CN103088144A

CN103088144A - 一种肺炎克雷伯菌kpc型碳青霉烯酶基因核酸检测试剂盒

Info

Publication number: CN103088144A
Application number: CN2013100351249A
Authority: CN
Inventors: 王升启; 陈苏红; 吕虹; 刘志红; 孙晓彦; 刘琦琪
Original assignee: Institute of Radiation Medicine of CAMMS
Current assignee: Institute of Radiation Medicine of CAMMS
Priority date: 2013-01-30
Filing date: 2013-01-30
Publication date: 2013-05-08

Abstract

本发明涉及blaKPC基因检测试剂盒，特别是涉及一种利用复合探针技术实时荧光PCR技术检测肺炎克雷伯菌KPC型碳青霉烯酶(blaKPC)基因的试剂盒。该试剂盒通过对样本中的blaKPC基因进行定性检测，可广泛应用于含blaKPC基因细菌感染的辅助诊断。

Description

一种肺炎克雷伯菌KPC型碳青霉烯酶基因核酸检测试剂盒

技术领域

本发明涉及blaKPC基因检测试剂盒，特别是涉及一种利用复合探针技术实时荧光PCR技术检测肺炎克雷伯菌KPC型碳青霉烯酶基因(blaKPC基因)的试剂盒。该试剂盒通过对样本中的blaKPC基因进行定性检测，可广泛应用于含blaKPC基因细菌感染的辅助诊断。

背景技术

肺炎克雷伯菌是引起医院感染和社区感染的条件致病菌之一。碳青霉烯类抗菌药物是治疗包括产超广谱内酰胺酶(ESBLs)在内的肺炎克雷伯菌所致严重感染的强有力武器。但是，随着碳青霉烯类抗菌药物在临床上的大量使用，出现了不同的耐药菌株如铜绿假单胞菌和不动杆菌属细菌。2001年，自Yig it等在肺炎克雷伯菌中发现了一种新型的非金属碳青霉烯酶并命名为KPC(Klebsiella pneumoniae carbapenemase，KPC)以来，仅仅几年时间，KPC酶已在美国，特别是在美国的东北部各州蔓延，在局部造成暴发和流行，而且在肠杆菌的多个菌属中都有报道，包括肺炎克雷伯菌、阴沟肠杆菌、大肠埃希菌、产酸克雷伯菌、沙门菌，主要为质粒介导；目前，产KPC的在菌株中国、以色列、希腊、哥伦比亚、巴西、英国、挪威及瑞典等国家均已发现。[Yigit H，Queenan AM，Anders on GJ，e t al.Novelcarbapenem-hydrolyzing beta-lactamase，KPC-1，from a carbapenem-resistant strain of Klebsiellapneumoniae.Antimicrob Agents Chemother，2001，45(4)：1151-1161；Mendes RE，Bell JM，Turnidge JD，et al.Carbapenem-resistant isolates of Klebsiella pneumoniae in China and detection ofa conjugative plasmid(blaKPC-2plus qnrB4)and a blaIMP-4gene.Antimicrob Agents Chemother，2008，52(2)：798-799；Samuelsen，Naseer U，Tofteland S，et al.Emergence of clonally relatedKlebsiella pneumoniae isolates of sequence type258producing plasmid-mediated KPCcarbapenemase in Norway and Sweden.J Antimicrob Chemother，2009，63(4)：654-658]。

目前认为KPC型碳青霉烯酶基因是引起肠杆菌科细菌对碳青霉烯类抗生素耐药的主要原因，KPC型碳青霉烯酶是一种丝氨酸β-内酰胺酶，几乎能水解所有β-内酰胺类抗生素，包括头孢菌素类、青霉素类、碳青霉烯类，KPC酶基因位于可移动的质粒上，可以通过质粒或插入序列进行水平传播。目前所报道的KPC酶分为1～4型，其中KPC1位于一个非接合性质粒上，KPC2、3都位于接合性质粒上。对目前所报道的相关文献进行统计和分类发现，世界各地与中国地区均以KPC2型报道较多。Naas等报道在产KPC酶的肺炎克雷伯菌中，KPC酶基因位于Tn4401转座子上，左右各有一个插入序列，KPC编码基因很可能依靠两边的插入序列随着转座子在不同的菌种中快速传播。[Bratu S，Landam D，Haag R，et al.Rapid spread ofcarbapenem-resistant Klebsiella pneum oniae in New York City：a new threat to our antibioticarmamentarium.Arch Intern Med，2005，165：1430-1435；Smith Moland E，Hanson ND，HerreraVL，et al.Plasmid-mediated carbapenem-hydrolyzingβ-lactamase，KPC-2，in Klebsiellapneumoniae isolates.J Antimicrob Chemother，2003，51(3)：711-714；Naas T， Nordnann D，Vedel G，et al.Plasmid-mediated carbapenem-hydrolyzingβ-lactamase KPC in a Klebsiella pneumoniaeisolate from France.Antimicrob Agents Chemother，2005，49(10)：4423-4424]。

