CN101680034A - 用于鉴定碳青霉烯酶基因的组合物和方法 - Google Patents

用于鉴定碳青霉烯酶基因的组合物和方法 Download PDF

Info

Publication number
CN101680034A
CN101680034A CN200880016405A CN200880016405A CN101680034A CN 101680034 A CN101680034 A CN 101680034A CN 200880016405 A CN200880016405 A CN 200880016405A CN 200880016405 A CN200880016405 A CN 200880016405A CN 101680034 A CN101680034 A CN 101680034A
Authority
CN
China
Prior art keywords
seq
oligonucleolide primers
nucleic acid
sample
pcr
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN200880016405A
Other languages
English (en)
Other versions
CN101680034B (zh
Inventor
C·C·怀特福特
C·于
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Becton Dickinson and Co
Original Assignee
Becton Dickinson and Co
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Becton Dickinson and Co filed Critical Becton Dickinson and Co
Priority to CN201510917644.1A priority Critical patent/CN105349685B/zh
Publication of CN101680034A publication Critical patent/CN101680034A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN101680034B publication Critical patent/CN101680034B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/975—Kit

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

提供了用于快速且灵敏地检测样品中的碳青霉烯酶的组合物和方法。所述组合物包括新型引物和探针组合物，其用于检测样品中这种酶的存在情况，特别是通过使用PCR方法。这些引物和探针组可以在扩增方法(例如，PCR，特别是定量PCR)中使用，并且包装到试剂盒中以用于在扩增方法中使用，以便为了检测测试样品，特别是患者样品，特别是直接样品中的碳青霉烯酶。因此，在一个实施方案中，本发明提供了SEQ ID NO：1、2、4、5、7、8、14、15、17、18和20中所示的新型寡核苷酸引物，以及SEQ ID NO：3、6、9、16和19中所示的新型寡核苷酸探针序列。这些序列可以在用于检测样品中的碳青霉烯酶的方法中使用。

Description

用于鉴定碳青霉烯酶基因的组合物和方法
发明领域
本发明涉及用于快速鉴定赋予抗生素抗性的克雷伯氏菌属(Klebsiella)细菌的碳青霉烯酶基因的组合物和方法。
发明背景
肠杆菌科(Enterobacteriaceae)是一个大型的细菌科，包括较熟悉的病原体中的许多，例如沙门氏菌属(Salmonella)细菌和大肠杆菌(Escherichia coli)。属于肠杆菌科的属的成员已获得了这样的名声，即将它们置于临床微生物学中最致病和最常遇到的生物之中。这些大的革兰氏阴性杆菌常常与肠道感染相关，但可以在几乎所有的天然生境中发现。这个科的许多成员是在人和其他动物的肠中发现的肠道微生物区系的正常部分，而其他成员在水或土壤中发现，或者是在各种不同动物和植物上的寄生物。大肠杆菌是最重要的模式生物之一，并且它的遗传学和生物化学已得到了仔细研究。
肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)是在口、皮肤和肠的正常微生物区系中发现的革兰氏阴性的、不动的、有荚膜的、发酵乳糖的、兼性厌氧的细菌。它是肠杆菌科的克雷伯氏菌属的临床上最重要的成员。肺炎克雷伯氏菌可以引起细菌性肺炎，尽管它更通常地牵涉医院内泌尿道和伤口感染，特别是在无免疫应答的个体中。对于老年人中的泌尿道感染，克雷伯氏菌属的排位仅次于大肠杆菌。对于具有慢性肺病、肠致病性、鼻粘膜萎缩和鼻硬结症的患者，它还是机会致病菌。粪便是患者感染的最重要的来源，随后为与被污染的器具接触。随着抗生素抗性菌株持续出现，肺炎克雷伯氏菌日益成为医院感染。
克雷伯氏菌属细菌具有染色体A类β-内酰胺酶，该酶给予其对于氨苄青霉素的固有抗性。许多菌株已获得了超广谱β-内酰胺酶(extended-spectrum beta-lactamase，ESBL)，其具有另外的对于羧苄青霉素、氨苄青霉素、喹诺酮类的抗性，以及逐渐增加的对于头孢他啶的抗性。碳青霉烯抗生素已成为用于对付革兰氏阴性感染的重要试剂，特别是当革兰氏阴性感染由不同的医院病原体引起时。
碳青霉烯类具有任何β-内酰胺抗生素的最广泛的活性谱，并且通常是用于在由多重抗性革兰氏阴性细菌引起的感染的治疗中使用的最合适的试剂。碳青霉烯类被认为是被选择用于治疗由于具有超广谱β-内酰胺酶(ESBL)的肠杆菌科细菌而引起的感染的试剂。产生ESBL的肺炎克雷伯氏菌的流行已在美国出现，并且在某些地区中接近分离物的50％。当遇到这样高比率的产生ESBL的生物时，碳青霉烯类成为日益重要的治疗选择。在过去数年中，已在某些地区中观察到抗碳青霉烯的革兰氏阴性菌的逐渐增加。在美国，碳青霉烯抗性在很大程度上归于在鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumannii)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)和罕见地肺炎克雷伯氏菌的分离物中C类头孢菌素酶的表达和外膜孔蛋白的丧失。罕见地在肺炎克雷伯氏菌中回收到了水解碳青霉烯的β-内酰胺酶(碳青霉烯酶)。然而，最近在美国东北部鉴定了具有碳青霉烯酶KPC-1、KPC-2和KPC-3的分离物。这些分离物通常对于多种抗生素类别具有抗性，从而给临床医生呈现了非常有限的治疗选择。
引起感染暴发的高抗性生物的出现是微生物学和传染病界已研究了数年的重大问题。目前，可以将碳青霉烯抗性肺炎克雷伯氏菌的出现添加至正在增长的高抗性生物列表中。2005年在纽约市的多个医院中发生的碳青霉烯抗性肺炎克雷伯氏菌感染的爆发将广泛的关注带至这些生物。
KPC酶是介导对于超广谱头孢菌素类的抗性以及对于碳青霉烯类的抗性的β-内酰胺酶。2001年在North Carolina首次报道了这些碳青霉烯酶，但目前已在美国各个部分中分离出了它们，最经常地在东海岸。产生碳青霉烯酶的分离物的检测对于疗法的更好管理和对于感染控制是重要的。
发明概述
提供了用于快速且灵敏地检测赋予抗生素抗性的碳青霉烯酶基因的组合物和方法。所述组合物包含用于检测样品中该基因的存在情况的寡核苷酸新型引物和探针组。这些引物和探针组可以在扩增方法(例如PCR，特别是定量PCR)中使用，并且包装到试剂盒中以用于在扩增方法中使用，以便为了检测测试样品，特别是患者样品中碳青霉烯酶基因的存在情况，由此检测到该基因表明所述样品包含对于碳青霉烯类具有抗性的细菌。
因此，在一个实施方案中，本发明提供了SEQ ID NO：1、2、4、5、7、8、14、15、17、18和20中所示的新型寡核苷酸引物，以及SEQID NO：3、6、9、16和19中所示的新型寡核苷酸探针序列。这些序列可以在用于检测样品中的碳青霉烯酶基因的方法中使用，所述碳青霉烯酶基因的存在表明所述样品包含具有碳青霉烯抗性的细菌。
进一步提供了可用于检测样品中的碳青霉烯酶基因的试剂盒，其中所述试剂盒包含根据本发明的组合物。所述试剂盒可以进一步包含关于在基于聚合酶的扩增反应(例如，PCR或QPCR)中使用所提供的组合物的指导说明书。
在另一个实施方案中，本发明涉及通过使用在该细菌中存在的靶核酸区域的基于聚合酶的扩增，来检测样品中的碳青霉烯酶的方法，所述方法包括：(a)提供怀疑包含具有碳青霉烯抗性的肠细菌的测试样品，(b)在足以提供基于聚合酶的核酸扩增产物(其包含编码碳青霉烯酶的核苷酸序列的靶核酸区域)的条件下，使所述样品与本发明的组合物接触；和(c)检测所述核酸扩增产物的存在情况，作为测试样品中碳青霉烯酶的存在情况的指示。在各种实施方案中，所述测试样品是直接样品，并且本发明的方法和组合物能够在这样的细菌浓度下检测该直接样品中碳青霉烯酶的存在情况，所述细菌浓度处于在从被那种细菌感染的受试者中收集的样品中通常发现的细菌负荷范围之内。
本发明还涉及根据本发明的引物的用途，其中所述引物或探针具有根据在SEQ ID NO：1-9和14-20和14-20中所定义的序列中任一序列的序列。
附图简述
图1：关于标准PCR的灵敏度实验。还将相同的DNA稀释方案(20ng至2fg)用于标准PCR引物。可靠的阳性判读(call)基于在所有3个重复内可靠地检测出条带的能力。使用这个标准，对于标准PCR引物而言可靠的阳性是32pg，并因此灵敏度是32pg(1,000个基因组等价物)。
图2：关于标准PCR的直接样品实验。还将从尿和血液样品中提取的DNA用于接种标准PCR反应。在这个凝胶中未展示的是尿阴性对照样品，其在分开的凝胶上走样并且不包含任何条带。除了阳性模板对照(positive template control，PTC)外，没有样品产生条带。
发明详述
I.概览
本文提供了用于检测在怀疑具有产生碳青霉烯酶的细菌的样品中碳青霉烯酶的存在情况的新型方法和组合物。由于有时低水平的酶表达或不易与其他抗性机制(例如，不渗性或靶修饰)相区分，当使用常规易感性测试方法时，就碳青霉烯酶产生来筛选分离物是困难的。用于检测/鉴定碳青霉烯酶的某些表型方法已在文献中进行了描述，但它们通常不是标准化的，并且由于所需的专业水平和/或专门设备，有些对于常规临床实验室测试来说是不可行的。科学委员会(例如CLSI)目前未给出关于用于碳青霉烯酶检测的方法的推荐。因此，对于用于筛选包含碳青霉烯酶的细菌的快速且可靠的测试存在着需要。
