JP5684563B2 - カルバペネマーゼ遺伝子の同定のための組成物および方法 - Google Patents
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Description
本発明は、抗生物質耐性を付与する肺炎桿菌属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）のカルバペネマーゼ遺伝子の迅速な同定のための組成物および方法に関する。
腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）は、細菌の大きい科であり、より一般的な病原体（例えば、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）および大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ））の多くを含む。腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）に属する属のメンバーは、最も病原性が高く臨床微生物学において最も頻繁に遭遇する生物としての評判を得ている。これらの大きいグラム陰性桿菌は通常、腸内感染症と関連しているが、ほとんど全ての天然生息地に見出すことができる。この科の多くのメンバーは、ヒトおよび他の動物の腸において見出される腸管内菌叢の正常な一部分であるが、その他のメンバーは、水または土壌中に見出されるか、あるいは多様な種々の動物および植物に対する寄生生物である。大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）（Ｅ．ｃｏｌｉとしての方がよく知られている）は、最も重要なモデル生物の１つであり、その遺伝学および生化学は綿密に研究されている。
肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）は、口、皮膚および腸の正常な細菌叢中に見出される、グラム陰性、非運動性、莢膜保有、乳酸発酵性、通性嫌気性の細菌である。これは、腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）の肺炎桿菌属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）の臨床的に最も重要なメンバーである。肺炎桿菌（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）は細菌性肺炎を引き起こすことができるが、特に免疫無防備状態の個体において、尿路および創傷の院内感染に、より一般的に関与する。肺炎桿菌属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）は、高齢者における尿路感染症について、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に次いで２位にある。これは、慢性肺疾患、腸内病原性、鼻粘膜萎縮症および鼻硬化症を有する患者にとっての日和見病原体でもある。糞便が、患者の感染症の最も顕著な感染源であり、次いで汚染器具との接触が続く。抗生物質耐性の株が出現し続けるため、肺炎桿菌（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）はますます院内感染を生じる。
肺炎桿菌属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）は、アンピシリンに対する固有の耐性を供与する染色体性クラスＡ β−ラクタマーゼを保有する。多くの株が、カルベニシリン、アンピシリン、キノロン系抗菌薬、および次第にセフタジジムに対するさらなる耐性と共に、基質特異性拡張型β−ラクタマーゼ（ＥＳＢＬ）を獲得している。カルバペネム系抗生物質は、特に、難しい院内感染病原体によって引き起こされた場合の、グラム陰性感染症の管理のために重要な薬剤であった。
カルバペネム系薬剤は、任意のβ−ラクタム抗生物質の最も広い活性スペクトルを有し、しばしば、多剤耐性グラム陰性細菌によって引き起こされる感染症の治療において使用するための最も適切な薬剤である。カルバペネム系薬剤は、基質特異性拡張型β−ラクタマーゼ（ＥＳＢＬ）を保有する腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）に起因する感染症の治療のために最適な薬剤であるとみなされている。ＥＳＢＬ産生肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の有病率は、米国において上昇してきており、ある地域では単離体の５０％に迫っている。このような高率のＥＳＢＬ産生生物に遭遇したとき、カルバペネム系薬剤は、ますます重要な治療の選択肢となる。過去数年間にわたり、カルバペネム耐性グラム陰性細菌の増加の進行が、いくつかの地域で観察されている。米国において、カルバペネム耐性は、クラスＣセファロスポリナーゼの発現と、アシネトバクター・バウマンニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）および稀ではあるが肺炎桿菌（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の単離体における外膜ポーリンの欠失とに主に起因している。カルバペネム加水分解β−ラクタマーゼ（カルバペネマーゼ）は、肺炎桿菌（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ではほとんど回収されていない。しかし、カルバペネマーゼＫＰＣ−１、ＫＰＣ−２およびＫＰＣ−３を保有する単離体が、米国の北東部において最近同定された。これらの単離体はしばしば、複数の抗生物質クラスに対して耐性であり、臨床医に対して提示される治療選択肢は非常に限定されている。
感染症の大流行を引き起こす高度に耐性の生物の出現は、微生物学および感染症の学会が数年にわたって取り組んできた重要な問題である。現在、カルバペネム耐性肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の出現を、高度に耐性の生物の増大するリストに追加することができる。２００５年にニューヨーク市の複数の病院で発生したカルバペネム耐性肺炎桿菌（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）感染症の大流行は、これらの生物に対する広範な注目を集めた。
ＫＰＣ酵素は、広域スペクトル型セファロスポリンに対する耐性ならびにカルバペネム系薬剤に対する耐性を媒介するβ−ラクタマーゼである。これらのカルバペネマーゼは、ノースカロライナ州で２００１年に最初に報告されたが、今や米国の様々な部分において、最も頻繁には東海岸において単離されている。カルバペネマーゼを産生する単離体の検出は、治療のより良い管理および感染症制御にとって重要である。
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抗生物質耐性を供与するカルバペネマーゼ遺伝子の迅速かつ高感度の検出のための組成物および方法が提供される。これらの組成物は、サンプル中のこの遺伝子の存在を検出する際に使用するためのオリゴヌクレオチドの新規プライマーおよびプローブセットを含む。これらのプライマーおよびプローブセットは、増幅方法（例えばＰＣＲ、特に定量ＰＣＲ）において使用でき、試験サンプル、特に患者サンプル中のカルバペネマーゼ遺伝子の存在を検出することを目的とした増幅方法において使用するためのキットへと包装でき、それによるこの遺伝子の検出は、そのサンプルがカルバペネム系薬剤に対して耐性の細菌を含むことを示す。
したがって、一実施形態において、本発明は、配列番号１、２、４、５、７、８、１４、１５、１７、１８および２０に示される新規オリゴヌクレオチドプライマー、ならびに配列番号３、６、９、１６および１９に示される新規オリゴヌクレオチドプローブ配列を提供する。これらの配列は、サンプル中のカルバペネマーゼ遺伝子を検出する方法において使用でき、その存在は、そのサンプルが、カルバペネム耐性を有する細菌を含むことを示す。
さらに、サンプル中のカルバペネマーゼ遺伝子の検出に有用なキットが提供され、このキットは、本発明による組成物を含む。このキットは、提供された組成物を、ポリメラーゼベースの増幅反応（例えば、ＰＣＲまたはＱＰＣＲ）において使用するための指示書をさらに含むことができる。
別の実施形態において、本発明は、細菌中に存在する標的核酸領域のポリメラーゼベースの増幅を使用して、サンプル中のカルバペネマーゼを検出する方法に関し、この方法は、（ａ）カルバペネム耐性を有する腸内細菌を含むことが疑われる試験サンプルを提供するステップと、（ｂ）カルバペネマーゼをコードするヌクレオチド配列の標的核酸領域を含むポリメラーゼベースの核酸増幅産物を提供するのに充分な条件下で、サンプルを本発明の組成物と接触させるステップと、（ｃ）試験サンプル中のカルバペネマーゼの存在の指標として核酸増幅産物の存在を検出するステップとを含む。種々の実施形態において、試験サンプルは直接的サンプルであり、本発明の方法および組成物は、その細菌に感染した対象から収集したサンプル中に典型的に見出される細菌負荷の範囲内の細菌濃度で、直接的サンプル中のカルバペネマーゼの存在を検出することが可能である。
本発明はまた、本発明によるプライマーの使用に関するものであり、このプライマーまたはプローブは、配列番号１〜９および１４〜２０および１４〜２０に規定される配列のいずれかに従う配列を有する。
Ｉ．概観
カルバペネマーゼを産生する細菌を有する疑いがあるサンプル中のカルバペネマーゼの存在を検出するための新規方法および組成物が、本明細書中に提供される。カルバペネマーゼ産生についての単離体のスクリーニングは、慣用の感受性試験方法を使用した場合、しばしば低レベルの酵素発現または他の耐性機構（例えば、不透過性または標的改変）からの劣った識別に起因して、困難である。カルバペネマーゼの検出／同定のためのいくつかの表現型による方法が文献中に記載されているが、これらは典型的には規格化されておらず、いくつかは、必要な専門的知識のレベルおよび／または特殊装置に起因して、慣用の臨床的実験室試験にはなじまない。科学委員会（例えばＣＬＳＩ）は最近、カルバペネマーゼ検出のための方法に関して提言を行っていない。したがって、カルバペネマーゼを含む細菌についてスクリーニングするための迅速で信頼性のある試験が必要とされている。
カルバペネマーゼを産生する細菌を有する疑いがあるサンプル中のカルバペネマーゼの存在を検出するための新規方法および組成物が、本明細書中に提供される。カルバペネマーゼ産生についての単離体のスクリーニングは、慣用の感受性試験方法を使用した場合、しばしば低レベルの酵素発現または他の耐性機構（例えば、不透過性または標的改変）からの劣った識別に起因して、困難である。カルバペネマーゼの検出／同定のためのいくつかの表現型による方法が文献中に記載されているが、これらは典型的には規格化されておらず、いくつかは、必要な専門的知識のレベルおよび／または特殊装置に起因して、慣用の臨床的実験室試験にはなじまない。科学委員会（例えばＣＬＳＩ）は最近、カルバペネマーゼ検出のための方法に関して提言を行っていない。したがって、カルバペネマーゼを含む細菌についてスクリーニングするための迅速で信頼性のある試験が必要とされている。
本発明の方法および組成物は、プラスミドが保持するβ−ラクタマーゼ遺伝子、より具体的にはカルバペネマーゼ抗生物質耐性遺伝子の検出および／または定量に関し、この抗生物質耐性遺伝子の迅速な同定を可能にする。試験サンプルにおけるこの遺伝子の検出は、そのサンプルがカルバペネマーゼを産生する細菌を含むことを示す。この方法は、ポリメラーゼベースの増幅方法、特にポリメラーゼ連鎖反応の使用を含む。本明細書中で使用する場合、「ポリメラーゼ連鎖反応」即ち「ＰＣＲ」とは、特異的ポリヌクレオチド鋳型配列（即ち「標的核酸」）を増幅するためのｉｎ ｖｉｔｒｏの方法をいう。
カルバペネマーゼは、腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）において重要な新たな耐性機構を示す。したがって、本発明の方法は、腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）のメンバー（緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、アシネトバクター・バウマンニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ）、肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、クレブシエラ・オキシトカ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａ）、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）菌種、サルモネラ・エンテリカ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などが含まれるがこれらに限定されない）におけるカルバペネム耐性を検出するために有用である。カルバペネマーゼは、カルバペネムクラスの抗生物質（イミペネム、メロペネムおよびエルタペネムが含まれる）に対する耐性を供与する。
