KR102301527B1

KR102301527B1 - 락토바실러스 플란타룸 검출용 조성물 및 이의 용도

Info

Publication number: KR102301527B1
Application number: KR1020200067386A
Authority: KR
Inventors: 최재웅; 이영경; 이성훈; 홍지영; 홍희도; 조장원
Original assignee: 한국식품연구원
Priority date: 2020-06-04
Filing date: 2020-06-04
Publication date: 2021-09-13

Abstract

본 발명은 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)을 특이적으로 신속하게 검출할 수 있는 검출용 프라이머 세트에 관한 것으로, 유산균들 중에서 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) AMT-74419 균주만의 차이점이 있는 부분을 선택적으로 증폭시킬 수 있으므로, 궁극적으로 식품 등에 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) AMT-74419 균주가 존재하는지 여부를 신속하고 특이적으로 확인할 수 있다. 따라서, 본 발명의 균주를 사용하는 프로바이오틱스 제품 관리 기술 및 산업 경쟁력을 강화할 수 있다.

Description

락토바실러스 플란타룸 검출용 조성물 및 이의 용도{A Primer composition for specifically detecting Lactobacillus plantarum and uses thereof}

본 발명은 락토바실러스 플란타룸 검출용 조성물 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로 락토바실러스 플란타룸 중에서도 락토바실러스 플란타룸 AMT-74419를 특이적으로 검출할 수 있는 조성물과 이를 포함하는 키트 및 이를 이용한 검출 방법에 관한 것이다.

인간은 미생물과 지속적인 접촉을 하며 살아가고 있다. 수많은 미생물이 인체의 안팎에 존재하며 사람의 건강에 유익하거나, 유해한 영향을 미친다. 인간과 공생하는 미생물은 상재균이라고 하며, 대부분 위장관에 존재한다. 상재균은 장관 내부에 하나의 생태계를 이루며, 체내의 대사, 영양, 에너지 이용, 선천 면역, 적응 면역 및 장관 내 점막 상피세포의 발달과 생성뿐만 아니라 병원체의 침입방지에 까지 다양한 역할을 수행하는 것으로 알려져 있다. 게다가 장내에 존재하는 미생물 집단('장내세균총'이라고도 함)은 과민성 대장 증후군, 염증성 장질환, 비만,변비, 지방간, 신생사 괴사성 장염, 알레르기 등의 질환과 관계가 있다고 알려져 있다.

이에, 많은 사람들이 장내세균총을 개선할 수 있는 프로바이오틱스에 대한 관심과 연구가 진행되었고, 이로 인해 프로바이오틱스는 건강기능식품으로써 자리잡게 되었다. 한국건강기증식품협회에서는 집계한 통계에 따르면, 2019년 국내 건강기능식품 시장의 규모는 4조 6천억원 이상으로 집계하였고, 이 중에서 프로바이오틱스 시장 규모는 약 6천억원인 것으로 발표하였다. 프로바이오틱스 시장은 매년 성장하고 있으며, 2022년에는 약 1조원대가 될 것으로 추산되어, 고기능성 프로바이오틱스를 이용한 제품의 시장성은 무한하다고 할 수 있다.

프로바이오틱스란 숙주의 건강에 유익한 살아있는 미생물을 의미하는 것으로, 프로바이오틱스로 인정받기 위해서는 위산, 담즙산에서 죽지 않고 소장까지 도달하여 장에서 증식하고 정착하여야 하며 장관 내에서 유익한 효과를 나타내어야 하고 독성이 없으며 병원성이 없어야 한다. 최근까지 밝혀진 프로바이오틱스의 효능으로는 유산 발효에 의한 식품 보존성 향상, 혈중 콜레스테롤 농도 저하, 면역 증진, 비타민 합성을 통한 생리활성화, 유해효소의 합성 억제, 유당 불내증 개선, 장내 유해균 증식 억제, 설사 치유 및 정장작용, 장내 정상적 균총 조성을 통한 노화 방지, 피부 미용효과 등 이 있다.

프로바이오틱스 중 일부는 건강기능식품의 고시형 원료로 선정되었고, 이를 제품화하기 위해서는 해당 균주 외에 다른 균주의 오염을 줄이고, 프로바이오틱스의 정확한 발생을 유도하는 것이 중요하다, 따라서 프로바이오틱스 중에서 특정 균주를 정확하게 검출 및 판별하는 방법의 개발은 제품의 품질과 상품성에 있어서 필수적이다.

현재까지 알려진 프로바이오틱스로는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus), 바실러스 폴리퍼멘티쿠스(Bacillus polyfermenticus), 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) 등이 있고, 이러한 프리바이오틱스 균주들을 검출 및 진단하기 위해서는 평판배양법이나 미생물의 표현형 특성을 이용한 생화학 방법이 주로 사용되었다. 그러나 이러한 방법들은 시간이 많이 소모되고 유산균들의 발효 패턴에 따라 잘못된 결과가 나타나는 등의 단점이 있다.

상술한 문제를 해결하기 위하여 PCR(Polymerase chain reaction, 중합연쇄반응)을 기반으로 하는 RAD-PPCR(random amplified polymorphic DNA-PCR)이나 PCR-PFLP(PCR-restriction fragment length polymorphism) 또는 16S rRNA-based PCR이 개발되었으나, 같은 속에 속하는 균종의 16S rRNA 유전자 서열은 98~99% 일치하기 때문에, 16S rRNA 유전자를 이용한 종래의 방법으로는 같은 그룹에 속하는 균주의 종을 구별하기는 어렵다는 한계점이 존재한다.

특허문헌 1. 대한민국 등록특허공보 제10-2099344호

본 발명의 해결하고자 하는 과제는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)을 특이적으로 신속하게 검출할 수 있는 검출용 프라이머 세트, 상기 균주의 검출용 조성물, 상기 균주를 검출하기 위한 키트 및 상기 균주의 검출 방법을 제공하는 것이다.

상기한 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 정방향 프라이머 및 서열번호 2로 표시되는 역방향 프라이머로 구성된 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) 검출용 프라이머 세트를 제공한다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)은 서열번호 3으로 표시되는 염기서열로 이루어진 유전자를 갖는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) AMT-74419일 수 있다.

본 발명은 서열번호 1로 표시되는 정방향 프라이머 및 서열번호 2로 표시되는 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트를 포함하는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) 검출용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)은 서열번호 3으로 표시되는 염기서열로 이루어진 유전자를 갖는 락토바실러스 플란타룸 (Lactobacillus plantarum) AMT-74419일 수 있다.

본 발명의 다른 실시예에 의하면, 상기 정방향 프라이머는 5'-말단에 연결된, 형광단, 발색단, 화학발광단, 자기입자 및 방사능동위원소로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 표지를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명은 프라이머 세트를 포함하는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) 검출용 키트를 제공한다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 키트는 완충용액, DNA 중합효소, dNTP 및 증류수를 더 포함할 수 있다.

본 발명은 시료에서 분리된 DNA를 주형으로 하고, 제1항에 따른 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) 검출용 프라이머 세트를 이용하여, 표적 서열을 증폭하는 단계를 포함하는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)을 검출하는 방법을 제공한다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 표적 서열은 서열번호 3으로 표시되는 염기서열일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 증폭 단계로부터 얻어진 PCR 산물은 형광발색, 탁색도, 스핀다운에 의한 침전물, 전기영동 및 용융 곡선(melting curve) 분석으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 통해 분석할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 증폭 단계로부터 얻어진 PCR 산물이 640 내지 650 bp이면, 시료 내 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) AMT-74419가 함유된 것으로 판단할 수 있다.

본 발명의 다른 실시예에 의하면,상기 증폭 단계로부터 얻어진 PCR 산물의 용융 곡선에서 74 내지 75 ℃의 용해 피크가 관찰되면, 시료 내 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) AMT-74419가 함유된 것으로 판단할 수 있다.

