺伝子配列の１
１２２〜１１４９、２１１７〜２０９２をそれぞれ基に
して設計したものである。
【００１３】配列表の配列番号３〜４に記載の塩基配列
からなるオリゴヌクレオチドは、ラクトコッカス・ラク
チス サブスピーシーズ クレモリスの菌種同定に用い
るオリゴヌクレオチドプライマーであり、該菌種のグル
タミン酸脱炭酸酵素遺伝子に特異的な配列を含んでお
り、被検菌がラクトコッカス・ラクチス サブスピーシ
ーズ クレモリスである場合にのみＤＮＡが増幅され
る。増幅されるＤＮＡは９９６ｂｐである。配列番号３
記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをｇａｄＢ
ＣＦＷ（以下、ＣＦＷと略記することがある。）と、配
列番号４記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを
ｇａｄＢＣＲＶ（以下、ＣＲＶと略記することがあ
る。）と、それぞれ名付けた。なお、ＣＦＷとＣＲＶ
は、データ―ベースであるＤＤＢＪにAccession No.AB0
33218 として登録されているグルタミン酸脱炭酸酵素遺
伝子配列の３９３〜４２０、１３８８〜１３６３をそれ
ぞれ基にして設計したものである。
からなるオリゴヌクレオチドは、ラクトコッカス・ラク
チス サブスピーシーズ クレモリスの菌種同定に用い
るオリゴヌクレオチドプライマーであり、該菌種のグル
タミン酸脱炭酸酵素遺伝子に特異的な配列を含んでお
り、被検菌がラクトコッカス・ラクチス サブスピーシ
ーズ クレモリスである場合にのみＤＮＡが増幅され
る。増幅されるＤＮＡは９９６ｂｐである。配列番号３
記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをｇａｄＢ
ＣＦＷ（以下、ＣＦＷと略記することがある。）と、配
列番号４記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを
ｇａｄＢＣＲＶ（以下、ＣＲＶと略記することがあ
る。）と、それぞれ名付けた。なお、ＣＦＷとＣＲＶ
は、データ―ベースであるＤＤＢＪにAccession No.AB0
33218 として登録されているグルタミン酸脱炭酸酵素遺
伝子配列の３９３〜４２０、１３８８〜１３６３をそれ
ぞれ基にして設計したものである。
【００１４】配列表の配列番号５〜６記載の塩基配列か
らなるオリゴヌクレオチドは、ラクトコッカス・ラクチ
ス サブスピーシーズ ラクチスおよびラクトコッカス
・ラクチス サブスピーシーズ クレモリスのグルタミ
ン酸脱炭酸酵素遺伝子の内部配列と３' 下流配列におい
て、両菌種に共通な配列を含んでいるため、どちらの菌
種であってもＤＮＡが増幅される。しかし、ラクトコッ
カス・ラクチス サブスピーシーズ クレモリスは増幅
領域内に約４０ｂｐの塩基欠失があるため、この１対の
プライマーを用いた場合の増幅産物はラクトコッカス・
ラクチス サブスピーシーズ ラクチスの増幅産物より
も約４０ｂｐ小さくなり、ラクトコッカス・ラクチス
サブスピーシーズ ラクチスの場合は６０２ｂｐ、ラク
トコッカス・ラクチス サブスピーシーズ クレモリス
の場合は５６４ｂｐである。配列番号５記載の塩基配列
からなるオリゴヌクレオチドをｇａｄＢ（２１）と、配
列番号６記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを
ＧＡＤ７と、それぞれ名付けた。なお、ｇａｄＢ（２
１）とＧＡＤ７は、データ―ベースであるＤＤＢＪにAc
cession No.AB010789 として登録されているグルタミン
酸脱炭酸酵素遺伝子配列の１９０１〜１９２６、２５０
２〜２４７６をそれぞれ基にして設計したものである。
らなるオリゴヌクレオチドは、ラクトコッカス・ラクチ
ス サブスピーシーズ ラクチスおよびラクトコッカス
・ラクチス サブスピーシーズ クレモリスのグルタミ
ン酸脱炭酸酵素遺伝子の内部配列と３' 下流配列におい
て、両菌種に共通な配列を含んでいるため、どちらの菌
種であってもＤＮＡが増幅される。しかし、ラクトコッ
カス・ラクチス サブスピーシーズ クレモリスは増幅
領域内に約４０ｂｐの塩基欠失があるため、この１対の
プライマーを用いた場合の増幅産物はラクトコッカス・
ラクチス サブスピーシーズ ラクチスの増幅産物より
も約４０ｂｐ小さくなり、ラクトコッカス・ラクチス
サブスピーシーズ ラクチスの場合は６０２ｂｐ、ラク
トコッカス・ラクチス サブスピーシーズ クレモリス
の場合は５６４ｂｐである。配列番号５記載の塩基配列
からなるオリゴヌクレオチドをｇａｄＢ（２１）と、配
列番号６記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを
ＧＡＤ７と、それぞれ名付けた。なお、ｇａｄＢ（２
１）とＧＡＤ７は、データ―ベースであるＤＤＢＪにAc
cession No.AB010789 として登録されているグルタミン
酸脱炭酸酵素遺伝子配列の１９０１〜１９２６、２５０
２〜２４７６をそれぞれ基にして設計したものである。
【００１５】また、ラクトコッカス・ラクチス サブス
ピーシーズ クレモリスは、グルタミン酸脱炭酸酵素遺
伝子の内部に、１塩基のチミン挿入変異が存在する。こ
の変異によって、該菌種のグルタミン酸脱炭酸酵素遺伝
子の制限酵素切断サイトである配列表の配列番号７記載
の配列が消失する。すなわち、ラクトコッカス・ラクチ
ス サブスピーシーズ ラクチスから増幅されたＤＮＡ
断片は、配列表の配列番号７記載の配列を認識するＡｓ
ｅＩ等の制限酵素で切断されるが、ラクトコッカス・ラ
クチス サブスピーシーズ クレモリスから増幅したＤ
ＮＡ断片は、該制限酵素では切断されない。したがっ
て、両菌種間で制限酵素断片長に多型が生じ、ポリメラ
ーゼ連鎖反応−制限酵素断片長多型解析（以下、ＰＣＲ
−ＲＦＬＰと略記することがある。）が可能となる。
ピーシーズ クレモリスは、グルタミン酸脱炭酸酵素遺
伝子の内部に、１塩基のチミン挿入変異が存在する。こ
の変異によって、該菌種のグルタミン酸脱炭酸酵素遺伝
子の制限酵素切断サイトである配列表の配列番号７記載
の配列が消失する。すなわち、ラクトコッカス・ラクチ
ス サブスピーシーズ ラクチスから増幅されたＤＮＡ
断片は、配列表の配列番号７記載の配列を認識するＡｓ
ｅＩ等の制限酵素で切断されるが、ラクトコッカス・ラ
クチス サブスピーシーズ クレモリスから増幅したＤ
ＮＡ断片は、該制限酵素では切断されない。したがっ
て、両菌種間で制限酵素断片長に多型が生じ、ポリメラ
ーゼ連鎖反応−制限酵素断片長多型解析（以下、ＰＣＲ
−ＲＦＬＰと略記することがある。）が可能となる。
【００１６】上記のように設計した配列表の配列番号１
〜６に記載した塩基配列からなる３組のオリゴヌクレオ
チドプライマーは、その塩基配列に従い、ＤＮＡ合成機
等を用いた常法によって、人工的に合成することができ
る。これらの合成されたオリゴヌクレオチドプライマー
の種特異性については、７種の乳酸菌（ラクトコッカス
・ラクチス サブスピーシーズ ラクチス、ラクトコッ
カス・ラクチス サブスピーシーズ クレモリス、スト
レプトコッカス・サーモフィルス（Streptococcus ther
mophilus）、ロイコノストック・メゼンテロイデス（Le