本発明の組成物および方法は、カルバペネマーゼまたはカルバペネム加水分解β−ラクタマーゼをコードする遺伝子、およびしたがってサンプル中のカルバペネマーゼの存在の検出のための迅速かつ有効な試験を提供する。カルバペネマーゼは、陽性の基質特異性拡張型β−ラクタマーゼ（ＥＳＢＬ）確認試験（セフトリアキソン、セフタジジム、セフェピムおよびアズトレオナムの、クラブラン酸塩で強化された活性）と関連しているので、カルバペネマーゼの検出は、臨床的実験室にとっての問題点を提示してきた。したがって、イミペネムまたはメロペネムに対して感受性の単離体におけるカルバペネム感受性の低下の重要性を認識し損なうことは、単離体がＥＳＢＬ産生体として誤って同定される結果を生じる場合がある。
ＩＩ．組成物
ヌクレオチド配列
肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）のいくつかの単離体由来のカルバペネマーゼに関するヌクレオチド配列は、配列番号１０〜１３に提供される。本発明のプライマーおよびプローブの配列もまた、配列番号１〜９および１４〜２０として提供される。プライマーおよびプローブセットには以下が含まれる：配列番号１に示される順方向プライマー、配列番号２に示される逆方向プライマー、および配列番号３に示される核酸プローブ；配列番号４に示される順方向プライマー、配列番号５に示される逆方向プライマー、および配列番号６に示される核酸プローブ；配列番号７に示される順方向プライマー、配列番号８に示される逆方向プライマー、および配列番号９に示される核酸プローブ；配列番号１４に示される順方向プライマー、配列番号２に示される逆方向プライマー、および配列番号３に示される核酸プローブ；配列番号４に示される順方向プライマー、配列番号１５に示される逆方向プライマー、および配列番号１６に示される核酸プローブ；配列番号２０に示される順方向プライマー、配列番号８に示される逆方向プライマー、および配列番号９に示される核酸プローブ；ならびに配列番号１７に示される順方向プライマー、配列番号１８に示される逆方向プライマー、および配列番号１９に示される核酸プローブ。これらのプライマーおよびプローブセットは、カルバペネマーゼ抗生物質耐性遺伝子の迅速な同定のために、ポリメラーゼベースの増幅方法、例えばリアルタイムＰＣＲ法において使用できる。プライマーおよびプローブセットは、肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）カルバペネマーゼ（ＫＰＣ）遺伝子の公知の単離体全てを認識でき、かつ他の腸内細菌においてカルバペネマーゼ遺伝子を検出できる点で、汎用的である。特定のプライマーおよびプローブの配列が同定されているが、これらの配列はヌクレオチドの付加または置換によって変動してもよいことが認識される。
ヌクレオチド配列
肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）のいくつかの単離体由来のカルバペネマーゼに関するヌクレオチド配列は、配列番号１０〜１３に提供される。本発明のプライマーおよびプローブの配列もまた、配列番号１〜９および１４〜２０として提供される。プライマーおよびプローブセットには以下が含まれる：配列番号１に示される順方向プライマー、配列番号２に示される逆方向プライマー、および配列番号３に示される核酸プローブ；配列番号４に示される順方向プライマー、配列番号５に示される逆方向プライマー、および配列番号６に示される核酸プローブ；配列番号７に示される順方向プライマー、配列番号８に示される逆方向プライマー、および配列番号９に示される核酸プローブ；配列番号１４に示される順方向プライマー、配列番号２に示される逆方向プライマー、および配列番号３に示される核酸プローブ；配列番号４に示される順方向プライマー、配列番号１５に示される逆方向プライマー、および配列番号１６に示される核酸プローブ；配列番号２０に示される順方向プライマー、配列番号８に示される逆方向プライマー、および配列番号９に示される核酸プローブ；ならびに配列番号１７に示される順方向プライマー、配列番号１８に示される逆方向プライマー、および配列番号１９に示される核酸プローブ。これらのプライマーおよびプローブセットは、カルバペネマーゼ抗生物質耐性遺伝子の迅速な同定のために、ポリメラーゼベースの増幅方法、例えばリアルタイムＰＣＲ法において使用できる。プライマーおよびプローブセットは、肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）カルバペネマーゼ（ＫＰＣ）遺伝子の公知の単離体全てを認識でき、かつ他の腸内細菌においてカルバペネマーゼ遺伝子を検出できる点で、汎用的である。特定のプライマーおよびプローブの配列が同定されているが、これらの配列はヌクレオチドの付加または置換によって変動してもよいことが認識される。
サンプル供給源
本発明の方法を実施する際に使用できる代表的な生物学的サンプルには、鼻スワブ、喉スワブ、糞便、皮膚スワブ、血液（血液培養物を含む）、痰、気管支肺胞上皮洗浄液、気管支吸引物、肺組織および尿が含まれる。生物学的サンプルの収集および保存の方法は、当業者に公知である。生物学的サンプルは、細菌をプレートして増殖させることによって、処理できる。好ましい実施形態において、サンプルは直接的サンプルであり、直接的サンプルは、ＰＣＲ反応成分および適切なオリゴヌクレオチドと、直接接触させられる。これらの方法は、体液（例えば、血液および尿）におけるカルバペネマーゼの存在を検出するために特に有用である。
本発明の方法を実施する際に使用できる代表的な生物学的サンプルには、鼻スワブ、喉スワブ、糞便、皮膚スワブ、血液（血液培養物を含む）、痰、気管支肺胞上皮洗浄液、気管支吸引物、肺組織および尿が含まれる。生物学的サンプルの収集および保存の方法は、当業者に公知である。生物学的サンプルは、細菌をプレートして増殖させることによって、処理できる。好ましい実施形態において、サンプルは直接的サンプルであり、直接的サンプルは、ＰＣＲ反応成分および適切なオリゴヌクレオチドと、直接接触させられる。これらの方法は、体液（例えば、血液および尿）におけるカルバペネマーゼの存在を検出するために特に有用である。
「直接的サンプル」は、対象から収集され、そのサンプルから細菌を単離も培養もせずに、ＰＣＲ反応でスクリーニングされるサンプルである。直接的サンプルは一般に、スクリーニング前に最低限処理されるだけである。種々の実施形態において、サンプルは、当技術分野で公知の任意の許容可能な方法を使用して溶解でき、細胞断片を除去するために遠心分離できる。上清はスクリーニングのために保持される。別の実施形態において、核酸は、ペレット化され、洗浄され、ＰＣＲ法でのスクリーニングの前に適切な緩衝液中に再懸濁される。
オリゴヌクレオチドプライマー
本発明の一実施形態において、サンプル中のカルバペネマーゼ抗生物質耐性遺伝子の検出において使用するためのオリゴヌクレオチドプライマーが提供される。本明細書中で使用する場合、「プライマー」とは、カルバペネマーゼ遺伝子中に存在するまたはカルバペネマーゼ遺伝子に由来する標的ポリヌクレオチドに相補的な配列を有するまたは含む型のオリゴヌクレオチドをいい、塩基対合を介して標的ポリヌクレオチドとハイブリダイズする。一実施形態において、本発明の順方向および逆方向のプライマーは、配列番号１、２、４、５、７、８、１４、１５、１７、１８および２０に示されるヌクレオチド配列を含むプライマーである。用語「オリゴヌクレオチド」とは、典型的には１５０ヌクレオチド長以下の長さ（例えば、５と１５０との間、好ましくは１０から１００の間、より好ましくは１５から５０ヌクレオチドの間の長さ）の短いポリヌクレオチドをいう。しかし、本明細書中で使用する場合、この用語は、より長いまたはより短いポリヌクレオチド鎖を包含することも意図する。
本発明の一実施形態において、サンプル中のカルバペネマーゼ抗生物質耐性遺伝子の検出において使用するためのオリゴヌクレオチドプライマーが提供される。本明細書中で使用する場合、「プライマー」とは、カルバペネマーゼ遺伝子中に存在するまたはカルバペネマーゼ遺伝子に由来する標的ポリヌクレオチドに相補的な配列を有するまたは含む型のオリゴヌクレオチドをいい、塩基対合を介して標的ポリヌクレオチドとハイブリダイズする。一実施形態において、本発明の順方向および逆方向のプライマーは、配列番号１、２、４、５、７、８、１４、１５、１７、１８および２０に示されるヌクレオチド配列を含むプライマーである。用語「オリゴヌクレオチド」とは、典型的には１５０ヌクレオチド長以下の長さ（例えば、５と１５０との間、好ましくは１０から１００の間、より好ましくは１５から５０ヌクレオチドの間の長さ）の短いポリヌクレオチドをいう。しかし、本明細書中で使用する場合、この用語は、より長いまたはより短いポリヌクレオチド鎖を包含することも意図する。
本発明のプライマーおよびプローブセットは、カルバペネマーゼをコードする核酸分子を検出するために設計される。本発明の組成物は、カルバペネマーゼをコードする核酸配列の５’側、３’側およびその中間で検出するために設計した。本発明のプライマーおよびプローブセットの各々は、カルバペネマーゼ遺伝子の公知のアイソフォームの全てを認識できる。本発明のプライマーおよびプローブの配列は、５’末端または３’末端に付加的なヌクレオチドを含めることによって改変できる。プライマーまたはプローブ配列の伸長のために使用するヌクレオチドを決定するために、配列番号１０〜１３（ＫＰＣカルバペネマーゼ遺伝子の全長配列を含む）および表２（カルバペネマーゼ配列内のプライマーおよびプローブ配列の位置を含む）を使用する当業者は、プライマーおよびプローブの配列をカルバペネマーゼコード配列と配列比較（アライン）し、プライマーまたはプローブ配列の５’領域および３’領域のヌクレオチド塩基を決定することによって、伸長されたプライマー配列を設計できる。同様に、プライマーおよびプローブの配列は、配列内にヌクレオチドを置換することにより、改変できる。プライマーおよびプローブの配列は、カルバペネマーゼ核酸配列と特異的にハイブリダイズするのに充分な相補性を含むべきであることが理解される。この様式において、少なくとも１、２、３、４または約５ヌクレオチドまでが置換できる。
本明細書中で使用する場合、用語「標的ポリヌクレオチド」および「標的核酸」とは、その存在を決定すべきサンプル中のポリヌクレオチドをいう。本発明において、標的核酸は、カルバペネム系薬剤を加水分解することが可能なβ−ラクタマーゼであるカルバペネマーゼをコードする核酸に対応する。肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）カルバペネマーゼ（ＫＰＣ）の４つのアイソフォームのヌクレオチド配列は、配列番号１０〜１３に示される。配列の任意の部分が、本発明の方法によって同定できる。カルバペネマーゼ配列の類似性に起因して、本発明のプライマープローブセットは、任意の腸内細菌においてカルバペネマーゼ配列を同定することが可能である。
本明細書中で使用する場合、用語「相補的」とは、２つのポリヌクレオチド鎖の領域間または同じポリヌクレオチド鎖の２つの領域間の、配列の相補性をいう。２つの領域をアンチパラレル様式で配置した場合、ポリヌクレオチドの第１の領域は、同じまたは異なるポリヌクレオチドの第２の領域に対して相補的であり、第１の領域の少なくとも１ヌクレオチドが、第２の領域の塩基と塩基対合することが可能である。したがって、２つの相補的ポリヌクレオチドは、全てのヌクレオチド位置で塩基対合する必要はない。「完全に相補的」とは、第１のポリヌクレオチドが、第２のポリヌクレオチドに対して１００％即ち「完全に」相補的であり、したがって、全てのポリヌクレオチド位置で塩基対を形成することをいう。また「部分的に相補的」とは、１００％相補的でない（例えば、９０％または８０％または７０％相補的な）第１のポリヌクレオチドをいい、１つまたは複数のヌクレオチド位置でミスマッチしたヌクレオチドを含む。
本明細書中で使用する場合、用語「ハイブリダイゼーション」は、相補的（部分的に相補的を含む）ポリヌクレオチド鎖の対合に関して使用される。ハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションの強さ（即ち、ポリヌクレオチド鎖間の会合の強さ）は、当技術分野で周知の多数の要因（ポリヌクレオチド間の相補性の程度、塩濃度などの条件によって影響を受ける、関与する条件のストリンジェンシー、形成されたハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）、他の成分の存在（例えば、ポリエチレングリコールの存在または非存在）、ハイブリダイズしている鎖のモル濃度、およびポリヌクレオチド鎖のＧ：Ｃ含量が含まれる）によって影響を受ける。一実施形態において、プライマーは、セット中の一方のプライマーのＴｍが、セット中の他方のプライマーのＴｍの２℃以内となるように設計される。核酸のハイブリダイゼーションに関する広範な指針は、非特許文献１；および非特許文献２中に見出される。非特許文献３を参照されたい。
