JP2654890B2 - 乳酸菌の簡易同定方法およびこの同定方法に使用する同定キット - Google Patents
乳酸菌の簡易同定方法およびこの同定方法に使用する同定キットInfo
- Publication number
- JP2654890B2 JP2654890B2 JP4188842A JP18884292A JP2654890B2 JP 2654890 B2 JP2654890 B2 JP 2654890B2 JP 4188842 A JP4188842 A JP 4188842A JP 18884292 A JP18884292 A JP 18884292A JP 2654890 B2 JP2654890 B2 JP 2654890B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- lactobacillus
- dna
- lactic acid
- identification
- restriction enzyme
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、乳酸菌、特にラクトバ
シラス属に属する細菌の同定法およびこの同定に使用す
るキットに関する。
シラス属に属する細菌の同定法およびこの同定に使用す
るキットに関する。
【０００２】
【従来の技術】発酵乳製品の製造に伝統的に用いられて
いる乳酸菌、例えばラクトバシラス属菌株の同定は、一
般に、糖の資化性、生育温度などの生理学的性状を調べ
ることにより行われている。しかし、これらの試験は迅
速性および客観性に欠け恣意的な判断に基づく分類・同
定におちいりやすい欠陥がみられる。
いる乳酸菌、例えばラクトバシラス属菌株の同定は、一
般に、糖の資化性、生育温度などの生理学的性状を調べ
ることにより行われている。しかし、これらの試験は迅
速性および客観性に欠け恣意的な判断に基づく分類・同
定におちいりやすい欠陥がみられる。
【０００３】一方、近年、分子生物学の発展に伴い、細
菌の分類同定のためにＤＮＡ／ＤＮＡホモロジー手法の
導入による新しい分類体系が確立された。そしてこの手
法を用いると、従来の性状試験では正確に同定できない
場合でも正確に同定できるようになってきた。その結
果、一般性状は同一ながら、このＤＮＡの相同性分析に
より、異なる菌種であると判断される菌株が存在するこ
とが判明した。例えば、ラクトバシラスに属するラクト
バシラス・アシドフィラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕ
ｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）は従来までの分類学上で
は、一般性状は同一であるが、このＤＮＡの相同性から
６つのホモロジーグループに分けられることが判明して
いる（Ｅ．Ｌａｕｅｒ ｅｔ．ａｌ．，Ｉｎｔ．Ａｂ
ｔ．Ｏｒｉｇ．Ｃ１，１５０−１６８，１９８０）。こ
のホモロジーグループはＡ１Ａ２Ａ３Ａ４Ｂ１Ｂ２の６
グループとして分類されている。Ａ１グループにはＬ．
ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓの名を残したが、Ｂ１グルー
プは新菌種ラクトバシラス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃ
ｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ）として認められている
（Ｅ．Ｌａｕｅｒ ｅｔ．ａｌ．，Ｉｎｔ．Ａｂｔ．Ｏ
ｒｉｇ．Ｃ１，７５−７８．１９８０）。さらに最近、
以前から記載のあった菌種ラクトバシラス・クリスパタ
ス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕ
ｓ）がホモロジーグループＡ２と同一の菌種であること
が示された（Ｅ．Ｐ．Ｃａｔｏ，ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｓ
ｙｓｔ．Ｂａｃｔ．，ｖｏｌ．３３，４２６−４２８，
１９８３）。Ａ３、Ａ４、Ｂ２の各ホモロジーグループ
については菌種名は付与されていない。
菌の分類同定のためにＤＮＡ／ＤＮＡホモロジー手法の
導入による新しい分類体系が確立された。そしてこの手
法を用いると、従来の性状試験では正確に同定できない
場合でも正確に同定できるようになってきた。その結
果、一般性状は同一ながら、このＤＮＡの相同性分析に
より、異なる菌種であると判断される菌株が存在するこ
とが判明した。例えば、ラクトバシラスに属するラクト
バシラス・アシドフィラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕ
ｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）は従来までの分類学上で
は、一般性状は同一であるが、このＤＮＡの相同性から
６つのホモロジーグループに分けられることが判明して
いる（Ｅ．Ｌａｕｅｒ ｅｔ．ａｌ．，Ｉｎｔ．Ａｂ
ｔ．Ｏｒｉｇ．Ｃ１，１５０−１６８，１９８０）。こ
のホモロジーグループはＡ１Ａ２Ａ３Ａ４Ｂ１Ｂ２の６
グループとして分類されている。Ａ１グループにはＬ．
ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓの名を残したが、Ｂ１グルー
プは新菌種ラクトバシラス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃ
ｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ）として認められている
（Ｅ．Ｌａｕｅｒ ｅｔ．ａｌ．，Ｉｎｔ．Ａｂｔ．Ｏ
ｒｉｇ．Ｃ１，７５−７８．１９８０）。さらに最近、
以前から記載のあった菌種ラクトバシラス・クリスパタ
ス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕ
ｓ）がホモロジーグループＡ２と同一の菌種であること
が示された（Ｅ．Ｐ．Ｃａｔｏ，ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｓ
ｙｓｔ．Ｂａｃｔ．，ｖｏｌ．３３，４２６−４２８，