본 발명에 따른 프라이머 세트는, 유산균들 중에서 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) AMT-74419 균주만의 차이점이 있는 부분을 선택적으로 증폭시킬 수 있으므로, 궁극적으로 식품 등에 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) AMT-74419 균주가 존재하는지 여부를 신속하고 특이적으로 확인할 수 있다.

즉, 본 발명에 따른 프라이머 세트는 16S rRNA가 유사하거나 동일한 다른 락토바실러스 플란타룸 중에서도 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) AMT-74419 균주만을 특이적으로 검출할 수 있기 때문에 프로바이오틱스 제품 관리 기술 및 산업 경쟁력을 강화할 수 있다.

도 1은 전장유전체 분석이 완료된 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) AMT-74419의 전체 유전자 지도이다.
도 2는 서열번호 1 및 2로 구성된 프라이머 세트를 활용한 PCR 분석한 결과이다.
도 3은 서열번호 1 및 2로 구성된 프라이머 세트를 활용하여, 종래 8종의 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) 균주를 PCR 분석한 결과이다.
도 4는 서열번호 1 및 2로 구성된 프라이머 세트를 활용하여, 종래 8종의 락토바실러스 속(Lactobacillus) 균주를 PCR 분석한 결과이다.
도 5는 Real-time PCR Ct 그래프 결과로, 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) AMT-74419에 대한 실시간 PCR 증폭 반응(Real-time PCR)에서의 표준곡선을 나타낸 결과이다.
도 6은 본 발명의 프라이머 세트를 활용하여 측정된, 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) AMT-74419에 대한 용융피크(Melting peak)를 도시한 것이다.
도 7은 본 발명의 프라이머 세트를 활용하여 측정된, 락토바실러스 균주에 대한 용융피크(Melting peak)를 도시한 것이다. 도 7(a)는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) KACC17115 균주에 대한 용융피크이고, 도 7(b)는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) KACC 11451 균주에 대한 용융피크이며, 도 7(c)는 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) KCTC 5033 균주에 대한 용융피크이며, 도 7(d)는 락토바실러스 그라미니스(Lactobacillus graminis) KCTC 3542 균주에 대한 용융피크이다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명에서 용어 '프라이머(primer)'란, 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity) 뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다. 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)를 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 프라이머는 디옥시리보뉴클레오타이드이며 단일쇄이다. 본 발명에서 이용되는 프라이머는 자연(naturally occurring) dNMP(즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 변형 뉴클레오타이드 또는 비-자연 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 또한, 프라이머는 리보뉴클레오타이드도 포함할 수 있다.

상기 프라이머는 타겟 핵산에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 본 발명에서 용어 '상보적'이란, 소정의 어닐링 또는 혼성화 조건하에서 프라이머 또는 프로브가 타겟 핵산 서열에 선택적으로 혼성화 할 정도로 충분히 상보적인 것을 의미하며, 실질적으로 상보적(substantially complementary) 및 완전히 상보적(perfectly complementary)인 것을 모두 포괄하는 의미를 가지며, 바람직하게는 완전히 상보적인 것을 의미한다.

본 발명에서 용어 '프라이머 세트(primer set)'란 특정 서열 DNA를 증폭하기 위한 프라이머의 조합을 의미하고 하나의 프라이머 세트에는 통상 2가지 프라이머가 포함되나 이를 초과하는 경우도 있다.

본 발명에서 용어 '올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)'란 단일가닥 또는 이중가닥 형태로 존재하는 디옥시리보올리고뉴클레오티드 또는 리보올리고뉴클레오티드이며, 다르게 특별하게 언급되어 있지 않는 한 자연의 뉴클레오티드의 유사체를 포함한다.

종래 수많은 프로바이오틱 균주들 중에서 특정 균주를 검출하기 위하여 사용된 방법들은 비용이 높거나 정확도가 낮거나, 민감도가 낮아 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) AMT-74419 균주를 구별하지 못하고, 다른 락토바실러스 속의 균주를 오검출하는 문제점이 있었다.

본 발명자들은 프로바이오틱 균주들 중에서도 우수한 효과를 갖는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) AMT-74419를 제품화할 수 있도록, 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) AMT-74419를 정확하게 검출 및 판별하는 프라이머 세트, 조성물 및 방법을 제공하고자 노력하였고, 그 결과 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

이를 위해, 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) AMT-74419와 다른 락토바실러스 속 균주와의 게놈을 비교분석해본 결과, 16S rRNA 영역 외에 약 120 내지 140 bp 크기를 갖는 서열번호 3로 표시되는 유전자들이 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) AMT-74419에만 존재하는 것을 확인하였다. 이에 따라 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) AMT-74419와 다른 유산균주들 간에 차이가 나는 부분을 확인할 수 있는 프라이머 세트들을 개발하여 높은 민감도로 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) AMT-74419의 존재 유무를 확인할 수 있는 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 일 측면은 서열번호 1로 표시되는 정방향 프라이머 및 서열번호 2로 표시되는 역방향 프라이머로 구성된 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) 검출용 프라이머 세트에 관한 것이다.

본 발명의 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) AMT-74419는 서열번호 3으로 표시되는 ATP-dependent RecD-like DNA helicase 단백질 유전자를 갖는다. 상기 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) AMT-74419를 제외한 알려진 모든 유산균에는 서열번호 3으로 표시되는 ATP-dependent RecD-like DNA helicase 단백질 유전자를 갖지 않는다. 이런 차이를 통해 기존에 알려진 유산균들과 차이를 갖는 전혀 다른 위치의 서열을 확인하고, 이를 증폭할 수 있는 특이적 프라이머 세트를 설계하였으며, 이를 이용하여 일반(conventional) PCR 및 실시간(real-time) PCR 증폭 반응을 수행한 결과, 락토바실러스 플란타룸 (Lactobacillus plantarum) AMT-74419만을 특이적으로 검출할 수 있음을 확인하여 완성하게 되었다.

상기 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트는 ATP-dependent RecD-like DNA helicase 단백질 유전자, 특히 서열번호 3의 염기서열로 이루어지는 유전자를 특이적으로 검출할 수 있다.

다시 말해, 상기 프라이머 세트는 락토바실러스 플란타룸 (Lactobacillus plantarum) AMT-74419의 서열번호 3으로 표시되는 염기서열로 이루어진 유전자 전체 또는 일부를 증폭할 수 있다. PCR 수행 시 120 내지 140 bp의 증폭 산물을 생성할 수 있다.

본 발명의 프라이머 세트는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) AMT-74419 균주와 유사하거나 동일한 종 및 속을 갖는 유사 균주들과 혼합되어 있는 시료에서도 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) AMT-74419 균주를 특이적으로 검출할 수 있다.

상기 시료는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) AMT-74419 균주를 함유하거나, 함유할 것으로 예상되는 모든 식품, 예컨대 김치, 된장, 메주, 발효유 등과 같은 발효 식품, 정육제품, 건조 소시지, 또는 김치 양념소와 같은 혼합 양념으로부터 얻은 것일 수 있고, 특별히 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 프라이머 세트는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) AMT-74419의 생균뿐만 아니라 사균까지 정확하게 검출할 수 있다.

본 발명의 프라이머 세트는 후술하는 실험예에서 확인된 바와 같이, 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) AMT-74419 균주를 제외한 다른 락토바실러스 균주와 락토바실러스 플란타룸 균주에 대해서도 전혀 PCR 산물을 합성하지 않으므로, 상기 프라이머 세트를 사용하여 시료로부터 정확하게 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) AMT-74419 균주의 존재여부를 특이적으로 판별할 수 있다.

본 발명의 프라이머 세트의 표적이 되는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) AMT-74419 균주(수탁번호 KCCM 80229)는 한국미생물보존센터에 기탁된 균주로, 장 건강에 효과를 가지는 것으로 확인된 균주이다.

본 발명은 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) AMT-74419 균주의 특이적인 프라이머 세트 설계를 위해, 이의 전장 유전체 서열을 분석하였으며, 이는 하기 도 1에 나타내었고, NCBI에도 등록하였다.

상기 정방향 프라이머 혹은 역방향 프라이머의 5'-말단 또는 3'-말단에 연결된, 형광단, 발색단, 화학발광단, 자기입자 및 방사능동위원소로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 표지를 추가로 포함하는 것일 수 있다.