本発明のプライマーは、当技術分野で公知の技術（適切な配列のクローニングおよび消化ならびに直接的化学合成が含まれるが、これらに限定されない）を使用して調製できる。
本発明のプライマーを作製するために使用できる化学合成方法には、非特許文献４に記載されるホスホトリエステル法、非特許文献５に開示されるホスホジエステル法、非特許文献６に開示されるジエチルホスホルアミダート法、および特許文献１に記載される固相支持法が含まれるが、これらに限定されない。本発明の合成オリゴヌクレオチドプライマーを調製するための自動化オリゴヌクレオチド合成機の使用も、本明細書中で企図される。さらに、所望の場合、プライマーは、当技術分野で公知の技術および以下に記載する技術を使用して標識化できる。
オリゴヌクレオチドプローブ
本発明のオリゴヌクレオチドプライマーの１または複数は、１つもしくは複数のプローブ配列と共に使用できるか、または１つもしくは複数のプローブ配列を含むことができる。プローブは、オリゴヌクレオチドプライマーとは別個であってもよく（「二分子プローブ」）、またはオリゴヌクレオチドプライマーに結合していてもよい（「一分子プローブ」または「テイルドプローブ」）。例えば、非特許文献７および特許文献２（これらは共に、参照によってその全体が本明細書中に組み込まれる）に記載される、自己プロービング配列（例えば、ＳＣＯＲＰＩＯＮＳ（商標）プライマー、「テイルドプローブ」ともいう）を参照されたい。
本発明のオリゴヌクレオチドプライマーの１または複数は、１つもしくは複数のプローブ配列と共に使用できるか、または１つもしくは複数のプローブ配列を含むことができる。プローブは、オリゴヌクレオチドプライマーとは別個であってもよく（「二分子プローブ」）、またはオリゴヌクレオチドプライマーに結合していてもよい（「一分子プローブ」または「テイルドプローブ」）。例えば、非特許文献７および特許文献２（これらは共に、参照によってその全体が本明細書中に組み込まれる）に記載される、自己プロービング配列（例えば、ＳＣＯＲＰＩＯＮＳ（商標）プライマー、「テイルドプローブ」ともいう）を参照されたい。
本明細書中で使用する場合、用語「プローブ」とは、プローブ中の少なくとも１つの配列とプライマー伸長産物中の配列との相補性に起因して、プライマー伸長産物と共にハイブリッド構造を形成するポリヌクレオチドをいう。「プライマー伸長産物」とは、配列番号１、２、４、５、７、８、１４、１５、１７、１８および２０として本明細書中に開示される配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーの、ポリメラーゼベースの伸長（鋳型として標的核酸を使用する）から得られる核酸産物を意図する。プローブのポリヌクレオチド領域は、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡおよび／または合成ヌクレオチドアナログから構成できる。好ましくは、プローブは、上記オリゴヌクレオチドプライマー配列に対して相補的な配列を含まない。本発明のプローブは、理想的には約５０ヌクレオチド以下の長さ、例えば、約４０ヌクレオチド以下、約３０ヌクレオチド以下、約２０ヌクレオチド以下の長さ、または約１０ヌクレオチド未満の長さである。好ましくは、本発明のプローブ配列は、配列番号３、６、９、１６および１９として本明細書中に開示される配列である。
本明細書中で使用する場合、「Ｔｍ」と「融解温度」とは、相互交換可能な用語であり、二本鎖ポリヌクレオチド分子の集団の５０％が一本鎖へと解離する温度である。ポリヌクレオチドのＴｍの計算式は、当技術分野で周知である。例えば、Ｔｍは、以下の式：Ｔｍ＝６９．３＋０．４１×（Ｇ＋Ｃ）％−６５０／Ｌによって計算でき、式中、Ｌは、プローブの長さ（ヌクレオチド）である。ハイブリッドポリヌクレオチドのＴｍは、１Ｍの塩におけるハイブリダイゼーションアッセイから採用された、ＰＣＲプライマーのＴｍを計算するために一般に使用される計算式：［（Ａ＋Ｔの数）×２℃＋（Ｇ＋Ｃの数）×４℃］を使用して概算することもできる。例えば、非特許文献８を参照されたい。Ｔｍの計算のために構造的特徴ならびに配列特徴を考慮に入れた、他のより精巧な計算方法が当技術分野に存在する。計算されたＴｍは単なる計算値である。最適な温度は一般に実験的に決定される。
標識化
本発明のプライマーおよび／またはプローブは、増幅反応のモニタリングを容易にするための１つまたは複数の標識をさらに含むことができる。本明細書中で使用する場合、用語「標識」または「標識化」とは、検出可能な（好ましくは定量可能な）シグナルを提供するために使用でき、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチドプライマーまたはプローブに結合できる、任意の原子または部分をいう。多様な種々の標識およびコンジュゲート化技術（直接的標識および間接的標識化を含む）が公知であり、科学文献および特許文献の両方で広範に報告されている。使用できる標識の例には、放射性ヌクレオチド、酵素、基質、補因子、インヒビター、蛍光部分、インターカレーター、化学発光部分、磁性粒子などが含まれる。このような標識の使用を教示する特許には、特許文献３；特許文献４；特許文献５；特許文献６；特許文献７；特許文献８；および特許文献９（参照によりその全体が本明細書中に組み込まれる）が含まれる。
本発明のプライマーおよび／またはプローブは、増幅反応のモニタリングを容易にするための１つまたは複数の標識をさらに含むことができる。本明細書中で使用する場合、用語「標識」または「標識化」とは、検出可能な（好ましくは定量可能な）シグナルを提供するために使用でき、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチドプライマーまたはプローブに結合できる、任意の原子または部分をいう。多様な種々の標識およびコンジュゲート化技術（直接的標識および間接的標識化を含む）が公知であり、科学文献および特許文献の両方で広範に報告されている。使用できる標識の例には、放射性ヌクレオチド、酵素、基質、補因子、インヒビター、蛍光部分、インターカレーター、化学発光部分、磁性粒子などが含まれる。このような標識の使用を教示する特許には、特許文献３；特許文献４；特許文献５；特許文献６；特許文献７；特許文献８；および特許文献９（参照によりその全体が本明細書中に組み込まれる）が含まれる。
ＩＩＩ．方法
サンプル中のカルバペネム耐性を有する細菌の検出のための迅速かつ高感度の方法が、本明細書中にさらに提供される。これらの方法は、カルバペネム耐性を有する対象を診断するため、ならびに細菌感染症を有する対象に適切な治療計画を立案するために有用であり、この治療は、カルバペネム耐性の存在または非存在に基づいて決定される。
サンプル中のカルバペネム耐性を有する細菌の検出のための迅速かつ高感度の方法が、本明細書中にさらに提供される。これらの方法は、カルバペネム耐性を有する対象を診断するため、ならびに細菌感染症を有する対象に適切な治療計画を立案するために有用であり、この治療は、カルバペネム耐性の存在または非存在に基づいて決定される。
これらの方法は、本明細書中に記載するプライマーおよびプローブを使用したカルバペネマーゼの増幅および検出の、ＰＣＲベース、特に定量的ＱＰＣＲベースの方法を含む。種々の実施形態において、本明細書中に開示する方法は、生理学的範囲内の細菌濃度（即ち、細菌に感染した対象から収集したサンプル中の細菌濃度）でカルバペネマーゼの存在を検出することが可能である。したがって、サンプルは、カルバペネマーゼの存在を検出するために、細菌集団を単離も濃縮も増殖（例えば培養）もする必要なく、直接スクリーニングできる。種々の実施形態において、本明細書中に開示する方法は、約１×１０3ＣＦＵ／ｍｌ、約１×１０4ＣＦＵ／ｍｌ、約１×１０5ＣＦＵ／ｍｌまたは約１×１０6ＣＦＵ／ｍｌの細菌濃度を有するサンプルから、カルバペネマーゼの存在を検出することが可能である。
ポリメラーゼベースの増幅
多数の異なるＰＣＲまたはＱＰＣＲのプロトコルが当技術分野で公知であり、本明細書中以下に例示され、サンプル中のカルバペネマーゼの検出のために本明細書に記載する組成物を使用した使用のために、直接適用するまたは適合させることができる。一般に、ＰＣＲにおいて、標的ポリヌクレオチド配列は、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーまたはオリゴヌクレオチドプライマーの対との反応によって増幅される。プライマーは、標的核酸の相補的領域とハイブリダイズし、ＤＮＡポリメラーゼがプライマーを伸長して、標的配列を増幅する。ポリメラーゼベースの核酸増幅産物を提供するのに充分な条件下では、１つのサイズの核酸フラグメントが、反応産物（増幅産物である標的ポリヌクレオチド配列）で優位となる。増幅サイクルが、単一の標的ポリヌクレオチド配列の濃度を増大させるために反復される。この反応は、ＰＣＲのために一般に使用される任意のサーマルサイクラーで実施できる。しかし、リアルタイム蛍光測定能力を有するサイクラー、例えば、ＳＭＡＲＴＣＹＣＬＥＲ（登録商標）（Ｃｅｐｈｅｉｄ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７７００（登録商標）（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）、ＲＯＴＯＲ−ＧＥＮＥ（商標）（Ｃｏｒｂｅｔｔ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｓｙｄｎｅｙ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）、ＬＩＧＨＴＣＹＣＬＥＲ（登録商標）（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｃｏｒｐ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）、ＩＣＹＣＬＥＲ（登録商標）（Ｂｉｏｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）およびＭＸ４０００（登録商標）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）が好ましい。
多数の異なるＰＣＲまたはＱＰＣＲのプロトコルが当技術分野で公知であり、本明細書中以下に例示され、サンプル中のカルバペネマーゼの検出のために本明細書に記載する組成物を使用した使用のために、直接適用するまたは適合させることができる。一般に、ＰＣＲにおいて、標的ポリヌクレオチド配列は、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーまたはオリゴヌクレオチドプライマーの対との反応によって増幅される。プライマーは、標的核酸の相補的領域とハイブリダイズし、ＤＮＡポリメラーゼがプライマーを伸長して、標的配列を増幅する。ポリメラーゼベースの核酸増幅産物を提供するのに充分な条件下では、１つのサイズの核酸フラグメントが、反応産物（増幅産物である標的ポリヌクレオチド配列）で優位となる。増幅サイクルが、単一の標的ポリヌクレオチド配列の濃度を増大させるために反復される。この反応は、ＰＣＲのために一般に使用される任意のサーマルサイクラーで実施できる。しかし、リアルタイム蛍光測定能力を有するサイクラー、例えば、ＳＭＡＲＴＣＹＣＬＥＲ（登録商標）（Ｃｅｐｈｅｉｄ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７７００（登録商標）（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）、ＲＯＴＯＲ−ＧＥＮＥ（商標）（Ｃｏｒｂｅｔｔ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｓｙｄｎｅｙ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）、ＬＩＧＨＴＣＹＣＬＥＲ（登録商標）（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｃｏｒｐ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）、ＩＣＹＣＬＥＲ（登録商標）（Ｂｉｏｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）およびＭＸ４０００（登録商標）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）が好ましい。
定量ＰＣＲ（ＱＰＣＲ）（リアルタイムＰＣＲともいう）は、定量的測定だけでなく測定時間および汚染の低下も提供するので、ある状況下で好ましい。本明細書中で使用する場合、「定量ＰＣＲ」（または「リアルタイムＱＰＣＲ」）とは、ＰＣＲ増幅の進行の直接的モニタリングをいい、反応産物を繰り返しサンプリングする必要なしに実施される。ＱＰＣＲにおいて、反応産物は、生成されたときにシグナル発生機構（例えば蛍光）を介してモニタリングでき、反応がプラトーに達する前の、バックグラウンドレベルを上回ってシグナルが上昇した後に追跡される。蛍光の検出可能なレベル即ち「閾値」レベルに達するのに必要なサイクル数（本明細書中で、サイクル閾値即ち「ＣＴ」という）は、ＰＣＲプロセスの開始時の増幅可能な標的の濃度によって直接変動し、サンプル中の標的核酸の量のリアルタイムでの測定を提供するためのシグナル強度の測定を可能にする。