临床微生物实验室对产KPC酶菌株的检测较为困难，主要原因包括：1)产KPC-2型碳青霉烯酶的菌株既可表现为对碳青霉烯类抗生素耐药，也可表现为低敏感性；2)存在接种效应，会出现假敏现象；3)产KPC酶的菌株用ESBLs确证试验检测可能为阳性，容易造成误判；4)产KPC酶的菌株往往同时产其它β-内酰胺酶，产生多重耐药，容易导致误检。现将目前临床上检测KPC酶肺炎克雷伯菌的主要方法分述如下：

1.通过液体培养基和纸片扩散法检测抗菌素敏感性，这类方法由于β-内酰胺类抗生素抗性的异质表达而容易产生假敏现象。

2.琼脂扩散法：在检测KPC酶介导的耐药性时，厄他培南比单独的美罗培南、亚安培南敏感性更强，因此似乎厄他培南是检测产KPC肠杆菌属的最佳分子；然而，由于厄他培南抗性本身并不是KPC表达的标志物，因为其他因素如ESBL和AmpC也会引起厄他培南抗性，因此这类方法也有很大的局限性。

3.分子诊断方法：通过分子诊断方法检测产KPC菌株正逐渐成为金标准。其中，实时荧光PCR法则是公认的检测细菌最准确、最快捷的方法。目前也有数种基于PCR末端和实时检测技术被用于产KPC菌株的检测，这些技术具有更高的特异性，但需要专业的技术人员和设备才能实施，检测成本相对也较高。

本试验以blaKPC基因为靶序列，应用复合探针法建立了一种特异、灵敏、快速检测产KPC酶细菌的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种实时荧光PCR法检测blaKPC基因的试剂盒(下面简称试剂盒)，该试剂盒包括：(1)样本处理液、PCR反应液A、PCR反应液B、阴性对照、强阳对照、临界阳性对照各内标。(2)分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒。

为了解决上述任务，本发明的具体技术路线为：

(1)针对blaKPC基因保守序列设计的能够与靶多核苷酸结合的寡核苷酸引物和寡核苷酸探针。

(2)寡核苷酸探针标记荧光发生基团，使所说的荧光发生基团与被扩增的靶多聚核苷酸间接结合。

(3)适宜于PCR扩增的反应体系和荧光检测体系。核酸扩增反应体系包括耐热DNA聚合酶、2’-脱氧核苷三磷酸、能够与双链靶多聚核苷酸的第一条链结合的正向引物、能够与双链靶多聚核苷酸的第二条链结合的反向引物、能够与靶多聚核苷酸结合并且两末端分别结合有荧光发生基团和荧光淬灭基团的寡核苷酸探针、含有镁离子和甲酰胺的缓冲液。

(4)从待测样本中提取DNA，加入前述的反应体系中，直接经PCR扩增，从荧光扩增曲线判断是否存在blaKPC基因。

根据本发明一个优选的实施方案，其中试剂盒的PCR反应液由2×PCR缓冲液、靶基因及内标正向引物、反向引物、寡核苷酸探针、灭菌水、内标组成，其特征在于用于靶多核苷酸扩增的正向和反向引物分别是5’-CTGGGCAGTCGGAGACAAAA-3’和5’-AGACGGCCAACACAATAGGT-3’，内标正向和反向引物分别是5’-ACCCTATTTTCATTCTTCGCC-3’和5’-GGTATCCAGATCCACAACCTT-3’；用于靶多核苷酸扩增和监测体系的寡核苷酸探针是f：FAM-CAAATGACTATGCCGTCGTCTGGCC-P，q：ACGACGGCATAGTCATTT-dabcyl，内标探针是5’-HEX-CGCTTCCATCTTCCAGGGATACGACA-TAMRA-3’；PCR反应酶系包含Taq酶和UNG酶。