uconostoc mesenteroides)、エンテロコッカス・フェカ
リス（Enterocuccus faecalis)、エンテロコッカス・フ
ェシウム（Enterococcus faecium）、ラクトバチルス・
カゼイ（Lactobacillus casei)）に属する１４菌株に対
するプライマーのバンド形成能を指標として確認したと
ころ、特異性には何ら問題はなかった。
〜６に記載した塩基配列からなる３組のオリゴヌクレオ
チドプライマーは、その塩基配列に従い、ＤＮＡ合成機
等を用いた常法によって、人工的に合成することができ
る。これらの合成されたオリゴヌクレオチドプライマー
の種特異性については、７種の乳酸菌（ラクトコッカス
・ラクチス サブスピーシーズ ラクチス、ラクトコッ
カス・ラクチス サブスピーシーズ クレモリス、スト
レプトコッカス・サーモフィルス（Streptococcus ther
mophilus）、ロイコノストック・メゼンテロイデス（Le
uconostoc mesenteroides)、エンテロコッカス・フェカ
リス（Enterocuccus faecalis)、エンテロコッカス・フ
ェシウム（Enterococcus faecium）、ラクトバチルス・
カゼイ（Lactobacillus casei)）に属する１４菌株に対
するプライマーのバンド形成能を指標として確認したと
ころ、特異性には何ら問題はなかった。
【００１７】次に、本発明のオリゴヌクレオチドをプラ
イマーとして用いてＰＣＲ反応を行うことによって、乳
酸菌を同定・検出する方法について説明する。まず、被
検菌となる乳酸菌をＭ１７やＭＲＳ等の培地を用いて、
２５〜３７℃、好ましくは３０℃で１〜２日間、好まし
くは１日間培養する。培養終了後、培養物を遠心分離し
て菌体を集め、Murmur法やSaito & Miura の方法等の定
法にしたがってＤＮＡを調製する。例えば、Saito & Mi
ura の方法では、湿菌体１ｇをリゾチームとＮ−アセチ
ルムラミダーゼを含む０．１５Ｍ 塩化ナトリウム−
０．１Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）溶液５ｍＬに懸濁
し、３７℃で３０分間加温する。加温後、該菌体懸濁液
に０．１Ｍ トリス−塩酸（ｐＨ９．０）−１％ ＳＤ
Ｓ溶液１５ｍＬを加え、さらに６０℃で１０分間加温す
る。続いて、該懸濁液と等量の水飽和フェノールを加え
てよく混和した後、冷却遠心（１００００ｒｐｍ、２０
分間）し、水層とフェノール層を得る。こうして得た水
層に、２倍量の冷エタノールを加えてＤＮＡを沈殿させ
た後、ＤＮＡを７０％エタノールですすぎ、風乾した
後、０．１×ＳＳＣ１０ｍＬに溶解し、これをＤＮＡ溶
液とする。該ＤＮＡ溶液に０．２％ ＲＮａｓｅ Ａ溶
液２５０μＬを加え、３７℃で３０分間反応させる。反
応終了後、ＤＮＡ溶液の１／５量の水飽和フェノールを
加えてよく混和し、上記と同様に遠心分離、エタノール
沈殿、エタノールによるすすぎを行い、ゲノムＤＮＡを
抽出する。
イマーとして用いてＰＣＲ反応を行うことによって、乳
酸菌を同定・検出する方法について説明する。まず、被
検菌となる乳酸菌をＭ１７やＭＲＳ等の培地を用いて、
２５〜３７℃、好ましくは３０℃で１〜２日間、好まし
くは１日間培養する。培養終了後、培養物を遠心分離し
て菌体を集め、Murmur法やSaito & Miura の方法等の定
法にしたがってＤＮＡを調製する。例えば、Saito & Mi
ura の方法では、湿菌体１ｇをリゾチームとＮ−アセチ
ルムラミダーゼを含む０．１５Ｍ 塩化ナトリウム−
０．１Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）溶液５ｍＬに懸濁
し、３７℃で３０分間加温する。加温後、該菌体懸濁液
に０．１Ｍ トリス−塩酸（ｐＨ９．０）−１％ ＳＤ
Ｓ溶液１５ｍＬを加え、さらに６０℃で１０分間加温す
る。続いて、該懸濁液と等量の水飽和フェノールを加え
てよく混和した後、冷却遠心（１００００ｒｐｍ、２０
分間）し、水層とフェノール層を得る。こうして得た水
層に、２倍量の冷エタノールを加えてＤＮＡを沈殿させ
た後、ＤＮＡを７０％エタノールですすぎ、風乾した
後、０．１×ＳＳＣ１０ｍＬに溶解し、これをＤＮＡ溶
液とする。該ＤＮＡ溶液に０．２％ ＲＮａｓｅ Ａ溶
液２５０μＬを加え、３７℃で３０分間反応させる。反
応終了後、ＤＮＡ溶液の１／５量の水飽和フェノールを
加えてよく混和し、上記と同様に遠心分離、エタノール
沈殿、エタノールによるすすぎを行い、ゲノムＤＮＡを
抽出する。
【００１８】こうして得た被検菌のゲノムＤＮＡを鋳型
として、ＰＣＲ反応を行う。プライマーとしては、配列
番号１〜２、配列番号３〜４、配列番号５〜６記載のオ
リゴヌクレオチドプライマーの組み合わせから１または
２以上を選択して用いるが、組み合わせについては特に
制限されることはない。抽出したゲノムＤＮＡは、ＴＥ
緩衝液（１０ｍＭ トリス−塩酸（ｐＨ８．０）−１ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ）等に溶解して濃度を測定した後、約２０
０μｇ／ｍＬの濃度となるように調製し、これを鋳型Ｄ
ＮＡ溶液とする。続いて、これを鋳型としてＰＣＲ反応
を行う。ＰＣＲ反応は、定法にしたがって行えばよく、
市販されているＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡社製）やＡ
ｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ（パーキンエルマー社製）等
のＰＣＲ反応試薬キットを使用することによって、より
簡便に行うことができる。該キットを用いてＰＣＲ反応
を行う場合には、使用するキットの推奨する温度と時間
で、予備加熱、変性、アニーリングや伸長を行えばよ
い。ただし、アニーリングの温度については、最適な条
件を検討する必要がある。また、伸長時間は、予想され
る産物長によって変更する必要があるが、上記のＰＣＲ
反応試薬キットにおいては、予想される産物長１ｋｂに
対して６０秒の反応時間を推奨している。例えば、ＫＯ
Ｄ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡社製）の場合、ＰＣＲ反応液の
総量を５０μＬとすると、キット付属の反応緩衝液 ５
μＬ、ｄＮＴＰ ｍｉｘｔｕｒｅ ０．２ｍＭ、ＭｇＳ
Ｏ4 １ｍＭ、プライマー 各０．３μＭ、鋳型ＤＮＡ
２００ｎｇ、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−ＤＮＡポリメラーゼ
１．０Ｕ を含む反応液を、ＰＣＲ反応機により、９
４℃で２分の予備加熱後、変性を９４℃で１５秒、アニ
ーリングを６４℃で３０秒、伸長を６８℃で６０秒３５
サイクルのＰＣＲ反応を行う。
として、ＰＣＲ反応を行う。プライマーとしては、配列
番号１〜２、配列番号３〜４、配列番号５〜６記載のオ
リゴヌクレオチドプライマーの組み合わせから１または
２以上を選択して用いるが、組み合わせについては特に
制限されることはない。抽出したゲノムＤＮＡは、ＴＥ