本发明的方法和组合物旨在检测和/或定量质粒承载的(plasmid-borne)β-内酰胺酶基因，更具体地，碳青霉烯酶抗生素抗性基因的质粒，并且允许快速地鉴定这种抗生素抗性基因。在测试样品中检测到该基因表明所述样品包含产生碳青霉烯酶的细菌。该方法涉及使用基于聚合酶的扩增方法，特别是聚合酶链式反应。如本文中所使用的，“聚合酶链式反应”或“PCR”是指用于扩增特定多核苷酸模板序列(或“靶核酸”)的体外方法。
碳青霉烯酶代表了在肠杆菌科细菌中重要的新出现的抗性机制。因此，本发明的方法可用于检测肠杆菌科成员中的碳青霉烯抗性，所述成员包括但不限于，铜绿假单胞菌、鲍氏不动杆菌、肺炎克雷伯氏菌、产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)、肠杆菌属物种(Enterobacter sp.)、肠沙门氏菌(Salmonella enterica)、大肠杆菌等。碳青霉烯酶赋予针对碳青霉烯类抗生素的抗性，所述碳青霉烯类抗生素包括亚胺培南、美罗培南和厄他培南。
本发明的组合物和方法提供了快速且有效的测试，以用于检测样品中的编码碳青霉烯酶或水解碳青霉烯的β-内酰胺酶的基因，并因此检测碳青霉烯酶的存在情况。碳青霉烯酶的检测给临床实验室提出了问题，因为碳青霉烯酶与阳性超广谱β-内酰胺酶(ESBL)确证测试(由克拉维酸盐加强的头孢曲松、头孢他啶、头孢吡肟和氨曲南的活性)相关。因此，无法识别对亚胺培南或美罗培南易感的分离物中减少的碳青霉烯易感性的意义可以导致这些分离物被不正确地鉴定为ESBL产生者。
II.组合物
核苷酸序列
来自几种肺炎克雷伯氏菌分离物的碳青霉烯酶的核苷酸序列提供在SEQ ID NO：10-13中。还将本发明的引物和探针序列提供为SEQ IDNO：1-9和14-20。所述引物和探针组包括SEQ ID NO：1中所示的正向引物，SEQ ID NO：2中所示的反向引物，和SEQ ID NO：3中所示的核酸探针；SEQ ID NO：4中所示的正向引物，SEQ ID NO：5中所示的反向引物，和SEQ ID NO：6中所示的核酸探针；SEQ ID NO：7中所示的正向引物，SEQ ID NO：8中所示的反向引物，和SEQ ID NO：9中所示的核酸探针；SEQ ID NO：14中所示的正向引物，SEQ ID NO：2中所示的反向引物，和SEQ ID NO：3中所示的核酸探针；SEQ ID NO：4中所示的正向引物，SEQ ID NO：15中所示的反向引物，和SEQ ID NO：16中所示的核酸探针；SEQ ID NO：20中所示的正向引物，SEQ ID NO：8中所示的反向引物，和SEQ ID NO：9中所示的核酸探针；以及SEQ IDNO：17中所示的正向引物，SEQ ID NO：18中所示的反向引物，和SEQID NO：19中所示的核酸探针。这些引物和探针组可以在基于聚合酶的扩增方法(例如，实时PCR方法)中使用，以用于快速地鉴定碳青霉烯酶抗生素抗性基因。所述引物和探针组是通用的，因为它们可以识别肺炎克雷伯氏菌碳青霉烯酶(KPC)基因的所有已知的同种型，以及检测其他肠细菌中的碳青霉烯酶基因。尽管鉴定了特定的引物和探针序列，但应当认识到所述序列可以通过核苷酸的添加或置换而发生改变。
样品来源
可以在实践本发明的方法中使用的代表性生物样品包括鼻拭子、咽喉拭子、粪便、皮肤拭子、血液(包括血液培养物)、痰、细支气管肺泡灌洗液、支气管吸出物、肺组织和尿。生物样品的收集和贮存方法是本领域技术人员已知的。可以通过铺板和使细菌生长来对生物样品进行加工。在一个优选的实施方案中，所述样品是直接样品，并且使所述直接样品直接与PCR反应组分和合适的寡核苷酸接触。所述方法特别可用于检测体液例如血液和尿中碳青霉烯酶的存在情况。
“直接样品”是这样的样品，其收集自受试者并且无需从样品中分离或培养细菌而在PCR反应中进行筛选。直接样品在筛选前一般仅最低限度地进行加工。在各种实施方案中，样品可以使用本领域已知的任何可接受的方法来进行裂解，并且进行离心以去除细胞碎片。保留上清液用于筛选。在另一个实施方案中，在PCR方法中进行筛选之前，使核酸形成粒状沉淀，洗涤，并重悬浮于合适的缓冲液中。
寡核苷酸引物
在本发明的一个实施方案中，将寡核苷酸引物提供用于检测样品中的碳青霉烯酶抗生素抗性基因。如本文中所使用的，“引物”是指这样类型的寡核苷酸，其具有或包含与在碳青霉烯酶基因中存在的或衍生自碳青霉烯酶基因的靶多核苷酸互补的序列，并且其通过碱基配对与靶多核苷酸杂交。在一个实施方案中，本发明的正向和反向引物是包含SEQ ID NO：1、2、4、5、7、8、14、15、17、18和20中所示的核苷酸序列的那些。术语“寡核苷酸”是指短的多核苷酸，长度通常小于或等于150个核苷酸(例如，长度为5-150个，优选地10-100个，更优选地15-50个核苷酸)。然而，如本文中所使用的，该术语还意欲包括更长或更短的多核苷酸链。
本发明的引物和探针组被设计为用于检测编码碳青霉烯酶的核酸分子。本发明的组合物被设计为用于检测编码碳青霉烯酶的核酸序列的5′、3′和中间部分。本发明的引物和探针组中的每一个可以识别碳青霉烯酶基因的所有已知的同种型。本发明的引物和探针序列可以通过在5′或3′末端处包含另外的核苷酸来进行修饰。为了确定用于延伸引物或探针序列的核苷酸，使用SEQ ID NO：10-13(其包含了KPC碳青霉烯酶基因的全长序列)和表2(其包含有在碳青霉烯酶序列内的引物和探针序列的位置)，通过使引物和探针序列与碳青霉烯酶编码序列进行比对并确定引物或探针序列的5′和3′区域处的核苷酸碱基，本领域技术人员可以设计出延长的引物序列。同样地，引物和探针序列可以通过在所述序列内具有被置换的核苷酸来进行修饰。应当认识到，引物和探针序列必须包含足够的互补性，以特异性地与碳青霉烯酶核酸序列杂交。以这种方式，可以置换至少1、2、3、4或直至约5个核苷酸。
如本文中所使用的，术语“靶多核苷酸”和“靶核酸”是指待在样品中测定其存在的多核苷酸。在本发明中，靶核酸相应于编码能够水解碳青霉烯的β-内酰胺酶(碳青霉烯酶)的核酸。肺炎克雷伯氏菌碳青霉烯酶(KPC)的4种同种型的核苷酸序列显示在SEQ ID NO：10-13中。所述序列的任何部分可以通过本发明的方法来进行鉴定。因为碳青霉烯酶序列的相似性，所以本发明的引物探针组能够鉴定任何肠细菌中的碳青霉烯酶序列。
如本文中所使用的，术语“互补”是指两条多核苷酸链的区域之间或者同一多核苷酸链的两个区域之间的序列互补性。如果当两个区域以反向平行方式进行排列时，第一个区域的至少一个核苷酸能够与第二个区域的碱基进行碱基配对，那么多核苷酸的第一个区域与相同或不同的多核苷酸的第二个区域互补。因此，并不要求两个互补的多核苷酸在每一个核苷酸位置处都碱基配对。“完全互补”是指第一多核苷酸与第二多核苷酸100％或“完全”互补，并因此在每一个核苷酸位置处形成碱基对。“部分互补”还指第一多核苷酸不是100％互补的(例如，90％或80％或70％互补的)，并且在一个或多个核苷酸位置处包含错配的核苷酸。
如本文中所使用的，在关于互补的(包括部分互补的)多核苷酸链的配对时，使用术语“杂交”。杂交和杂交强度(即，多核苷酸链之间的结合强度)受到本领域众所周知的许多因素的影响，包括多核苷酸之间的互补性程度，所涉及的条件的严紧性，其受到诸如下列的条件的影响：盐浓度、所形成的杂合体的解链温度(Tm)、其他组分的存在(例如，聚乙二醇的存在或不存在)、杂交链的体积摩尔浓度和多核苷酸链的G∶C含量。在一个实施方案中，如此地设计引物，即使得该组中的一个引物的Tm在该组中的另一个引物的Tm的2℃之内。关于核酸杂交的详尽指导可在下列文献中找到：Tijssen(1993)Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes，第I部分，第2章(Elsevier，New York)；和Ausubel等人，编辑(1995)CurrentProtocols in Molecular Biology，第2章(Greene Publishing andWiley-Interscience，New York)。参见Sambrook等人，(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual(第2版，Cold SpringHarbor Laboratory Press，Plainview，New York)。
可以使用本领域已知的技术来制备本发明的引物，所述技术包括但不限于，合适序列的克隆和消化以及直接的化学合成。
可以用于制备本发明的引物的化学合成方法包括但不限于，由Narang等人，(1979)Methods in Enzymology 68：90所描述的磷酸三酯法，由Brown等人，(1979)Methods in Enzymology 68：109所公开的磷酸二酯法，由Beaucage等人，(1981)Tetrahedron Letters22：1859所公开的氨基磷酸二乙酯法，和在美国专利号4,458,066中所描述的固体支持物法。此处还考虑使用自动化寡核苷酸合成仪来制备本发明的合成寡核苷酸引物。此外，需要时，可以使用本领域已知的和下文所描述的技术来对引物进行标记。
寡核苷酸探针
本发明的一种或多种寡核苷酸引物可以与一种或多种探针序列一起使用，或者可以包含一种或多种探针序列。所述探针可以与所述寡核苷酸引物分开(“双分子探针”)，或者附着至所述寡核苷酸引物(“单分子探针”或“有尾探针(tailed probe)”)。参见例如，Whitcombe等人，(1999)Nature Biotechnol.17：804-807和美国专利号6,326,145中所描述的自身探测序列(self-probing sequence)(例如，SCORPIONSTM引物，也称为“有尾探针”)，所述两篇参考文献通过提及而以其整体合并入本文。
如本文中所使用的，术语“探针”是指由于探针中的至少一个序列与引物延伸产物中的序列的互补性而与引物延伸产物形成杂合结构的多核苷酸。“引物延伸产物”意指由于寡核苷酸引物的基于聚合酶的延伸(使用靶核酸作为模板)而产生的核酸产物，所述寡核苷酸引物包含在本文中公开为SEQ ID NO：1、2、4、5、7、8、14、15、17、18和20的序列。探针的多核苷酸区域可以由DNA和/或RNA和/或合成的核苷酸类似物组成。优选地，探针不包含与上文所描述的寡核苷酸引物序列互补的序列。理想地，本发明的探针的长度小于或等于约50个核苷酸，例如长度小于或等于约40个、约30个、约20个或小于约10个核苷酸。优选地，本发明的探针序列是在本文中公开为SEQID NO：3、6、9、16和19的序列。