根据本发明另一个优选的实施方案，阴性质控品为灭菌水；阳性质控品和内标质控品为通过体外重组将目的片段基因导入T载体，构建并提取重组质粒DNA，用TE液稀释-20C保存。用于实际检测中的质量控制。

根据本发明提供的试剂盒，对blaKPC基因进行检测，该方法包括下列步骤：

(1)用样本处理液进行阴、阳性质控品和待测样本的DNA提取。样本处理液除本发明提及的方法外，还可以使用其它成熟的DNA提取方法和试剂盒。

(2)将提取的DNA加入到含有PCR反应液和PCR反应酶系的PCR反应管中，进行PCR扩增，使用荧光定量PCR检测仪进行检测。

本发明所述的试剂盒针对blaKPC基因检测中的特殊性，对反应体系中引物探针浓度、Mg²⁺浓度、甲酰胺浓度，退火温度等均进行优化，结合荧光PCR技术，用于blaKPC基因的核酸检测，并研制出用于blaKPC基因核酸检测试剂盒，灵敏度可达到10²拷贝/ml。

本发明与现有技术相比，具有下列优点：

(1)采用的复合探针技术为国内唯一实时荧光PCR技术(专利号：ZL99125469.4，相关论文发表于Anal Biochem，2002，309：206-211)，是具有自主知识产权产品。特异性更强，灵敏度更高；

(2)全封闭反应，提取病毒DNA后，直接用于PCR检测，避免了污染发生；

(3)检测速度快，整个过程不超过2小时；

(4)操作简单，可控性强，可进行大批量样品检测，有利于产业化；

(5)PCR反应体系中加有内标，具有防止假阴性等优点。

附图说明

图1显示试剂盒检测blaKPC基因核酸的条件设置。

图2显示试剂盒检测blaKPC基因核酸时不同浓度样本的扩增曲线，十个阳性标本的扩增曲线为S形，均能够判定为阳性。

图3显示试剂盒十个阴性标本的扩增曲线，均不具S形特征，能够判定为阴性。

图4显示强阳性对照和临界阳性对照的扩增曲线。图示扩增曲线为S型曲线，说明检测体系有效扩增了blaKPC基因核酸。

图5显示阴性质控品扩增曲线。图示扩增曲线为较平直的折线，与荧光检测阈值线没有交点，且曲线不呈S型，说明检测过程中没有轮状病毒核酸的污染。

图6显示内标扩增曲线。图示内标扩增曲线为S形，说明检测体系扩增效率好。

具体实施方式

下列实施例旨在举例说明而不是限制本发明。

blaKPC基因核酸检测试剂盒检测方法

1.样品的采集

a)血液-采集5-10ml全血，置于EDTA抗凝的采集管中，密闭送检。

b)痰液-清水反复漱口后用力咳痰，从呼吸道深部咳出新鲜痰液于无菌容器密闭送检。

c)尿液-尿液常规检验需收集晨尿，女性采样前应先用肥皂水或0.1％高锰酸钾溶液冲洗外弃阴部。去前后1/3留取中段尿液约5～10ml于无菌容器密闭送检。

d)脓液和创口分泌物-无菌生理盐水擦洗病灶表面后用棉拭取病灶深部的脓液和分泌物于无菌容器密闭送检。未破溃的脓肿宜消毒皮肤后，以无菌注射器抽取脓液于无菌容器密闭送检。