１９８３）。Ａ３、Ａ４、Ｂ２の各ホモロジーグループ
については菌種名は付与されていない。
【０００４】このように、従来単一菌種とされてきたラ
クトバシラス・アシドフィラスは多様な菌種の混合であ
ることが明らかとなった。現在のところ、これらのホモ
ロジーグループの鑑別にはＤＮＡの相同性の測定が必要
である。しかし、この手法には、操作が煩雑であること
など幾つかの問題が指摘されている。これらの点を解決
するために、特異プローブを用いたハイブリダイゼーシ
ョン法（特開昭６１−４４０００号公報および特開昭６
１−１１０２９９号公報）、マイクロプレートを用いて
染色体ＤＮＡの相同性を簡便に測定し同定する方法（特
開平１−１９６３００号公報）などが知られている。特
異プローブは特定菌群の検出には有用であるが、日常の
同定作業に用いるためには多数の特異プローブを準備
し、それぞれとハイブリダイゼーションする必要がある
ため利便性に乏しい。一方、マイクロプレートを用いた
方法は一度同定用のマイクロプレートを準備すれば簡便
に同定を行うことができるが、そのためには該当菌種す
べての染色体ＤＮＡを準備しなければならない困難があ
った
クトバシラス・アシドフィラスは多様な菌種の混合であ
ることが明らかとなった。現在のところ、これらのホモ
ロジーグループの鑑別にはＤＮＡの相同性の測定が必要
である。しかし、この手法には、操作が煩雑であること
など幾つかの問題が指摘されている。これらの点を解決
するために、特異プローブを用いたハイブリダイゼーシ
ョン法（特開昭６１−４４０００号公報および特開昭６
１−１１０２９９号公報）、マイクロプレートを用いて
染色体ＤＮＡの相同性を簡便に測定し同定する方法（特
開平１−１９６３００号公報）などが知られている。特
異プローブは特定菌群の検出には有用であるが、日常の
同定作業に用いるためには多数の特異プローブを準備
し、それぞれとハイブリダイゼーションする必要がある
ため利便性に乏しい。一方、マイクロプレートを用いた
方法は一度同定用のマイクロプレートを準備すれば簡便
に同定を行うことができるが、そのためには該当菌種す
べての染色体ＤＮＡを準備しなければならない困難があ
った
【０００５】さらに、微生物の分類指標としてリボゾー
マルＲＮＡ（ｒＲＮＡ）およびその遺伝子（ｒＤＮＡ）
を用いる方法が次第に利用されつつある（Ｎｕｃｌｅｉ
ｃＡｃｉｄ Ｔｅｃｈｉｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂａｃｔ
ｅｒｉａｌ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉ
ｌｅｙ ＆ ＳＯＮＳ，Ｅｎｇｌａｎｄ，１９９１）。
これは、１６ＳリボゾーマルＲＮＡ遺伝子が全生物に普
遍的に存在し、かつ指標となりうるだけの多様性を有し
ていることに因っている。ｒＲＮＡまたはｒＤＮＡの同
定への利用方法としては、その塩基配列を決定し、これ
を比較したり、ある分類群に特異的な配列をＤＮＡプロ
ーブとして用いることが一般に行われている。また、ｒ
ＤＮＡの制限酵素切断後の電気泳動パターンを同定に利
用しようとする研究が行われており（Ａｎｎ．Ｉｎｓ
ｔ．Ｐａｓｔｅｕｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３７Ｂ：
１６５−１７５）、いくつかの分類群についてはその有
用性が認められている。また特表昭５８−５０１４９６
号公報には、ｒＤＮＡを用い、ハイブリダイゼーション
プローブとの選択的な結合を利用し、真核生物に共生す
る原核生物の検出を行う方法が開示されている。制限酵
素切断ｒＤＮＡの電気泳動パターンによる同定法は、簡
便性および同定精度など他の方法に比較して優れている
が、ラクトバシラス属に属する細菌の同定法としては未
だ検討されていない。
マルＲＮＡ（ｒＲＮＡ）およびその遺伝子（ｒＤＮＡ）
を用いる方法が次第に利用されつつある（Ｎｕｃｌｅｉ
ｃＡｃｉｄ Ｔｅｃｈｉｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂａｃｔ
ｅｒｉａｌ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉ
ｌｅｙ ＆ ＳＯＮＳ，Ｅｎｇｌａｎｄ，１９９１）。
これは、１６ＳリボゾーマルＲＮＡ遺伝子が全生物に普
遍的に存在し、かつ指標となりうるだけの多様性を有し
ていることに因っている。ｒＲＮＡまたはｒＤＮＡの同
定への利用方法としては、その塩基配列を決定し、これ
を比較したり、ある分類群に特異的な配列をＤＮＡプロ
ーブとして用いることが一般に行われている。また、ｒ
ＤＮＡの制限酵素切断後の電気泳動パターンを同定に利
用しようとする研究が行われており（Ａｎｎ．Ｉｎｓ
ｔ．Ｐａｓｔｅｕｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３７Ｂ：
１６５−１７５）、いくつかの分類群についてはその有
用性が認められている。また特表昭５８−５０１４９６
号公報には、ｒＤＮＡを用い、ハイブリダイゼーション
プローブとの選択的な結合を利用し、真核生物に共生す
る原核生物の検出を行う方法が開示されている。制限酵
素切断ｒＤＮＡの電気泳動パターンによる同定法は、簡
便性および同定精度など他の方法に比較して優れている
が、ラクトバシラス属に属する細菌の同定法としては未
だ検討されていない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記のよう
な従来法およびハイブリダイゼーション法の欠点を克服
すべく検討したところ、ハイブリダイゼーション法と同
程度に簡便かつ正確であり、かつハイブリダイゼーショ
ン法が本質的に必要とする対照試料を必要としない同定
方法及びこの同定方法に使用するラクトバシラス属同定
キットを提供することを課題とする。
な従来法およびハイブリダイゼーション法の欠点を克服
すべく検討したところ、ハイブリダイゼーション法と同
程度に簡便かつ正確であり、かつハイブリダイゼーショ
ン法が本質的に必要とする対照試料を必要としない同定
方法及びこの同定方法に使用するラクトバシラス属同定
キットを提供することを課題とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明は、ラクトバシラ