如本文中所使用的，“Tm”和“解链温度”是可互换的术语，其是一群双链多核苷酸分子的50％解离成单链时所处的温度。用于计算多核苷酸的Tm的等式是本领域众所周知的。例如，Tm可以通过下述等式来计算：Tm＝69.3+0.41x(G+C)％-650/L，其中L是以核苷酸表示的探针的长度。杂合体多核苷酸的Tm也可以通过使用根据在1M盐中的杂交测定法而调整的公式来进行估计，并且常常用于计算PCR引物的Tm：[(A+T的数目)x 2℃+(G+C的数目)x 4℃]，参见例如，Newton等人，(1997)PCR(第2版；Springer-Verlag，New York)。在本领域中存在有其他更复杂的计算，其考虑了结构以及序列特征以用于计算Tm。计算出的Tm仅是估计值；最佳温度常常凭经验来确定。
标记
本发明的引物和/或探针可以进一步包含一种或多种标记，以有助于监测扩增反应。如本文中所使用的，术语“标记”或“经标记的”是指这样的任何原子或部分，其可以用于提供可检测的(优选地，可定量的)信号，并且可以附着至多核苷酸、寡核苷酸引物或探针。广泛多样的标记和缀合技术(包括直接和间接标记法)是已知的，并且在科学和专利文献中详尽地进行了报道。可以使用的标记的例子包括放射性核苷酸、酶、底物、辅因子、抑制剂、荧光部分、嵌入剂、化学发光部分、磁性颗粒等。教导了此类标记的使用的专利包括美国专利号3,817,837；3,850,752；3,939,350；3,996,345；4,277,437；4,275,149；和4,366,241，所述专利通过提及而以其整体合并入本文。
III.方法
本文进一步提供了用于检测样品中具有碳青霉烯抗性的细菌的快速且灵敏的方法。所述方法可用于诊断具有碳青霉烯抗性的受试者，以及开发对于具有细菌感染的受试者合适的治疗方案，其中所述治疗基于碳青霉烯抗性的存在或不存在来确定。
所述方法包括基于PCR(特别是QPCR)的碳青霉烯酶的扩增和检测方法，其中使用本文所描述的引物和探针。在各种实施方案中，本文所公开的方法能够在处于生理范围内的细菌浓度(即在从被所述细菌感染的受试者中收集的样品中的细菌浓度)下检测碳青霉烯酶的存在情况。因此，无需分离、浓缩或扩展(例如培养)细菌群体，样品可以直接进行筛选以检测碳青霉烯酶的存在情况。在各种实施方案中，本文所公开的方法能够从具有约1×103CFU/ml，约1×104CFU/ml，约1×105CFU/ml，或约1×106CFU/ml的细菌浓度的样品中检测碳青霉烯酶的存在情况。
基于聚合酶的扩增
众多不同的PCR或QPCR方案是本领域已知的并在本文下面中例示，并且可以直接应用于或经调整而用于通过使用本文所描述的组合物来检测样品中的碳青霉烯酶。一般地，在PCR中，通过与至少一种寡核苷酸引物或寡核苷酸引物对反应来扩增靶多核苷酸序列。所述引物与靶核酸的互补区杂交，并且DNA聚合酶延伸所述引物从而扩增出靶序列。在足以提供基于聚合酶的核酸扩增产物的条件下，有着一种大小的核酸片段在反应产物中占优势(作为扩增产物的靶多核苷酸序列)。重复扩增循环以增加该单一靶多核苷酸序列的浓度。所述反应可以在任何常常用于PCR的循环变温器中进行。然而，优选的是具有实时荧光测量能力的循环仪，例如
Figure A20088001640500161
(Cepheid，Sunnyvale，CA)、ABI PRISM
Figure A20088001640500162
(Applied Biosystems，FosterCity，CA)、ROTOR-GENETM(Corbett Research，Sydney，Australia)、
Figure A20088001640500163
(Roche Diagnostics Corp，Indianapolis，IN)、
Figure A20088001640500164
(Biorad Laboratories，Hercules，CA)和
Figure A20088001640500165
(Stratagene，La Jolla，CA)。
定量PCR(QPCR)(也称为实时PCR)在某些情况下是优选的，因为它不仅提供定量测量，而且还减少时间和污染。如本文中所使用的，“定量PCR”(或“实时QPCR”)是指PCR扩增过程的直接监测，正如它无需反应产物的反复取样而发生。在QPCR中，可以经由发信号机制(例如荧光)来监测反应产物，正如产生了它们并且在信号升高超过背景水平之后但在反应达到平台之前跟踪它们。达到可检测或“阈值”荧光水平所需的循环数目(本文称为循环阈值(cycle threshold)或“CT”)直接随着在PCR过程开始时可扩增靶的浓度而改变，使得能够测量信号强度从而提供样品中靶核酸的量的实时测量。
在一个优选的实施方案中，将经标记的探针用于检测通过PCR扩增而产生的延伸产物。可以使用利用经标记的包含本发明序列的探针的任何探针形式，例如本领域已知的或本文其他地方描述的SCORPIONSTM探针、日出探针(sunrise probe)、探针、或分子信标探针。
PCR条件
用于建立PCR反应的方法是本领域技术人员众所周知的。反应混合物最低限度包含模板核酸(除了在下文所描述的阴性对照的情况下之外)和寡核苷酸引物和/或探针(与合适的缓冲液、盐等相组合)，以及合适浓度的核酸聚合酶。如本文中所使用的，“核酸聚合酶”是指催化核苷三磷酸的聚合的酶。一般地，所述酶将会在与靶序列退火的引物的3′-末端处起始合成，并且将会以5′-方向沿着模板前行直至合成终止。合适的浓度包括在本文所描述的方法中催化这种反应的浓度。已知的DNA聚合酶包括例如，大肠杆菌DNA聚合酶I、T7 DNA聚合酶、嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)(Tth)DNA聚合酶、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)DNA聚合酶、海滨热球菌(Thermococcus litoralis)DNA聚合酶、水生栖热菌(Thermusaquaticus)(Taq)DNA聚合酶和激烈火球菌(Pyrococcus furiosus)(Pfu)DNA聚合酶。
除了上述组分外，本方法的反应混合物还包含引物、探针和脱氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)。通常地，反应混合物将进一步包含相应于4种天然存在的核苷碱基的4种不同类型的dNTPs，即dATP、dTTP、dCTP和dGTP。在本发明的方法中，每种dNTP通常将会以约10-5000μM，经常约20-1000μM，约100-800μM，或约300-600μM的量存在。
在本发明方法的第一个步骤中制备的反应混合物进一步包含水性缓冲介质，其包含单价离子来源、二价阳离子来源和缓冲剂。可以采用任何方便的单价离子来源，例如氯化钾、乙酸钾、乙酸铵、谷氨酸钾、氯化铵、硫酸铵等。二价阳离子可以是镁、锰、锌等，其中该阳离子通常将会是镁。可以采用任何方便的镁阳离子来源，包括氯化镁、乙酸镁等。缓冲液中存在的镁的量可以是0.5-10mM，并且可以是约1-约6mM，或约3-约5mM。可以存在于缓冲液中的代表性缓冲剂或盐包括Tris、Tricine、HEPES、MOPS等，其中缓冲剂的量通常将会是约5-150mM，通常约10-100mM，和更通常约20-50mM，其中在某些优选的实施方案中，缓冲剂将会以足以提供约6.0-9.5的pH，例如约pH 6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0或9.5的量存在。可以存在于缓冲介质中的其他试剂包括螯合剂，例如EDTA、EGTA等。
在制备反应混合物中，各种组成组分可以以任何方便的顺序相组合。例如，缓冲液可以与引物、聚合酶相组合，随后与模板核酸相组合，或者所有各种组成组分可以同时相组合，以产生反应混合物。
备选地，商购可得的预混合的试剂可以根据制造商的指导在本发明的方法中利用，或者进行修饰以改善反应条件(例如，必要时，改变缓冲液浓度、阳离子浓度或dNTP浓度)，包括例如
Figure A20088001640500181
Universal PCR Master Mix(Applied Biosystems)、
Figure A20088001640500182
或
Figure A20088001640500183
(Cepheid)、IQTM Supermix(Bio-Rad Laboratories)、FastStart(Roche Applied Science，Indianapolis，IN)或QPCR Master Mix(Stratagene，La Jolla，CA)。
在制备反应混合物后，使反应混合物经历引物延伸反应条件(“足以提供基于聚合酶的核酸扩增产物的条件”)，即使得能够通过使用模板链作为模板经由向引物分子的末端添加核苷酸来进行由聚合酶介导的引物延伸的条件。在许多实施方案中，引物延伸反应条件是扩增条件，所述条件包括多个反应循环，其中每个反应循环包括：(1)变性步骤，(2)退火步骤，和(3)聚合步骤。反应循环的数目将会依据所施行的应用而改变，但通常将会是至少15个，更通常至少20个，和可以高至60个或更高，其中不同循环的数目通常将会是约20-40个。对于其中施行超过约25个，通常超过约30个循环的方法，可以方便的是或可以希望，将另外的聚合酶引入反应混合物中，从而使得维持了适合于酶促引物延伸的条件。
变性步骤包括将反应混合物加热至升高的温度，并且使混合物维持在该升高的温度下一定的时间段，所述时间段足够用于使反应混合物中存在的任何双链或杂交的核酸解离。关于变性，反应混合物的温度将会通常升高至并维持在约85-100℃，通常约90-98℃，和更通常约93-96℃下，并保持约3-120秒，通常约3秒的时间段。
在变性后，反应混合物将会经历这样的条件，所述条件足以使引物与在该混合物中存在的模板核酸(如果存在)退火，并且使核苷酸聚合至引物末端，从而通过使用引物所与之杂交的核酸作为模板来以5′至3′方向将引物延伸；即，对于引物延伸产物的酶促产生而言足够的条件。在这个实施方案中，退火和延伸过程在同一步骤中发生。通常将会对为了达到这些条件而将反应混合物降低至的温度进行选择，以提供最佳效率和特异性，并且一般将会是约50-75℃，通常约55-70℃，和更通常约60-68℃，更特别地大约60℃。退火条件将会维持约15秒-30分钟，通常约20秒-5分钟，或约30秒-1分钟，或约30秒的时间段。