好ましい実施形態において、標識化プローブは、ＰＣＲ増幅によって生成される伸長産物を検出するために使用される。本発明の配列を含む標識化プローブを利用する任意のプローブ形式が、当技術分野で公知のように、または本明細書の他の箇所に記載したように、使用できる（例えば、ＳＣＯＲＰＩＯＮＳ（商標）プローブ、サンライズプローブ、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）プローブまたは分子ビーコンプローブ）。
ＰＣＲ条件
ＰＣＲ反応を設定するための方法は当業者に周知である。反応混合物は、適切な緩衝液、塩などならびに適切な濃度の核酸ポリメラーゼと組み合わせて、鋳型核酸（以下に記載する陰性対照の場合を除く）ならびにオリゴヌクレオチドプライマーおよび／またはプローブを最低限含む。本明細書中で使用する場合「核酸ポリメラーゼ」とは、ヌクレオシド三リン酸の重合を触媒する酵素をいう。一般に、この酵素は、標的配列にアニールしたプライマーの３’末端で合成を開始し、合成が終結するまで鋳型に沿って５’方向に進行するであろう。適切な濃度には、本明細書中に記載した方法においてこの反応を触媒する濃度が含まれる。公知のＤＮＡポリメラーゼには、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ、高度好熱菌（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（Ｔｔｈ）ＤＮＡポリメラーゼ、好熱性細菌（バチルス・ステアロサーモフィルス；Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＤＮＡポリメラーゼ、超好熱性古細菌（サーモコッカス・リトラリス；Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）ＤＮＡポリメラーゼ、高度好熱菌（サーマス・アクアティクス；Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）（Ｔａｑ）ＤＮＡポリメラーゼおよびパイロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ）（Ｐｆｕ）ＤＮＡポリメラーゼが含まれる。
ＰＣＲ反応を設定するための方法は当業者に周知である。反応混合物は、適切な緩衝液、塩などならびに適切な濃度の核酸ポリメラーゼと組み合わせて、鋳型核酸（以下に記載する陰性対照の場合を除く）ならびにオリゴヌクレオチドプライマーおよび／またはプローブを最低限含む。本明細書中で使用する場合「核酸ポリメラーゼ」とは、ヌクレオシド三リン酸の重合を触媒する酵素をいう。一般に、この酵素は、標的配列にアニールしたプライマーの３’末端で合成を開始し、合成が終結するまで鋳型に沿って５’方向に進行するであろう。適切な濃度には、本明細書中に記載した方法においてこの反応を触媒する濃度が含まれる。公知のＤＮＡポリメラーゼには、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ、高度好熱菌（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（Ｔｔｈ）ＤＮＡポリメラーゼ、好熱性細菌（バチルス・ステアロサーモフィルス；Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＤＮＡポリメラーゼ、超好熱性古細菌（サーモコッカス・リトラリス；Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）ＤＮＡポリメラーゼ、高度好熱菌（サーマス・アクアティクス；Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）（Ｔａｑ）ＤＮＡポリメラーゼおよびパイロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ）（Ｐｆｕ）ＤＮＡポリメラーゼが含まれる。
上記成分に加えて、本発明の反応混合物は、プライマー、プローブおよびデオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）を含む。通常、反応混合物は、４つの天然に存在するヌクレオシド塩基に対応する４つの異なるタイプのｄＮＴＰ（即ち、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＧＴＰ）をさらに含むであろう。本発明の方法において、各ｄＮＴＰは典型的に、約１０から５０００μＭ、通常約２０から１０００μＭ、約１００から８００μＭまたは約３００から６００μＭの範囲の量で存在する。
本発明の方法の第１のステップで調製される反応混合物は、一価イオンの供給源、二価カチオンの供給源および緩衝剤を含む水性緩衝媒体をさらに含む。一価イオンの任意の簡便な供給源（例えば、塩化カリウム、酢酸カリウム、酢酸アンモニウム、グルタミン酸カリウム、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウムなど）が使用できる。二価カチオンは、マグネシウム、マンガン、亜鉛などとすることができ、このカチオンは典型的にはマグネシウムとなる。マグネシウムカチオンの任意の簡便な供給源が使用でき、これには、塩化マグネシウム、酢酸マグネシウムなどが含まれる。緩衝液中に存在するマグネシウムの量は、０．５から１０ｍＭの範囲とすることができ、約１から約６ｍＭまたは約３から約５ｍＭの範囲とすることができる。緩衝液中に存在できる代表的な緩衝剤または塩には、Ｔｒｉｓ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、ＨＥＰＥＳ、ＭＯＰＳなどが含まれ、緩衝剤の量は、典型的には約５から１５０ｍＭの範囲、通常約１０から１００ｍＭ、より通常は約２０から５０ｍＭの範囲となり、特定の好ましい実施形態では、緩衝剤は、約６．０から９．５の範囲のｐＨ（例えば、約ｐＨ６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０または９．５）を提供するのに充分な量で存在する。緩衝媒体中に存在できる他の薬剤には、キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡなど）が含まれる。
反応混合物の調製において、種々の構成成分を任意の簡便な順序で合わせることができる。例えば、緩衝液は、プライマー、ポリメラーゼおよび次いで鋳型核酸と合わせてもよく、あるいは種々の構成成分の全てを、反応混合物を生成しても同時に合わせてもよい。
あるいは、市販の予め混合された試薬が、製造業者の指示に従って、または反応条件を改善するために改変して（例えば、必要に応じて、緩衝液濃度、カチオン濃度またはｄＮＴＰ濃度の改変）、本発明の方法において利用できる（例えば、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、ＯＭＮＩＭＩＸ（登録商標）またはＳＭＡＲＴＭＩＸ（登録商標）（Ｃｅｐｈｅｉｄ）、ＩＱ（商標）Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、ＬＩＧＨＴＣＹＣＬＥＲ（登録商標）ＦａｓｔＳｔａｒｔ（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）、あるいはＢＲＩＬＬＩＡＮＴ（登録商標）ＱＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）が含まれる）。
反応混合物の調製後、この反応混合物は、プライマー伸長反応条件（「ポリメラーゼベースの核酸増幅産物を提供するのに充分な条件」）、即ち、鋳型鎖を鋳型として使用したプライマー分子の末端へのヌクレオチドの付加による、ポリメラーゼ媒介性のプライマー伸長を可能にする条件に供される。多くの実施形態において、プライマー伸長反応条件は増幅条件であり、この条件は複数の反応サイクルを含み、各反応サイクルは、（１）変性ステップ、（２）アニーリングステップおよび（３）重合ステップを含む。反応サイクルの数は、実施される適用に依存して変動するであろうが、通常は、少なくとも１５、より通常は少なくとも２０となり、６０以上の多い数としてもよく、種々のサイクルの数は典型的に、約２０から４０の範囲となる。約２５サイクルより多い、通常は約３０サイクルより多いサイクルが実施される方法について、酵素的プライマー伸長に適切な条件が維持されるように、反応混合物中にさらなるポリメラーゼを導入することが、簡便または所望されてもよい。
変性ステップは、高温まで反応混合物を加熱するステップ、および反応混合物中に存在する任意の二本鎖またはハイブリダイズした核酸が解離するのに充分な時間にわたり、その高温で混合物を維持するステップを含む。変性のために、反応混合物の温度は通常、約８５から１００℃、通常約９０から９８℃、より通常は約９３から９６℃の範囲の温度に昇温され、約３から１２０秒、通常約３秒からの範囲の時間にわたり、その温度で維持される。
変性後、反応混合物は、混合物中に存在する（存在する場合）鋳型核酸へのプライマーアニーリングに充分な条件、ならびに鋳型としてハイブリダイズする核酸を使用して５’から３’の方向でプライマーが伸長するような様式でのプライマー末端へのヌクレオチドの重合に充分な条件（即ち、プライマー伸長産物の酵素的産生に充分な条件）に供される。この実施形態において、アニーリングおよび伸長のプロセスは、同じステップで起こる。これらの条件を達成するために反応混合物の温度を低下させ、温度は通常、最適な効率および特異性を提供するために選択され、一般には、約５０から７５℃、通常約５５から７０℃、より通常は約６０から６８℃、より具体的には約６０℃の範囲となる。アニーリング条件は、約１５秒から３０分、通常約２０秒から５分、または約３０秒から１分、または約３０秒の範囲の時間にわたって維持される。
このステップは任意選択で、各ステップのための温度および時間の長さを変動および最適化した、アニーリングステップおよび伸長ステップの各々の１つを含むことができる。２ステップのアニーリングおよび伸長において、アニーリングステップは上記のように進行させる。鋳型核酸へのプライマーのアニーリング後、反応混合物は、上記のようなプライマー末端へのヌクレオチドの重合を提供するのに充分な条件にさらに供される。重合条件を達成するために、反応混合物の温度は典型的に、約６５から７５℃、通常約６７から７３℃の範囲の温度に昇温されまたはその温度で維持され、約１５秒から２０分、通常約３０秒から５分の範囲の時間にわたって維持される。
変性、アニーリングおよび重合の上記サイクルは、サーマルサイクラーとして典型的に公知の自動化機器を使用して実施できる。使用できるサーマルサイクラーは、本明細書中の他の箇所に記載されており、また特許文献１０；特許文献１１；特許文献１２；および特許文献１３（これらの開示は、参照によって本明細書中に組み込まれる）にも記載されている。
本発明の方法は、標的核酸配列を検出するための非ＰＣＲベースの適用でも使用でき、このとき、このような標的は固相支持体上に固定化してもよい。固相支持体上に核酸配列を固定化する方法は当技術分野で公知であり、非特許文献９、および製造業者が提供するプロトコル（例えば、膜についてはＰａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ；磁性ビーズについてはＤｙｎａｌ；培養プレートについてはＣｏｓｔａｒ、Ｎａｌｇｅｎｕｎｃ；ビーズアレイプラットホームについてはＬｕｍｉｎｅｘおよびＢｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ；ならびに本発明に従って有用な他の支持体についてはＣＰＧ，Ｉｎｃ．）に記載されている。
核酸増幅の分野における当業者は、他の迅速な増幅手順（例えば、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、転写ベースの増幅系（ＴＡＳ）、自家持続配列複製法（３ＳＲ）、核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）および分岐ＤＮＡ（ｂＤＮＡ）（非特許文献１０）の存在を知っている。本発明の範囲は、ＰＣＲによる増幅の使用に限定されず、むしろ、カルバペネマーゼ抗生物質耐性遺伝子の検出および／または定量のために本発明の配列と共に有用であり得る任意の迅速な核酸増幅方法または任意の他の手順の使用を含む。
さらに、同様の増幅または検出／定量の結果を導く、種々の試薬の正確な量、ならびにＰＣＲまたは他の適切な増幅手順のための条件（例えば、緩衝液条件、サイクル回数など）に関する変動は、当業者に公知であり、等価であるとみなされる。一実施形態において、目的のＱＰＣＲ検出は、サンプル中の、５０コピーより少ない（好ましくは２５コピーより少ない、より好ましくは１５コピーより少ない、なおより好ましくは１０コピーより少ない）標的核酸（即ち、カルバペネマーゼ核酸）を検出する感度を有する。一実施形態において、非特異的増幅からバックグラウンドを減少させることによってＰＣＲ反応を改善するため、および所望の伸長産物の増幅を増大させるために、ホットスタートＰＣＲ反応（例えば、ホットスタートＴａｑＤＮＡポリメラーゼを使用する）が実施される。