상기 '표지(lable)' 또는 '검출가능한 표지(detectable label)'는 뉴클레오티드, 뉴클레오티드 중합체, 또는 핵산 결합 인자에 결합된 어떠한 화학적 모이어티를 의미할 수 있으며, 상기 결합은 공유결합 또는 비공유 결합일 수 있다. 바람직하게는, 상기 표지는 검출 가능하며, 본 발명의 실험자에게 검출될 수 있는 상기 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 중합체일 수 있다. 검출가능한 표지는 발광분자, 화학 발광 분자, 형광 색소, 형광 퀀칭제(quenching agent), 색깔 분자, 방사성 동위원소 또는 신틸런트(scintillant)를 포함한다. 검출가능한 표지는 또한, 임의의 유용한 링커 분자(예를 들어, 비오틴, 아비딘, 스트랩트아비딘, HRP, protein A, protein G, 항체 또는 그의 단편, Grb2, 폴리히스티딘, Ni2+, FLAG 태그, myc 태그), 중금속, 효소(예를 들어. 알칼라인 포스파타제, 퍼옥시다제 및 루시퍼라제), 전자 공여체(donor)/수용체(acceptor), 아크리디늄 에스테르, 염료(dye) 및 열량 측정 기질(calorimetric substrate)를 포함한다. 또한, 표면 플라스몬 공명(surface plasmon resonance) 검출의 경우와 같이, 질량의 변화(a change in mass)를 나타내는데 검출가능한 표지가 고려될 수 있다. 당업자는 상기 언급되지 않은 유용한 검출가능한 표지에 대해서도 용이하게 인식할 수 있을 것이며, 이들 또한 본 발명의 실시에 사용될 수 있다.

또한, 본 발명의 다른 측면은 서열번호 1로 표시되는 정방향 프라이머 및 서열번호 2로 표시되는 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트를 포함하는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) 검출용 조성물을 제공한다.

본 발명의 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) AMT-74419는 서열번호 3으로 표시되는 ATP-dependent RecD-like DNA helicase 단백질 유전자를 갖는다. 상기 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) AMT-74419를 제외한 알려진 모든 유산균에는 서열번호 3으로 표시되는 ATP-dependent RecD-like DNA helicase 단백질 유전자를 갖지 않는다. 이런 차이를 통해 기존에 알려진 유산균들과 차이를 갖는 전혀 다른 위치의 서열을 확인하고, 이를 증폭할 수 있는 특이적 프라이머 세트를 설계하였으며, 이에 따라 증폭되는 PCR 산물의 유무에도 분명한 차이가 나타냄을 확인한 바, 본 발명을 완성하게 되었다.

상기 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트를 포함하는 조성물은 ATP-dependent RecD-like DNA helicase 단백질 유전자, 특히 서열번호 3의 염기서열로 이루어지는 유전자를 특이적으로 검출할 수 있다.

본 발명의 조성물은 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) AMT-74419 균주와 유사하거나 동일한 종 및 속을 갖는 유사 균주들과 혼합되어 있는 시료에서도 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) AMT-74419 균주를 특이적으로 검출할 수 있다.

본 발명의 조성물은 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) AMT-74419의 생균뿐만 아니라 사균까지 정확하게 검출할 수 있다.

본 발명의 조성물은 후술하는 실험예에서 확인된 바와 같이, 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) AMT-74419 균주를 제외한 다른 락토바실러스 균주와 락토바실러스 플란타룸 균주에 대해서도 전혀 PCR 산물을 합성하지 않으므로, 상기 프라이머 세트를 사용하여 시료로부터 정확하게 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) AMT-74419 균주의 존재여부를 특이적으로 판별할 수 있다.

본 발명의 조성물의 표적이 되는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) AMT-74419 균주(수탁번호 KCCM 80229)는 한국미생물보존센터에 기탁된 균주로, 장 건강에 효과를 가지는 것을 가지는 것으로 확인된 균주이다.

본 발명의 또 다른 측면은 프라이머 세트를 포함하는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) 검출용 키트에 관한 것이다.

본 발명에서 용어 '증폭'이란, 표적 핵산 서열 또는 그에 상보적인 서열의 카피 수를 증가시키는 것이다.

본 발명에서 용어 'PCR'이란, 중합효소를 이용하여 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍으로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법을 의미한다.

본 발명에서 '역전사(reverse transcription)'란 RNA를 주형으로 하여 RNA 서열에 상보적인 DNA 가닥을 합성하는 것을 의미한다.

상기 키트는 타겟 핵산을 증폭하기 위한 것일 수 있다. 증폭은 핵산 증폭을 위하여 알려진 방법이라면 특별히 이에 제한되지 않는다. 예를 들어 상기 증폭은 DNA 증폭 또는 RNA 증폭일 수 있다. DNA 증폭 방법은 열순환(termal cycling)을 필요로 하는 것 또는 등온(isothermal)에서 수행되는 것일 수 있이라면 특별히 이에 제한되지 않으며, 구체적으로 폴리머라아제 연쇄 반응(polymerase chain reaction: PCR), 핵산 서열-기초 증폭(nucleic acid sequence-based amplification: NASBA), 리가아제 연쇄 반응(ligase chain reaction: LCR), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplificaton: SDA) 및 롤링 서클증폭(rolling circle amplification: RCA)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다. 상기 RNA 증폭 방법은 역전사(reverse transcription: RT) 또는 역전사-PCR일 수 있다.

상기 키트는 표적 핵산의 증폭에 필요한 물질을 더 포함할 수 있는데, 구체적으로 완충용액, 핵산 중합효소, dNTP 및 증류수를 더 포함할 수 있으며, 이는 당업계에서 통상적으로 사용되는 용액, 효소 등이 제한업이 사용될 수 있다. 또한 상기 키트는 상기 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다.

상기 핵산 중합효소는 DNA 폴리머라아제, RNA 폴리머라아제, 역전사 효소(reverse transcriptase) 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있고, 바람직하게는 DNA 폴리머라아제인 것이 바람직하다.

상기 완충용액(buffer)은 증폭 반응에 첨가되어 상기 증폭 반응을 조절함으로서 상기 증폭 반응의 하나 이상의 요소를 안정성, 활성, 및/또는 수명을 변형시키는 화합물이다. 본 발명의 상기 완충액은 PCR 증폭 및 RNase H 절단 활성과 양립할 수 있다. 완충용액은 구체적으로, HEPES(4-(2-히드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산), MOPS(3-(N-morpholino)propanesulfonic acid)(3-(N-모르폴리노)-프로판술폰산) 및 아세테이트 또는 포스페이트를 포함하는 완충액 등을 포함하나 이에 한정하지는 않는다. 또한, PCR 완충용액은 일반적으로 약 70 mM 이하의 KCl 및 약 1.5 mM 또는 그 이상의 MgCl2, 약 50-200 uM의 각각의 dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP를 포함할 수 있다. 본 발명의 완충용액은 효율적인 역전사 효소-PCR 또는 PCR 반응을 최적화시키기 위해 첨가물을 포함할 수 있다.