ス・アシドフィラス等の特定の乳酸菌に属すると思われ
る細菌のリボゾーマルＲＮＡ遺伝子（ｒＤＮＡ）を特定
の制限酵素で切断することによって産生されるＤＮＡ断
片の長さを解析・比較することよりなる乳酸菌の簡易同
定方法に関する。
ス・アシドフィラス等の特定の乳酸菌に属すると思われ
る細菌のリボゾーマルＲＮＡ遺伝子（ｒＤＮＡ）を特定
の制限酵素で切断することによって産生されるＤＮＡ断
片の長さを解析・比較することよりなる乳酸菌の簡易同
定方法に関する。
【０００８】より詳しくは、本発明の方法は、まず、ラ
クトバシラス・アシドフィラス、ラクトバシラス・クリ
スパタス、ラクトバシラス・ガセリおよびその類縁菌種
に含まれると判断される被検菌より染色体ＤＮＡを抽出
する。この抽出は、従来行われている染色体ＤＮＡの抽
出法、例えば、菌体を緩衝液に懸濁し、Ｎ−アセチルム
ラミディスＳＧなどの溶菌酵素を作用させて溶菌し、フ
ェノール処理、エタノール沈澱をくり返し、得られる沈
澱を水に溶解することによって、染色体ＤＮＡ溶液を得
ることができる。この染色体ＤＮＡを直接、制限酵素Ｈ
ｉｎｆＩおよびＤｒａＩにより切断し、アガロースゲル
電気泳動にかけ、放射性同位元素または非放射性標識体
により標識した１６ＳｒＤＮＡをプローブとしたサザン
・ハイブリダイゼーション法により切断断片を同定す
る。あるいは、抽出した染色体ＤＮＡから酵素的遺伝子
増幅法によって１６ＳｒＤＮＡを特異的に増幅し、これ
を制限酵素ＨｉｎｆｌおよびＤｒａＩにより切断し、ア
ガロースゲル電気泳動にかける。すなわち、制限酵素Ｈ
ｉｎｆＩおよびＤｒａＩをそれぞれ単独に使用して制限
酵素Ｈｉｎｆによる断片及びＤｒａＩによる断片を得
て、これをアガロースゲル電気泳動にかける。これらの
方法により得られる切断ＤＮＡ断片の長さを標準株のも
のと比較し、標準株と一致する泳動パターンを示す被検
菌は標準株同一菌種に含まれるものとする同定方法であ
る。本発明に使用する制限酵素は、乳酸菌のｒＤＮＡを
特異的に切断し、電気泳動時に菌種特有のパターンを呈
するものが使用できる。このような点で、制限酵素Ｈｉ
ｎｆＩおよびＤｒａＩはラクトバシラス・アシドフィラ
ス、ラクトバシラス・クリスパタス、ラクトバシラス・
ガセリおよびその類縁菌種のｒＤＮＡを切断するに最適
の制限酵素として選択される。
クトバシラス・アシドフィラス、ラクトバシラス・クリ
スパタス、ラクトバシラス・ガセリおよびその類縁菌種
に含まれると判断される被検菌より染色体ＤＮＡを抽出
する。この抽出は、従来行われている染色体ＤＮＡの抽
出法、例えば、菌体を緩衝液に懸濁し、Ｎ−アセチルム
ラミディスＳＧなどの溶菌酵素を作用させて溶菌し、フ
ェノール処理、エタノール沈澱をくり返し、得られる沈
澱を水に溶解することによって、染色体ＤＮＡ溶液を得
ることができる。この染色体ＤＮＡを直接、制限酵素Ｈ
ｉｎｆＩおよびＤｒａＩにより切断し、アガロースゲル
電気泳動にかけ、放射性同位元素または非放射性標識体
により標識した１６ＳｒＤＮＡをプローブとしたサザン
・ハイブリダイゼーション法により切断断片を同定す
る。あるいは、抽出した染色体ＤＮＡから酵素的遺伝子
増幅法によって１６ＳｒＤＮＡを特異的に増幅し、これ
を制限酵素ＨｉｎｆｌおよびＤｒａＩにより切断し、ア
ガロースゲル電気泳動にかける。すなわち、制限酵素Ｈ
ｉｎｆＩおよびＤｒａＩをそれぞれ単独に使用して制限
酵素Ｈｉｎｆによる断片及びＤｒａＩによる断片を得
て、これをアガロースゲル電気泳動にかける。これらの
方法により得られる切断ＤＮＡ断片の長さを標準株のも
のと比較し、標準株と一致する泳動パターンを示す被検
菌は標準株同一菌種に含まれるものとする同定方法であ
る。本発明に使用する制限酵素は、乳酸菌のｒＤＮＡを
特異的に切断し、電気泳動時に菌種特有のパターンを呈
するものが使用できる。このような点で、制限酵素Ｈｉ
ｎｆＩおよびＤｒａＩはラクトバシラス・アシドフィラ
ス、ラクトバシラス・クリスパタス、ラクトバシラス・
ガセリおよびその類縁菌種のｒＤＮＡを切断するに最適
の制限酵素として選択される。
【０００９】さらに、本発明は、このような乳酸菌の同
定に使用する同定用キットに関する。本発明の同定用キ
ットは、被検菌体からＤＮＡを抽出する試薬、乳酸
菌のリボゾーマルＲＮＡ遺伝子を特異的に増幅するため
の試薬、制限酵素ＨｉｎｆＩ、ＤｒａＩと反応用試薬
及び対照試料として標準菌株の切断ＤＮＡまたはそれ
に関する資料よりなる。の試薬としては溶菌に必要な
酵素溶液および界面活性剤、さらに染色体ＤＮＡの精製
に必要なフェノール、エタノールなどが含まれる。に
は、酵素的遺伝子増幅法に必要な耐熱性ＤＮＡ合成酵
素、緩衝液、基質以外に１６Ｓリボゾーマル遺伝子に特
異的なプライマー２種類が含まれる。には制限酵素お
よび反応用緩衝液が含まれる。の試薬としては、同定
作業の最終段階で行う電気泳動時に被検試料と並行して
電気泳動を行うことによって比較・確認し得る標準菌株
の切断ＤＮＡ断片、あるいは一般的に入手可能なＤＮＡ
サイズマーカーと標準菌株の切断ＤＮＡ断片の関係を示
した図などが含まれる。
定に使用する同定用キットに関する。本発明の同定用キ
ットは、被検菌体からＤＮＡを抽出する試薬、乳酸
菌のリボゾーマルＲＮＡ遺伝子を特異的に増幅するため
の試薬、制限酵素ＨｉｎｆＩ、ＤｒａＩと反応用試薬
及び対照試料として標準菌株の切断ＤＮＡまたはそれ
に関する資料よりなる。の試薬としては溶菌に必要な
酵素溶液および界面活性剤、さらに染色体ＤＮＡの精製
に必要なフェノール、エタノールなどが含まれる。に
は、酵素的遺伝子増幅法に必要な耐熱性ＤＮＡ合成酵
素、緩衝液、基質以外に１６Ｓリボゾーマル遺伝子に特
異的なプライマー２種類が含まれる。には制限酵素お
よび反応用緩衝液が含まれる。の試薬としては、同定
作業の最終段階で行う電気泳動時に被検試料と並行して
電気泳動を行うことによって比較・確認し得る標準菌株
の切断ＤＮＡ断片、あるいは一般的に入手可能なＤＮＡ
サイズマーカーと標準菌株の切断ＤＮＡ断片の関係を示
した図などが含まれる。
【００１０】本発明は、従来の乳酸菌の各種同定方法に
比べて以下のような長所を有している。すなわち、 同定のための指標としてＤＮＡ断片の長さという絶対
値を用いているため、他の同定方法では必要とされる標
準サンプルを必要としない。これにより、被検菌のみを