緩衝液（１０ｍＭ トリス−塩酸（ｐＨ８．０）−１ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ）等に溶解して濃度を測定した後、約２０
０μｇ／ｍＬの濃度となるように調製し、これを鋳型Ｄ
ＮＡ溶液とする。続いて、これを鋳型としてＰＣＲ反応
を行う。ＰＣＲ反応は、定法にしたがって行えばよく、
市販されているＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡社製）やＡ
ｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ（パーキンエルマー社製）等
のＰＣＲ反応試薬キットを使用することによって、より
簡便に行うことができる。該キットを用いてＰＣＲ反応
を行う場合には、使用するキットの推奨する温度と時間
で、予備加熱、変性、アニーリングや伸長を行えばよ
い。ただし、アニーリングの温度については、最適な条
件を検討する必要がある。また、伸長時間は、予想され
る産物長によって変更する必要があるが、上記のＰＣＲ
反応試薬キットにおいては、予想される産物長１ｋｂに
対して６０秒の反応時間を推奨している。例えば、ＫＯ
Ｄ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡社製）の場合、ＰＣＲ反応液の
総量を５０μＬとすると、キット付属の反応緩衝液 ５
μＬ、ｄＮＴＰ ｍｉｘｔｕｒｅ ０．２ｍＭ、ＭｇＳ
Ｏ4 １ｍＭ、プライマー 各０．３μＭ、鋳型ＤＮＡ
２００ｎｇ、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−ＤＮＡポリメラーゼ
１．０Ｕ を含む反応液を、ＰＣＲ反応機により、９
４℃で２分の予備加熱後、変性を９４℃で１５秒、アニ
ーリングを６４℃で３０秒、伸長を６８℃で６０秒３５
サイクルのＰＣＲ反応を行う。
【００１９】続いて、ＰＣＲ反応によって得られたＰＣ
Ｒ産物をアガロースゲル電気泳動し、バンドの有無また
は移動度によってラクトコッカス・ラクチスの亜種であ
るラクトコッカス・ラクチス サブスピーシーズ ラク
チスおよびラクトコッカス・ラクチス サブスピーシー
ズ クレモリスの２菌種を同定・検出する。同定・検出
方法は、例えばＰＣＲ産物を１．５〜４％アガロースで
５０〜１００Ｖ、好ましくは１００Ｖで、３０〜６０
分、好ましくは４０分で電気泳動し、臭化エチジウム
（０．５μｇ／ｍＬ）で染色後、ＵＶランプ下でバンド
を観察することによって行うことができる。すなわち、
配列表の配列番号１〜２記載のオリゴヌクレオチドプラ
イマーを用いてＰＣＲ反応を行い、９９６ｂｐのＰＣＲ
産物が生じた場合には、被検菌がラクトコッカス・ラク
チス サブスピーシーズ ラクチスであり、配列番号３
〜４記載のオリゴヌクレオチドプライマーを用いてＰＣ
Ｒ反応を行い、９９６ｂｐのＰＣＲ産物が生じた場合に
は、被検菌がラクトコッカス・ラクチス サブスピーシ
ーズ クレモリスである。
Ｒ産物をアガロースゲル電気泳動し、バンドの有無また
は移動度によってラクトコッカス・ラクチスの亜種であ
るラクトコッカス・ラクチス サブスピーシーズ ラク
チスおよびラクトコッカス・ラクチス サブスピーシー
ズ クレモリスの２菌種を同定・検出する。同定・検出
方法は、例えばＰＣＲ産物を１．５〜４％アガロースで
５０〜１００Ｖ、好ましくは１００Ｖで、３０〜６０
分、好ましくは４０分で電気泳動し、臭化エチジウム
（０．５μｇ／ｍＬ）で染色後、ＵＶランプ下でバンド
を観察することによって行うことができる。すなわち、
配列表の配列番号１〜２記載のオリゴヌクレオチドプラ
イマーを用いてＰＣＲ反応を行い、９９６ｂｐのＰＣＲ
産物が生じた場合には、被検菌がラクトコッカス・ラク
チス サブスピーシーズ ラクチスであり、配列番号３
〜４記載のオリゴヌクレオチドプライマーを用いてＰＣ
Ｒ反応を行い、９９６ｂｐのＰＣＲ産物が生じた場合に
は、被検菌がラクトコッカス・ラクチス サブスピーシ
ーズ クレモリスである。
【００２０】さらに、配列番号５〜６記載のオリゴヌク
レオチドプライマーを用いてＰＣＲ反応を行い、ＰＣＲ
産物として６０２ｂｐのバンドが得られた場合の被検菌
は、ラクトコッカス・ラクチス サブスピーシーズ ラ
クチス、５６４ｂｐのバンドが得られた場合の被検菌
は、ラクトコッカス・ラクチス サブスピーシーズ ク
レモリスである。また、ラクトコッカス・ラクチス サ
ブスピーシーズ ラクチス ＭＧ １３６３株は、表現
型ではラクトコッカス・ラクチス サブスピーシーズ
ラクチスに分類されるが、ＤＮＡ配列の系統解析ではラ
クトコッカス・ラクチス サブスピーシーズ クレモリ
スに分類される菌株である。該菌株のＰＣＲ産物の大き
さは、ラクトコッカス・ ラクチス サブスピーシーズ
クレモリスと同じ５６４ｂｐである。しかし、その後
の制限酵素処理で、ラクトコッカス・ ラクチス サブ
スピーシーズ クレモリスは切断されないのに対して、
ラクトコッカス・ラクチス サブスピーシーズ ラクチ
ス ＭＧ １３６３株はラクトコッカス・ラクチス サ
ブスピーシーズ ラクチスと同様に２本の断片に切断さ
れる。該切断断片の大きさは、ラクトコッカス・ラクチ
ス サブスピーシーズ ラクチスが約１９０ｂｐと約４
１０ｂｐであるのに対し、ラクトコッカス・ラクチス
サブスピーシーズラクチス ＭＧ １３６３株は約１９
０ｂｐと約３７０ｂｐとなる。すなわち、制限酵素切断
サイトの有無が、表現型であるグルタミン酸脱炭酸酵素
活性の有無と関連しているといえる。これらの同定・検
出結果は、従来の生化学的性状試験の結果やＤＮＡ情報
による分類と一致し、さらに制限酵素による切断も表現
型による分類と一致している。
レオチドプライマーを用いてＰＣＲ反応を行い、ＰＣＲ
産物として６０２ｂｐのバンドが得られた場合の被検菌
は、ラクトコッカス・ラクチス サブスピーシーズ ラ
クチス、５６４ｂｐのバンドが得られた場合の被検菌
は、ラクトコッカス・ラクチス サブスピーシーズ ク
レモリスである。また、ラクトコッカス・ラクチス サ
ブスピーシーズ ラクチス ＭＧ １３６３株は、表現
型ではラクトコッカス・ラクチス サブスピーシーズ
ラクチスに分類されるが、ＤＮＡ配列の系統解析ではラ
クトコッカス・ラクチス サブスピーシーズ クレモリ
スに分類される菌株である。該菌株のＰＣＲ産物の大き
さは、ラクトコッカス・ ラクチス サブスピーシーズ
クレモリスと同じ５６４ｂｐである。しかし、その後
の制限酵素処理で、ラクトコッカス・ ラクチス サブ
スピーシーズ クレモリスは切断されないのに対して、
ラクトコッカス・ラクチス サブスピーシーズ ラクチ
ス ＭＧ １３６３株はラクトコッカス・ラクチス サ
ブスピーシーズ ラクチスと同様に２本の断片に切断さ
れる。該切断断片の大きさは、ラクトコッカス・ラクチ
ス サブスピーシーズ ラクチスが約１９０ｂｐと約４
１０ｂｐであるのに対し、ラクトコッカス・ラクチス
サブスピーシーズラクチス ＭＧ １３６３株は約１９
０ｂｐと約３７０ｂｐとなる。すなわち、制限酵素切断
サイトの有無が、表現型であるグルタミン酸脱炭酸酵素
活性の有無と関連しているといえる。これらの同定・検
出結果は、従来の生化学的性状試験の結果やＤＮＡ情報
による分類と一致し、さらに制限酵素による切断も表現
型による分類と一致している。