상기 첨가물은 오염된 효소의 불활성화, 단백질 접힘의 안정화, 및/또는 응집의 감소에 영향을 미친다. 증폭 반응에 포함될 수 있는 첨가물의 예는 베타인, 포름아미드, KCl, CaCl2, MgOAc, MgCl2, NaCl, NH4OAc, NaI, Na(CO3)2, LiCl, MnOAc, NMP, 트레할로스, 데미에틸술폭시드(DMSO), 글리세롤, 에틸렌 글리콜, 디티오트레이톨(DTT), 피로포스파타제(Thermoplasma acidophilum 무기 피로포스파타제(inorganic pyrophosphatase, TAP)를 포함하나, 이에 한정하지 않는다.), 우혈청 알부민(BSA), 프로필렌 글리콜, 글리신아미드, CHES, 퍼콜(Percoll), 아우린트리카르복실산, Tween 20, Tween 21, Tween 40, Tween 60, Tween 85, Brij 30, NP-40, Triton X-100, CHAPS, CHAPSO, Mackernium, LDAO(N-도데실-N,N-디메틸아민-N-옥시드), Zwittergent 3-10, Xwittergent 3-14, Xwittergent SB 3-16, Empigen, NDSB-20, T4G32, E. Coli SSB, RecA, 닉킹 엔도뉴클레아제(nicking endonucleases), 7-디아자G, dUTP, 음이온 디터전트(anionic detergent), 양이온 디터전트(cationic detergent), 비-이온 디터전트(nonionic detergent), zwittergent, 스테롤, 삼투조절물질(osmolyte), 양이온, 및 증폭의 효율을 변화시킬 수 있는 기타 화합물, 단백질, 또는 보조인자를 포함하나, 이에 한정하지 않는다. 일 구체예에서, 2 이상의 첨가물이 증폭 반응에 포함될 수 있다. 상기 첨가물이 RNase H의 활성을 방해하지 않는다면, 첨가물은 프라이머 어닐링의 선택성을 향상시키기 위해 선택적으로 첨가될 수 있다.

본 발명자들은 시료 내에 존재하는 수 많은 미생물들 중에서, 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) AMT-74419의 서열번호 3으로 표시되는 유전자를 표적으로 하는 프라이머 세트(정방향 프라이머와 역방향 프라이머)를 개발하였고, 상기 증폭된 PCR 산물의 형성 유무를 확인함으로써, 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) AMT-74419를 정확하고, 신속하게 검출할 수 있는 방법을 개발하였다. 구체적으로 상기 증폭된 PCR 산물은 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) AMT-74419만이 120 내지 140 bp의 크기를 나타내며, 특이적 용융 피크를 가지므로, 이를 통해 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) AMT-74419를 특이적으로 검출 및 판별할 수 있다. 실제 PCR 분석에 상기 조성물을 이용할 경우, 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) AMT-74419에서는 약 120 내지 140 bp의 PCR 산물 크기를 갖고 있는 것으로 확인되었고, 이는 프라이머 세트로 증폭된 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) AMT-74419의 서열번호 3으로 표시되는 유전자와 동일한 서열을 갖는다.

이외에 다른 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) 등의 유산균은 PCR 산물을 전혀 생성하지 않을뿐더러, 비특이적 용융 피크를 나타내므로, 명확하고 확연하게 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) AMT-74419만을 검출 및 구별할 수 있다.

또한, 본 발명의 또 다른 측면은 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)을 검출하는 방법을 제공한다. 본 발명은 시료에서 적어도 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) AMT-74419에 특이적인 1개의 핵산 서열의 존재를 검출하는 방법을 제공하며, 이는 시료에서 분리된 DNA를 주형으로 하고, 제1항에 따른 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) 검출용 프라이머 세트를 이용하여, 표적 서열을 증폭하는 단계를 포함하는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)을 검출하는 방법에 관한 것이다.

상기 프라이머 세트에 대한 모든 내용은 위에서 기술한 내용을 모두 적용 또는 준용할 수 있다.

본 발명에서 용어 '게놈 DNA'는 염색체 외에서 자체 복제 능력이 있는 원형의 DNA를 의미한다.

상기 시료로부터 게놈 DNA를 추출하는 단계는 통상적으로 사용되는 게놈 DNA 추출 방법이라면 바람직하며, 특별히 이에 제한되지 않는다. 구체적으로 DNA 추출 단계는 발명의 기술분야에서 통상적으로 사용되는 SDS 추출법(Tai et al. Plant Mol. Biol. Reporter, 8: 297-303, 1990), CTAB 분리법(Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide; Murray et al. Nuc. Res., 4321-4325, 1980) 또는 상업적으로 판매되는 DNA 추출 키트를 이용하여 분리될 수 있으며, 예를 들면, Fast DNA spin kit for soil(Mp Biomedicals)나 게놈(genomic) DNA 추출 키트(DNeasyㄾBlood & Tissue Kit(Qiagen (Hilden, Germany))를 이용할 수 있다.

상기 분리된 DNA를 주형으로 하고, 본 발명에 따른 프라이머 세트를 이용하여 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)의 서열번호 3으로 표시되는 유전자를 표적 서열로 하여 특이적으로 증폭한다.

상기 증폭 반응은 DNA 증폭 또는 RNA 증폭일 수 있다. DNA 증폭 방법은 열순환(termal cycling)을 필요로 하는 것 또는 등온(isothermal)에서 수행되는 것일 수 있이라면 특별히 이에 제한되지 않으며, 구체적으로 폴리머라아제 연쇄 반응(polymerase chain reaction: PCR), 핵산 서열-기초 증폭(nucleic acid sequence-based amplification: NASBA), 리가아제 연쇄 반응(ligase chain reaction: LCR), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplificaton: SDA) 및 롤링 서클증폭(rolling circle amplification: RCA)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다. 상기 RNA 증폭 방법은 역전사(reverse transcription: RT) 또는 역전사-PCR일 수 있으나, 상기 중합효소 연쇄 반응(PCR)이 특이적인 표적 DNA 서열을 증폭하는 것이 가장 일반적이고, 바람직하다.

또한 상기 PCR은 실시간(real-time) PCR, qRT-PCR 또는 RT-PCR일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 실시간 PCR 증폭 반응을 이용하는 경우 실시간으로 정량적인 분석이 가능하다. 일반적인 PCR 증폭 반응은 특정 DNA를 증폭한 후에 특정 DNA의 증폭 여부를 확인하는 단계를 추가로 수행하여야 하는 통상의 PCR 증폭 반응을 의미하며, 상기 특정 DNA의 증폭 여부를 확인하는 단계는 전기영동 등을 통하여 증폭된 DNA 산물의 크기를 확인하는 방법으로 수행할 수 있다. 구체적인 PCR 증폭 방법은 당업자에 의해 적절히 선택되어 수행될 수 있다.

본 발명에서 용어 '중합 효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction)' 또는 'PCR'이란, 일반적으로 원하는 표적 서열을 인 비트로(in vitro)에서 증폭하는 방법을 말하는 것으로, 이는 당업계에서 통상적으로 사용되는 과정이라면 특별히 이에 한정되지 않는다. 예를 들어 상기 PCR 과정은 2배 몰농도 이상 과량의, 상기 이중 가닥 표적 서열의 반대 가닥에 상보적인 올리고뉴클레오티드 프라이머를 원하는 표적 서열(들)을 포함하는 반응 혼합물에 넣는 단계로 이루어져 있다. 상기 반응혼합물은 DNA 중합효소의 존재 하에 온도 싸이클링(thermal cycling) 프로그램에 적용하여, 상기 DNA 프라이머 세트 사이의 원하는 표적 서열을 증폭하도록 한다. 한편 PCR 분석 방법으로써 최근 실질적으로 이용되고 있는 실시간(real-time) PCR법은 특이 프라이머와 표지물질이 연결된 프로브를 이용하여 PCR 증폭 시 프로브로부터 표지물질이 해리되어 형광 발색의 양을 측정하는 원리로, 정량적으로 도입 유전자의 양을 분석할 수 있는 장점이 있다.

본 발명의 PCR 반응 조건은 통상적인 조건이라면 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게 PCR 반응 조건 중에서 어닐링(annealing) 온도는 30 내지 65 ℃로 수행되는 것일 수 있고, 바람직하게는 어닐링 온도 35 내지 60 ℃로 수행되는 것일 수 있다. 예를 들어 초기 변성을 95 ℃에서 30 초간 1회 수행한 후, 변성(denaturation, 95 ℃에서 10초), 어닐링(annealing, 40 ℃에서 10초) 및 연장(extention, 72℃에서 40초)를 총 30 사이클 수행한 후, 최종 확장 반응을 72℃에서 5분 동안 실시하는 것일 수 있다.