対照
本発明のＰＣＲまたはＱＰＣＲ反応は、種々の対照を含むことができる。このような対照は、「非鋳型」陰性対照を含むべきであり、この対照においては、プライマー、緩衝液、酵素および他の必要な試薬（例えば、塩化マグネシウム、ヌクレオチド）が、添加された試験サンプルの非存在下でサイクル反応される。公知の標的核酸を含む陽性対照もまた、並行して実施すべきである。陽性対照および陰性対照の両方を、増幅反応に含めてもよい。単一の反応は、陽性対照、陰性対照またはサンプル鋳型のいずれかを含むことができ、あるいは単一の反応は、サンプル鋳型および陽性対照の両方を含んでもよい。
本発明のＰＣＲまたはＱＰＣＲ反応は、種々の対照を含むことができる。このような対照は、「非鋳型」陰性対照を含むべきであり、この対照においては、プライマー、緩衝液、酵素および他の必要な試薬（例えば、塩化マグネシウム、ヌクレオチド）が、添加された試験サンプルの非存在下でサイクル反応される。公知の標的核酸を含む陽性対照もまた、並行して実施すべきである。陽性対照および陰性対照の両方を、増幅反応に含めてもよい。単一の反応は、陽性対照、陰性対照またはサンプル鋳型のいずれかを含むことができ、あるいは単一の反応は、サンプル鋳型および陽性対照の両方を含んでもよい。
「非鋳型」対照に加えて、陰性対照は、反応中に含まれる非特異的標的核酸を用いた増幅反応を含むこともできるか、あるいは、サンプル調製の任意のまたは全てのステップ（核酸抽出から増幅調製まで）を使用して、試験サンプルの添加なしに（例えば、各ステップが、非試験サンプルまたはカルバペネマーゼを含まないことがわかっているサンプルのいずれかを使用する）調製されたサンプルとすることができる。
陽性対照および陰性対照は、試験サンプルがカルバペネム耐性を有するまたは有さないと分類されるパラメータを設定するために有用である。例えば、ＱＰＣＲ反応において、陽性対照サンプル中でカルバペネマーゼが検出されるサイクル閾値は、サンプルを「陽性」と分類するための閾値を設定するために使用でき、陰性対照サンプル中でカルバペネマーゼが検出されるサイクル閾値は、サンプルを「陰性」と分類するための閾値を設定するために使用できる。単一の反応からのＣＴを各対照について使用してもよく、または複製サンプルの中央値もしくは平均値を使用してもよい。なお別の実施形態において、ヒストリカル対照値を使用してもよい。陰性対照および陽性対照の各々についての検出の最低レベルは典型的に、複数の反応にわたる平均ＣＴの９５％信頼区間の下限に設定される。この値は、診断アッセイの要件に依存して調節できる。
プライマー伸長産物の確認
所望に応じて、プライマー伸長または増幅産物の同定は、（例えば）サザンブロットアッセイを含む標準的な分子技術を使用して確認できる。サザンブロットアッセイにおいて、増幅産物は、電気泳動によって分離され、膜（即ち、ニトロセルロース、ナイロンなど）に転写され、オリゴヌクレオチドプローブまたは目的の核酸配列の任意の部分と反応させられる。次いでプローブは、検出を可能にするために修飾される。修飾方法は、放射性標識されたヌクレオチドまたは任意の数の非放射活性標識（例えばビオチン）の取り込みとすることができる。
所望に応じて、プライマー伸長または増幅産物の同定は、（例えば）サザンブロットアッセイを含む標準的な分子技術を使用して確認できる。サザンブロットアッセイにおいて、増幅産物は、電気泳動によって分離され、膜（即ち、ニトロセルロース、ナイロンなど）に転写され、オリゴヌクレオチドプローブまたは目的の核酸配列の任意の部分と反応させられる。次いでプローブは、検出を可能にするために修飾される。修飾方法は、放射性標識されたヌクレオチドまたは任意の数の非放射活性標識（例えばビオチン）の取り込みとすることができる。
サザンブロットアッセイで使用されるオリゴヌクレオチドプローブはこの核酸配列由来であり、したがって、このカルバペネマーゼ抗生物質耐性遺伝子に特異的であり、配列番号３、６、９、１６または１９に示される配列を含むプローブとすることができる。サザンブロットアッセイで使用されるプローブは、慣用的な標準的方法を使用して調製できる。例えば、プローブは、当技術分野で公知の慣用技術を使用して、単離、クローニングおよび制限でき、あるいは本明細書中に以前に記載した化学合成方法を使用して作製できる。
あるいは、増幅産物は、ドットブロット分析を使用して検出できる。ドットブロット分析は、オリゴヌクレオチドプローブ（例えば以前に記載したもの）を、ニトロセルロースまたは固体支持体（例えば、ビーズ（例えば、ポリスチレンビーズ、磁性ビーズまたは非磁性ビーズなどであるがこれらに限定されない）、反応トレイの壁、ストリップ（例えば、ニトロセルロースストリップであるがこれに限定されない）、試験管であるがこれらに限定されない）に接着させることを含む。標識化増幅産物を含むサンプルが添加され、反応され、未結合のサンプルを除去するために洗浄され、プローブに結合した標識化増幅産物が、当該技術分野で公知の慣用的な技術を使用して可視化される。プライマー伸長産物または増幅産物を確認するためのより厳密な方法は、当技術分野で周知の技術を使用する直接的配列決定を介したものである。
キット
本発明は、本発明の方法を実施するために必要な要素を含む「キット」の調製を容易にする。このようなキットは、その中に１つまたは複数の容器（例えば、チューブまたはバイアル）を密に封じ込めて受容するために区画化された運搬手段を含むことができる。容器の１つは、少なくとも１つの未標識または検出可能に標識された本発明のＤＮＡプライマーを含むことができる。１つまたは複数の標識化ＤＮＡプライマーは、必要に応じて、凍結乾燥された形態または適切な緩衝液中に存在してもよい。１つまたは複数の容器は、ＰＣＲ反応において利用される１つまたは複数の酵素または試薬を含んでもよい。これらの酵素は、凍結乾燥された形態でまたは適切な緩衝液中に、それ自体でまたは混合物として存在することができる。最後に、このキットは、本発明の技術を実施するのに必要なさらなる要素（例えば、緩衝液、抽出試薬、酵素、ピペット、プレート、核酸、ヌクレオシド三リン酸、ろ紙、ゲル材料、転写材料、オートラジオグラフィー必需品など）を全て含んでいてもよい。
本発明は、本発明の方法を実施するために必要な要素を含む「キット」の調製を容易にする。このようなキットは、その中に１つまたは複数の容器（例えば、チューブまたはバイアル）を密に封じ込めて受容するために区画化された運搬手段を含むことができる。容器の１つは、少なくとも１つの未標識または検出可能に標識された本発明のＤＮＡプライマーを含むことができる。１つまたは複数の標識化ＤＮＡプライマーは、必要に応じて、凍結乾燥された形態または適切な緩衝液中に存在してもよい。１つまたは複数の容器は、ＰＣＲ反応において利用される１つまたは複数の酵素または試薬を含んでもよい。これらの酵素は、凍結乾燥された形態でまたは適切な緩衝液中に、それ自体でまたは混合物として存在することができる。最後に、このキットは、本発明の技術を実施するのに必要なさらなる要素（例えば、緩衝液、抽出試薬、酵素、ピペット、プレート、核酸、ヌクレオシド三リン酸、ろ紙、ゲル材料、転写材料、オートラジオグラフィー必需品など）を全て含んでいてもよい。
本発明によるキットは、少なくとも以下を含む：（ａ）標識化オリゴヌクレオチド（ここで、このキットは、２以上の識別可能なオリゴヌクレオチド（例えば、カルバペネマーゼをコードするヌクレオチド配列とハイブリダイズするもの）を含む）；および（ｂ）高い忠実度の増幅（例えばＰＣＲ反応）において提供された標識化オリゴヌクレオチドを使用するための指示書。一実施形態において、２つの識別可能なオリゴヌクレオチドは、配列番号１〜９および１４〜２０からなる群より選択される。
対象のキットは、必要とされるあるいは本発明の方法の間に調製された反応混合物中に含めることが簡便および／または所望されるさらなる試薬をさらに含んでもよく、このような試薬には以下が含まれる：１つまたは複数のポリメラーゼ；水性緩衝媒体（調製されたものまたはその構成成分で存在するもののいずれかであり、その成分の１つまたは複数は予め混合されていてもよく、あるいは成分の全てが分離していてもよい）など。
キットの種々の試薬成分は、別個の容器中に存在してもよく、あるいは鋳型核酸と合わせるために、試薬混合物へと全てが予め合わせられていてもよい。
上記成分に加えて、キットは、本発明の方法を実施するための指示書をさらに含む。これらの指示書は、種々の形態でキット中に存在してもよく、そのうち１つまたは複数がキット中に存在していてもよい。これらの指示書が存在できる１つの形態は、適切な媒体または被印刷物上に印刷された情報としてである（例えば、キットの包装中、包装インサート中などの、情報が印刷された１枚または複数の紙片）。なお別の手段は、情報が記録されたコンピュータ可読媒体（例えば、ディスク、ＣＤなど）となる。存在できるなお別の手段は、離れたサイトで情報にアクセスするためにインターネットを介して使用できるウェブサイトアドレスである。任意の簡便な手段がキット中に存在してもよい。
以下の実施例は、例示のために提供されたものであって、限定のためのものではない。
実験
材料および方法
以下で言及する参考文献の非特許文献１１〜１６は、実験セクションの最後に列挙する。
材料および方法
以下で言及する参考文献の非特許文献１１〜１６は、実験セクションの最後に列挙する。
細菌株：カルバペネム耐性肺炎桿菌属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を、ＢＤ ＩＤ／ＡＳＴ微生物バンクから、ＣＬＳＩが記載したとおりに、培地微量希釈によって同定した（非特許文献１１）。実験を通じて、野生型（アンピシリン感受性）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＡＴＣＣ２５９２２（株ＩＤ３００９６０）を陰性対照として使用した。ＫＰＣ−１、ＫＰＣ−２およびＫＰＣ−３を含むと以前に決定された３つの株（株ＩＤ３０１９１６＝ＫＰＣ−１、３０１９１７＝ＫＰＣ−２、３０１９１８＝ＫＰＣ−３）を、陽性対照として使用した（非特許文献１４）。ＥＳＢＬ陽性の肺炎桿菌属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）もまた、リアルタイムアッセイの特異性を実証するためにスクリーニングした。ＥＳＢＬ陽性株を、ＣＬＳＩ推奨の培地微量希釈アッセイを使用して同定した（非特許文献１２）。任意の処理または抽出の前に、全ての株を、５％のヒツジ赤血球を含むＴｒｙｐｔｉｃａｓｅ Ｓｏｙ Ａｇａｒ（ＴＳＡ）プレート（ＢＤ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｓｐａｒｋｓ、ＭＤ）上にストリークして広げ、３５℃で一晩増殖させた。
抗菌剤感受性試験：抗菌剤感受性試験を、ＣＬＳＩが記載したように、ミュラー−ヒントン培地（ＢＤ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｓｐａｒｋｓ、ＭＤ）を使用して実施した（非特許文献１１）。抗菌剤粉末は、以下の会社から取得した；アンピシリン（Ａｍｐ）およびセフォタキシム（ＣＴＸ）（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、セフタジジム（ＣＡＺ）（Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）、クラブラン酸（Ｓｍｉｔｈ−Ｋｌｉｎｅ、Ｋｉｎｇ ｏｆ Ｐｒｕｓｓｉａ、ＰＡ）、イミペネム（ＩＰＭ）（Ｍｅｒｃｋ＆Ｃｏ．、Ｒａｈｗａｙ、ＮＪ）。
ＤＮＡ抽出および標準化：細菌ＤＮＡの単離は、標準的な加熱溶菌プロトコルを使用して実施した。このプロトコルにおいて、ＴＳＡ単離プレートからのコロニーの一部を、５０μｌの分子生物学グレードの水中に配置した。次いでこれらのサンプルを、８００ｒｐｍで１０分間振盪しながら、９５℃でインキュベートした。ＤＮＡを、短い遠心分離ステップ（１４，０００ｒｐｍ（２０，８００×ｇ）で５分間）によって回収した。ＤＮＡを含む上清を取り出し、きれいなチューブ中に配置した。サンプルを分光測定にかけ、核酸を、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ＋１ｍＭ ＥＤＴＡ（ＴＥ）緩衝液（ｐＨ８．０）中、１００ｎｇ／μｌの濃度に標準化した。ＤＮＡの純度を、２６０／２８０吸光度比を分析することによって決定した（純粋なＤＮＡは＞１．７の比を有する）。