【００２１】また、本発明の乳酸菌の同定・検出方法に
おいては、上記のようにＤＮＡを調製しなくても、乳酸
菌の生菌から直接ＰＣＲ反応を行うことも可能である。
その場合の実施方法としては、例えば寒天平板培地にコ
ロニーを形成した乳酸菌を滅菌した爪楊枝で釣菌し、こ
れを鋳型ＤＮＡを含まないＰＣＲ反応液１０〜１００μ
Ｌ、好ましくは５０μＬに加えてＰＣＲ反応を行った
後、アガロース電気泳動を行ってバンドの有無または泳
動距離を調べる方法がある。さらに、この他の方法とし
ては、被検菌をＭＲＳ培地やＭ１７培地等の液体培地で
培養した培養液を、滅菌蒸留水で１０〜１０4 倍、好ま
しくは１０2 倍に希釈し、該希釈液の１μＬをＰＣＲ反
応液（組成は、上記と同様）に加えてＰＣＲ反応を行
い、バンド形成能から同定することもできる。
おいては、上記のようにＤＮＡを調製しなくても、乳酸
菌の生菌から直接ＰＣＲ反応を行うことも可能である。
その場合の実施方法としては、例えば寒天平板培地にコ
ロニーを形成した乳酸菌を滅菌した爪楊枝で釣菌し、こ
れを鋳型ＤＮＡを含まないＰＣＲ反応液１０〜１００μ
Ｌ、好ましくは５０μＬに加えてＰＣＲ反応を行った
後、アガロース電気泳動を行ってバンドの有無または泳
動距離を調べる方法がある。さらに、この他の方法とし
ては、被検菌をＭＲＳ培地やＭ１７培地等の液体培地で
培養した培養液を、滅菌蒸留水で１０〜１０4 倍、好ま
しくは１０2 倍に希釈し、該希釈液の１μＬをＰＣＲ反
応液（組成は、上記と同様）に加えてＰＣＲ反応を行
い、バンド形成能から同定することもできる。
【００２２】
【実施例】以下に、本発明を実施例によって詳しく説明
するが、本発明はこれらによって限定されるものではな
い。 実施例１ （１）被検菌の培養とＤＮＡの抽出 各種被検菌となる乳酸菌をＭ１７培地またはＭＲＳ培地
を用いて、３０℃で１日間培養した。培養終了後、培養
物を遠心分離して菌体を集め、下記のSaito &Miura の
方法にしたがってＤＮＡを調製した。まず、湿菌体１ｇ
をリゾチームとＮ−アセチルムラミダーゼを含む０．１
５Ｍ塩化ナトリウム−０．１Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．
０）溶液５ｍＬに懸濁し、３７℃で３０分間加温した。
加温後、該菌体懸濁液に０．１Ｍ トリス−塩酸（ｐＨ
９．０）−１％ ＳＤＳ溶液１５ｍＬを加え、さらに６
０℃で１０分間加温した。続いて、該菌体懸濁液と等量
の水飽和フェノールを加えよく混和した後、冷却遠心
（１００００ｒｐｍ、２０分間）し、水層とフェノール
層を得た。
するが、本発明はこれらによって限定されるものではな
い。 実施例１ （１）被検菌の培養とＤＮＡの抽出 各種被検菌となる乳酸菌をＭ１７培地またはＭＲＳ培地
を用いて、３０℃で１日間培養した。培養終了後、培養
物を遠心分離して菌体を集め、下記のSaito &Miura の
方法にしたがってＤＮＡを調製した。まず、湿菌体１ｇ
をリゾチームとＮ−アセチルムラミダーゼを含む０．１
５Ｍ塩化ナトリウム−０．１Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．
０）溶液５ｍＬに懸濁し、３７℃で３０分間加温した。
加温後、該菌体懸濁液に０．１Ｍ トリス−塩酸（ｐＨ
９．０）−１％ ＳＤＳ溶液１５ｍＬを加え、さらに６
０℃で１０分間加温した。続いて、該菌体懸濁液と等量
の水飽和フェノールを加えよく混和した後、冷却遠心
（１００００ｒｐｍ、２０分間）し、水層とフェノール
層を得た。
【００２３】このようにして得た水層に、２倍量の冷エ
タノールを加えてＤＮＡを沈殿させた後、ＤＮＡを７０
％エタノールですすぎ、風乾した後、０．１×ＳＳＣ１
０ｍＬに溶解し、これをＤＮＡ溶液とした。該ＤＮＡ溶
液に０．２％ ＲＮａｓｅＡ溶液２５０μＬを加え、３
７℃で３０分間反応させた。反応終了後、ＤＮＡ溶液の
１／５量の水飽和フェノールを加えてよく混和し、上記
と同様に遠心分離、エタノール沈殿、エタノールによる
すすぎを行い、ゲノムＤＮＡを抽出した。抽出したゲノ
ムＤＮＡを、ＴＥ緩衝液（１０ｍＭ トリス−塩酸（ｐ
Ｈ８．０）−１ｍＭ ＥＤＴＡ）に溶解して濃度を測定
した後、２００μｇ／ｍＬの濃度となるように調製し、
これを鋳型ＤＮＡ溶液とした。
タノールを加えてＤＮＡを沈殿させた後、ＤＮＡを７０
％エタノールですすぎ、風乾した後、０．１×ＳＳＣ１
０ｍＬに溶解し、これをＤＮＡ溶液とした。該ＤＮＡ溶
液に０．２％ ＲＮａｓｅＡ溶液２５０μＬを加え、３
７℃で３０分間反応させた。反応終了後、ＤＮＡ溶液の
１／５量の水飽和フェノールを加えてよく混和し、上記
と同様に遠心分離、エタノール沈殿、エタノールによる
すすぎを行い、ゲノムＤＮＡを抽出した。抽出したゲノ
ムＤＮＡを、ＴＥ緩衝液（１０ｍＭ トリス−塩酸（ｐ
Ｈ８．０）−１ｍＭ ＥＤＴＡ）に溶解して濃度を測定
した後、２００μｇ／ｍＬの濃度となるように調製し、
これを鋳型ＤＮＡ溶液とした。
【００２４】（２）ＰＣＲ反応
（１）において得た被検菌のＤＮＡ溶液を鋳型とし、Ｌ
ＦＷ（配列番号１）およびＬＲＶ（配列番号２）をプラ
イマーとして用い、ＰＣＲ反応試薬キットであるＫＯＤ
−Ｐｌｕｓ−（東洋紡社製）の方法にしたがってＰＣＲ
反応を行った。ＰＣＲ反応液の総量を５０μＬとする
と、キット付属の反応緩衝液 ５μＬ、ｄＮＴＰ ｍｉ
ｘｔｕｒｅ ０．２ｍＭ、ＭｇＳＯ4 １ｍＭ、プライ
マー 各０．３μＭ、鋳型ＤＮＡ ２００ｎｇ、ＫＯＤ
−Ｐｌｕｓ−ＤＮＡポリメラーゼ１．０Ｕを含む反応液
を、ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ２４００
（パーキンエルマー社製）を用いて、９４℃で２分の予
備加熱後、変性を９４℃で１５秒、アニーリングを６４
℃で３０秒、伸長を６８℃で６０秒のサイクルを３５サ
イクル行った。
ＦＷ（配列番号１）およびＬＲＶ（配列番号２）をプラ
イマーとして用い、ＰＣＲ反応試薬キットであるＫＯＤ
−Ｐｌｕｓ−（東洋紡社製）の方法にしたがってＰＣＲ
反応を行った。ＰＣＲ反応液の総量を５０μＬとする
と、キット付属の反応緩衝液 ５μＬ、ｄＮＴＰ ｍｉ
ｘｔｕｒｅ ０．２ｍＭ、ＭｇＳＯ4 １ｍＭ、プライ
マー 各０．３μＭ、鋳型ＤＮＡ ２００ｎｇ、ＫＯＤ
−Ｐｌｕｓ−ＤＮＡポリメラーゼ１．０Ｕを含む反応液
を、ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ２４００
（パーキンエルマー社製）を用いて、９４℃で２分の予
備加熱後、変性を９４℃で１５秒、アニーリングを６４
℃で３０秒、伸長を６８℃で６０秒のサイクルを３５サ
イクル行った。
【００２５】（３）アガロース電気泳動
ＰＣＲ反応によって得られたＰＣＲ産物を、１．５％ア
ガロースゲルで１００Ｖ、３０分電気泳動した。次に、
アガロースゲルを臭化エチジウム（０．５μｇ／ｍＬ）
で染色後、ＵＶランプ下でバンドを観察した。結果を、
第１表に示す。表中、プライマーと反応して９９６ｂｐ
のＰＣＲ産物が増幅されたものを＋、プライマーと反応
しなかったものを−と表す。なお、ラクトコッカス・ラ
クチスサブスピーシーズ ラクチス ＡＴＣＣ １９４
３５株、ラクトコッカス・ ラクチス サブスピーシー
ズ ラクチス バイオバラエティー ジアセチラクチス