또한, 상기 과정을 통해 얻은 PCR 산물을 얻을 수 있고, 상기 PCR 산물은 'PCR 절편(PCR fragment)' 또는 '역전사 효소-PCR 절편(reverse transcriptase-PCR fragment)' 또는 '앰플리콘(amplicon)'이라고도 하며, 특정한 표적 핵산의 증폭에 따라 생성되는 폴리뉴클레오티드 분자(또는 집합적으로 분자의 다수)를 의미한다. PCR 절편은 일반적으로, DNA PCR 절편을 의미하나, 이에 한정하는 것은 아니다. PCR 절편은 단일 가닥 또는 이중 가닥, 또는 임의의 농도비에 따른 그의 혼합물일 수 있다. PCR 절편 또는 역전사 효소-PCR 절편은 100-500개의 뉴클레오티드 또는 그 이상일 수 있다.

상기 증폭된 PCR 산물을 분석하여, 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) AMT-74419를 검출할 수 있다. 상기 증폭 단계로부터 얻어진 PCR 산물은 형광발색, 탁색도, 스핀다운에 의한 침전물, 전기영동 및 용융 곡선(melting curve) 분석으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 통해 분석할 수 있다.

예를 들어, 형광발색을 통해 분석하기 위해서는, 당업계에 공지된 형광 다이(dye)를 붙인 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 수행한 후, 형광분석장치를 통해 확인할 수 있다. 또한, 아가로스 겔 전기영동에 의해 확인하는 경우, 전기영동 후, 에티듐 브로마이드(ethidium bromide) 염색으로 전기영동 결과를 분석할 수 있다. 일반적인(conventional) PCR 수행 및 그 결과 분석 방법에 대해서는 당업계에 널리 알려진 방법이라면 특별히 이에 제한되지 않는다.

상기 분석을 위한 방법으로는 PCR 산물의 염기서열을 분석하거나, 증폭산물의 크기를 확인하여 120 내지 140 bp, 보다 바람직하게는 120 내지 130 bp, 바람직하게는 127 bp 수행되는 것일 수 있다.

본 발명에서는 증폭된 PCR 산물의 생성 유무를 분석하여 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) AMT-74419를 검출하거나, 판별할 수 있다. 나아가 본 발명에서는 증폭된 PCR 산물의 유전자 단편을 분석하여 정확하게 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) AMT-74419를 판별한다.

즉, 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) AMT-74419에 특이적으로 나타나는 PCR 산물에 대한 정보를 축적하고, 축적된 정보에 근거하여 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) AMT-74419와 동일한 속종의 균주들과의 유전자 정보를 비교함으로써, 특이적으로 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) AMT-74419를 높은 신뢰도로 정확하고 빠르게 검출, 판별 및 분석할 수 있다.

이때 상기 PCR 산물 중에서 120 내지 140 bp, 보다 바람직하게는 120 내지 130 bp, 가장 바람직하게는 127 bp인 것이 있을 경우, 시료 내에 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) AMT-74419 균주가 존재함을 분명하게 판별할 수 있다.

상기 PCR 산물의 용융 곡선 분석을 수행하여 용융 곡선 분석 결과에 따라 타겟 서열이 상기 시료 내에 존재하는지 여부를 결정할 수 있다. 이때 타겟 서열은 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) AMT-74419의 서열번호 3으로 표시되는 유전자일 수 있다. 상기 용융 곡선 분석에서 본 발명의 프라이머 세트와 타겟 서열이 혼성화되어 형성된 PCR 산물의 융점(Tm)dp 해당하는 용융 피크의 존재 유무를 확인함으로써, 시료에서 타겟 핵산 서열의 존재가 검출 또는 판별할 수 있다.

상기 PCR에 의한 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) AMT-74419 검출의 최소 DNA 양은 게놈 DNA(genomic DNA)에서 500 내지 5,000,000 fg(femtogram)(5 ng(nanogram))일 수 있고, 복제 DNA(cloned DNA)에서 5 내지 5,000,000 fg(5 ng)일 수 있으며, 세균 세포 현탁액(bacterial cell suspension)에서 균체 농도 OD₆₀₀이 0.1 × 10^-3 내지 0.1 × 100 unit일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

이하에서 실시예 등을 통해 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자하며, 다만 이하에 실시예 등에 의해 본 발명의 범위와 내용이 축소되거나 제한되어 해석될 수 없다. 또한, 이하의 실시예를 포함한 본 발명의 개시 내용에 기초한다면, 구체적으로 실험 결과가 제시되지 않은 본 발명을 통상의 기술자가 용이하게 실시할 수 있음은 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속하는 것도 당연하다.

<실시예>

<실험예 1> 락토바실러스 플란타룸( Lactobacillus plantarum ) AMT-74419의 유전체 분석.

락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) AMT-74419의 전장유전체 분석을 하여, 전체 유전자(Whole genome)와 다른 유산균의 전체 유전자를 비교분석하였다.

구체적으로, 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) AMT-74419는 수탁번호 KCCM 80229로, 이의 유전체 분석을 진행하였다. DNA 준비과정은 Qiagen Genomic DNA Extraction Kit(Hilden, Germany)을 이용하여, 제조사가 제공하는 방법을 통해 DNA를 추출하였다. 추출한 DNA는 천랩(대한민국, 서울)에 의뢰하여 퍼시픽 바이오사이언스(Pacific Biosciences) 회사에서 구입한 PacBio RS Ⅱ를 이용하여 유전자 서열 정보를 분석하였다.

어셈블리(Assembly) 단계는 RS hierarchical genome assembly process version 3.0을 사용하여 수행하였다. 평균 170.84 × depth를 갖는 높은 수준의 라이브러리(library) 하에서 유전자 서열 분석을 진행하였고, 그 결과는 도 1에 나타내었다.

도 1은 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) AMT-74419의 전체 유전체 지도를 나타낸 것으로, 이에 따르면 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) AMT-74419는 총 유전자 서열의 크기가 3,227,194 bp이고, 3010 개의 CDS(coding sequence)가 존재하는 것을 확인하였다. 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) AMT-74419는 플라스미드가 존재하지 않음을 확인하였다. 분석한 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) AMT-74419의 전장 유전체 서열은 NCBI에 CP052869.1로 등록하였다.

<실험예 2> 락토바실러스 플란타룸( Lactobacillus plantarum ) AMT-74419와 유사 균주 선별

다른 락토바실러스 속의 균주와 차별화되는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) AMT-74419의 특이적인 서열을 확인하고자 하였다. 이를 위해 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) AMT-74419과 상동성이 98~100%인 락토바실러스 플란타룸 18종을 선정하였고, 이들에 대한 비교유전체학(Comparative genomic)을 이용해 분석하였다. 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) AMT-74419 균주를 포함한 상기 18종의 락토바실러스 플란타룸 균주의 정보를 하기 표 1에 정리하였다.

Project accession	분류명	균주명	유래	게놈 크기 (bp)
43248_AMT4419.1	Lactobacillus plantarum	AMT74419	Kimchi	3227194
GCA_003076435.1	Lactobacillus plantarum subsp. plantarum	plantarum	weaned piglets	3164369
GCA_004141895.1	Lactobacillus plantarum subsp. plantarum	SRCM103303	food	3301393
GCA_002948215.1	Lactobacillus plantarum subsp. plantarum	KC28	Fermented Kimchi	3291849
GCA_004730965.1	Lactobacillus plantarum subsp. plantarum	UNQLp11	Pinot noir wine	3534932
GCA_003269405.1	Lactobacillus plantarum subsp. plantarum	SK151	Kimchi	3231249
GCA_000469115.1	Lactobacillus paraplantarum	AY01	fresh ewes milk	3315973
GCA_001273585.1	Lactobacillus plantarum subsp. argentoratensis	SNU.Lp177	Porcine feces(HostL pig)	3204772
GCA_000392485.2	Lactobacillus plantarum subsp. plantarum	P-8		3246630
GCA_00463075.21	CM001538_s	EGD-AQ4	non-alcoholic fermented bamboo shoot products	3414633
GCA_000023085.1	Lactobacillus plantarum subsp. plantarum	JDM1		3197759
GCA_001662895.1	Lactobacillus plantarum subsp. plantarum	SRCM101060	Pepper jangajji	3263056
GCA_000743895.1	Lactobacillus plantarum subsp. plantarum	DmCS_001	pure bacterial culture(Host: Drosophila melanogaster)	3194687
GCA_000143745.1	Lactobacillus plantarum subsp. plantarum	ATCC 14917(T)	pickled cabbage	3212261
GCA_000347515.1	Lactobacillus plantarum subsp. plantarum	UCMA_3037	unpasteurized Camembert cheese	3108278
GCA_001633545.1	Lactobacillus plantarum subsp. plantarum	Nizo2802	Cheese	3372514
GCA_000203855.3	Lactobacillus plantarum subsp. plantarum	WCFS1	Human saliva	3348624
GCA_001267905.1	Lactobacillus plantarum subsp. plantarum	L31-1		3216480
GCA_003053165.1	Lactobacillus plantarum subsp. plantarum	DS3_9	Commercial dietary supplements(Host: Homo sapiens)	3231607

표 1에 나타난 바와 같이, 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) AMT-74419와 상동성이 유사하거나 동일한 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) 균주 18종의 유전자 정보를 NCBI를 통해 확보하였다.