这个步骤可以任选地包括退火步骤和延伸步骤中每一个之一，其中对于每个步骤进行温度和时间长度的变化和优化。在两步式退火和延伸中，允许退火步骤如上进行。在引物与模板核酸退火后，进一步地使反应混合物经历足以提供核苷酸向引物末端的聚合的条件(如上)。为了达到聚合条件，反应混合物的温度通常将会升高至或维持在约65-75℃，通常约67-73℃的温度，并且维持约15秒-20分钟，通常约30秒-5分钟的时间段。
上述的变性、退火和聚合的循环可以通过使用自动化装置(通常称为热循环仪)来执行。可以采用的热循环仪在本文其他地方以及在美国专利号5,612,473；5,602,756；5,538,871；和5,475,610中进行描述；这些专利的公开内容通过提及而合并入本文。
本发明的方法还可以在非基于PCR的应用中使用，以检测靶核酸序列，其中此类靶可以固定在固体支持物上。用于使核酸序列固定在固体支持物上的方法是本领域已知的，并且在Ausubel等人，编辑(1995)Current Protocols in Molecular Biology(GreenePublishing and Wiley-Interscience，NY)中以及在由制造商所提供的方案中进行了描述，例如对于膜：Pall Corporation，Schleicher &Schuell；对于磁珠：Dynal；对于培养平板：Costar，Nalgenunc；对于珠阵列平台：Luminex和Becton Dickinson；和对于根据本发明有用的其他支持物：CPG，Inc。
核酸扩增领域中的技术人员知晓存在有其他快速扩增程序，例如连接酶链式反应(LCR)、基于转录的扩增系统(TAS)、自动维持序列复制(3SR)、基于核酸序列的扩增(NASBA)、链置换扩增(SDA)和分支DNA(bDNA)(Persing等人，(1993)Diagnostic MolecularMicrobiology：Principles and Applications(American Societyfor Microbiology，Washington，DC))。本发明的范围并不局限于使用通过PCR的扩增，而是包括使用任何快速核酸扩增方法或任何其他程序，其与本发明的序列一起可用于检测和/或定量碳青霉烯酶抗生素抗性基因。
此外，导致相似的扩增或检测/定量结果的对于各种试剂的确切量和对于PCR或其他合适的扩增程序的条件(例如，缓冲条件、循环时间等)的变化是本领域技术人员已知的，并且被视为是等价的。在一个实施方案中，目标QPCR检测具有检测出样品中少于50个拷贝(优选地少于25个拷贝，更优选地少于15个拷贝，更加优选地少于10个拷贝)的靶核酸(即碳青霉烯酶核酸)的灵敏度。在一个实施方案中，施行热启动PCR反应(例如，通过使用热启动Taq DNA聚合酶)，以便通过减少来自非特异性扩增的背景来改善PCR反应，并且增加所希望的延伸产物的扩增。
对照
本发明的PCR或QPCR反应可以包括各种对照。此类对照应当包括“无模板”阴性对照，其中引物、缓冲液、酶和其他必需试剂(例如氯化镁、核苷酸)在不存在添加的测试样品的情况下进行循环。还应平行地运行包括已知的靶核酸的阳性对照。阳性对照和阴性对照都可以被包括在扩增反应中。单个反应可以包含阳性对照、阴性对照或样品模板，或者单个反应可以包含样品模板和阳性对照两者。
除了“无模板”对照外，阴性对照还可以包括使用在反应中所包括的非特异性靶核酸的扩增反应，或者可以是通过使用样品制备的任何或所有步骤(从核酸提取到扩增制备)但不添加测试样品(例如，每个步骤不使用测试样品或使用已知不含碳青霉烯酶的样品)而制备的样品。
阳性和阴性对照可用于设定参数，在所述参数内测试样品将会被分类为具有或不具有碳青霉烯抗性。例如，在QPCR反应中，可以将在其下在阳性对照样品中检测出碳青霉烯酶的循环阈值用于设定用于将样品分类为“阳性”的阈值，并且可以将在其下在阴性对照样品中检测出碳青霉烯酶的循环阈值用于设定用于将样品分类为“阴性”的阈值。可以将来自单个反应的CT用于每种对照，或者可以使用重复样品的中值或平均值。在另外一个实施方案中，可以使用历史对照值。通常将关于阴性和阳性对照中每一个的最低检测水平设定在多个反应间的平均CT的95％置信区间的下端。这个值可以依据诊断测定法的要求来进行调整。
引物延伸产物的证实
需要时，可以通过使用标准分子技术(包括(例如)Southern印迹测定法)来证实引物延伸或扩增产物的身份。在Southern印迹测定法中，通过电泳来分开扩增产物，转移至膜(即硝化纤维素、尼龙等)，与寡核苷酸探针或目的核酸序列的任何部分反应。然后，对探针进行修饰以使得能够进行检测。修饰方法可以是掺入经放射性标记的核苷酸或任何数目的非放射性标记(例如生物素)。
在Southern印迹测定法中使用的寡核苷酸探针源自所述核酸序列，并因此对于该碳青霉烯酶抗生素抗性基因是特异的，并且可以是包含SEQ ID NO：3、6、9、16或19中所示的序列的探针。在Southern印迹测定法中使用的探针可以使用常规的标准方法来制备。例如，探针可以通过使用本领域已知的常规技术来进行分离、克隆和限制酶切，或者可以通过使用本文先前所描述的化学合成方法来制备。
备选地，可以使用斑点印迹分析来检测扩增产物。斑点印迹分析涉及使寡核苷酸探针(例如先前所描述的那种)附着至硝化纤维素或固体支持物，例如但不限于，珠(例如但不限于聚苯乙烯珠、磁珠或非磁性珠等)、反应托盘(reaction tray)的壁、细条(strip)(例如但不限于硝化纤维素细条)、试管。加入包含经标记的扩增产物的样品，进行反应，进行洗涤以去除未结合的样品，并且通过使用本领域已知的常规技术来显现附着至探针的、经标记的、扩增出的产物。一种用于验证引物延伸产物或扩增产物的更严格的方法是通过使用本领域众所周知的技术的直接测序。
试剂盒
本发明容易地适合于制备“试剂盒”，其包含对于施行本发明方法而言所必需的要素。此类试剂盒可以包含承载物，所述承载物被区室化以便在其中以紧密约束的形式接受一个或多个容器，例如管或小瓶。容器之一可以包含至少一种未标记的或经可检测地标记的本发明的DNA引物。必要时，经标记的DNA引物可以以冻干形式或者在合适的缓冲液中存在。一个或多个容器可以包含待在PCR反应中使用的一种或多种酶或试剂。这些酶可以单独地，或者以混合物、以冻干形式或在合适的缓冲液中存在。最后，所述试剂盒可以包含对于施行本发明的技术而言所必需的所有另外的要素，例如缓冲液、提取试剂、酶、移液管、平板、核酸、核苷三磷酸、滤纸、凝胶材料、转移材料、放射自显影供应物等。
根据本发明的试剂盒将会至少包含：(a)经标记的寡核苷酸，其中所述试剂盒包含两种或更多种可区别的寡核苷酸，例如与编码碳青霉烯酶的核苷酸序列杂交的寡核苷酸；和(b)关于在高保真度扩增(例如PCR)反应中使用所提供的经标记的寡核苷酸的指导说明书。在一个实施方案中，所述两种可区别的寡核苷酸选自SEQ ID NO：1-9和14-20。
目标试剂盒可以进一步包含另外的试剂，所述另外的试剂对于被在包括在于本发明方法的过程中所制备的反应混合物之中而言是必需的或者方便和/或希望的，其中此类试剂包括：一种或多种聚合酶；水性缓冲介质(以其组成组分制备或存在，其中所述组分中的一种或多种可以预混合或者所有组分可以是分开的)等。
试剂盒的各种试剂组分可以存在于分开的容器中，或者可以全部预组合成试剂混合物以用于与模板核酸相组合。
除了上述组分外，所述试剂盒将会进一步包含关于实践本发明方法的指导说明书。这些指导说明书可以以各种形式存在于试剂盒中，所述形式中的一种或多种可以存在于试剂盒中。这些指导说明书所可以存在的一种形式是作为在合适的介质或基质上的印刷信息，例如其上印刷有信息的一张或多张纸，在试剂盒的包装中，在包装插入物中等。另外一种手段是在其上已记录了信息的计算机可读的介质，例如软盘、CD等。可以存在的另外一种手段是可以经由因特网使用的网址，以访问在远处地点处的信息。任何方便的手段可以存在于试剂盒中。
提供了下列实施例，这是为了举例说明而不是限制。
实验
材料和方法
下文提及的参考文献(1)-(6)在实验部分结束时列出。
细菌菌株：通过由CLSI所描述的培养液微稀释法(brothmicrodilution)从BD ID/AST微生物库中鉴定出碳青霉烯抗性克雷伯氏菌属细菌和大肠杆菌(1)。在所述实验的自始至终，将野生型(氨苄青霉素敏感的)大肠杆菌ATCC 25922(菌株ID 300960)用作阴性对照。将事先被确定为包含KPC-1、KPC-2和KPC-3的三种菌株(菌株ID 301916＝KPC-1，301917＝KPC-2，301918＝KPC-3)用作阳性对照(4)。还筛选出ESBL阳性克雷伯氏菌属细菌和大肠杆菌，以用于证明所述实时测定法的特异性。通过使用CLSI所推荐的培养液微稀释测定法来鉴定ESBL阳性菌株(2)。在任何加工或提取之前，将所有菌株在包含5％绵羊红细胞的胰胨豆胨琼脂(Trypticase Soy Agar，TSA)(BD Diagnostic Systems，Sparks，MD)平板上进行划线培养，并且在35℃下生长过夜。
抗微生物剂敏感性试验：如CLSI所描述的，使用Mueller-Hinton培养液(BD Diagnostic Systems，Sparks，MD)来进行抗微生物剂敏感性试验(1)。从下列公司获得抗微生物粉剂；氨苄青霉素(Amp)和头孢噻肟(CTX)(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)、头孢他啶(CAZ)(Eli Lilly，Indianapolis，IN)、克拉维酸(Smith-Kline，King of Prussia，PA)、亚胺培南(IPM)(Merck & Co.，Rahway，NJ)。
DNA提取和标准化：使用标准热裂解方案来进行细菌DNA分离。在这个方案中，将来自TSA分离平板的菌落的一部分放置到50μl分子生物学级水中。然后，在同时于800r pms进行摇动的情况下，使样品在95℃下温育10分钟(min)。通过短暂的离心步骤(14,000rpms(20,800×g)，5分钟)来回收DNA。移出包含DNA的上清液并放置到干净的管中。样品经历分光光度法，并且将核酸标准化至100ng/μl，在具有1mM EDTA的10mM Tris-HCL(TE)缓冲液(pH 8.0)中。通过分析260/280吸光度比率来测定DNA纯度；纯的DNA具有＞1.7的比率。
实时PCR方案：在PCR分析之前将所有经纯化的DNA(100ng/μl)稀释至少1/20，以稀释掉在经热裂解的样品中存在的任何抑制性蛋白质。将DNA样品的5ng等分试样放置到20μl PCR主混合物中，所述PCR主混合物包含250nM的每种引物、125nM的经双重标记的探针和
Figure A20088001640500251