リアルタイムＰＣＲプロトコル：全ての精製したＤＮＡ（１００ｎｇ／μｌ）を、ＰＣＲ分析の前に少なくとも１／２０希釈し、加熱溶菌したサンプル中に存在する任意の阻害タンパク質を徹底的に希釈した。ＤＮＡサンプルの５ｎｇアリコートを、２５０ｎＭの各プライマー、１２５ｎＭの二重標識化プローブおよびＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｆａｓｔ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を含むＰＣＲマスターミックス２０μｌ中に配置した。リアルタイムアッセイで使用したプライマーおよびプローブの配列は、表２に見出すことができる。全てのプライマーおよびプローブは、このプロジェクトの指示のもとに、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．が合成した。二重標識化した加水分解プローブを、５’６−ＦＡＭ（商標）／３’ＢＨＱ−１（商標）を用いて合成し、ＨＰＬＣを用いて２回精製した。サンプルを、２段階２ステップのＰＣＲプログラム（２０秒の酵素活性化段階、ならびに（３秒間９５℃の変性ステップおよび３０秒６０℃のアニーリング／伸長ステップ）×４０サイクルからなる２ステップのＰＣＲ段階が存在する）を使用してＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（ＡＢＩ）７５００ Ｆａｓｔ Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）で実行した。ＰＣＲプログラムの平均実行時間は３５分間であった。
配列決定：リアルタイムＰＣＲアッセイにおいて同定されたＫＰＣ陽性株を確認するために、非特許文献１３および非特許文献１５に記載されたプライマーを使用して、アンプリコン配列（単位複製配列）決定を実施した。ＤＮＡサンプルの１００ｎｇアリコートを、０．２ｐｍｏｌの各プライマーおよびＱｉａｇｅｎ（登録商標）Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を含むＰＣＲマスターミックス１５μｌ中に配置した。反応を、製造元（Ｑｉａｇｅｎ）が記載したサイクリングパラメータを使用して、ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＰＴＣ−２００サーマルサイクラー（ＢｉｏＲａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）中で増幅した。ＰＣＲ反応を、ＥｘｏＳａｐ−ＩＴ（登録商標）（ＵＳＢ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ、ＯＨ）プロトコルに従って清浄化した。配列決定反応およびサイクリングパラメータを、ＡＢＩ ＢｉｇＤｙｅ（登録商標）Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ１．１ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇキット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）に従って実施した。配列決定反応産物を、製造者が提供したプロトコルに従ってＤｙＥｘ（商標）２．０ Ｓｐｉｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を使用して精製し、ＡＢＩ ３１３０ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）で分析した。ＫＰＣアンプリコン配列決定から得られた配列を、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）からのＢＬＡＳＴアルゴリズムを使用してＧｅｎＢａｎｋ中の非重複配列に対して比較した。
結果
ＫＰＣ配列比較解析（アラインメント）およびアッセイ設計：ＫＰＣおよびその関連の変異体を、ＮＣＢＩから得た。特有のＫＰＣ変異体の全てを、ＤＮＡＳＴＡＲ（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）配列分析ソフトウェア中のＣｌｕｓｔａｌ Ｗアルゴリズムを使用してアラインして、ＫＰＣアイソフォームに関連する全てのヌクレオチド変異体の配列を決定した。アラインメントで同定された全てのＫＰＣ変異体を、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション（受託）番号および保有宿主の種と共に、表１中に列挙する。アラインされた配列を次いで、プライマーおよびプローブ設計のための参照として使用した。リアルタイムアッセイを、全てのＫＰＣ変異体を認識するその能力について特異的に選択した。リアルタイムアッセイからのプライマーおよびプローブの大多数は、ＫＰＣ−７５８アッセイ以外は、公知のＫＰＣ変異体と重複しない。ＫＰＣ−７５８アッセイにおける逆方向プライマーは、ヌクレオチド位置８１４でＫＰＣ−３変異体と重複する。ＫＰＣ−３変異体は、感度における見かけの損失なしに、ＫＰＣ−７５８アッセイで検出される（以下の表４中のＣＴ値を参照のこと）。プライマーおよびプローブを、Ｐｒｉｍｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓ ｖ３（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）の助けで、全てのプライマーが互いの２度以内かつ６０℃の最適Ｔｍ（融解温度）の２度以内でなければならないという基準を用いて、設計した。プローブのＴｍは、プローブアニーリングの特異性を増大させるために、プライマー対よりも１０度高かった（表２）。ＫＰＣリアルタイムプライマーおよびプローブを、ＮＣＢＩからのＢＬＡＳＴアルゴリズムを使用してＧｅｎＢａｎｋ中の非重複配列に対して比較した。全てのリアルタイムアッセイは、＞１００％のカバー度および＞１００％の配列同一性で、利用可能なＧｅｎＢａｎｋのＫＰＣ配列と一致し、データベース中の任意の他の遺伝子に対しては有意な同一性を全く有さなかった。
ＫＰＣ配列比較解析（アラインメント）およびアッセイ設計：ＫＰＣおよびその関連の変異体を、ＮＣＢＩから得た。特有のＫＰＣ変異体の全てを、ＤＮＡＳＴＡＲ（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）配列分析ソフトウェア中のＣｌｕｓｔａｌ Ｗアルゴリズムを使用してアラインして、ＫＰＣアイソフォームに関連する全てのヌクレオチド変異体の配列を決定した。アラインメントで同定された全てのＫＰＣ変異体を、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション（受託）番号および保有宿主の種と共に、表１中に列挙する。アラインされた配列を次いで、プライマーおよびプローブ設計のための参照として使用した。リアルタイムアッセイを、全てのＫＰＣ変異体を認識するその能力について特異的に選択した。リアルタイムアッセイからのプライマーおよびプローブの大多数は、ＫＰＣ−７５８アッセイ以外は、公知のＫＰＣ変異体と重複しない。ＫＰＣ−７５８アッセイにおける逆方向プライマーは、ヌクレオチド位置８１４でＫＰＣ−３変異体と重複する。ＫＰＣ−３変異体は、感度における見かけの損失なしに、ＫＰＣ−７５８アッセイで検出される（以下の表４中のＣＴ値を参照のこと）。プライマーおよびプローブを、Ｐｒｉｍｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓ ｖ３（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）の助けで、全てのプライマーが互いの２度以内かつ６０℃の最適Ｔｍ（融解温度）の２度以内でなければならないという基準を用いて、設計した。プローブのＴｍは、プローブアニーリングの特異性を増大させるために、プライマー対よりも１０度高かった（表２）。ＫＰＣリアルタイムプライマーおよびプローブを、ＮＣＢＩからのＢＬＡＳＴアルゴリズムを使用してＧｅｎＢａｎｋ中の非重複配列に対して比較した。全てのリアルタイムアッセイは、＞１００％のカバー度および＞１００％の配列同一性で、利用可能なＧｅｎＢａｎｋのＫＰＣ配列と一致し、データベース中の任意の他の遺伝子に対しては有意な同一性を全く有さなかった。
カルバペネム加水分解株およびＥＳＢＬ産生株についてのスクリーニング：ＢＤ ＩＤ／ＡＳＴ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｂａｎｋを、ＣＬＳＩが記載したように、培地微量希釈を用いてカルバペネム耐性の肺炎桿菌属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）についてスクリーニングした（非特許文献１２）。プラスミドが保持するＫＰＣ遺伝子についての主な保有宿主の種であるため、肺炎桿菌属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）菌種および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を選択した。ＩＰＭの最低阻害濃度（ＭＩＣ）を、標準的な培地微量希釈に基づいて２〜１６μｇ／ｍｌの範囲内で評価し、１６μｇ／ｍｌ以上をＩＰＭに対して耐性であるとみなした（非特許文献１２）。表３中の２４株のうち３株（下線で示す）は、ＣＬＳＩ標準に従ってＩＰＭに対して耐性（１６μｇ／ｍｌ以上）であった。
ＫＰＣ産生単離体が陽性のＥＳＢＬ ＣＬＳＩ確証的試験と関連すること（非特許文献１６）およびいくつかのＫＰＣ産生単離体が１６μｇ／ｍｌ以上のＩＰＭ耐性ポイントを下回ることが見出されたこと（非特許文献１６）を示唆する文献中の報告に起因して、ＩＰＭ耐性ではなかったがＥＳＢＬ陽性であったさらなる肺炎桿菌属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）菌種および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株を、スクリーニングした。これらのさらなるＥＳＢＬ株は、リアルタイムアッセイの感度および特異性を実証するために含めた。
ＥＳＢＬ陽性株を、ＣＬＳＩ推奨の培地微量希釈アッセイを使用して同定した（非特許文献１２）。簡潔に述べると、この培地微量希釈アッセイは、抗菌剤の規定の範囲間での２倍希釈スキームを有する。例えば、抗菌剤の規定の範囲が２〜１６μｇ／ｍｌの場合、ウェル間での２倍希釈は、０．２５、０．５、１、２、４、８および１６μｇ／ｍｌで示される。ＥＳＢＬ陽性株を同定するために、抗菌剤単独またはクラブラン酸と組み合わせた抗菌剤についてのＭＩＣを決定するために、規定された範囲にわたるこれらの種々の２倍希釈で、単独またはクラブラン酸と組み合わせてかのいずれかで目的の抗菌剤を含むウェル中で増殖を評価する。抗菌剤へのクラブラン酸の添加はこの剤のＭＩＣを低下させることができ、例えば、その結果、微生物の増殖は、この薬剤単独を８μｇ／ｍｌ含むウェル中で阻害されるのとは対照的に、１μｇ／ｍｌのこの剤＋クラブラン酸を含むウェル中で阻害される。この特定の例は、３ウェル（これらのウェルのそれぞれの間で２倍希釈を有する）によるＭＩＣの低下と同等であり、ＭＩＣのこのタイプの低下により、その微生物をＥＳＢＬ陽性と判定することが許される。したがって、単独で試験した場合のそのＭＩＣに対した、クラブラン酸と組み合わせて試験した抗菌剤についてのＭＩＣにおける３以上の２倍濃度の低下は、ＥＳＢＬ陽性である微生物を示す（例えば、ＣＡＺ ＭＩＣ＝８μｇ／ｍｌ；ＣＣＺ（クラブラン酸＋セフタジジム（ＣＣＺ））ＭＩＣ＝１μｇ／ｍｌ）。表３中の２４の株のうち１１株が、ＣＬＳＩ標準に従ってＥＳＢＬ陽性である（表３、各アッセイについての列内を参照されたい。表中、ＥＳＢＬ陽性株を示す結果はアスタリスクで示す）。野生型の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＩＤ３００９６０もまたスクリーニングし、全てのリアルタイムアッセイについて陰性対照として使用した。
ＫＰＣリアルタイムＰＣＲアッセイ：総ＤＮＡを、材料および方法において概説した加熱溶菌プロトコルを使用して、表３に列挙した株から単離した。総ＤＮＡを、リアルタイムＰＣＲ分析の前に少なくとも１／２０希釈し、加熱溶菌したサンプル中に存在する任意の阻害タンパク質を徹底的に希釈した。ＤＮＡサンプルのアリコートを、各プライマー、二重標識化プローブおよびＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｆａｓｔ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を含むＰＣＲマスターミックス中に配置した。リアルタイムアッセイで使用したプライマーおよびプローブの配列は、表２に見出すことができる。サンプルを、２段階２ステップのＰＣＲプログラムを４０サイクルにわたり使用して、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（ＡＢＩ）７５００ Ｆａｓｔ Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）で実行した。全てのアッセイは２連で実行し、サンプルについてのサイクル閾値（ＣＴ）の値は、使用者が規定したベースラインおよびＣＴに従ってＡＢＩ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎソフトウェアｖ１．３．１（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を使用して計算した。ＣＴは、陽性対照についての曲線の線形期または対数期に設定した。分析のためのベースラインは、ＣＴを横切るサンプルが存在しなかった領域（３回目〜１２回目のサイクル）において設定した。陽性または陰性の判定についてＣＴ範囲を決定するために、陽性対照および陰性対照を分析した。表４中に見出される範囲（即ち、Ｍｉｎ ＣＴ Ｃａｌｌ（最低ＣＴ判定）またはＭａｘ ＣＴ Ｃａｌｌ（最大ＣＴ判定））は、平均ＣＴ（これは、全てのＫＰＣアッセイ（８７、２８９および７５８）を使用して陽性対照または陰性対照から計算した）から＋／−６標準偏差（ＳｔｄＤｅｖ）であると計算された。これらの陽性判定および陰性判定の範囲を、全ての株をスコアリングするために使用した。