<실험예 3> 락토바실러스 플란타룸( Lactobacillus plantarum ) AMT-74419의 특이적 유전자 확보.

실시예 2로부터 확보한 18종 락토바실러스 플란타룸 균주와 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) AMT-74419의 전체 유전체 서열을 비교하여, 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) AMT-74419의 특이적 유전자 서열을 얻고자 하였다. 유전체서열비교(genome alignment)는 MAUVE algorithm software를 이용하여 수행하였다. 구체적으로 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) AMT-74419와 종래 락토바실러스 속 균주간의 유전자 유사성(similarity) 분석을 수행하였는데, 우선 OrthoANI algorithm을 통해서 상동성 분석을 진행하고, EzBioCloud에 존재하는 데이터베이스를 통해 범유전체학(Pan-genome)과 균주 특이(strain specific) CDSs 분석을 진행함으로써, 다른 락토바실러스 플란타룸 균주에는 존재하지 않는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) AMT-74419의 특이적인 유전자 서열을 확인하였으며, 이는 표 2에 나타내었다.

CDS name	Other name(s)	Product	EggNog ID	KEGG ID
AMT74419_00887	frdA	Fumarate reductase(quinol)	C:COG1053│C:COG0543│H:COG1477	K00244
AMT74419_00953		Hypothetical protein
AMT74419_01191	ENO, eno	Phosphopyruvate hydratase	G:COG0148	K01689
AMT74419_01606	lptB	ATP-binding protein ChvD	S:COG0488	K06861
AMT74419_01641	pps,ppsA	Pyruvate, water dikinase	G:COG0574	K01007
AMT74419_02066		Hypothetical protein	S:ENOG410Y0EM	K3071
AMT74419_02067		Hypothetical protein
AMT74419_02068		Hypothetical protein
AMT74419_02099		Hypothetical protein	S:ENOG4111UJ6
AMT74419_02117		Hypothetical protein
AMT74419_02120		Hypothetical protein
AMT74419_02570		Hypothetical protein	L:COG0389	K03502
AMT74419_02949		PTS system lactose-specific EIICB component	G:COG1455	K02761

표 2에 나타난 바와 같이, 다른 락토바실러스 플란타룸 균주에는 존재하지 않는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) AMT-74419의 특이적인 유전자 총 13개가 존재하고 있음을 확인하였다.

<실험예 4> 락토바실러스 플란타룸( Lactobacillus plantarum ) AMT-74419의 특이적 유전자 서열 분석.

실험예 3을 통해 확인된, 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) AMT-74419의 특이적인 13종의 유전자에 대해 상세히 분석하고자 하였다.

상기 13종의 유전자에 대하여 NCBI의 primer-BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)를 사용하여 락토바실러스 플란타룸 뿐만 아니라 다른 유산균 서열에도 존재하지 않는 서열이 있음을 확인하였고, 이를 서열번호 3으로 표시하였다.

상기 서열번호 3로 표시되는 염기서열은 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) AMT-74419에서 ATP-dependent RecD-like DNA helicase 단백질을 암호화하는 유전자인 것으로 확인되었다.

<실험예 5> 프라이머 세트 제작

실험예 4의 결과에 기초하여 하기 표 3과 같이 1개의 프라이머 세트를 설계하였다. 서열번호 1로 표시되는 정방향 프라이머 및 서열번호 2로 표시되는 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트는 각각 서열번호 3으로 표시되는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) AMT-74419의 유전자를 증폭시킬 수 있다.

서열번호	명칭		프라이머 서열(5'->3')	PCR 산물 크기 (bp)
1	74419_Con_F	Forward	TCCAATAATCAAGCTTTAATAATG	127
2	74419_Con_R	Reverse	CTCCAACTATTCTTTATTAATAGGAATT	127

<실험예 6> 프라이머 세트를 활용한 PCR 분석.

실험예 5로부터 제조된 본 발명의 프라이머 세트가 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) AMT-74419 균주를 특이적으로 검출할 수 있는지 확인함과 동시에 PCR 조건을 최적화하고자 하였다.

우선, 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) AMT-74419 균주를 MRS 배지(Difco, 288110)fh 37 ℃, 24 시간동안 배양하였다. 이후 상기 배양액을 회수한 후, 원심분리(13,000 x g, 10 min)하여 균체를 분리하고, QIAamp DNA Mini Kit(QIAGEN, USA)를 이용하여 제조사가 제공하는 프로토콜에 따라 DNA를 추출하였다.

추출한 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) AMT-74419의 DNA 10 ng에 대하여 PCR을 실시하였다. PCR 반응시 총 반응액은 20 ㎕이였고, BioFACT™ Pfu DNA Polymerase(BIOFACT, Korea)를 사용하였고, 나머지 용액은 상기 제조사에서 제공하는 프로토콜에 따라 제조하였다.

PCR 증폭 반응은 T100™ Thermal Cycler(BIO-RAD, USA)를 사용하여 실시하였으며, 구체적인 PCR 증폭 반응 조건은 95 ℃에서 30초간 처리하여 변성한 후, 95 ℃ 10초(변성), 65 ℃ 10초(어닐링), 72 ℃ 30초(증폭)를 한 사이클로 하여, 30회 반복하였다.

PCR 조건을 최적화하기 위하여, 상기 65 ℃의 어닐링(Annealing) 단계 온도를 60 ℃, 56 ℃, 52 ℃, 48 ℃, 44 ℃, 40 ℃, 36 ℃, 32 ℃로 다양하게 하여 PCR을 수행하였다. 상기 과정으로 증폭된 증폭산물(PCR 산물)을 2% 아가로스(Agarose)(E&S, Korea) 조건에서 MINIE-135(Miulab, China)를 이용하여 전기영동하여 분석하였다.

도 2는 서열번호 1 및 2로 구성된 프라이머 세트를 활용한 PCR 분석한 결과이다. 구체적으로 서열번호 1 및 2로 구성된 프라이머 세트를, 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) AMT-74419에 처리한 후, 다양한 어닐링 조건으로 PCR을 수행한 결과를 나타낸 것이다. 도 2에 표기된 1~8의 숫자는 어닐링 온도를 표기한 것으로, 1부터 순서대로 60 ℃, 56 ℃, 52 ℃, 48 ℃, 44 ℃, 40 ℃, 36 ℃, 32 ℃의 어닐링 온도조건으로 수행한 것임을 의미한다.

도 2에 나타난 바와 같이, 서열번호 1 및 2로 구성된 프라이머 세트를 활용한 PCR 분석결과, 대부분 PCR 산물이 확인되었다. PCR 산물을 선명하게 얻기 위해서는 어닐링 온도가 30 내지 50 ℃일 때가 바람직하며, PCR 결과를 가장 선명하게 얻을 수 있는 어닐링 온도는 40 ℃임을 확인하였다.

<실험예 7> 프라이머 세트의 정확도 평가-1.