Universal Fast PCR Master Mix(Applied Biosystems，Foster City，CA)。在所述实时测定法中所使用的引物和探针的序列可以在表2中找到。所有引物和探针由Integrated DNA Technologies，Inc.在该计划的指导下进行合成。用5′6-FAMTM/3′BHQ-1TM和2X HPLC(纯化的)来合成经双重标记的水解探针。样品在Applied Biosystems(ABI)7500 Fast Real-Time PCR System(Applied Biosystems，Foster City，CA)上运行，在此使用2阶段2步PCR程序，其中存在有20秒(sec)酶激活阶段，以及由3秒95℃变性步骤和30秒60℃退火/延伸步骤(40个循环)组成的2步PCR阶段。所述PCR程序的平均运行时间是35分钟。
测序：通过使用在Yigit等人，2001(3)和Bratu等人，2005(5)中所描述的引物来进行扩增子测序，以核实在实时PCR测定法中鉴定的KPC阳性菌株。将DNA样品的100ng等分试样放置到15μl PCR主混合物中，所述主混合物包含0.2pmol的每种引物和
Figure A20088001640500252
Multiplex PCRMaster Mix(Qiagen，Valencia，CA)。反应在MJ Research PTC-200热循环仪(BioRad，Hercules，CA)中进行扩增，其中使用由售卖者(Qiagen)描述的循环参数。PCR反应根据ExoSap-
Figure A20088001640500253
(USBCorporation，Cleveland，OH)方案来进行清理(clean up)。测序反应和循环参数根据ABI
Figure A20088001640500254
Terminator v1.1循环测序试剂盒(Applied Biosystems，Foster City，CA)来执行。根据制造商提供的方案，使用DyExTM 2.0 Spin Kit(Qiagen，Valencia，CA)来纯化测序反应产物，并在ABI 3130 Genetic Analyzer(AppliedBiosystems，Foster City，CA)上进行分析。使用来自国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)的BLAST算法，将从KPC扩增子测序中获得的序列与GenBank中的非丰余序列进行比较。
结果
KPC比对和测定法设计：从NCBI获得KPC及其相关的变体。使用DNASTAR(DNASTAR，Inc.Madison，WI)序列分析软件中的Clustal W算法来对所有独特的KPC变体进行比对，以揭示与KPC同种型相关的所有核苷酸变体。在所述比对中鉴定出的所有KPC变体连同其GenBank登录号和储存物种一起在表1中列出。然后，将经比对的序列用作用于引物和探针设计的参考。就其识别所有KPC变体的能力来特别地选择实时测定法。来自实时测定法的大多数引物和探针不与已知的KPC变体重叠，除了KPC-758测定法外。KPC-758测定法中的反向引物在核苷酸位置814处与KPC-3变体重叠。用KPC-758测定法来检测KPC-3变体，而在灵敏度方面无明显损失(参见下表4中的CT值)。借助于Primer Expressv3(Applied Biosystems，Foster City，CA)来设计引物和探针，其中采用这样的标准，即所有引物必须在彼此的2度之内和在60℃的最佳Tm(解链温度)的2度之内。探针的Tm比引物对高10度，以增加探针退火的特异性(表2)。使用来自NCBI的BLAST算法，将KPC实时引物和探针与GenBank中的非丰余序列进行比较。所有实时测定法以＞100％的覆盖和＞100％的序列同一性匹配可利用的GenBank KPC序列，并且与该数据库中的任何其他基因不具有任何显著的同一性。
表1.KPC核苷酸变体。从GenBank下载序列，使用DNASTAR(DNASTAR，Inc.Madison，WI)中的Clustal W算法进行比对，以鉴定与每种KPC同种型相关的特定核苷酸变异和位置。还注明了关于KPC基因的某些储存物种。
Figure A20088001640500261
Figure A20088001640500271
*核苷酸位置基于KPC基因的开放读码框或编码序列。
**碱基变化是与在那个位置处的共有碱基相比较而言的变化。
***通过缺乏任何上文提及的变化来确定KPC-2变体。
表2.关于KPC的实时测定法。就其识别所有KPC变体的能力来特别地选择实时测定法。引物被设计为在彼此的2度之内和在60℃的最佳Tm的2度之内，并且探针的Tm被设计为比引物对高10度。“起始”和“终止”是指相应的在KPC编码序列(参见，SEQ ID NO：10-13)内的核苷酸位置。
Figure A20088001640500272
Figure A20088001640500281
筛选水解碳青霉烯和产生ESBL的菌株：用由CLSI所描述的培养液微稀释法，就碳青霉烯抗性克雷伯氏菌属细菌和大肠杆菌来对BDID/AST Microbial Bank进行筛选(2)。选择克雷伯氏菌属物种(Klebsiella spp.)和大肠杆菌，这是因为它们是质粒承载的KPC基因的主要储存物种。基于标准微培养液稀释法，在2-16μg/ml的范围内评价IPM的最小抑制浓度(MIC)，其中≥16μg/ml被视为对IPM具有抗性(2)。根据CLSI标准，表3中的24种菌株中的3种(显示为有下划线的)对于IPM具有抗性(≥16μg/ml)。
由于文献中的一些报道提出产生KPC的分离物与阳性ESBL CLSI证实性测试相关(6)并且已发现某些产生KPC的分离物低于≥16μg/ml的IPM抗性点(6)，因而筛选出非IPM抗性的但ESBL阳性的另外的克雷伯氏菌属物种和大肠杆菌菌株。包括了这些另外的ESBL菌株，以用于证明所述实时测定法的灵敏度和特异性。
使用CLSI所推荐的培养液微稀释测定法来鉴定ESBL阳性菌株(2)。简而言之，这种培养液微稀释测定法具有在抗微生物剂的规定范围之间的两倍稀释方案。例如，当抗微生物剂的规定范围是2-16μg/ml时，孔之间的两倍稀释由0.25、0.5、1、2、4、8和16μg/ml代表。为了鉴定ESBL阳性菌株，在包含单独的或与克拉维酸相组合的处于跨越规定范围的这些各种两倍稀释度的目的抗微生物剂的孔中评价生长，以便测定单独的或与克拉维酸相组合的抗微生物剂的MIC。向抗微生物剂添加克拉维酸可以减少该试剂的MIC，例如，从而使得微生物的生长在包含1μg/ml试剂+克拉维酸的孔中受到抑制，而微生物的生长在包含8μg/ml单独的该试剂的孔中被抑制。这个具体例子等同于MIC减少了3个孔(其在每个这些孔之间具有两倍稀释)，并且MIC的这种类型的减少保证了该微生物被判读为ESBL阳性。因此，相比于单独测试时它的MIC而言与克拉维酸相组合地进行测试的抗微生物剂的MIC具有≥3个两倍浓度减少，是所述微生物为ESBL阳性的指示(例如，CAZ MIC＝8μg/ml；CCZ(克拉维酸+头孢他啶(CCZ))MIC＝1μg/ml)。根据CLSI标准，表3中的24种菌株中的11种是ESBL阳性的(参见表3，在关于每个测定法的列内，其中指明了ESBL阳性菌株的结果用星号指示)。还筛选了野生型大肠杆菌菌株ID 300960，并且用作关于所有实时测定法的阴性对照。
表3.抗微生物剂敏感性试验。如CLSI所描述的，使用Mueller-Hinton培养液(BD Diagnostic Systems，Sparks，MD.)来进行抗微生物剂敏感性试验(1)。IPM抗性菌株(≥16μg/ml)是有下划线的，和ESBL阳性菌株(使用CLSI标准)用星号指示。
  菌株ID   细菌   Amp   CTX   CCX   CAZ   CCZ   IPM
  300960   ESCCOL   ＜＝0.25   ＜＝0.25   ＜＝0.25   ＜＝0.5   ＜＝0.25   ＜＝0.25
  300967   KLEOXY   ＞32   ＞64   ＞64   ＝128   ＝128   ＞16
  300996   KLEPNEP   ＞32   ＝2*   ＝0.5*   ＝4*   ＝0.5*   ＝8
  301008   KLEPNEP   ＝16   ＜＝0.25   ＜＝0.25   ＜＝0.25   ＜＝0.25   ＜＝2
  301888   ESCCOL   ＞32   ＝32*   ＝1*   ＝64*   ＝2*   ＝4
  301891   KLEPNEP   ＞32   ＝4   ＝4   ＝16   ＝16   ＜＝2
  301892   ESCCOL   ＞32   ＝32*   ＝4*   ＝64*   ＝4*   ＝4
  301894   ESCCOL   ＞32   ＝16*   ＜＝0.25*   ＞128*   ＝2*   ＜＝2
  301896   ESCCOL   ＞32   ＝64*   ＜＝0.25*   ＞128*   ＝1*   ＜＝2
  301898   KLEPNEP   ＞32   ＞64   ＞64   ＞128   ＞128   ＝4
  301899   KLEPNEP   ＞32   ＞64   ＞64   ＞128   ＞128   ＝4
  301905   ESCCOL   ＞32   ＞64   ＝16   ＝32   ＝16   ＝8
  301916   KLEPNEP   ＞32   ＞64   ＞64   ＞128   ＞128   ＝8
  301917   KLEPNEP   ＞32   ＝32*   ＝0.5*   ＝4*   ＝2*   ＝8
  301918   ESCCOL   ＞32   ＞64   ＞64   ＞128   ＞128   ＝16
  301919   KLEPNEP   ＞32   ＝16*   ＜＝0.25*   ＝32*   ＜＝0.25*   ＜＝2
  301920   KLEPNEP   ＞32   ＞64*   ＜＝0.25*   ＝64*   ＜＝0.25*   ＜＝2
  301921   ESCCOL   ＞32   ＞64*   ＜＝0.25*   ＝32*   ＜＝0.25*   ＜＝2
  301922   ESCCOL   ＞32   ＞64*   ＜＝0.25*   ＝16*   ＝0.5*   ＜＝0.25
  303364   ESCCOL   ＞32   ＝32   ＝16   ＝128   ＝64   ＜＝2