表５は、試験した２４株全てについての判定を含む。これらの判定は、所与の株についての全てのＫＰＣアッセイにわたって計算した平均ＣＴ値を使用して成された。試験した２４株のうち合計１０株が陽性と判定された。表６において、平均（Ａｖｇ）内部ＣＴ（Ｉｎｔｒａ−ＣＴ）距離（最大陽性／陰性Ａｖｇ ＣＴ−最小陽性／陰性Ａｖｇ ＣＴ）、平均ＣＴ、および平均ＣＴ間（Ｉｎｔｅｒ−ＣＴ）距離（陽性Ａｖｇ ＣＴ−陰性Ａｖｇ ＣＴ）を、表５からの判定および平均（Ａｖｇ）ＣＴ値を使用して、全ての陽性株および陰性株について計算した。陽性株間でのＡｖｇ Ｉｎｔｒａ−ＣＴ距離は、互いの４．４ＣＴ以内であり、Ａｖｇ Ｉｎｔｅｒ−ＣＴ距離は、陰性対照よりも１４．４ＣＴ小さかった。これらの結果は、これらのアッセイが、陰性株から陽性株を桁違いに（正確には２14.4）識別することができることを示し、このアッセイは１００％の効率であったと推測される（Ｅ＝２、即ち、サイクル毎に２コピーが生成される）。アッセイの最適化の一部として、アッセイの効率は＞９８％であると決定されている。
既に注記したとおり、ＫＰＣ−３変異体を用いたアッセイの逆方向プライマーにおける１塩基対のミスマッチに起因した感度の低下は、ＫＰＣ−７５８アッセイでは存在しなかった。これは、ＫＰＣ−１株３０１９１６（Ａｖｇ ＣＴ＝１６．４）またはＫＰＣ−２株３０１９１７（Ａｖｇ ＣＴ＝１８．５）と比較して、配列確認されたＫＰＣ−３株３０１９１８についてのＡｖｇ ＣＴ（Ａｖｇ ＣＴ＝１６．２）を見て、表４中に見出すことができる。
リアルタイム（アッセイ）陽性株の配列決定：リアルタイムアッセイを検証するために、全ての陽性判定株の配列を確認した。標準的ＰＣＲを、ＫＰＣ遺伝子のオープンリーディングフレームまたはコード配列全体を増幅するプライマー（非特許文献１３および非特許文献１５）を使用して実施した。材料および方法に記載したように、ＰＣＲアンプリコン（増幅断片）を清浄化し、配列決定した。ＰＣＲアンプリコンの逆方向鎖を配列決定し、トリミング（調整）した。配列は、Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェアｖ５．１（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）におけるＫＢベース判定子（ｂａｓｅｃａｌｌｅｒ）によって評価した品質値に基づいてトリミングした。＞２０の品質値を有する塩基を、ＮＣＢＩデーターベース比較のために使用した。読み取りの平均長さは＞５００ｂｐであった。配列を、ＮＣＢＩからのＢＬＡＳＴアルゴリズムを使用して、ＧｅｎＢａｎｋ中の非重複配列に対して比較した。リアルタイムアッセイからの全ての陽性株由来の配列（Positives）は、＞９９％のカバー度および＞９９％の配列同一性で、利用可能なＧｅｎＢａｎｋ ＫＰＣ配列と一致し、任意の他の遺伝子に対しては有意な同一性を全く有さなかった。したがって、株のこの課題セットにおけるこれらのＫＰＣリアルタイムアッセイは、１６μｇ／ｍｌ以上のＩＰＭ耐性を用いたＣＬＳＩ標準培地微量希釈の５８．８％の感度（７つの偽陰性＝株ＩＤ３００９９６、３０１８８８、３０１８９２、３０１８９４、３０１９０５、３０１９１６、３０１９１７）および１００％の特異性の性能と比較して、１００％の感度および１００％の特異性で機能した（非特許文献１２）。
感度リアルタイムＰＣＲアッセイ：５倍ＤＮＡ希釈スキーム（２０ｎｇから２ｆｇ）を、陽性対照株（株ＩＤ３０１９１６）を使用して設定した。陰性ＣＴ閾値を、各実験内で陰性対照（株ＩＤ３００９６０）を使用して各アッセイについて確立した。９５％信頼区間（ＣＩ）を陰性ＣＴ閾値に適用した。ＣＩを計算するために、表４に列挙したヒストリカル標準偏差（ＳｔｄＤｅｖ）（０．９）を３倍し（０．９×３＝２．７即ち３ＣＴ）、その結果、サンプルを陰性と判定するためのＣＴ閾値は、３ＣＴ−最低の陰性対照ＣＴであると計算された。標準的ＰＣＲ反応およびプライマー（順方向＃５および逆方向＃１０）を、Ｙｉｇｉｔら、２００１およびＷｏｏｄｆｏｒｄら、２００４に従って使用した。標準的ＰＣＲ反応物をゲル電気泳動にかけ、エチジウムブロマイドおよびゲルドキュメンテーションシステム（Ｋｏｄａｋ １Ｄ ｖ３．６、Ｎｅｗ Ｈａｖｅｎ、ＣＴ．）を使用して可視化した。
直接的サンプルアッセイ：陽性（株ＩＤ３０１９１６）株および陰性（株ＩＤ３００９６０）株を、５％ヒツジ赤血球を含むＴＳＡプレート（ＢＤ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｓｐａｒｋｓ、ＭＤ．）上に画線（ストリーク）して広げ、３５℃で一晩増殖させた。各株の純粋なコロニーを、Ｔｒｙｐｔｉｃａｓｅ Ｓｏｙ Ｂｒｏｔｈ（ＴＳＢ）（ＢＤ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｓｐａｒｋｓ、ＭＤ．）中に配置し、比濁計（ｎｅｐｈｌｏｍｅｔｅｒ）（ＢＤ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｓｐａｒｋｓ、ＭＤ．）を使用して定量し、無菌尿中１．０Ｅ+06、１．０Ｅ+05、１．０Ｅ+04および１．０Ｅ+03ＣＦＵ／ｍｌに希釈した。細菌を遠心分離によって収集し、ＤＮＡ抽出方法論において記載したような標準的な加熱溶菌法を使用して、ＤＮＡを単離した。ＤＮＡを含む上清５マイクロリットルを、リアルタイムＰＣＲ反応および標準的ＰＣＲ反応において使用した。標準的ＰＣＲ反応およびプライマー（番号付けはＹｉｇｉｔらから取った。順方向＃５および逆方向＃１０）を、非特許文献１３および非特許文献１７に従って使用した。純粋な陽性コロニーおよび陰性コロニーを、５ｍｌの無菌血液を含むＢａｃｔｅｃ好気ビン中に接種し、Ｂａｃｔｅｃ機器（ＢＤ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｓｐａｒｋｓ、ＭＤ．）中に配置した。機器がビンを陽性と判定した場合、１００μｌのアリコートをビンから取り出し、１．５ｍｌのチューブ中に配置した。細菌を遠心分離によって収集し、ペレットを直接的に加熱溶菌すること、または８５％の食塩水１００μｌで２回洗浄して次いで加熱溶菌することの両方を行った。ＤＮＡを含む上清５マイクロリットルを、リアルタイムＰＣＲ反応および標準的ＰＣＲ反応において使用した。純粋なコロニーから単離した陽性（株ＩＤ３０１９１６）鋳型対照および陰性（株ＩＤ３００９６０）鋳型対照を用いて、全てのアッセイを実行し、ＰＣＲ反応が機能していることを確認した。ゲノムコピーまたはゲノム当量を計算するために使用した計算式は以下のとおりである［コピー数＝（量（ｎｇ）＊６．０２２×１０23）／（長さ＊１×１０9＊６５０）］。株ＩＤ３０１９１９の肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の概算されたゲノムサイズまたは長さは、２，９００，０００ｂｐである。
結果
ＫＰＣリアルタイムＰＣＲ感度アッセイ：公知のアッセイと比較した本明細書中に記載するリアルタイムアッセイの感度を決定するために、感度アッセイ比較を設定した。これらの実験を設定するために、材料および方法において既に概説した加熱溶菌プロトコルを使用して、ＫＰＣ陽性（株ＩＤ３０１９１６）株および陰性（株ＩＤ３００９６０）株由来の純粋なコロニーから全核酸を単離した。核酸を、ＴＥ緩衝液中１００ｎｇ／μｌに標準化し、次いで２０ｎｇから２ｆｇの範囲に連続希釈（５倍希釈スキーム）した。核酸サンプルの５μｌアリコートを、リアルタイムＰＣＲアッセイ（ＫＰＣ−８７およびＫＰＣ−７５８）および標準的（Ｓｔｄ）ＰＣＲアッセイ（プライマーは非特許文献１３から）中に配置した。全てのＰＣＲアッセイを３連（トリプリケート）で実行した。リアルタイムアッセイを、２段階２ステップのＰＣＲプログラムを４０サイクルにわたって使用して、ＡＢＩ ７５００ Ｆａｓｔ Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ．）で実行した。標準的ＰＣＲ反応は、非特許文献１３中に概説されたＰＣＲプログラムを使用して、ＡＢＩ ２７２０ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ．）で実行した。標準的ＰＣＲ反応物をゲル電気泳動にかけ、エチジウムブロマイドおよびゲルドキュメンテーションシステム（Ｋｏｄａｋ １Ｄ ｖ３．６、Ｎｅｗ Ｈａｖｅｎ、ＣＴ．）を使用して可視化した（図１）。リアルタイムＰＣＲアッセイについてのサイクル閾値（ＣＴ）の値を、使用者が規定したベースラインおよびＣＴに従ってＡＢＩ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎソフトウェアｖ１．３．１（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ．）を使用して計算した。ＣＴを、陽性対照についての曲線の対数期に設定した。分析のためのベースラインを、ＣＴを横切るサンプルが存在しなかった領域（３回目〜１２回目のサイクル）において設定した。陰性判定についてのＣＴ範囲を決定するために、陰性対照をこの実験内で分析した。陰性ＣＴ閾値は、この実験において同時に実行した陰性対照のみに基づいて、表４中に見出されるヒストリカル陰性ＣＴ閾値には基づかずに設定した。このストラテジーの背後にある論拠は、これらの実験で使用した試薬（例えば、市販のマスターミックス）がこれらのプライマープローブアッセイのために特異的に最適化されておらず、陰性対照の成績がこれらの試薬に基づいて変動してもよいということである。この陰性対照の変動は、これらのアッセイの感度を決定することに対して有意な影響を与えることができる。陰性対照閾値についての９５％信頼区間（ＣＩ）を設定するために、表４に列挙したヒストリカル標準偏差（ＳｔｄＤｅｖ）（０．９）を３倍し（０．９×３＝２．７即ち３ＣＴ）、その結果、サンプルを陰性と判定するＣＴ閾値は、３ＣＴ−最低の陰性対照ＣＴであると計算された。
ＫＰＣリアルタイムＰＣＲ感度アッセイ：公知のアッセイと比較した本明細書中に記載するリアルタイムアッセイの感度を決定するために、感度アッセイ比較を設定した。これらの実験を設定するために、材料および方法において既に概説した加熱溶菌プロトコルを使用して、ＫＰＣ陽性（株ＩＤ３０１９１６）株および陰性（株ＩＤ３００９６０）株由来の純粋なコロニーから全核酸を単離した。核酸を、ＴＥ緩衝液中１００ｎｇ／μｌに標準化し、次いで２０ｎｇから２ｆｇの範囲に連続希釈（５倍希釈スキーム）した。核酸サンプルの５μｌアリコートを、リアルタイムＰＣＲアッセイ（ＫＰＣ−８７およびＫＰＣ−７５８）および標準的（Ｓｔｄ）ＰＣＲアッセイ（プライマーは非特許文献１３から）中に配置した。全てのＰＣＲアッセイを３連（トリプリケート）で実行した。リアルタイムアッセイを、２段階２ステップのＰＣＲプログラムを４０サイクルにわたって使用して、ＡＢＩ ７５００ Ｆａｓｔ Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ．）で実行した。標準的ＰＣＲ反応は、非特許文献１３中に概説されたＰＣＲプログラムを使用して、ＡＢＩ ２７２０ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ．）で実行した。標準的ＰＣＲ反応物をゲル電気泳動にかけ、エチジウムブロマイドおよびゲルドキュメンテーションシステム（Ｋｏｄａｋ １Ｄ ｖ３．６、Ｎｅｗ Ｈａｖｅｎ、ＣＴ．）を使用して可視化した（図１）。リアルタイムＰＣＲアッセイについてのサイクル閾値（ＣＴ）の値を、使用者が規定したベースラインおよびＣＴに従ってＡＢＩ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎソフトウェアｖ１．３．１（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ．）を使用して計算した。ＣＴを、陽性対照についての曲線の対数期に設定した。分析のためのベースラインを、ＣＴを横切るサンプルが存在しなかった領域（３回目〜１２回目のサイクル）において設定した。陰性判定についてのＣＴ範囲を決定するために、陰性対照をこの実験内で分析した。陰性ＣＴ閾値は、この実験において同時に実行した陰性対照のみに基づいて、表４中に見出されるヒストリカル陰性ＣＴ閾値には基づかずに設定した。このストラテジーの背後にある論拠は、これらの実験で使用した試薬（例えば、市販のマスターミックス）がこれらのプライマープローブアッセイのために特異的に最適化されておらず、陰性対照の成績がこれらの試薬に基づいて変動してもよいということである。この陰性対照の変動は、これらのアッセイの感度を決定することに対して有意な影響を与えることができる。陰性対照閾値についての９５％信頼区間（ＣＩ）を設定するために、表４に列挙したヒストリカル標準偏差（ＳｔｄＤｅｖ）（０．９）を３倍し（０．９×３＝２．７即ち３ＣＴ）、その結果、サンプルを陰性と判定するＣＴ閾値は、３ＣＴ−最低の陰性対照ＣＴであると計算された。