ＡＴＣＣ １３６７５株、ラクトコッカス・ラクチス
サブスピーシーズ クレモリス ＡＴＣＣ１９２５７株
は、それぞれラクトコッカス・ラクチス サブスピーシ
ーズ ラクチスとラクトコッカス・ラクチス サブスピ
ーシーズ ラクチス バイオバラエティー ジアセチラ
クチス、ラクトコッカス・ラクチス サブスピーシーズ
クレモリスの標準株である。この結果、従来の生化学
性状試験でラクトコッカス・ラクチス サブスピーシー
ズ ラクチスと同定されるラクトコッカス・ラクチス
サブスピーシーズ ラクチスおよびラクトコッカス・ラ
クチス サブスピーシーズ ラクチス バイオバラエテ
ィー ジアセチラクチイスと同定される菌株だけを特異
的に検出することができた。
ガロースゲルで１００Ｖ、３０分電気泳動した。次に、
アガロースゲルを臭化エチジウム（０．５μｇ／ｍＬ）
で染色後、ＵＶランプ下でバンドを観察した。結果を、
第１表に示す。表中、プライマーと反応して９９６ｂｐ
のＰＣＲ産物が増幅されたものを＋、プライマーと反応
しなかったものを−と表す。なお、ラクトコッカス・ラ
クチスサブスピーシーズ ラクチス ＡＴＣＣ １９４
３５株、ラクトコッカス・ ラクチス サブスピーシー
ズ ラクチス バイオバラエティー ジアセチラクチス
ＡＴＣＣ １３６７５株、ラクトコッカス・ラクチス
サブスピーシーズ クレモリス ＡＴＣＣ１９２５７株
は、それぞれラクトコッカス・ラクチス サブスピーシ
ーズ ラクチスとラクトコッカス・ラクチス サブスピ
ーシーズ ラクチス バイオバラエティー ジアセチラ
クチス、ラクトコッカス・ラクチス サブスピーシーズ
クレモリスの標準株である。この結果、従来の生化学
性状試験でラクトコッカス・ラクチス サブスピーシー
ズ ラクチスと同定されるラクトコッカス・ラクチス
サブスピーシーズ ラクチスおよびラクトコッカス・ラ
クチス サブスピーシーズ ラクチス バイオバラエテ
ィー ジアセチラクチイスと同定される菌株だけを特異
的に検出することができた。
【００２６】実施例２
被検菌の乳酸菌から調製したゲノムＤＮＡを鋳型とし、
ＣＦＷ（配列番号３）とＣＲＶ（配列番号４）をプライ
マーとして用いたこと以外は、すべて実施例１と同様に
行った。結果を、第１表に示す。表中、プライマーと反
応して９９６ｂｐのＰＣＲ産物が増幅されたものを＋、
プライマーと反応しなかったものを−と表す。この結
果、従来の生化学性状試験でラクトコッカス・ラクチス
サブスピーシーズ クレモリスと同定される菌株だけ
を特異的に検出することができた。
ＣＦＷ（配列番号３）とＣＲＶ（配列番号４）をプライ
マーとして用いたこと以外は、すべて実施例１と同様に
行った。結果を、第１表に示す。表中、プライマーと反
応して９９６ｂｐのＰＣＲ産物が増幅されたものを＋、
プライマーと反応しなかったものを−と表す。この結
果、従来の生化学性状試験でラクトコッカス・ラクチス
サブスピーシーズ クレモリスと同定される菌株だけ
を特異的に検出することができた。
【００２７】
【表１】第 １ 表
* ＋：反応あり、−：反応なし**
ラクトコッカス・ラクチス サブスピーシーズ ラク
チス ＭＧ １３６３株は、表現型ではラクトコッカス
・ラクチス サブスピーシーズ ラクチスに分類される
が、ＤＮＡ配列の系統解析ではラクトコッカス・ ラク
チス サブスピーシーズ クレモリスに分類される。こ
こでは、表現型による分類に基づいた。
チス ＭＧ １３６３株は、表現型ではラクトコッカス
・ラクチス サブスピーシーズ ラクチスに分類される
が、ＤＮＡ配列の系統解析ではラクトコッカス・ ラク
チス サブスピーシーズ クレモリスに分類される。こ
こでは、表現型による分類に基づいた。
【００２８】実施例３（ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法による乳酸
菌の同定） （１）被検菌の培養とＤＮＡの抽出 被検菌である乳酸菌からのゲノムＤＮＡの調製は、すべ
て実施例１と同様に行った。抽出した制限酵素処理ゲノ
ムＤＮＡをＴＥ緩衝液（１０ｍＭ トリス−塩酸（ｐＨ
８．０）−１ｍＭ ＥＤＴＡ）に溶解して濃度を測定し
た後、２００μｇ／ｍＬの濃度となるように調製し、こ
れを鋳型ＤＮＡ溶液とした。
菌の同定） （１）被検菌の培養とＤＮＡの抽出 被検菌である乳酸菌からのゲノムＤＮＡの調製は、すべ
て実施例１と同様に行った。抽出した制限酵素処理ゲノ
ムＤＮＡをＴＥ緩衝液（１０ｍＭ トリス−塩酸（ｐＨ
８．０）−１ｍＭ ＥＤＴＡ）に溶解して濃度を測定し
た後、２００μｇ／ｍＬの濃度となるように調製し、こ
れを鋳型ＤＮＡ溶液とした。
【００２９】（２）ＰＣＲ反応
（１）において得た被検菌のＤＮＡ溶液を鋳型とし、ｇ
ａｄＢ（２１）（配列番号５）およびＧＡＤ７（配列番
号６）をプライマーとして用い、ＰＣＲ反応試薬キット
であるＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ（パーキンエルマー
社製）の方法にしたがってＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ
反応液の総量を５０μＬとすると、キット付属の反応緩
衝液 ５μＬ、ｄＮＴＰ ｍｉｘｔｕｒｅ ０．２ｍ
Ｍ、プライマー 各０．４μＭ、鋳型ＤＮＡ ２００ｎ
ｇ、ＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ １．０Ｕ
を含む反応液を、ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔ
ｅｍ（パーキンエルマー社製）を用いて、９５℃で９分
の予備加熱後、変性を９５℃で３０秒、アニーリングを
５０℃で３０秒、伸長を７２℃で６０秒のサイクルを４
５サイクル行った。
ａｄＢ（２１）（配列番号５）およびＧＡＤ７（配列番
号６）をプライマーとして用い、ＰＣＲ反応試薬キット
であるＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ（パーキンエルマー
社製）の方法にしたがってＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ
反応液の総量を５０μＬとすると、キット付属の反応緩
衝液 ５μＬ、ｄＮＴＰ ｍｉｘｔｕｒｅ ０．２ｍ
Ｍ、プライマー 各０．４μＭ、鋳型ＤＮＡ ２００ｎ
ｇ、ＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ １．０Ｕ
を含む反応液を、ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔ
ｅｍ（パーキンエルマー社製）を用いて、９５℃で９分
の予備加熱後、変性を９５℃で３０秒、アニーリングを
５０℃で３０秒、伸長を７２℃で６０秒のサイクルを４
５サイクル行った。
【００３０】（３）アガロース電気泳動
上記ＰＣＲ反応によって得られたＰＣＲ産物を、４％ア
ガロースゲルで１００Ｖ、５０分電気泳動した。続い
て、アガロースゲルを臭化エチジウム（０．５μｇ／ｍ
Ｌ）で染色後、ＵＶランプ下でバンドを観察した。
ガロースゲルで１００Ｖ、５０分電気泳動した。続い
て、アガロースゲルを臭化エチジウム（０．５μｇ／ｍ