用いて同定操作を用い、同定を確実に実施することがで
きる。 本法は、一般に広く行われている実験操作の組合せに
より実施可能なため、高度な技術、訓練、設備などを必
要とせず、時間的にも経済的にも負担が少ない。 本法は、１つの被検菌について実施する場合と、複数
株について実施する場合に要する労力・時間に大差がな
く、多数の被検菌の同定を行うのに適している。上記の
ような長所を有していることから、本発明の方法は迅速
かつ確実にラクトバシラス・アシドフィラス、ラクトバ
シラス・クリスパタス、ラクトバシラス・ガセリおよび
その類縁菌種を同定し得る経済的に有利な方法である。
比べて以下のような長所を有している。すなわち、 同定のための指標としてＤＮＡ断片の長さという絶対
値を用いているため、他の同定方法では必要とされる標
準サンプルを必要としない。これにより、被検菌のみを
用いて同定操作を用い、同定を確実に実施することがで
きる。 本法は、一般に広く行われている実験操作の組合せに
より実施可能なため、高度な技術、訓練、設備などを必
要とせず、時間的にも経済的にも負担が少ない。 本法は、１つの被検菌について実施する場合と、複数
株について実施する場合に要する労力・時間に大差がな
く、多数の被検菌の同定を行うのに適している。上記の
ような長所を有していることから、本発明の方法は迅速
かつ確実にラクトバシラス・アシドフィラス、ラクトバ
シラス・クリスパタス、ラクトバシラス・ガセリおよび
その類縁菌種を同定し得る経済的に有利な方法である。
【００１１】以下に実施例を示し、本発明を詳細に説明
する。
する。
【実施例１】本実施例においては、標準菌株のｒＤＮＡ
の制限酵素切断後の電気泳動によるホモロジーグループ
の確認例を示す。試験方法 本実施例に使用したラクトバシラス・アシドフィラス、
ラクトバシラス・クリスパタス、ラクトバシラス・ガセ
リおよびその類縁菌種でありホモロジーグループが判明
している６グループ１０菌株を表１に示す。これらの標
準株は全て、ＡＴＣＣから入手することが可能である。
この菌株を８ｍｌのＭＲＳブロス（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｉｅｓ）にて３７℃で１６時間培養した。
得られた菌体をＳＴＭ緩衝液（５０ｍＭトリス−マレイ
ン酸ｐＨ６．５．１Ｍサッカロース）により２回洗浄し
た後、同緩衝液５ｍｌに懸濁した。これにＮ−アセチル
ムラミデイス−ＳＧ（生化学工業）（１０ｍｇ／ｍｌ）
１００μｌ加え、３７℃で１５〜３０分反応させた。−
８０℃にて凍結後、２０％ＳＤＳを２５０μｌ加え、６
０℃に１０分間保ち溶菌した。フェノール処理後、２倍
容のエタノールを加え、遠心分離により染色体ＤＮＡを
回収し２ｍｌの滅菌水に溶解した。ＲＮアーゼ−Ａ（Ｓ
ｉｇｍａ）を５０μｇ／ｍｌ加え、３７℃で３０分反応
させた。再度フェノール処理、エタノール沈澱を行い、
１００μｌの滅菌水に溶解したものを染色体ＤＮＡ溶液
とした。
の制限酵素切断後の電気泳動によるホモロジーグループ
の確認例を示す。試験方法 本実施例に使用したラクトバシラス・アシドフィラス、
ラクトバシラス・クリスパタス、ラクトバシラス・ガセ
リおよびその類縁菌種でありホモロジーグループが判明
している６グループ１０菌株を表１に示す。これらの標
準株は全て、ＡＴＣＣから入手することが可能である。
この菌株を８ｍｌのＭＲＳブロス（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｉｅｓ）にて３７℃で１６時間培養した。
得られた菌体をＳＴＭ緩衝液（５０ｍＭトリス−マレイ
ン酸ｐＨ６．５．１Ｍサッカロース）により２回洗浄し
た後、同緩衝液５ｍｌに懸濁した。これにＮ−アセチル
ムラミデイス−ＳＧ（生化学工業）（１０ｍｇ／ｍｌ）
１００μｌ加え、３７℃で１５〜３０分反応させた。−
８０℃にて凍結後、２０％ＳＤＳを２５０μｌ加え、６
０℃に１０分間保ち溶菌した。フェノール処理後、２倍
容のエタノールを加え、遠心分離により染色体ＤＮＡを
回収し２ｍｌの滅菌水に溶解した。ＲＮアーゼ−Ａ（Ｓ
ｉｇｍａ）を５０μｇ／ｍｌ加え、３７℃で３０分反応
させた。再度フェノール処理、エタノール沈澱を行い、
１００μｌの滅菌水に溶解したものを染色体ＤＮＡ溶液
とした。
【表１】
【００１２】調製した染色体ＤＮＡをテンプレートと
し、２つのユニバーサル・プライマー（５−ＡＧＡＧＴ
ＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧ−３’および ５’−
ＡＡＧＧＡＧＧＴＧＡＴＣＣＡＧＣＣＧＣＡ−３’）を
用いてＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒ
ｅａｃｔｉｏｎ）反応を行った。反応は２．５ユニット
のＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（ＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮ
Ａ ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅとしてＰＥＲＫＩＮ ＥＬＭ
ＥＲ ＣＥＴＵＳ社より販売）、５０ｍＭ塩化カリウ
ム、１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ８．３）、１．５ｍＭ
塩化マグネシウム、それぞれ０．２μｇのユニバーサル
・プライマー、２００μＭのｄＡＴＰ、２００μＭのｄ
ＣＴＰ、２００μＭのｄＧＴＰおよび２００μＭのｄＴ
ＴＰを含む全量１００μｌ反応液で、９４℃−１分間、
６２℃−２分間、７２℃−３分間、３６サイクルの条件
で行い、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子内の約１．５Ｋｂ断片を
増幅した。
し、２つのユニバーサル・プライマー（５−ＡＧＡＧＴ
ＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧ−３’および ５’−
ＡＡＧＧＡＧＧＴＧＡＴＣＣＡＧＣＣＧＣＡ−３’）を
用いてＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒ
ｅａｃｔｉｏｎ）反応を行った。反応は２．５ユニット
のＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（ＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮ
Ａ ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅとしてＰＥＲＫＩＮ ＥＬＭ
ＥＲ ＣＥＴＵＳ社より販売）、５０ｍＭ塩化カリウ
ム、１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ８．３）、１．５ｍＭ
塩化マグネシウム、それぞれ０．２μｇのユニバーサル
・プライマー、２００μＭのｄＡＴＰ、２００μＭのｄ
ＣＴＰ、２００μＭのｄＧＴＰおよび２００μＭのｄＴ
ＴＰを含む全量１００μｌ反応液で、９４℃−１分間、
６２℃−２分間、７２℃−３分間、３６サイクルの条件
で行い、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子内の約１．５Ｋｂ断片を
増幅した。
【００１３】得られたＤＮＡ溶液をクロロフオルム処理
し、エタノールにより沈澱させた。これらのＤＮＡ断片
約２μｇを制限酵素ＨｉｎｆＩまたはＤｒａＩ５ユニッ
トとともにそれぞれの至適ｐＨおよび塩濃度下で３７℃
にて１時間反応させた。これらの反応液をＨｉｎｆＩ反
応液は５％、ＤｒａＩ反応液は３％のアガロースゲル電
気泳動に供した。ＤＮＡの染色は１μｇ／ｍｌのエチジ
ウムブロマイド溶液により行った。
し、エタノールにより沈澱させた。これらのＤＮＡ断片
約２μｇを制限酵素ＨｉｎｆＩまたはＤｒａＩ５ユニッ
トとともにそれぞれの至適ｐＨおよび塩濃度下で３７℃
にて１時間反応させた。これらの反応液をＨｉｎｆＩ反
応液は５％、ＤｒａＩ反応液は３％のアガロースゲル電
気泳動に供した。ＤＮＡの染色は１μｇ／ｍｌのエチジ
ウムブロマイド溶液により行った。
【００１４】実験結果 上記の手順を経て得られた結果を図１、図２及び表２に
示す。図１及び図２の電気泳動パターンにより各ホモロ
ジーグループを同定することができた。ＨｉｎｆＩ切断
断片についてはホモロジー・グループＡ１には約３３５
塩基対、Ａ４には約２２３塩基対の特異的な断片が生成
され、それぞれこれをもって同定することができる。ま
たホモロジー・グループＡ２とＡ３、Ｂ１とＢ２は同様
のパターンを示し識別することができない。一方、制限
酵素ＤｒａＩではホモロジー・グループＡ１、Ａ２、Ａ
４、Ｂ２について切断断片が生成されないのに対し、Ａ
３とＢ１では同じ切断断片が生成される。このため、Ｈ
ｉｎｆＩ切断断片では識別できないホモロジー・グルー
プＡ２とＡ３、Ｂ１とＢ２がＤｒａＩ切断断片を用いる
ことにより識別できる。したがって、ＨｉｎｆＩ切断断
片とＤｒａＩ切断断片の２つを同定のための指標として
用いれば、６ホモロジー・グループ全てが同定可能とな
る。
示す。図１及び図２の電気泳動パターンにより各ホモロ
ジーグループを同定することができた。ＨｉｎｆＩ切断
断片についてはホモロジー・グループＡ１には約３３５
塩基対、Ａ４には約２２３塩基対の特異的な断片が生成
され、それぞれこれをもって同定することができる。ま
たホモロジー・グループＡ２とＡ３、Ｂ１とＢ２は同様
のパターンを示し識別することができない。一方、制限
酵素ＤｒａＩではホモロジー・グループＡ１、Ａ２、Ａ
４、Ｂ２について切断断片が生成されないのに対し、Ａ
３とＢ１では同じ切断断片が生成される。このため、Ｈ
ｉｎｆＩ切断断片では識別できないホモロジー・グルー
プＡ２とＡ３、Ｂ１とＢ２がＤｒａＩ切断断片を用いる
ことにより識別できる。したがって、ＨｉｎｆＩ切断断
片とＤｒａＩ切断断片の２つを同定のための指標として
用いれば、６ホモロジー・グループ全てが同定可能とな
る。
【表２】
【００１５】
【参考例】実施例１と同様に制限酵素ＡｃｃＩＩ、Ｈｈ
ａＩ、ＨｐａＩＩを用いて、標準菌株のｒＤＮＡの制限
酵素切断後、アクリルアミドゲル電気泳動を行い生成す
る断片の長さを測定した。測定結果を表３、表４に示し
た。実施例１に示した制限酵素断片と異なる電気泳動パ
ターンがえられた。実施例１に示したＤｒａＩとＡｃｃ
ＩＩの組み合わせでは、ホモロジー・グループＡ２、Ａ
３、Ｂ１、Ｂ２の同定はできたが、Ａ１とＡ４の区別が
できなかった。またＡｃｃＩＩ、ＤｒａＩ、ＨｈａＩの
組み合わせ、もしくはＡｃｃＩＩ、ＤｒａＩ、ＨｐａＩ
Ｉの組み合わせでも、ホロモジー・グループＡ１とＡ４
の区別ができなかった。６ホモロジー・グループの同定
に最適の組み合わせは制限酵素ＨｉｎｆＩとＤｒａＩの
組み合わせであることが確認できた。
ａＩ、ＨｐａＩＩを用いて、標準菌株のｒＤＮＡの制限
酵素切断後、アクリルアミドゲル電気泳動を行い生成す
る断片の長さを測定した。測定結果を表３、表４に示し
た。実施例１に示した制限酵素断片と異なる電気泳動パ
ターンがえられた。実施例１に示したＤｒａＩとＡｃｃ
ＩＩの組み合わせでは、ホモロジー・グループＡ２、Ａ
３、Ｂ１、Ｂ２の同定はできたが、Ａ１とＡ４の区別が
できなかった。またＡｃｃＩＩ、ＤｒａＩ、ＨｈａＩの
組み合わせ、もしくはＡｃｃＩＩ、ＤｒａＩ、ＨｐａＩ
Ｉの組み合わせでも、ホロモジー・グループＡ１とＡ４
の区別ができなかった。６ホモロジー・グループの同定
に最適の組み合わせは制限酵素ＨｉｎｆＩとＤｒａＩの
組み合わせであることが確認できた。
【表３】
【表４】
【００１６】
【実施例２】本実施例においては、人糞便より分離さ
れ、従来方法でラクトバシラス・アシドフィラスと同定
された乳酸菌を、本発明の方法によってホモロジーグル
ープ同定を行った実例を示す。表５、表６、表７及び表
８に示した性状を示す成人糞便由来菌株３７株を用い、
実施例１と同様に操作を行いｒＤＮＡの制限酵素切断片
を調製し、アガロースゲル電気泳動を行った。３７株の
分類を表９に示した。３７株中、ラクトバシラス．アシ
ドフィラス類縁菌種として同定されたものは３２株であ
り、５株はラクトバシラス・アシドフィラス類縁菌種以
外に属するものと判定された。また３２株中ラクトバシ
ラス・ガセリが２５株（７８％）と最も多く、ラクトバ
シラス．アシドフィラス２株、ラクトバシラス・クリス
パタス１株、ホモロジーグループＡ３は３株、ホモロジ
ーグループＢ２はなしとなった。以上の結果から従来人