表７に列挙した各リアルタイムアッセイについての最低の陰性対照ＣＴ値−３ＣＴ（ＣＩ）を用いて、陰性ＣＴ閾値を、該実験における各アッセイについて計算した。この計算式に基づくと、ＫＰＣ−８７についての陰性ＣＴ閾値は＞３５ＣＴであり、ＫＰＣ−７５８については＞３０ＣＴであった。したがって、ＫＰＣ−８７アッセイおよびＫＰＣ−７５８アッセイの両方についての信頼性のある感度は、陽性ＫＰＣ株由来の１．３Ｅ-03ｎｇ即ち１．３ｐｇの核酸濃度であった。この値をゲノムコピーまたはゲノム当量に換算するために、核酸投入が全てゲノムＤＮＡであると仮定し、次いで、上記の材料および方法のセクションに見出される計算式を使用しなければならない。この計算式を使用して、本発明者らの計算によれば、リアルタイムアッセイは、４２ゲノム当量を信頼性よく検出できる。リアルタイムアッセイと比較して、Ｓｔｄ（標準）ＰＣＲアッセイは、陽性ＫＰＣ株由来の３．２Ｅ-02ｎｇ即ち３２ｐｇの核酸濃度で、３つの複製の全てにおいて信頼性よくバンドを検出する能力を有していた。本発明者らの計算によれば、Ｓｔｄ ＰＣＲアッセイは、１，０００ゲノム当量を信頼性よく検出できる。したがって、本明細書中に記載するリアルタイムアッセイの感度は、非特許文献１３および非特許文献１７に記載されたＳｔｄ ＰＣＲアッセイよりも、少なくとも１桁高感度である。
直接的サンプルの分析：リアルタイムアッセイ（ＫＰＣ−８７およびＫＰＣ−７５８）が一次即ち直接的サンプル（血液および尿）中のＫＰＣを検出する能力を決定し、この能力をＳｔｄ ＰＣＲアッセイと比較するために、直接的サンプル比較アッセイを実施した。直接的尿サンプル実験を設定するために、各株（３０１９１６および３００９６０）の純粋なコロニーを、Ｔｒｙｐｔｉｃａｓｅ Ｓｏｙ Ｂｒｏｔｈ（ＴＳＢ）（ＢＤ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｓｐａｒｋｓ、ＭＤ．）中に配置し、比濁計（ＢＤ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｓｐａｒｋｓ、ＭＤ．）を使用して定量し、引き続いて無菌尿中１．０Ｅ+06、１．０Ｅ+05、１．０Ｅ+04および１．０Ｅ+03ＣＦＵ／ｍｌに希釈した。細菌を遠心分離によって収集し、ＤＮＡ抽出方法論において記載したような標準的な加熱溶菌法を使用して、ＤＮＡを単離した。核酸サンプルの５μｌアリコートを、リアルタイムＰＣＲアッセイ（ＫＰＣ−８７およびＫＰＣ−７５８）および標準的（Ｓｔｄ）ＰＣＲアッセイ（プライマーは非特許文献１３から）中に配置した。全てのＰＣＲアッセイを３連で実施した。既に記載したように、リアルタイムアッセイおよび標準的ＰＣＲ反応を実行し、分析した。表８に列挙した陰性対照ＣＴ値に基づいて、各アッセイについての最低の陰性ＣＴ値−３ＣＴ（ＣＩ）を使用して、各アッセイについて陰性ＣＴ閾値を確立した。これらの基準に基づいて、ＫＰＣ−８７およびＫＰＣ−７５８の両方についての陰性ＣＴ閾値は＞３５ＣＴである。ＫＰＣ−８７がＣＴを有さなかったという事実に起因して、ＫＰＣ−７５８アッセイについての最低のＣＴを、この実験のために陰性対照についての保存的値として使用した。したがって、ＫＰＣ−８７についての信頼性のある陽性ＣＴ判定即ち検出限界は＜３３ＣＴであり、ＫＰＣ−７５８については＜３２ＣＴであった。これは、尿サンプルにおける１．０Ｅ+04ＣＦＵ／ｍｌの信頼性ある検出レベルに換算される。尿路感染症（ＵＴＩ）に関連する平均生物負荷（バイオバーデン）が１．０Ｅ+05ＣＦＵ／ｍｌであるという事実に起因して、このレベルは非常に重要である。さらなる最適化のために、感度をさらにより低くすることも可能であり得る。これらの尿サンプルから抽出した同じ核酸を、Ｓｔｄ ＰＣＲプライマーを使用しても分析した。陽性鋳型対照（ＰＴＣ）以外は、バンドを生じたサンプルは存在しなかった。したがって、非特許文献１３および非特許文献１７の両方に記載されたＳｔｄ ＰＣＲアッセイは、直接的尿サンプルにおいては機能できない。ＰＣＲ反応が機能していることを確認するために、純粋なコロニーから単離された陽性（株ＩＤ３０１９１６）鋳型対照および陰性（株ＩＤ３００９６０）鋳型対照を、全てのアッセイにおいて実行した。
直接的血液サンプル実験を設定するために、各株（株３０１９１６および株３００９６０）の純粋なコロニーを、５ｍｌの無菌血液を含むＢａｃｔｅｃ好気プラスビン中に接種し、Ｂａｃｔｅｃ機器（ＢＤ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｓｐａｒｋｓ、ＭＤ．）中に配置した。機器がビンを陽性と判定した場合、１００μｌのアリコートをビンから取り出し、１．５ｍｌのチューブ中に配置した。細菌を遠心分離によって収集し、ペレットを直接的に加熱溶菌するか、または洗浄し次いで加熱溶菌することのいずれかを行った。核酸サンプルの５μｌアリコートを、リアルタイムＰＣＲアッセイ（ＫＰＣ−８７およびＫＰＣ−７５８）およびＳｔｄ ＰＣＲアッセイ（非特許文献１３）中に配置した。全てのＰＣＲアッセイを３連で実施した。既に記載したように、リアルタイムアッセイおよび標準的ＰＣＲ反応を実行し、分析した。ＫＰＣ−８７およびＫＰＣ−７５８の両方について、計算された陰性ＣＴ閾値は＞３３ＣＴであった。したがって、ＫＰＣ−８７についての信頼性のある陽性ＣＴ判定即ち検出限界は＜３０であり、ＫＰＣ−７５８については＜２８ＣＴであった。表７中の検量線情報を使用すると、血液におけるこれらの両方のアッセイについての検出レベルは、約６．４ｐｇ即ち２，０００ゲノム当量であった。血液を陽性のＢａｃｔｅｃビン１／１００（１００μｌサンプル（１／１０）、合計５０μｌのうち５μｌ（１／１０）を分析した）から希釈したことを考慮すると、陽性Ｂａｃｔｅｃビン中の最初のＣＦＵ／ｍｌは２．０Ｅ+05ＣＦＵ／ｍｌであった。肺炎桿菌属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）菌種を含む陽性Ｂａｃｔｅｃビンについての平均ＣＦＵ／ｍｌが１．０Ｅ+05ＣＦＵ／ｍｌから１．０Ｅ+06ＣＦＵ／ｍｌの間であろうという理論に起因して、この結果は非常に重要である。
図２中に見出されるように、Ｓｔｄ ＰＣＲプライマーは、陽性鋳型対照（ＰＴＣ）以外では、眼に見えるバンドを生じなかった。したがって、非特許文献１３およびＷｏｏｄｆｏｒｄら、２００４の両方に記載されたＳｔｄ ＰＣＲアッセイは、陽性血液培養サンプルにおいては機能しない。ＰＣＲ反応が機能していることを確認するために、純粋なコロニーから単離した陽性（株ＩＤ３０１９１６）鋳型対照および陰性（株ＩＤ３００９６０）鋳型対照を、全てのアッセイにおいて実行した。
参考文献
非特許文献１１
非特許文献１２
非特許文献１３
非特許文献１４
非特許文献１５
非特許文献１６
非特許文献１７
非特許文献１１
非特許文献１２
非特許文献１３
非特許文献１４
非特許文献１５
非特許文献１６
非特許文献１７
本明細書中で言及した全ての刊行物および特許出願は、本発明が関連する分野の当業者の水準を示すものである。全ての刊行物および特許出願は、各個々の刊行物または特許出願が参照により組み込まれると具体的かつ個々に示されたのと同じ程度まで、参照によって本明細書中に組み込まれる。
上記発明を、理解を明確にする目的のための例証および実例として幾分詳細に記載してきたが、特定の変化および改変が添付の特許請求の範囲内で実施できることは、明らかであろう。
Claims (10)
- ｉ）配列番号１を含む第１のオリゴヌクレオチドプライマー、配列番号２を含む第２のオリゴヌクレオチドプライマー、および配列番号３のプローブ、
ｉｉ）配列番号４を含む第１のオリゴヌクレオチドプライマー、配列番号５を含む第２のオリゴヌクレオチドプライマー、および配列番号６のプローブ、
ｉｉｉ）配列番号７を含む第１のオリゴヌクレオチドプライマー、配列番号８を含む第２のオリゴヌクレオチドプライマー、および配列番号９のプローブ、
に示される群から選択されることを特徴とする、
配列番号１０〜１３のいずれか１つに示されるカルバペネマーゼ遺伝子を含む細菌を同定するための単離された核酸分子。 - 配列番号１０〜１３のいずれか１つに示されるカルバペネマーゼ遺伝子をあらわすヌクレオチド配列中に存在する標的核酸領域のポリメラーゼベースの増幅を使用して、サンプル中のカルバペネム耐性を有する細菌の存在を検出するための方法であって、
ａ）前記カルバペネム耐性細菌を含む疑いがある試験サンプルを提供するステップと、
ｂ）標的核酸領域を含むポリメラーゼベースの核酸増幅産物を提供するのに充分な条件下で、少なくとも第１、第２のオリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブと前記サンプルを接触させるステップであり、
少なくとも第１、第２のオリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブが、
ｉ）配列番号１を含む第１のオリゴヌクレオチドプライマー、配列番号２を含む第２のオリゴヌクレオチドプライマー、および配列番号３のプローブ、
ｉｉ）配列番号４を含む第１のオリゴヌクレオチドプライマー、および配列番号５を含む第２のオリゴヌクレオチドプライマー、および配列番号６のプローブ、
ｉｉｉ）配列番号７を含む第１のオリゴヌクレオチドプライマー、配列番号８を含む第２のオリゴヌクレオチドプライマー、および配列番号９のプローブ、
ｃ）増幅された産物を検出するステップと、
を含むことを特徴とする方法。 - サンプルは、細菌の単離も培養もせずに直接的にＰＣＲでスクリーニングされるサンプルであることを特徴とする請求項２に記載の方法。
- ポリメラーゼベースの核酸増幅がリアルタイム定量増幅であることを特徴とする請求項２に記載の方法。
- 患者由来のサンプル中の配列番号１０〜１３のいずれか１つに示されるカルバペネマーゼ遺伝子を含む細菌の存在を検出するための方法であって、
（ａ）患者由来のサンプルを提供するステップと、
（ｂ）サンプルから核酸を単離および精製するステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）の核酸の少なくとも一部、ヌクレオシド三リン酸モノマーの混合物、緩衝化溶液中の酵素Ｔａｑポリメラーゼ、および
ｉ）配列番号１を含む第１のオリゴヌクレオチドプライマー、配列番号２を含む第２のオリゴヌクレオチドプライマー、および配列番号３のプローブ、
ｉｉ）配列番号４を含む第１のオリゴヌクレオチドプライマー、および配列番号５を含む第２のオリゴヌクレオチドプライマー、および配列番号６のプローブ、
ｉｉｉ）配列番号７を含む第１のオリゴヌクレオチドプライマー、配列番号８を含む第２のオリゴヌクレオチドプライマー、および配列番号９のプローブ、
（ｄ）ＰＣＲ反応溶液に対してポリメラーゼ連鎖反応を実施して、カルバペネマーゼをコードするいずれかのヌクレオチド配列を増幅するステップと、
（ｅ）ポリメラーゼ連鎖反応で得られた核酸を、カルバペネマーゼＰＣＲ産物の存在について分析するステップであり、前記サンプル中の前記産物の存在が、前記サンプル中の前記細菌の存在を表すステップと、
を含むことを特徴とする方法。 - ポリメラーゼ連鎖反応が定量ＰＣＲであることを特徴とする請求項５に記載の方法。
- ｉ）配列番号１を含む第１のオリゴヌクレオチドプライマー、配列番号２を含む第２のオリゴヌクレオチドプライマー、および配列番号３のプローブ、
ｉｉ）配列番号４を含む第１のオリゴヌクレオチドプライマー、および配列番号５を含む第２のオリゴヌクレオチドプライマー、および配列番号６のプローブ、
ｉｉｉ）配列番号７を含む第１のオリゴヌクレオチドプライマー、配列番号８を含む第２のオリゴヌクレオチドプライマー、および配列番号９のプローブ、
からなる群から選択されるプライマーセットを使用したＰＣＲによって、配列番号１０〜１３のいずれか１つに示されるカルバペネマーゼ遺伝子の存在について患者から取り出されたサンプルを試験するステップと、を含む、
配列番号１０〜１３のいずれか１つに示されるカルバペネマーゼ遺伝子の存在について患者から取り出されたサンプルを試験する方法。 - サンプルは、細菌の単離も培養もせずに直接的に前記ＰＣＲでスクリーニングされるサンプルであることを特徴とする請求項７に記載の方法。
- 前記ＰＣＲが定量ＰＣＲであることを特徴とする請求項７に記載の方法。
- ａ）配列番号１を含む第１のオリゴヌクレオチドプライマー、配列番号２を含む第２のオリゴヌクレオチドプライマー、および配列番号３のプローブ、
ｂ）配列番号４を含む第１のオリゴヌクレオチドプライマー、および配列番号５を含む第２のオリゴヌクレオチドプライマー、および配列番号６のプローブ、
ｃ）配列番号７を含む第１のオリゴヌクレオチドプライマー、配列番号８を含む第２のオリゴヌクレオチドプライマー、および配列番号９のプローブ、
からなる群から選択されるプライマーセットを含むことを特徴とする、配列番号１０〜１３のいずれか１つに示されるカルバペネマーゼ遺伝子を有するカルバペネム耐性細菌株の検出のためのキット。
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