Ｌ）で染色後、ＵＶランプ下でバンドを観察した。
【００３１】（４）ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法
（３）においてバンドが検出されたＰＣＲ産物につい
て、配列表の配列番号７記載の塩基配列を認識する制限
酵素であるＡｓｅＩ（東洋紡社製）で処理し、再度アガ
ロースゲル電気泳動した。制限酵素処理は、ＰＣＲ反応
液８．５μＬ、制限酵素用緩衝液（商品名：Ｈｉｇｈ
ｂｕｆｆｅｒ、東洋紡社製）１μＬ、ＡｓｅＩ ０．５
μＬを混和したものを、３７℃で４時間処理することに
よって行った。反応後、４％アガロースゲルを用いて１
００Ｖ、３０分電気泳動した。次いで、アガロースゲル
を臭化エチジウム（０．５μｇ／ｍＬ）で染色後、ＵＶ
ランプ下でバンドを観察した。結果を第２表に示す。
て、配列表の配列番号７記載の塩基配列を認識する制限
酵素であるＡｓｅＩ（東洋紡社製）で処理し、再度アガ
ロースゲル電気泳動した。制限酵素処理は、ＰＣＲ反応
液８．５μＬ、制限酵素用緩衝液（商品名：Ｈｉｇｈ
ｂｕｆｆｅｒ、東洋紡社製）１μＬ、ＡｓｅＩ ０．５
μＬを混和したものを、３７℃で４時間処理することに
よって行った。反応後、４％アガロースゲルを用いて１
００Ｖ、３０分電気泳動した。次いで、アガロースゲル
を臭化エチジウム（０．５μｇ／ｍＬ）で染色後、ＵＶ
ランプ下でバンドを観察した。結果を第２表に示す。
【００３２】
【表２】第 ２ 表
−：反応なし**
ラクトコッカス・ラクチス サブスピーシーズ ラク
チス ＭＧ １３６３株は、表現型ではラクトコッカス
・ラクチス サブスピーシーズ ラクチスに分類される
が、ＤＮＡ配列の系統解析ではラクトコッカス・ ラク
チス サブスピーシーズ クレモリスに分類される。こ
こでは、表現型による分類に基づいた。
チス ＭＧ １３６３株は、表現型ではラクトコッカス
・ラクチス サブスピーシーズ ラクチスに分類される
が、ＤＮＡ配列の系統解析ではラクトコッカス・ ラク
チス サブスピーシーズ クレモリスに分類される。こ
こでは、表現型による分類に基づいた。
【００３３】この結果、従来の生化学性状試験でラクト
コッカス・ラクチス サブスピーシーズ ラクチスと同
定される菌株についてのみ、約６００ｂｐの位置にバン
ドが検出された。一方、ラクトコッカス・ラクチス サ
ブスピーシーズ クレモリスと同定される菌株について
は、約５６０ｂｐの位置にバンドが検出された。両菌種
以外の乳酸菌からはバンドは検出されなかった。バンド
が検出されたＰＣＲ産物について、配列表の配列番号７
記載の塩基配列を認識する制限酵素であるＡｓｅＩで処
理した後、アガロースゲル電気泳動したところ、ラクト
コッカス・ラクチス サブスピーシーズ ラクチスの反
応産物は約１９０ｂｐと約４１０ｂｐに切断されてい
た。一方、ラクトコッカス・ラクチス サブスピーシー
ズ クレモリスのバンドには変化がなかった。また、表
現型による分類では、ラクトコッカス・ラクチス サブ
スピーシーズラクチスの性質を示すが、ＤＮＡ情報によ
る分類ではラクトコッカス・ラクチス サブスピーシー
ズ クレモリスに分類されるラクトコッカス・ラクチス
サブスピーシーズ ラクチス ＭＧ １３６３株のよ
うな菌株のＰＣＲ産物の大きさは、ラクトコッカス・ラ
クチス サブスピーシーズ クレモリスと同じ約５６０
ｂｐであり、制限酵素処理ではラクトコッカス・ラクチ
ス サブスピーシーズラクチスと同様に２本に切断され
た。切断断片の大きさは、約１９０ｂｐと約３７０ｂｐ
を示した。
コッカス・ラクチス サブスピーシーズ ラクチスと同
定される菌株についてのみ、約６００ｂｐの位置にバン
ドが検出された。一方、ラクトコッカス・ラクチス サ
ブスピーシーズ クレモリスと同定される菌株について
は、約５６０ｂｐの位置にバンドが検出された。両菌種
以外の乳酸菌からはバンドは検出されなかった。バンド
が検出されたＰＣＲ産物について、配列表の配列番号７
記載の塩基配列を認識する制限酵素であるＡｓｅＩで処
理した後、アガロースゲル電気泳動したところ、ラクト
コッカス・ラクチス サブスピーシーズ ラクチスの反
応産物は約１９０ｂｐと約４１０ｂｐに切断されてい
た。一方、ラクトコッカス・ラクチス サブスピーシー
ズ クレモリスのバンドには変化がなかった。また、表
現型による分類では、ラクトコッカス・ラクチス サブ
スピーシーズラクチスの性質を示すが、ＤＮＡ情報によ
る分類ではラクトコッカス・ラクチス サブスピーシー
ズ クレモリスに分類されるラクトコッカス・ラクチス
サブスピーシーズ ラクチス ＭＧ １３６３株のよ
うな菌株のＰＣＲ産物の大きさは、ラクトコッカス・ラ
クチス サブスピーシーズ クレモリスと同じ約５６０
ｂｐであり、制限酵素処理ではラクトコッカス・ラクチ
ス サブスピーシーズラクチスと同様に２本に切断され
た。切断断片の大きさは、約１９０ｂｐと約３７０ｂｐ
を示した。
【００３４】実施例４
第１表に記載された各種被検菌を、寒天平板培地に接種
して３０℃で２日間培養した。培養によって形成した各
種の被検菌のコロニーを、滅菌した爪楊枝で釣菌し、Ｐ
ＣＲ反応液５０μＬに懸濁し、ＰＣＲ反応を行った。な
お、ＰＣＲ反応液の組成は、キット付属の反応緩衝液
５μＬ、ｄＮＴＰ ｍｉｘｔｕｒｅ ０．２ｍＭ、Ｍｇ
ＳＯ4 １ｍＭ、プライマー 各０．３μＭ、ＫＯＤ−
Ｐｌｕｓ−ＤＮＡポリメラーゼ １．０Ｕを含む反応液
であり、プライマーとしてはＬＦＷとＬＲＶ（配列番号
１〜２記載）、ＣＦＷ（配列番号３）とＣＲＶ（配列番
号４）の２組のプライマーをそれぞれ用いた。次に、Ｐ
ＣＲ産物についてアガロースゲル電気泳動を行い、バン
ドの有無と移動度を調べた。なお、ＰＣＲ反応およびア
ガロース電気泳動の条件は、すべて実施例１および２と
同様である。この結果、調製したＤＮＡを鋳型に用いた
実施例１と同様の結果が得られた。したがって、本発明
の乳酸菌の同定・検出方法は、被検菌からＤＮＡを抽出
しなくても行うことができるため、従来法と比べて正
確、迅速、かつ簡便にラクトコッカス・ラクチスを選択
して同定・検出することができる。
して３０℃で２日間培養した。培養によって形成した各
種の被検菌のコロニーを、滅菌した爪楊枝で釣菌し、Ｐ
ＣＲ反応液５０μＬに懸濁し、ＰＣＲ反応を行った。な
お、ＰＣＲ反応液の組成は、キット付属の反応緩衝液
５μＬ、ｄＮＴＰ ｍｉｘｔｕｒｅ ０．２ｍＭ、Ｍｇ
ＳＯ4 １ｍＭ、プライマー 各０．３μＭ、ＫＯＤ−
Ｐｌｕｓ−ＤＮＡポリメラーゼ １．０Ｕを含む反応液
であり、プライマーとしてはＬＦＷとＬＲＶ（配列番号
１〜２記載）、ＣＦＷ（配列番号３）とＣＲＶ（配列番
号４）の２組のプライマーをそれぞれ用いた。次に、Ｐ
ＣＲ産物についてアガロースゲル電気泳動を行い、バン
ドの有無と移動度を調べた。なお、ＰＣＲ反応およびア
ガロース電気泳動の条件は、すべて実施例１および２と
同様である。この結果、調製したＤＮＡを鋳型に用いた
実施例１と同様の結果が得られた。したがって、本発明
の乳酸菌の同定・検出方法は、被検菌からＤＮＡを抽出
しなくても行うことができるため、従来法と比べて正
確、迅速、かつ簡便にラクトコッカス・ラクチスを選択
して同定・検出することができる。
【００３５】実施例５
第１表に記載された各種被検菌を、液体培地のＭＲＳ培
地（ＤＩＦＣＯ社製）またはＭ１７培地（ＤＩＦＣＯ社