서열번호 1 및 2로 구성된 프라이머 세트의 정확도와 특이성을 확인하기 위해서, 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) AMT-74419와 16S rRNA 서열이 유사한 락토바실러스 플란타룸 균주 8종을 준비한 후, 이에 대한 PCR 분석을 수행하였다.

우선, 하기 표 4에 나열된 8종의 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) 균주를 각각 MRS 배지(Difco, 288110)fh 37 ℃, 24 시간동안 배양하였다. 이후 상기 배양액을 각각 회수한 후, 원심분리(13,000 x g, 10 min)하여 균체를 분리하고, QIAamp DNA Mini Kit(QIAGEN, USA)를 이용하였고, 추출 조건은 2 g/L Lysozyme buffer을 이용하여 Gram 양성균인 락토바실러스 플란타룸의 표면을 녹이는 전처리를 수행한 후, 제조사가 제공하는 프로토콜에 따라 각각의 DNA를 추출하였다.

추출한 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) 균주의 DNA 10 ng에 대하여 PCR을 실시하였다. PCR 반응시 총 반응액은 20 ㎕이였고, BioFACT™ Pfu DNA Polymerase(BIOFACT, Korea)를 사용하였고, 나머지 용액은 상기 제조사에서 제공하는 프로토콜에 따라 제조하였다.

PCR 증폭 반응은 T100™ Thermal Cycler(BIO-RAD, USA)를 사용하여 실시하였으며, 구체적인 PCR 증폭 반응 조건은 95 ℃에서 30초간 처리하여 변성한 후, 95 ℃ 10초(변성), 40 ℃ 10초(어닐링), 72 ℃ 30초(증폭)를 한 사이클로 하여, 30회 반복하였다.

상기 과정으로 증폭된 증폭산물(PCR 산물)을 2% 아가로스(Agarose)(E&S, Korea) 조건에서 MINIE-135(Miulab, China)를 이용하여 전기영동하여 분석하였다.

lane 번호	균주	Registor NO
1	Lactobacillus plantarum	KCCM No. 80229
2	Lactobacillus plantarum	KCCM No. 17115
3	Lactobacillus plantarum	KCCM No. 17114
4	Lactobacillus plantarum	KCCM No. 17110
5	Lactobacillus plantarum	KCCM No. 13445
6	Lactobacillus plantarum	KCCM No. 15357
7	Lactobacillus plantarum	KCCM No. 10552
8	Lactobacillus plantarum	KCCM No. 11451

도 3은 서열번호 1 및 2로 구성된 프라이머 세트를 활용하여, 종래 8종의 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) 균주를 PCR 분석한 결과이다. 구체적으로 서열번호 1 및 2로 구성된 프라이머 세트를, 종래 8종의 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)에 처리한 후, PCR을 수행한 결과를 나타낸 것이다. 도 3에 표기된 L은 DNA size ladder를 나타내며 각 bp의 크기를 나타낸다. 도 3의 lane 번호 1부터 8은 각각 8종의 락토바실러스 플란타룸 균주를 나타내며, 순서대로 AMT-74419, KACC 17115, KACC 17114, KACC 17110, KACC 13445, KACC 15357, KACC 10552, KACC 11451에 대한 PCR 결과 이다.

도 3에 나타난 바와 같이, 본 발명의 프라이머 세트를 사용하여 PCR 분석을 수행한 결과, 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) AMT-74419에서만 PCR 산물(127 bp)을 확인할 수 있었다.

PCR 수행 결과, 본 발명의 프라이머 세트를 이용하는 경우, 락토바실러스 플란타룸 AMT-74419에서만 PCR 산물(127 bp 크기)을 확인할 수 있다. 나머지 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) 균주 8종 모두에서는 PCR 산물이 관찰되지 않았다. 이를 통해 본 발명의 프라이머 세트는 유산균 중에서 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) AMT-74419만을 특이적이고, 정확하게 검출한다는 것을 알 수 있다.

<실험예 8> 프라이머 세트의 정확도 평가-2.

서열번호 1 및 2로 구성된 프라이머 세트의 정확도와 특이성을 확인하기 위해서, 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) AMT-74419와 동속의 락토바실러스 균주 8종을 준비한 후, 이에 대한 PCR 분석을 수행하였다.

우선, 하기 표 5에 나열된 8종의 락토바실러스 속(Lactobacillus) 균주를 각각 MRS 배지(Difco, 288110)로 37 ℃, 24 시간동안 배양하였다. 이후 상기 배양액을 각각 회수한 후, 원심분리(13,000 x g, 10 min)하여 균체를 분리하고, QIAamp DNA Mini Kit(QIAGEN, USA)를 이용하였고, 추출 조건은 2 g/L Lysozyme buffer을 이용하여 Gram 양성균인 락토바실러스 플란타룸의 표면을 녹이는 전처리를 수행한 후, 제조사가 제공하는 프로토콜에 따라 각각의 DNA를 추출하였다.

추출한 락토바실러스 속(Lactobacillus) 균주의 DNA 10 ng에 대하여 PCR을 실시하였다. PCR 반응시 총 반응액은 20 ㎕이였고, BioFACT™ Pfu DNA Polymerase(BIOFACT, Korea)를 사용하였고, 나머지 용액은 상기 제조사에서 제공하는 프로토콜에 따라 제조하였다.

lane 번호	균주	Registor NO
1	Lactobacillus plantarum	KCCM No. 80229
2	Lactobacillus sakei	K040706
3	Lactobacillus rhamnosus	KCTC5033
4	Lactobacillus graminis	KCTC3542
5	Lactobacillus cuvatus	KCTC3767
6	Lactobacillus reuteri	KCTC3594
7	Lactobacillus buchneri	KCTC5064
8	Lactobacillus parabuchneri	KCTC3503

도 4는 서열번호 1 및 2로 구성된 프라이머 세트를 활용하여, 종래 8종의 락토바실러스 속(Lactobacillus) 균주를 PCR 분석한 결과이다. 구체적으로 서열번호 1 및 2로 구성된 프라이머 세트를, 종래 8종의 락토바실러스 속(Lactobacillus) 균주에 처리한 후, PCR을 수행한 결과를 나타낸 것이다. 도 4에 표기된 L은 DNA size ladder를 나타내며 각 bp의 크기를 나타낸다. 도 4의 lane 번호 1부터 8은 각각 8종의 락토바실러스 속(Lactobacillus) 균주를 나타내며, 순서대로 AMT-74419, K040706, KCTC 5033, KCTC 3542, KCTC 3767, KCTC 3594, KCTC 5064, KCTC 3503에 대한 PCR 결과이다

도 4에 나타난 바와 같이, 본 발명의 프라이머 세트를 사용하여 PCR 분석을 수행한 결과, 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) AMT-74419에서만 PCR 산물(127 bp)을 확인할 수 있었다. 나머지 락토바실러스 속(Lactobacillus) 균주 8종 모두에서는 PCR 산물이 관찰되지 않았다. 이를 통해 본 발명의 프라이머 세트는 유산균 중에서 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) AMT-74419만을 특이적이고, 정확하게 검출한다는 것을 알 수 있다.

<실험예 9> 프라이머 세트를 활용한 실시간(Real-time) PCR 분석

서열번호 1 및 2로 구성된 프라이머 세트가 실시간 PCR 분석에서도 우수한 정확도와 특이성을 갖는 확인하고자 하였다. 실험예 6과 동일하게 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) AMT-74419 배양액으로부터 DNA를 추출하고, 여기에 다음과 같이 실시간(Real-time) PCR 분석을 수행하였다.

추출한 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) AMT-74419 DNA 양을 50 ng 농도에서부터 500 fg까지 다양하게 하여 실시간 PCR 증폭 반응(Real-time PCR)을 각각 실시하였다. PCR 혼합액은 제조사가 제공하는 조성대로 제작하여 진행했으며 총 20 μL 의 양으로 진행하였다.