  303365   ESCCOL   ＞32   ＞64*   ＜＝0.25*   ＞128*   ＝1*   ＜＝2
  303369   ESCCOL   ＞32   ＝32   ＝8   ＝64   ＝64   ＜＝2
  303375   KLEPNEP   ＞32   ＝32   ＝64   ＝64   ＝64   ＜＝2
  303990   KLEOXY   ＞32   ＞64   ＞64   ＝128   ＝128   ＝16
ESCCOL＝大肠杆菌          CCX＝克拉维酸+头孢噻肟
KLEOXY＝产酸克雷伯氏菌    CCZ＝克拉维酸+头孢他啶
KLEPNEP＝肺炎克雷伯氏菌
KPC实时PCR测定法：使用在“材料和方法”中概述的热裂解方案，从在表3中所列出的菌株中分离出总DNA。在实时PCR分析之前将总DNA稀释至少1/20，以稀释掉在经热裂解的样品中存在的任何抑制性蛋白质。将DNA样品的等分试样放置到PCR主混合物中，所述PCR主混合物包含每种引物、经双重标记的探针和
Figure A20088001640500301
Universal Fast PCRMaster Mix(Applied Biosystems，Foster City，CA)。在所述实时测定法中所使用的引物和探针的序列可以在表2中找到。样品在Applied Biosystems(ABI)7500 Fast Real-Time PCR System(AppliedBiosystems，Foster City，CA)上运行，在此使用2阶段2步PCR程序(40个循环)。所有测定法一式两份地运行，并且根据用户定义的基线和CT，使用ABI Sequence Detection软件v1.3.1(AppliedBiosystems，Foster City，CA)来计算样品的循环阈值(CT)的值。对于阳性对照，将CT设定在曲线的线性或指数期中。将关于所述分析的基线设定在不具有任何与该CT相交的样品的区域中(第3-12个循环)。为了测定关于阳性或阴性判读的CT范围，分析了阳性和阴性对照。表4中可见的范围(即最小CT判读或最大CT判读)被计算为距离平均CT+/-6标准差(StdDev)，所述平均CT通过使用所有KPC测定法(87，289，和758)从阳性或阴性对照中计算出来。这些阳性和阴性判读范围用于对所有菌株进行评分。
表4：关于KPC实时测定法的判读范围。所有测定法一式两份地运行，并且根据用户定义的背景和CT，使用ABI Sequence Detection软件来计算所有样品的CT值。将最小CT判读(Min CT Call)和最大CT判读(MaxCT Call)计算为距离阳性或阴性对照的平均CT(来自所有KPC测定法)+/-6 StdDev。
Figure A20088001640500311
在给定KPC测定法内的所有重复的阳性反应为彼此的0.3 StdDev。
表5包含关于经测试的所有24种菌株的判读；通过使用对于给定菌株跨越所有KPC测定法而计算出的平均CT值来产生这些判读。在所测试的24种菌株中，总共10种菌株被判读为阳性。在表6中，对于所有阳性和阴性菌株，使用来自表5的判读和平均(Avg)CT值来计算平均(Avg)CT内(Intra-CT)距离(最大阳性/阴性Avg CT-最小阳性/阴性Avg CT)、平均CT、和平均CT间(Inter-CT)距离(阳性Avg CT-阴性Avg CT)。在阳性菌株中的Avg Intra-CT距离在彼此的4.4CT内，并且AvgInter-CT距离比阴性对照小14.4CT。这些结果表明，这些测定法可以以许多数量级(为精确的214.4)来将阳性菌株与阴性菌株相区别，假定所述测定法是100％有效的(E＝2，即每个循环产生2个拷贝)。作为对所述测定法进行优化的一部分，所述测定法的效率已确定为＞98％。
表5：关于碳青霉烯抗性的且产生ESBL的菌株的CT值。对于表3中所列出的所有菌株，一式两份地进行KPC实时PCR测定法。根据用户定义的背景和CT，使用ABI Sequence Detection软件来计算CT值。对于待判读的样品，CT值必须在任一对照的6 StdDev之内。经测试的所有样品在已知的阳性和阴性对照的6 StdDev之内。在所测试的24种中鉴定出了总共10种阳性菌株。
Figure A20088001640500321
Figure A20088001640500331
表6：来自所有菌株和测定法的概括性结果。基于表4中建立的判读标准，对于所有阳性和阴性菌株，使用来自KPC测定法的值来计算平均CT内距离(最大阳性CT-最小阳性CT)、平均CT、和平均CT间距离(阳性Avg CT-阴性Avg CT)。
Figure A20088001640500342
*使用在表5中找到的平均CT值来计算这些值。
在给定KPC测定法内的所有重复的阳性反应为彼此的0.3 StdDev。
如先前指出的，由于在使用KPC-3变体的测定法的反向引物中具有一个碱基对错配，因而在KPC-758测定法中不存在灵敏度的减少。这可以在表4中看出，请观察与KPC-1菌株301916(Avg CT＝16.4)或KPC-2菌株301917(Avg CT＝18.5)相比较，经序列验证的KPC-3菌株301918的Avg CT(Avg CT＝16.2)。
对实时阳性菌株进行测序：为了核实所述实时测定法，对所有阳性判读进行序列验证。通过使用扩增KPC基因的整个开放读码框或编码序列的引物(Yigit等人，2001(3)；和Bratu等人，2005(5))来进行标准PCR。如在“材料和方法”中所描述的，对PCR扩增子进行清理和测序。对PCR扩增子的反向链进行测序和修整。基于通过Sequencing Analysis软件v5.1(Applied Biosystems，Foster City，CA)中的KB basecaller而评估的品质值(quality value)来对序列进行修整。将具有＞20的品质值的碱基用于NCBI比较。读数的平均长度为＞500bp。通过使用来自NCBI的BLAST算法，将所述序列与GenBank中的非丰余序列进行比较。来自实时测定法的所有阳性以＞99％的覆盖和＞99％的序列同一性匹配可利用的GenBank KPC序列，并且与任何其他基因不具有任何显著的同一性。因此，这个菌株攻击组中的这些KPC实时测定法以100％的灵敏度和100％的特异性来进行，而采用处于≥16μg/ml的IPM抗性的CLSI标准微培养液稀释法具有58.8％的灵敏度(7个假阴性＝菌株ID 300996、301888、301892、301894、301905、301916、301917)和100％的特异性性能(2)。
灵敏度实时PCR测定法：使用阳性对照菌株(菌株ID 301916)来建立5倍DNA稀释方案(20ng至2fg)。在每个实验内使用阴性对照(菌株ID 300960)来对于每个测定法建立阴性CT阈值。将95％置信区间(CI)应用于阴性CT阈值。为了计算CI，将表4中列出的历史标准差(StdDev)(0.9)乘以3(0.9×3＝2.7或3CT)，从而使得用于将样品判读为阴性的CT阈值被计算为3CT减去最低阴性对照CT。根据Yigit等人，2001和Woodford等人，2004，使用标准PCR反应和引物(正向#5和反向#10)。使标准PCR反应体系在凝胶电泳上走样，并且使用溴化乙锭和凝胶成像系统(gel documentationsystem)(Kodak 1D v3.6，New Haven，CT.)来进行显现。
直接样品测定法：将阳性(菌株ID 301916)和阴性(菌株ID 300960)菌株在包含5％绵羊红细胞(BD Diagnostic Systems，Sparks，MD)的TSA平板上进行划线培养，并且在35℃下生长过夜。将每种菌株的纯菌落放置到胰胨豆胨培养液(Trypticase Soy Broth，TSB)(BDDiagnostic Systems，Sparks，MD.)中，使用浊度计(BD DiagnosticSystems，Sparks，MD.)进行定量，并且在无菌的尿中稀释至1.0E+06、1.0E+05、1.0E+04和1.0E+03CFU/ml。通过离心来收集细菌，并且使用在“DNA提取方法”中所描述的标准热裂解来分离出DNA。在实时PCR和标准PCR反应中使用5微升的包含DNA的上清液。根据Yigit等人，2001和Woodford等人，2004，使用标准PCR反应和引物(编号取自Yigit等人，正向#5和反向#10)。将纯的阳性和阴性菌落接种到包含5ml无菌血液的Bactec需氧瓶中，并且放置到Bactec仪器(BD Diagnostic Systems，Sparks，MD.)中。当该仪器将瓶判读为阳性时，从所述瓶中取出100μl等分试样，并且放置到1.5ml管中。通过离心来收集细菌，并且使粒状沉淀直接热裂解，或者用100μl 85％盐水洗涤两次并随后进行热裂解。在实时PCR和标准PCR反应中使用5微升的包含DNA的上清液。在每个测定法中运行从纯的菌落中分离的阳性(菌株ID 301916)和阴性(菌株ID 300960)模板对照，以确保施行PCR反应。用于计算基因组拷贝或等价物的公式如下：[拷贝数＝(量(ng)*6.022×1023)/(长度*1×109*650)]。经估计的菌株ID 301919肺炎克雷伯氏菌的基因组大小或长度是2,900,000bp。
结果
KPC实时PCR灵敏度测定法：为了测定相比于已知的测定法而言本文所描述的实时测定法的灵敏度，建立了灵敏度测定法比较。为了建立这些实验，使用上文在“材料和方法”中概述的热裂解方案，从来自KPC阳性(菌株ID 301916)和阴性(菌株ID 300960)菌株的纯菌落中分离出总核酸。将核酸标准化至在TE缓冲液中100ng/μl，然后无菌稀释(5倍稀释方案)至20ng-2fg的范围。将核酸样品的5μl等分试样放置到实时PCR测定法(KPC-87和KPC-758)和标准(Std)PCR测定法中(引物来自Yigit等人，2001)。所有PCR测定法一式三份地运行。在ABI 7500 Fast Real-time PCR System(Applied Biosystems，Foster City，CA.)上运行实时测定法，在此使用2阶段2步PCR程序(40个循环)。标准PCR反应在ABI 2720 Thermal Cycler(AppliedBiosystems，Foster City，CA.)上运行，其中使用在Yigit等人，2001中概述的PCR程序。使标准PCR反应体系在凝胶电泳上走样，并且使用溴化乙锭和凝胶成像系统(Kodak 1D v3.6，New Haven，CT.)来进行显现(图1)。根据用户定义的基线和CT，使用ABI Sequence Detection软件v1.3.1(Applied Biosystems，Foster City，CA.)来计算实时PCR测定法的循环阈值(CT)的值。对于阳性对照，将CT设定在曲线的指数期中。将关于所述分析的基线设定在不具有任何与该CT相交的样品的区域中(第3-12个循环)。为了测定关于阴性判读的CT范围，在该实验内分析了阴性对照。仅基于在该实验中同时运行的阴性对照，而不是基于表4中可见的历史阴性CT阈值，来设定阴性CT阈值。这一策略背后的原因是，在这些实验中使用的试剂(例如，商购可得的主混合物)未对这些引物探针测定法进行特别地优化，并且阴性对照的性能可能基于这些试剂而改变。这个阴性对照变化可以对于测定这些测定法的灵敏度具有显著的影响。为了建立关于阴性对照阈值的95％置信区间(CI)，将表4中列出的历史标准差(StdDev)(0.9)乘以3(0.9×3＝2.7或3CT)，从而使得用于将样品判读为阴性的CT阈值被计算为3CT减去最低阴性对照CT。