製）１００ｍＬに接種し、３０℃で１日間培養した。培
養終了後、該培養液５０μＬを滅菌蒸留水で１００倍に
希釈し、該希釈液の１μＬをＰＣＲ反応液に加えてＰＣ
Ｒ反応を行った。なお、ＰＣＲ反応液の組成は、キット
付属の反応緩衝液 ５μＬ、ｄＮＴＰ ｍｉｘｔｕｒｅ
０．２ｍＭ、ＭｇＳＯ4 １ｍＭ、プライマー 各
０．３μＭ、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−ＤＮＡポリメラーゼ
１．０Ｕを含む反応液であり、プライマーとしてはＬＦ
ＷとＬＲＶ（配列番号１〜２記載）、ＣＦＷ（配列番号
３）とＣＲＶ（配列番号４）の２組のプライマーをそれ
ぞれ用いた。次に、ＰＣＲ産物についてアガロースゲル
電気泳動を行い、バンドの有無と移動度を調べた。な
お、ＰＣＲ反応およびアガロース電気泳動の条件は、す
べて実施例１および２と同様である。この結果、調製し
たＤＮＡを鋳型に用いた実施例１と同様の結果が得られ
た。したがって、本発明の乳酸菌の同定・検出方法によ
れば、従来法と比べ正確、迅速、かつ簡便にラクトコッ
カス・ラクチスを選択して同定・検出することができる
ことが、この例からも支持された。
地（ＤＩＦＣＯ社製）またはＭ１７培地（ＤＩＦＣＯ社
製）１００ｍＬに接種し、３０℃で１日間培養した。培
養終了後、該培養液５０μＬを滅菌蒸留水で１００倍に
希釈し、該希釈液の１μＬをＰＣＲ反応液に加えてＰＣ
Ｒ反応を行った。なお、ＰＣＲ反応液の組成は、キット
付属の反応緩衝液 ５μＬ、ｄＮＴＰ ｍｉｘｔｕｒｅ
０．２ｍＭ、ＭｇＳＯ4 １ｍＭ、プライマー 各
０．３μＭ、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−ＤＮＡポリメラーゼ
１．０Ｕを含む反応液であり、プライマーとしてはＬＦ
ＷとＬＲＶ（配列番号１〜２記載）、ＣＦＷ（配列番号
３）とＣＲＶ（配列番号４）の２組のプライマーをそれ
ぞれ用いた。次に、ＰＣＲ産物についてアガロースゲル
電気泳動を行い、バンドの有無と移動度を調べた。な
お、ＰＣＲ反応およびアガロース電気泳動の条件は、す
べて実施例１および２と同様である。この結果、調製し
たＤＮＡを鋳型に用いた実施例１と同様の結果が得られ
た。したがって、本発明の乳酸菌の同定・検出方法によ
れば、従来法と比べ正確、迅速、かつ簡便にラクトコッ
カス・ラクチスを選択して同定・検出することができる
ことが、この例からも支持された。
【００３６】実施例６
第２表に記載された各種被検菌を、寒天平板培地に接種
して３０℃で２日間培養した。培養によって形成した各
種の被検菌のコロニーを、滅菌した爪楊枝で釣菌し、Ｐ
ＣＲ反応液５０μＬに懸濁し、ＰＣＲ反応を行った。次
に、ＰＣＲ産物についてアガロースゲル電気泳動を行
い、バンドの有無と移動度を調べた。なお、ＰＣＲ反応
およびアガロース電気泳動の条件は、すべて実施例３と
同様である。その結果、調製したＤＮＡを鋳型に用いた
実施例３と同様の結果が得られた。このことから、本発
明の乳酸菌の同定・検出方法は、被検菌からＤＮＡを抽
出しなくても行うことができるため、従来法と比べて正
確、迅速、かつ簡便にラクトコッカス・ラクチスを選択
して同定・検出できることが分かる。
して３０℃で２日間培養した。培養によって形成した各
種の被検菌のコロニーを、滅菌した爪楊枝で釣菌し、Ｐ
ＣＲ反応液５０μＬに懸濁し、ＰＣＲ反応を行った。次
に、ＰＣＲ産物についてアガロースゲル電気泳動を行
い、バンドの有無と移動度を調べた。なお、ＰＣＲ反応
およびアガロース電気泳動の条件は、すべて実施例３と
同様である。その結果、調製したＤＮＡを鋳型に用いた
実施例３と同様の結果が得られた。このことから、本発
明の乳酸菌の同定・検出方法は、被検菌からＤＮＡを抽
出しなくても行うことができるため、従来法と比べて正
確、迅速、かつ簡便にラクトコッカス・ラクチスを選択
して同定・検出できることが分かる。
【００３７】実施例７
第２表に記載された各種被検菌を、液体培地のＭＲＳ培
地（ＤＩＦＣＯ社製）またはＭ１７培地（ＤＩＦＣＯ社
製）１００ｍＬに接種し、３０℃で１日間培養した。培
養終了後、該培養液５０μＬを滅菌蒸留水で１００倍に
希釈し、該希釈液の１μＬをＰＣＲ反応液に加えてＰＣ
Ｒ反応を行った。次に、ＰＣＲ産物についてアガロース
ゲル電気泳動を行い、バンドの有無と移動度を調べた。
なお、ＰＣＲ反応およびアガロース電気泳動の条件は、
すべて実施例３と同様である。その結果、調製したＤＮ
Ａを鋳型に用いた実施例３と同様の結果が得られた。こ
のことから、本発明の乳酸菌の同定・検出方法は、被検
菌からＤＮＡを抽出しなくても行うことができるため、
従来法と比べて正確、迅速、かつ簡便にラクトコッカス
・ラクチスを選択して同定・検出できることが分かる。
地（ＤＩＦＣＯ社製）またはＭ１７培地（ＤＩＦＣＯ社
製）１００ｍＬに接種し、３０℃で１日間培養した。培
養終了後、該培養液５０μＬを滅菌蒸留水で１００倍に
希釈し、該希釈液の１μＬをＰＣＲ反応液に加えてＰＣ
Ｒ反応を行った。次に、ＰＣＲ産物についてアガロース
ゲル電気泳動を行い、バンドの有無と移動度を調べた。
なお、ＰＣＲ反応およびアガロース電気泳動の条件は、
すべて実施例３と同様である。その結果、調製したＤＮ
Ａを鋳型に用いた実施例３と同様の結果が得られた。こ
のことから、本発明の乳酸菌の同定・検出方法は、被検
菌からＤＮＡを抽出しなくても行うことができるため、
従来法と比べて正確、迅速、かつ簡便にラクトコッカス
・ラクチスを選択して同定・検出できることが分かる。
【００３８】
【発明の効果】本発明のプライマーを用いれば、発酵乳
製品や漬け物等から分離した乳酸菌から生菌を培養する
ことなく、正確、迅速、かつ簡便にラクトコッカス・ラ
クチスの亜種まで同定・検出することができる。また、
試料中のラクトコッカス・ラクチスの生菌数が、他の細
菌数に比較して極端に低く平板培地上で分離できない場
合においても、ラクトコッカス・ラクチスを検出するこ
とができる。このため、ラクトコッカス・ラクチスの同
定・検出における本発明の活用が期待される。
製品や漬け物等から分離した乳酸菌から生菌を培養する
ことなく、正確、迅速、かつ簡便にラクトコッカス・ラ
クチスの亜種まで同定・検出することができる。また、
試料中のラクトコッカス・ラクチスの生菌数が、他の細
菌数に比較して極端に低く平板培地上で分離できない場
合においても、ラクトコッカス・ラクチスを検出するこ
とができる。このため、ラクトコッカス・ラクチスの同
定・検出における本発明の活用が期待される。
【００３９】
【配列表】ＳＥＱＵＥＮＣＥ ＬＩＳＴＩＮＧ
<110> 農林水産省畜産試験場長 横内 圀生
<120> オリゴヌクレオチドおよびそれを用いた乳酸菌の