실시간 PCR 증폭 반응(Real-time PCR)은 Applied Biosystems™ 7500 시스템(Applied Biosystemas, USA)를 사용하여 실시하였으며, 각 반응은 ne Step PrimeScript™ RT-PCR KitII(TAKARA Bio, Japna) 통해서 수행하였다. 구체적인 반응 조건은 95 ℃에서 30초간 변성하고, 95 ℃ 30초, 40 ℃ 30초, 72 ℃ 30초로 40회 반복하였다. 어닐링 단계에서 형광 시그널을 수집하였으며, 데이터 분석은 Bio-Rad CFX Manager 1.6을 이용하였다. Cycle threshold(Ct)는 알려진 숫자의 DNA 농도의 대수증폭기로 시작하여 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) AMT-74419에 대한 표준곡선을 작성하였다.

도 5는 Real-time PCR Ct 그래프 결과로, 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) AMT-74419에 대한 실시간 PCR 증폭 반응(Real-time PCR)에서의 표준곡선을 나타낸 결과이다.

도 5에 나타난 바와 같이, 표준곡선(standard curve)의 R²(Regression coefficient) 값이 0.983으로 나타났고, 이는 적정범위에 존재하여 유효한 데이터인 것으로 판명되었다. 즉, 시료로부터 Real-time PCR기기로 판독하여 Ct 벨류를 확인하여 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) AMT-74419의 동정이 가능함을 알 수 있다.

<실험예 10> 프라이머 세트를 활용한 실시간(Real-time) PCR 분석의 정확도 및 특이도 평가.

서열번호 1 및 2로 구성된 프라이머 세트가 실시간 PCR 분석에서의 민감도를 확인하고자 하였다. 실험예 6 및 실험예 9와 동일하게 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) AMT-74419 및 다른 락토바실러스 균주를 배양액으로부터 DNA를 추출하고, 여기에 다음과 같이 실시간(Real-time) PCR 분석을 수행하였다.

추출한 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) AMT-74419 DNA 양을 20 ng으로 하여 실시간 PCR 증폭 반응(Real-time PCR)을 각각 실시하였다. PCR 혼합액은 제조사가 제공하는 조성대로 제작하여 진행했으며 총 20 μL 의 양으로 진행하였다.

실시간 PCR 증폭 반응(Real-time PCR)은 Applied Biosystems™ 7500 시스템(Applied Biosystemas, USA)을 사용하여 실시하였으며, 각 반응은 ne Step PrimeScript™ RT-PCR KitII(TAKARA Bio, Japna) 통해서 수행하였다. 구체적인 반응 조건은 95 ℃에서 30초간 변성하고, 95 ℃ 30초, 40 ℃ 30초, 72 ℃ 30초로 40회 반복하였다. 상기 과정으로 증폭된 증폭산물(PCR 산물)의 용융 피크(Melting peak)를 측정하였다. 용융 피크를 측정을 위해, 하기 절차에 따라 수행하였다. 어닐링 단계에서 온도를 40 ℃부터 95 ℃까지 5 초마다 0.5 ℃씩 증가시켰다.

도 6은 본 발명의 프라이머 세트를 활용하여 측정된, 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) AMT-74419에 대한 용융피크(Melting peak)를 도시한 것이다.

도 7은 본 발명의 프라이머 세트를 활용하여 측정된, 락토바실러스 균주에 대한 용융피크(Melting peak)를 도시한 것이다. 도 7(a)는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) KACC17115 균주에 대한 용융피크이고, 도 7(b)는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) KACC 11451 균주에 대한 용융피크이며, 도 7(c)는 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) KCTC 5033 균주에 대한 용융피크이며, 도 7(d)는 락토바실러스 그라미니스(Lactobacillus graminis) KCTC 3542 균주에 대한 용융피크이다.

도 6 및 7에 나타난 바와 같이, 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) AMT-74419의 표적 피크가 약 74.29 ℃에서 검출될 수 있다는 것을 확인할 수 있다. 또한, 락토바실러스 플란타룸 AMT-74419 균주에 대해서만 특이적으로 용융 피크가 측정되는 것을 확인하였고 다른 유산균에 대해서는 비특이적인 용융 피크가 나타남을 확인할 수 있다. 이로 인해 본원 발명의 프라이머 세트가 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) AMT-74419에 대해 우수한 특이성과, 정확도를 갖는다는 것을 알 수 있다.

<110> KOREA FOOD RESEARCH INSTITUTE <120> A Primer composition for specifically detecting Lactobacillus plantarum and uses thereof <130> HPC9343 <160> 3 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 74419_Con_F <400> 1 tccaataatc aagctttaat aatg 24 <210> 2 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 74419_Con_R <400> 2 aattcctatt aataaagaat agttggag 28 <210> 3 <211> 127 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Lactobacillus plantarum AMT-744419 2136060..2136186 <400> 3 tccaataatc aagctttaat aatgcaaaaa tccttattat taaacactaa agtgttagta 60 aatggggtat aacaatctta ttcttcgttg tcaaattttc tccaactatt ctttattaat 120 aggaatt 127

Claims

서열번호 1로 표시되는 정방향 프라이머 및 서열번호 2로 표시되는 역방향 프라이머로 구성된 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) AMT-74419[KCCM 80229] 검출용 프라이머 세트.
제1항에 있어서,
상기 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)은 서열번호 3으로 표시되는 염기서열로 이루어진 유전자를 갖는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) AMT-74419[KCCM 80229]인 것을 특징으로 하는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) AMT-74419[KCCM 80229] 검출용 프라이머 세트.
서열번호 1로 표시되는 정방향 프라이머 및 서열번호 2로 표시되는 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트를 포함하는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) AMT-74419[KCCM 80229] 검출용 조성물.
제3항에 있어서,
상기 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)은 서열번호 3으로 표시되는 염기서열로 이루어진 유전자를 갖는 락토바실러스 플란타룸 (Lactobacillus plantarum) AMT-74419[KCCM 80229]인 것을 특징으로 하는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) AMT-74419[KCCM 80229] 검출용 조성물.
제3항에 있어서,
상기 정방향 프라이머는 5'-말단에 연결된, 형광단, 발색단, 화학발광단, 자기입자 및 방사능동위원소로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 표지를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) AMT-74419[KCCM 80229] 검출용 조성물.
제1항 내지 제2항 중 어느 한 항에 따른 프라이머 세트를 포함하는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) AMT-74419[KCCM 80229] 검출용 키트.
제6항에 있어서,
상기 키트는 완충용액, 핵산 중합효소, dNTP 및 증류수를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) AMT-74419[KCCM 80229] 검출용 키트.
시료에서 분리된 DNA를 주형으로 하고, 제1항에 따른 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) AMT-74419[KCCM 80229] 검출용 프라이머 세트를 이용하여, 표적 서열을 증폭하는 단계를 포함하는, 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) AMT-74419[KCCM 80229]을 검출하는 방법.
제8항에 있어서,
상기 표적 서열은 서열번호 3으로 표시되는 염기서열인 것을 특징으로 하는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) AMT-74419[KCCM 80229]을 검출하는 방법.
제8항에 있어서,
상기 증폭 단계로부터 얻어진 PCR 산물은 형광발색, 탁색도, 스핀다운에 의한 침전물, 전기영동 및 용융 곡선(melting curve) 분석으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 통해 분석하는 것을 특징으로 하는 락토바실러스 플란타룸 (Lactobacillus plantarum) AMT-74419[KCCM 80229]을 검출하는 방법.
제8항에 있어서,
상기 증폭 단계로부터 얻어진 PCR 산물이 120 내지 140 bp이면, 시료 내 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) AMT-74419[KCCM 80229]가 함유된 것으로 판단하는 것을 특징으로 하는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) AMT-74419[KCCM 80229]을 검출하는 방법.
제8항에 있어서,
상기 증폭 단계로부터 얻어진 PCR 산물의 용융 곡선에서 74 내지 75 ℃의 용해 피크가 관찰되면, 시료 내 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) AMT-74419[KCCM 80229]가 함유된 것으로 판단하는 것을 특징으로 하는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) AMT-74419[KCCM 80229]을 검출하는 방법.