通过对于表7中列出的每个实时测定法使用最低阴性对照CT值减去3CT(CI)，对于该实验中的每个测定法计算出阴性CT阈值。基于这个公式，关于KPC-87的阴性CT阈值是＞35CT，和关于KPC-758的阴性CT阈值是＞30CT。因此，KPC-87和KPC-758测定法的可靠的灵敏度位于来自阳性KPC菌株的1.3E-03ng或1.3pg的核酸浓度。为了将这个值转变成基因组拷贝或等价物，必须假定核酸输入是所有基因组DNA，然后使用在上文的“材料和方法”部分中找到的等式。使用这个公式，我们计算出，所述实时测定法可以可靠地检测出42个基因组等价物。与所述实时测定法相比较而言，Std PCR测定法具有在来自阳性KPC菌株的3.2E-02ng或32pg的核酸浓度时在所有所述三个重复内可靠地检测出条带的能力。我们计算出，Std PCR测定法可以可靠地检测出1,000个基因组等价物。因此，本文所描述的实时测定法的灵敏度比在Yigit等人，2001和Woodford等人，2004中所描述的Std PCR测定法更灵敏至少1个数量级。
表7：关于KPC-87和KPC-758的灵敏度实验。使用阳性对照菌株(301916)来建立DNA稀释方案(20ng至2fg)。通过使用最低阴性对照CT值(300960)减去3CT(CI)，对于每个测定法建立阴性CT阈值(对于KPC-87为＞35CT，和对于KPC-758为＞30)。基于这些标准，对于KPC-87的可靠检测极限是＜31CT，和对于KPC-758是＜29.5CT。这将所述两个测定法的灵敏度置于1.3pg(42个基因组等价物)。
Figure A20088001640500391
ND(未检测出)：在40个循环内，荧光信号未与CT相交。
直接样品分析：为了测定实时测定法(KPC-87和KPC-758)检测原始或直接样品(血液和尿)中的KPC的能力，和为了将该能力与Std PCR测定法相比较，进行直接样品比较测定法。为了建立尿直接样品实验，将每种菌株(301916和300960)的纯菌落放置到胰胨豆胨培养液(TSB)(BD Diagnostic Systems，Sparks，MD.)中，使用浊度计(BDDiagnostic Systems，Sparks，MD.)进行定量，并且随后在无菌的尿中稀释至1.0E+06、1.0E+05、1.0E+04和1.0E+03CFU/ml。通过离心来收集细菌，并且使用在“DNA提取方法”中所描述的标准热裂解来分离出DNA。将核酸样品的5μl等分试样放置到实时PCR测定法(KPC-87和KPC-758)和标准(Std)PCR测定法中(引物来自Yigit等人，2001)。所有PCR测定法一式三份地运行。如先前所描述的，运行并分析实时测定法和标准PCR反应。基于表8中列出的阴性对照CT值，使用关于每个测定法的最低阴性CT值减去3CT(CI)，对于每个测定法建立阴性CT阈值。基于这些标准，对于KPC-87和KPC-758的阴性CT阈值是＞35CT。对于这个实验，由于KPC-87不具有CT，因而将关于KPC-758测定法的最低CT用作关于阴性对照的守恒值(conservative value)。因此，对于KPC-87的可靠阳性CT判读或检测极限是＜33CT，和对于KPC-758是＜32CT，这转变成在尿样品中1.0E+04CFU/ml的可靠检测水平。由于与尿道感染(UTI)相关的平均生物负荷是1.0E+05CFU/ml，所以这个水平是非常重要的。随着进一步优化，可以使该灵敏度更加低。还使用Std PCR引物来分析从这些尿样品中提取的相同核酸。没有一个样品产生条带，除了阳性模板对照(PTC)外。因此，在Yigit等人，2001和Woodford等人，2004中所描述的Std PCR测定法不能在直接尿样品中起作用。在每个测定法中运行从纯菌落中分离的阳性(菌株ID 301916)和阴性(菌株ID 300960)模板对照，以确保施行PCR反应。
为了建立血液直接样品实验，将每种菌株(菌株301916和菌株300960)的纯菌落接种到包含5ml无菌血液的Bactec需氧+瓶中，并且放置到Bactec仪器(BD Diagnostic Systems，Sparks，MD.)中。当该仪器将瓶判读为阳性时，从所述瓶中取出100μl等分试样，并且放置到1.5ml管中。通过离心来收集细菌，并且使粒状沉淀直接热裂解，或者进行洗涤并随后热裂解。将核酸样品的5μl等分试样放置到实时PCR测定法(KPC-87和KPC-758)和Std PCR测定法(Yigit等人，2001)中。所有PCR测定法一式三份地运行。如先前所描述的，运行并分析实时测定法和标准PCR反应。计算出的对于KPC-87和KPC-758的阴性CT阈值是＞33CT。因此，对于KPC-87的可靠阳性CT判读或检测极限是＜30CT，和对于KPC-758是＜28CT。使用表7中的标准曲线信息，在血液中这两种测定法的检测水平是约6.4pg或2,000个基因组等价物。当考虑到从阳性Bactec瓶中将血液稀释了1/100(100μl样品(1/10)，并且分析了总共50μl中的5μl(1/10))，那么阳性Bactec瓶中的起始CFU/ml为2.0E+05CFU/ml。由于包含克雷伯氏菌属物种的阳性Bactec瓶的平均CFU/ml在理论上是1.0E+05-1.0E+06CFU/ml，所以这个结果是非常重要的。
如从图2中看出的，Std PCR引物不产生可见的条带，除了阳性模板对照(PTC)外。因此，在Yigit等人，2001和Woodford等人，2004中所描述的Std PCR测定法不能在阳性血液培养物样品中起作用。在每个测定法中运行从纯菌落中分离的阳性(菌株ID 301916)和阴性(菌株ID 300960)模板对照，以确保施行PCR反应。
表8：关于KPC-87和KPC-758的直接样品实验。如在方法中所描述的，将阳性(301916)和阴性对照(300960)刺入无菌血液或尿样品中。对于这两个实时测定法建立尿阴性CT阈值＞35CT。基于这些标准，对于KPC-87的可靠阳性CT判读是＜33CT，和关于KPC-758是＜32CT，这转变成在尿样品中1.0E+04CFU/ml的可靠检测水平。对于这两个实时测定法建立血液阴性CT阈值＞33CT，并且对于KPC-87的可靠阳性CT判读或检测极限是＜30CT，和对于KPC-758是＜28CT。使用来自表7的标准曲线CT信息，在血液中这两种测定法的检测水平是约6.4pg或2,000个基因组等价物。
NA(不可用)：没有计算出CFU(菌落形成单位)值，
ND(未检测出)：在40个循环内，荧光信号未与CT相交。
参考文献
1.Clinical and Laboratory Standard Institute.2006.Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests forBacteria That Grow Aerobically；Approved Standard-SeventhEdition M7-A7.Clinical and Laboratory Standard Institute，Wayne，Pa.
2.Clinical and Laboratory Standard Institute.2007.Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing；Seventeenth Informational Supplement M100-S17.Clinical andLaboratory Standard Institute，Wayne，Pa.
3.Yigit等人，2001.Novel carbapenem-hydrolyzing β-lactamase，KPC-1，from a carbapenem-resistant strain ofKlebsiella pneumoniae.Antimicrob.Agents Chemother 45：1151-1161.
4.Moland等人，2003.Plasmid-mediated，carbapenem-hydrolysing b-lactamase，KPC-2，in Klebsiella pneumoniaeisolates.Journal of Antimicrobial Chemotherapy 51：711-714.
5.Bratu等人，2005.Carbapenemase-producing Klebsiellapneumoniae in Brooklyn，NY：molecular epidemiology and in vitroactivity of polymyxin B and other agents.Journal ofAntimicrobial Chemotherapy 56：128-132.
6.Bratu等人，2005a.Rapid spread of carbapenem-resistantKlebsiella pneumoniae in New York City：a new threat to ourantibiotic armamentarium.Arch Intern Med.165(12)：1430-5.
本说明书中所提及的所有出版物和专利申请表明了本发明所属领域的技术人员的水平。所有出版物和专利申请通过提及而合并入本文，就如同每一单个出版物或专利申请被明确和单独地说明通过提及而合并入本文一样。
尽管已通过举例说明和实施例一定程度地详细描述了前述的发明(为了清楚理解的目的)，但显而易见的是可以在所附权利要求的范围内实践某些改变和修饰。
序列表
<110>Whiteford，Craig C.