菌種同定法 <130> P121121K <160> 7 <210> 1 <211> 28 <212> DNA <213> Lactococcus lactis <400> 1 aactaatgag tcaaaccttg gaaaaaaa 28 <210> 2 <211> 26 <212> DNA <213> Lactococcus lactis <400> 2 caggcacttg ccatcccttc attaat 26 <210> 3 <211> 28 <212> DNA <213> Lactococcus lactis <400> 3 aactaatgag tcaaaccttg gaaaaaat 28 <210> 4 <211> 26 <212> DNA <213> Lactococcus lactis <400> 4 caggcacttg ccatcccttc attaaa 26 <210> 5 <211> 26 <212> DNA <213> Lactococcus lactis <400> 5 cgttatggat ttgatggata taaagc 26 <210> 6 <211> 27 <212> DNA <213> Lactococcus lactis <400> 6 actcttctta agaacaagtt taacagc 27 <210> 7 <211> 6 <212> DNA <213> Lactococcus lactis <400> 7 attaat 6
菌種同定法 <130> P121121K <160> 7 <210> 1 <211> 28 <212> DNA <213> Lactococcus lactis <400> 1 aactaatgag tcaaaccttg gaaaaaaa 28 <210> 2 <211> 26 <212> DNA <213> Lactococcus lactis <400> 2 caggcacttg ccatcccttc attaat 26 <210> 3 <211> 28 <212> DNA <213> Lactococcus lactis <400> 3 aactaatgag tcaaaccttg gaaaaaat 28 <210> 4 <211> 26 <212> DNA <213> Lactococcus lactis <400> 4 caggcacttg ccatcccttc attaaa 26 <210> 5 <211> 26 <212> DNA <213> Lactococcus lactis <400> 5 cgttatggat ttgatggata taaagc 26 <210> 6 <211> 27 <212> DNA <213> Lactococcus lactis <400> 6 actcttctta agaacaagtt taacagc 27 <210> 7 <211> 6 <212> DNA <213> Lactococcus lactis <400> 7 attaat 6
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(56)参考文献 特開 平11−169198（ＪＰ，Ａ)
Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕ
ｒｎａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，1999，Ｖ
ｏｌ．49，ｐ．163−166
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，1999，Ｖ
ｏｌ．145，ｐ．1375−1380
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
C12N 15/09
C12N 15/31
C12Q 1/68
ＣＡＰＬＵＳ（ＳＴＮ)
ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)
ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
ＰｕｂＭｅｄ
Claims (6)
- 【請求項１】 配列表の配列番号１および２に記載の塩
基配列の組み合わせからなるオリゴヌクレオチド。 - 【請求項２】 配列表の配列番号３および４に記載の塩
基配列の組み合わせからなるオリゴヌクレオチド。 - 【請求項３】 配列表の配列番号５および６に記載の塩
基配列の組み合わせからなるオリゴヌクレオチド。 - 【請求項４】 請求項１〜３のいずれかに記載のオリゴ
ヌクレオチドの組み合わせから選択される１または２以
上を使用することを特徴とする乳酸菌の同定・検出方
法。 - 【請求項５】 被検菌のゲノムＤＮＡを鋳型とし、請求
項１〜３のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドの組み
合わせから選択される１または２以上をプライマーとし
て用いたポリメラーゼ連鎖反応を行う工程を含む請求項
４記載の乳酸菌の同定・検出方法。 - 【請求項６】 被検菌のゲノムＤＮＡを鋳型とし、請求
項１〜３のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドの組み
合わせから選択される１または２以上をプライマーとし
て用いたポリメラーゼ連鎖反応によって増幅したＤＮＡ
断片中における配列表の配列番号７記載の塩基配列の有
無を検出することを特徴とする請求項４記載の乳酸菌の
同定・検出方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000154289A JP3448639B2 (ja) | 2000-05-25 | 2000-05-25 | オリゴヌクレオチドおよびそれを用いた乳酸菌の菌種同定法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000154289A JP3448639B2 (ja) | 2000-05-25 | 2000-05-25 | オリゴヌクレオチドおよびそれを用いた乳酸菌の菌種同定法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2001333777A JP2001333777A (ja) | 2001-12-04 |
| JP3448639B2 true JP3448639B2 (ja) | 2003-09-22 |
Family
ID=18659408
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000154289A Expired - Lifetime JP3448639B2 (ja) | 2000-05-25 | 2000-05-25 | オリゴヌクレオチドおよびそれを用いた乳酸菌の菌種同定法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3448639B2 (ja) |
-
2000
- 2000-05-25 JP JP2000154289A patent/JP3448639B2/ja not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１９９９，Ｖｏｌ．４９，ｐ．１６３−１６６ |
| Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９９９，Ｖｏｌ．１４５，ｐ．１３７５−１３８０ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2001333777A (ja) | 2001-12-04 |
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