腸内菌叢に常在する乳酸桿菌のうち、ラクトバシラス・
アシドフィラス類縁菌種とされていた菌株の多くは、ラ
クトバシラス・ガセリであることが判明した。
れ、従来方法でラクトバシラス・アシドフィラスと同定
された乳酸菌を、本発明の方法によってホモロジーグル
ープ同定を行った実例を示す。表５、表６、表７及び表
８に示した性状を示す成人糞便由来菌株３７株を用い、
実施例１と同様に操作を行いｒＤＮＡの制限酵素切断片
を調製し、アガロースゲル電気泳動を行った。３７株の
分類を表９に示した。３７株中、ラクトバシラス．アシ
ドフィラス類縁菌種として同定されたものは３２株であ
り、５株はラクトバシラス・アシドフィラス類縁菌種以
外に属するものと判定された。また３２株中ラクトバシ
ラス・ガセリが２５株（７８％）と最も多く、ラクトバ
シラス．アシドフィラス２株、ラクトバシラス・クリス
パタス１株、ホモロジーグループＡ３は３株、ホモロジ
ーグループＢ２はなしとなった。以上の結果から従来人
腸内菌叢に常在する乳酸桿菌のうち、ラクトバシラス・
アシドフィラス類縁菌種とされていた菌株の多くは、ラ
クトバシラス・ガセリであることが判明した。
【表５】
【表６】
【表７】
【表８】
【表９】 また従来の性状は表１０のように分類することができ
た。
た。
【表１０】
【００１７】
【実施例３】１６ＳｒＤＮＡを特異的に増幅する方法に
よるラクトバシラス・アシドフィラス、ラクトバシラス
・クリスパタス、ラクトバシラス・ガセリおよびその類
縁菌種の同定用キットは下記ないしの成分（１０検
体分）より構成される。 菌体からＤＮＡを抽出する試薬 酵素反応緩衝液〔トリス−マレイン酸緩衝液、ｐＨ６．５，１Ｍサッカロース ） ４０ｍｌ 溶菌酵素溶液〔Ｎ−アセチルムラミデイスＳＧ〕 ２００μｌ フェノール混液 ５ｍｌ 〔フェノール：クロロフォルム：イソアミルアルコール＝２５：２４：１〕 エタノール １０ｍｌ ７０％エタノール ５ｍｌ 洗浄液〔０．１ｘＳＳＣ（ＳＳＣ：０．１５Ｍ ＮａＣｌ，０．０１５Ｍクエ ン酸三ナトリウム溶液）〕 ２．５ｍｌ １６ＳｒＤＮＡを特異的に増幅するための試薬 １６ＳｒＤＮＡを切断するための試薬 制限酵素ＨｉｎｆＩ（５ Ｕｎｉｔ／μｌ） １０μｌ １０×ＨｉｎｆＩ反応緩衝液〔５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ ７．５， １０ｍＭ ＭｇＣｌ ，１ｍＭ ＤＴＴ，１００ｍＭ ＮａＣｌ〕 ２０μｌ 制限酵素ＤｒａＩ（５ Ｕｎｉｔ／μｌ） １０μｌ １０×ＤｒａＩ反応緩衝液〔１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ，ｐＨ ７．５，１ ０ｍＭ ＭｇＣｌ ，１ｍＭ ＤＴＴ，５０ｍＭ ＮａＣｌ］ ２０μｌ
よるラクトバシラス・アシドフィラス、ラクトバシラス
・クリスパタス、ラクトバシラス・ガセリおよびその類
縁菌種の同定用キットは下記ないしの成分（１０検
体分）より構成される。 菌体からＤＮＡを抽出する試薬 酵素反応緩衝液〔トリス−マレイン酸緩衝液、ｐＨ６．５，１Ｍサッカロース ） ４０ｍｌ 溶菌酵素溶液〔Ｎ−アセチルムラミデイスＳＧ〕 ２００μｌ フェノール混液 ５ｍｌ 〔フェノール：クロロフォルム：イソアミルアルコール＝２５：２４：１〕 エタノール １０ｍｌ ７０％エタノール ５ｍｌ 洗浄液〔０．１ｘＳＳＣ（ＳＳＣ：０．１５Ｍ ＮａＣｌ，０．０１５Ｍクエ ン酸三ナトリウム溶液）〕 ２．５ｍｌ １６ＳｒＤＮＡを特異的に増幅するための試薬 １６ＳｒＤＮＡを切断するための試薬 制限酵素ＨｉｎｆＩ（５ Ｕｎｉｔ／μｌ） １０μｌ １０×ＨｉｎｆＩ反応緩衝液〔５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ ７．５， １０ｍＭ ＭｇＣｌ ，１ｍＭ ＤＴＴ，１００ｍＭ ＮａＣｌ〕 ２０μｌ 制限酵素ＤｒａＩ（５ Ｕｎｉｔ／μｌ） １０μｌ １０×ＤｒａＩ反応緩衝液〔１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ，ｐＨ ７．５，１ ０ｍＭ ＭｇＣｌ ，１ｍＭ ＤＴＴ，５０ｍＭ ＮａＣｌ］ ２０μｌ
【００１８】 標準サンプル 標準サンプルは実施例１に示した標準菌株から調製し
た。
た。
【００１９】
【発明の効果】本発明の実施により、 乳酸菌、特にラ
クトバシラス属の正確な同定が可能となる。また、同定
用の分析キットが提供される。本発明によると、標準サ
ンプルを必要とせず、高度の技術訓練、設備を必要とせ
ず、多数の被検菌の同定を短時間のうちに行うことがで
きる。
クトバシラス属の正確な同定が可能となる。また、同定
用の分析キットが提供される。本発明によると、標準サ
ンプルを必要とせず、高度の技術訓練、設備を必要とせ
ず、多数の被検菌の同定を短時間のうちに行うことがで
きる。
【００２０】
配列番号：１ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴ ＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧ ２０ 配列番号：２ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ＡＡＧＧＡＧＧＴＧＡ ＴＣＣＡＧＣＣＧＣＡ ２０
【図面の簡単な説明】
【図１】制限酵素ＨｉｎｆＩにより切断したｒＤＮＡの
アガロース電気泳動パターンを示す。図中それぞれの番
号は、制限酵素処理された次の乳酸菌を示す。
アガロース電気泳動パターンを示す。図中それぞれの番
号は、制限酵素処理された次の乳酸菌を示す。
１ ATCC 4356 (A1) ２ ATCC 4355 (A1) ３ ATCC 33820 (A2) ４ ATCC 33197 (A2) ５ ATCC 33198 (A3) ６ ATCC 33199 (A4) ７ ATCC 33323 (B1) ８ ATCC 4963 (B1) ９ ATCC 332 (B2) 10 ATCC 33200 (B2)
【図２】制限酵素ＤｒａＩにより切断したｒＤＮＡのア
ガロース電気泳動パターンを示す。図中それぞれの番号
は、制限酵素処理された次の乳酸菌を示す。
ガロース電気泳動パターンを示す。図中それぞれの番号
は、制限酵素処理された次の乳酸菌を示す。