2.核酸提取

2.1增菌液的处理

a)配制样本处理液：取内标加入到样品处理液中，加入比例为1∶49，按需加入，振荡混匀。

b)取50μl增菌液转移至0.5ml离心管中，加入50μl样品处理液充分混匀，100℃保温10分钟，误差不超过1分钟；4℃放置10分钟；

c)12,000rpm离心5分钟，备用。

2.2.血液标本的处理

d)配制样本处理液：取内标加入到样品处理液中，加入比例为1∶49，按需加入，振荡混匀。

a)直接用淋巴细胞分离液分离沉淀白细胞；

b)去上清，沉淀中加入50μl样品处理液充分混匀，100℃保温10分钟，误差不超过1分钟；4℃放置10分钟；

c)12,000rpm离心5分钟，备用。

2.3.其他标本的处理

b)向标本管中加入适量(1ml左右)无菌生理盐水浸泡，然后剧烈振荡搅拌使其充分混匀，自然沉淀除去粗大颗粒物质后，吸取上清转移至1.5ml离心管中，12,000rpm离心10分钟；

c)去上清，沉淀中加入50μl样品处理液充分混匀，100℃保温10分钟，误差不超过1分钟；4℃放置10分钟；

d)12,000rpm离心5分钟，备用。

3.PCR检测

3.1配制体系

a)取一支0.5ml离心管，按下列组成配制PCR反应液(N为反应管数)：

PCR反应液A27μl×(N+1)

PCR反应液B0.4μl×(N+1)

按27.4μl/管分装至PCR反应管中。

(注意：使用前确保PCR反应液充分溶解，PCR反应液B在使用前需离心以确保所有酶集中在底部)

b)加样

将3μl处理过的样本上清液分别加入PCR反应管中盖紧管盖，6000rpm离心1min后放入PCR扩增仪。

扩增程序设置

Bio-Rad、ABI7300/7500PCR扩增仪的参数设置如下

仪器检测通道选择：FAM为KPC扩增信号，HEX为内标扩增信号。

Roche LightCycler2.0PCR扩增仪的参数设置如下

荧光通道选择：530为KPC扩增信号，560为内标扩增信号。

4.结果分析

反应结束后，根据各类仪器的软件进行分析，调节噪声容限至基线噪声以上，阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照曲线(无规则的噪音线)的最高点为准。基线选取6～10或6～15个循环区域。尽量使阴性对照Ct值不出现任何数值。

5.结果判定

如果样本扩增无S型曲线，同时内标结果为阳性，则判定该样品为阴性；

如果样本扩增曲线呈明显S型，则判定为阳性样品。在此基础上，如果Ct值大于20，则判定样品为一般阳性，标记为“+”；若Ct值小于等于20，则判定为强阳性，标记为“++”。

blaKPC基因核酸检测试剂盒中质控品的使用

blaKPC基因核酸检测试剂盒中质控品包括强阳性对照、临界阳性对照、阴性质控品和内标，用于临床试验中质量控制，操作方法同待检样本。

质控标准

阴性对照结果为阴性，Ct值为0或空白，同时内标结果为阳性；

强阳性对照结果为阳性，Ct值＜20；

临界阳性对照结果为阳性，Ct值＜37；

阴性对照、阳性对照、内标结果需在同一次实验中同时满足，否则本次实验无效，全部实验应重新进行。

Claims

1.一种实时荧光PCR法检测肺炎克雷伯菌KPC型碳青霉烯酶(blaKPC)基因的试剂盒(下面简称试剂盒)，该试剂盒包括：(1)样本处理液、PCR反应液A、PCR反应液B、阴性对照、强阳性对照、临界阳性对照和内标；(2)分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒。其中试剂盒的PCR反应液由2×PCR缓冲液、靶基因和内标的正向引物、反向引物、寡核苷酸探针和灭菌水组成，其特征在于用于靶多核苷酸扩增的正向和反向引物分别是5’-CTGGGCAGTCGGAGACAAAA-3’和5’-AGACGGCCAACACAATAGGT-3’监测体系的内标引物分别是5’-ACCCTATTTTCATTCTTCGCC-3’和5’-GGTATCCAGATCCACAACCTT-3’。

2.根据权利要求1的试剂盒，其特征还在于用于靶多核苷酸扩增的寡核苷酸探针是5’-FAM-CAAATGACTATGCCGTCGTCTGGCC-P-3’和5’-ACGACGGCATAGTCATTT-dabcyl-3’，监测体系的内标探针是5’-HEX-CGCTTCCATCTTCCAGGGATACGACA-TAMRA-3’。

3.根据权利要求1的试剂盒，其特征还在于PCR反应酶系包含Taq酶和UNG酶。

4.根据权利要求1的试剂盒，其特征还在于阴性质控品为灭菌水；阳性质控品和内标质控品为通过体外重组将目的片段基因导入pGEM-T载体，构建并提取重组质粒DNA。