１ ATCC 4356 (A1) ２ ATCC 4355 (A1) ３ ATCC 33820 (A2) ４ ATCC 33197 (A2) ５ ATCC 33198 (A3) ６ ATCC 33199 (A4) ７ ATCC 33323 (B1) ８ ATCC 4963 (B1) ９ ATCC 332 (B2) 10 ATCC 33200 (B2)
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 「生化学辞典（第２版）」（平成２年 11月）東京化学同人Ｐ．716 ＦＥＭＳ ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ ＬＥＴＴＥＲＳ，ＶＯＬ．93〜３！ （1992−ＪＵＮＥ−15）Ｐ．227−234 ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＣＬＩＮＩＣ ＡＬ ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ，ＶＯ Ｌ．29〜12！（1991）Ｐ．2774−2778 ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ ＪＯＵ ＲＮＡＬ ＯＦ ＳＹＳＴＥＭＡＴＩＣ ＢＡＣＴＥＲＩＯＬＯＧＹ，ＶＯＬ. 41〜４！（1991）Ｐ．483
Claims (3)
- 【請求項１】 ラクトバシラス・アシドフィラス（Ｌａ
ｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ），
ラクトバシラス・クリスパタス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌ
ｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ），ラクトバシラス・ガセ
リ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ）及
びその類縁菌種からなる群から選択される乳酸菌に属す
ると思われる細菌のリボゾーマルＲＮＡ遺伝子を、制限
酵素ＨｉｎｆＩ及び制限酵素ＤｒａＩをそれぞれ単独で
使用し切断することによって得られる複数のＤＮＡ断片
の長さを解析し、比較することによって同定する乳酸菌
の簡易同定方法。 - 【請求項２】 被検菌体からＤＮＡを抽出する試薬、
乳酸菌のリボゾーマルＲＮＡ遺伝子を特異的に増幅す
るための試薬、制限酵素ＨｉｎｆＩ、ＤｒａＩと反応
用試薬および対照試料として標準菌株の切断ＤＮＡま
たはそれに関する資料を含む、ラクトバシラス・アシド
フィラス、ラクトバシラス・クリスパタス、ラクトバシ
ラス・ガセリおよびその類縁菌種の同定用キット。 - 【請求項３】 被検菌体からＤＮＡを抽出する試薬、
制限酵素ＨｉｎｆＩ、ＤｒａＩと反応用試薬、乳酸
菌のリボゾーマルＲＮＡ遺伝子に対する放射性または非
放射性標識されたＤＮＡまたはＲＮＡプローブおよび４
対照試料として標準菌株の切断ＤＮＡまたはそれに関す
る資料を含む、ラクトバシラス・アシドフィラス、ラク
トバシラス・クリスパタス、ラクトバシラス・ガセリお
よびその類縁菌種の同定用キット。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4188842A JP2654890B2 (ja) | 1992-03-27 | 1992-06-23 | 乳酸菌の簡易同定方法およびこの同定方法に使用する同定キット |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4-102151 | 1992-03-27 | ||
| JP10215192 | 1992-03-27 | ||
| JP4188842A JP2654890B2 (ja) | 1992-03-27 | 1992-06-23 | 乳酸菌の簡易同定方法およびこの同定方法に使用する同定キット |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05317096A JPH05317096A (ja) | 1993-12-03 |
| JP2654890B2 true JP2654890B2 (ja) | 1997-09-17 |
Family
ID=14319739
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4188842A Expired - Lifetime JP2654890B2 (ja) | 1992-03-27 | 1992-06-23 | 乳酸菌の簡易同定方法およびこの同定方法に使用する同定キット |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2654890B2 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP3071128B2 (ja) * | 1995-06-26 | 2000-07-31 | 雪印乳業株式会社 | 乳酸菌の分離同定方法 |
| CA2367587A1 (en) * | 1999-03-01 | 2000-09-08 | Hendrik Van Haeringen | Detection and quantification of micro-organisms using amplification and restriction enzyme analysis |
-
1992
- 1992-06-23 JP JP4188842A patent/JP2654890B2/ja not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| 「生化学辞典（第２版）」（平成２年１１月）東京化学同人Ｐ．７１６ |
| ＦＥＭＳ ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ ＬＥＴＴＥＲＳ，ＶＯＬ．９３〜３！（１９９２−ＪＵＮＥ−１５）Ｐ．２２７−２３４ |
| ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＳＹＳＴＥＭＡＴＩＣ ＢＡＣＴＥＲＩＯＬＯＧＹ，ＶＯＬ．４１〜４！（１９９１）Ｐ．４８３ |
| ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＣＬＩＮＩＣＡＬ ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ，ＶＯＬ．２９〜１２！（１９９１）Ｐ．２７７４−２７７８ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH05317096A (ja) | 1993-12-03 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Springer et al. | Two-laboratory collaborative study on identification of mycobacteria: molecular versus phenotypic methods | |
| Querol et al. | Rapid diagnosis of pleural tuberculosis by polymerase chain reaction. | |
| Domig et al. | Methods used for the isolation, enumeration, characterisation and identification of Enterococcus spp.: 2. Pheno-and genotypic criteria | |
| CN102329880B (zh) | 结核菌检测用的引物和探针以及使用它们检测人型结核菌的方法 | |
| KR19990008049A (ko) | 종 동정에 사용하기 위한 보편적 표적 | |
| EP2344673B1 (en) | Diagnostic test for streptococcus equi | |
| Lew et al. | Detection of Pseudomonas pseudomallei by PCR and hybridization | |
| US5807672A (en) | Mycobacterial nucleic acid hybridization probes and methods of use | |
| EP0885310B1 (en) | Genetic markers and methods for the detection of escherichia coli serotype-0157:h7 | |
| Erlandson et al. | Strain-specific differentiation of lactococci in mixed starter culture populations using randomly amplified polymorphic DNA-derived probes | |
| Debruyne et al. | Comparative performance of different PCR assays for the identification of Campylobacter jejuni and Campylobacter coli | |
| US20040110129A1 (en) | Multiplex hybridization system for identification of pathogenic mycobacterium and method of use | |
| Swanson et al. | Identification and subspecific differentiation of Mycobacterium scrofulaceum by automated sequencing of a region of the gene (hsp65) encoding a 65-kilodalton heat shock protein | |
| EP0739987A2 (en) | Oligonucleotides for detecting Salmonella species and detection process using the same | |
| EP3115466A1 (en) | Listeria monocytogenes clonogrouping and assessment of infectivity | |
| JP2654890B2 (ja) | 乳酸菌の簡易同定方法およびこの同定方法に使用する同定キット | |
| Lübeck et al. | PCR technology and applications to zoonotic food-borne bacterial pathogens | |
| US7439022B2 (en) | Nucleic acids for detection of Listeria | |
| JPH10210980A (ja) | 乳酸菌検出用オリゴヌクレオチド及び該菌の検出方法 | |
| US6558909B2 (en) | Haemobartonella PCR methods and materials | |
| Korolik et al. | Specific identification, grouping and differentiation of Campylobacter jejuni among thermophilic campylobacters using multiplex PCR | |
| JP3634960B2 (ja) | ジャイレース遺伝子を用いた結核菌群構成細菌の同定・検出方法 | |
| CA2520617C (en) | Method of detecting bifidobacterium infantis | |
| WO2003062463A2 (en) | One-step multiplex pcr for the identification and differentiation of campylobacter species | |
| Koivula et al. | Genetic diversity in clinical isolates of Mycobacterium avium complex from Guinea-Bissau, West Africa |