     Yu，Charles
<120>用于鉴定碳青霉烯酶基因的组合物和方法
<130>35510/342810
<150>60/910,535
<151>2007-04-06
<160>20
<170>FastSEQ for Windows Version 4.0
<210>1
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>1
cgcggaacca ttcgctaa      18
<210>2
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>2
cggtatccat cgcgtacaca    20
<210>3
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸探针
<400>3
ctcgaacagg actttggcgg ctcc          24
<210>4
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>4
ggcaaaaatg cgctggtt                 18
<210>5
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<400>5
gccaccgtca tgcctgtt                 18
<210>6
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸探针
<400>6
cgtggtcacc catctcggaa aaatatctga    30
<210>7
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>7
ggcgcgcacc tattgtgt                                                18
<210>8
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>8
cgctgtgctt gtcatccttg t                                            21
<210>9
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸探针
<400>9
ccgtctacac ccgggcgcct                                              20
<210>10
<211>1377
<212>DNA
<213>肺炎克雷伯氏菌
<220>
<221>misc_feature
<222>(0)...(0)
<223>KPC-1同种型(GenBank登录号AF297554)
<400>10
cggggcagtt acagccgtta cagcctctgg agagggagcg gcttgccgct cggtgataat  60
cccagctgta gcggcctgat tacatccggc cgctacacct agctccacct tcaaacaagg 120
aatatcgttg atgtcactgt atcgccgtct agttctgctg tcttgtctct catggccgct 180
ggctggcttt tctgccaccg cgctgaccaa cctcgtcgcg gaaccattcg ctaaactcga 240
acaggacttt ggcggctcca tcggtgtgta cgcgatggat accggctcag gcgcaactgt 300
aagttaccgc gctgaggagc gcttcccact gtgcagctca ttcaagggct ttcttgctgc 360
cgctgtgctg gctcgcagcc agcagcaggc cggcttgctg gacacaccca tccgttacgg 420
caaaaatgcg ctggttccgt ggtcacccat ctcggaaaaa tatctgacaa caggcatgac  480
ggtggcggag ctgtccgcgg ccgccgtgca atacagtgat aacgccgccg ccaatttgtt  540
gctgaaggag ttgggcggcc cggccgggct gacggccttc atgcgctcta tcggcgatac  600
cacgttccgt ctggaccgct gggagctgga gctgaactcc gccatcccaa gcgatgcgcg  660
cgatacctca tcgccgcgcg ccgtgacgga aagcttacaa aaactgacac tgggctctgc  720
actggctgcg ccgcagcggc agcagtttgt tgattggcta aagggaaaca cgaccggcaa  780
ccaccgcatc cgcgcggcgg tgccggcaga ctgggcagtc ggagacaaaa ccggaacctg  840
cggagtgtat ggcacggcaa atgactatgc cgtcgtctgg cccactgggc gcgcacctat  900
tgtgttggcc gtctacaccc gggcgcctaa caaggatgac aagcacagcg aggccgtcat  960
cgccgctgcg gctagactcg cgctcgaggg attgggcgtc aacgggcagt aaggctctga 1020
aaatcatcta ttggcccacc accgccgccc ttgcgggcgg catggattac caaccactgt 1080
cacatttagg ctaggagtct gcgcggcaga gccgtgtgac cggttttctg tagagcactg 1140
acgatggcgg cggcgctctc tgcaattggc aaggcgtcgg cgccaaggat accaatcttg 1200
cggcgcgcgg cgtgttatga cgactggggt gcatttgagc cgccccattt aaccttcgcc 1260
ctcacagata cgccattcgc ctcaaattta gcgccatgca gacgagcttc cactcggctt 1320
gcaccttgtc caggcccctc atgctgaact gacgcaatcc catcaccgcc ttgatca    1377
<210>11
<211>960
<212>DNA
<213>肺炎克雷伯氏菌
<220>
<221>misc_feature
<222>(0)...(0)
<223>KPC-3同种型(GenBank登录号AF395881)
<400>11
atgtcactgt atcgccgtct agttctgctg tcttgtctct catggccgct ggctggcttt  60
tctgccaccg cgctgaccaa cctcgtcgcg gaaccattcg ctaaactcga acaggacttt 120
ggcggctcca tcggtgtgta cgcgatggat accggctcag gcgcaactgt aagttaccgc 180
gctgaggagc gcttcccact gtgcagctca ttcaagggct ttcttgctgc cgctgtgctg 240
gctcgcagcc agcagcaggc cggcttgctg gacacaccca tccgttacgg caaaaatgcg 300
ctggttccgt ggtcacccat ctcggaaaaa tatctgacaa caggcatgac ggtggcggag 360
ctgtccgcgg ccgccgtgca atacagtgat aacgccgccg ccaatttgtt gctgaaggag 420
ttgggcggcc cggccgggct gacggccttc atgcgctcta tcggcgatac cacgttccgt 480
ctggaccgct gggagctgga gctgaactcc gccatcccag gcgatgcgcg cgatacctca 540
tcgccgcgcg ccgtgacgga aagcttacaa aaactgacac tgggctctgc actggctgcg 600
ccgcagcggc agcagtttgt tgattggcta aagggaaaca cgaccggcaa ccaccgcatc 660
cgcgcggcgg tgccggcaga ctgggcagtc ggagacaaaa ccggaacctg cggagtgtat 720
ggcacggcaa atgactatgc cgtcgtctgg cccactgggc gcgcacctat tgtgttggcc 780
gtctacaccc gggcgcctaa caaggatgac aagtacagcg aggccgtcat cgccgctgcg 840
gctagactcg cgctcgaggg attgggcgtc aacgggcagt aaggctctga aaatcatcta 900
ttggcccacc accgccgccc ttgcgggcgg catggattac caaccactgt cacatttagg 960
<210>12
<211>918
<212>DNA
<213>肺炎克雷伯氏菌
<220>
<221>misc_feature
<222>(0)...(0)
<223>KPC-2同种型(GenBank登录号AY034847)
<400>12
cgttgatgtc actgtatcgc cgtctagttc tgctgtcttg tctctcatgg ccgctggctg  60
gcttttctgc caccgcgctg accaacctcg tcgcggaacc attcgctaaa ctcgaacagg 120
actttggcgg ctccatcggt gtgtacgcga tggataccgg ctcaggcgca actgtaagtt 180
accgcgctga ggagcgcttc ccactgtgca gctcattcaa gggctttctt gctgccgctg 240
tgctggctcg cagccagcag caggccggct tgctggacac acccatccgt tacggcaaaa 300
atgcgctggt tccgtggtca cccatctcgg aaaaatatct gacaacaggc atgacggtgg 360
cggagctgtc cgcggccgcc gtgcaataca gtgataacgc cgccgccaat ttgttgctga 420
aggagttggg cggcccggcc gggctgacgg ccttcatgcg ctctatcggc gataccacgt 480
tccgtctgga ccgctgggag ctggagctga actccgccat cccaggcgat gcgcgcgata 540
cctcatcgcc gcgcgccgtg acggaaagct tacaaaaact gacactgggc tctgcactgg 600
ctgcgccgca gcggcagcag tttgttgatt ggctaaaggg aaacacgacc ggcaaccacc 660
gcatccgcgc ggcggtgccg gcagactggg cagtcggaga caaaaccgga acctgcggag 720
tgtatggcac ggcaaatgac tatgccgtcg tctggcccac tgggcgcgca cctattgtgt 780
tggccgtcta cacccgggcg cctaacaagg atgacaagca cagcgaggcc gtcatcgccg 840
ctgcggctag actcgcgctc gagggattgg gcgtcaacgg gcagtaaggc tctgaaaatc 900
atctattggc ccaccacc                                               918
<210>13
<211>881
<212>DNA
<213>肺炎克雷伯氏菌
<220>
<221>misc_feature
<222>(0)...(0)
<223>KPC-4同种型(GenBank登录号AY700571)
<400>13
tgtcactgta tcgccgtcta gttctgctgt cttgtctctc atggccgctg gctggctttt  60
ctgccaccgc gctgaccaac ctcgtcgcgg aaccattcgc taaactcgaa caggactttg 120
gcggctccat cggtgtgtac gcgatggata ccggctcagg cgcaactgta agttaccgcg 180
ctgaggagcg cttcccactg tgcagctcat tcaagggctt tcttgctgcc gctgtgctgg 240
ctcgcagcca gcagcaggcc ggcttgctgg acacacccat ccgttacggc aaaaatgcgc 300
tggttcggtg gtcacccatc tcggaaaaat atctgacaac aggcatgacg gtggcggagc 360
tgtccgcggc cgccgtgcaa tacagtgata acgccgccgc caatttgttg ctgaaggagt 420
tgggcggccc ggccgggctg acggccttca tgcgctctat cggcgatacc acgttccgtc 480
tggaccgctg ggagctggag ctgaactccg ccatcccagg cgatgcgcgc gatacctcat 540
cgccgcgcgc cgtgacggaa agcttacaaa aactgacact gggctctgca ctggctgcgc 600
cgcagcggca gcagtttgtt gattggctaa agggaaacac gaccggcaac caccgcatcc 660
gcgcggcggt gccggcagac tgggcagtcg gagacaaaac cggaacctgc ggagggtatg 720
gcacggcaaa tgactatgcc gtcgtctggc ccactgggcg cgcacctatt gtgttggccg 780
tctacacccg ggcgcctaac aaggatgaca agcacagcga ggccgtcatc gccgctgcgg 840
ctagactcgc gctcgaggga ttgggcgtca acgggcagta a                     881
<210>14
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>14
gaaccattcg ctaaactcga aca                                          23
<210>15
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>15
ccgtcatgcc tgttgtcaga                                              20
<210>16
<211>15
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸探针
<400>16
cccatctcgg aaaaa            15
<210>17
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>17
cgccgtgcaa tacagtgata ac    22
<210>18
<211>14
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>18
cgggccgccc aact             14
<210>19
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸探针
<400>19
ccgccaattt gttgctga         18
<210>20
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>20
actgggcgcg caccta    16

Claims (16)

1.用于鉴定包含碳青霉烯酶的细菌的分离的核酸分子，所述核酸分子选自SEQ ID NO：1-9和14-20。
2.权利要求1的核酸分子，其中所述分子可在PCR反应中用作引物。
3.权利要求2的核酸分子，其中所述分子是选自SEQ ID NO：1、2、4、5、7、8、14、15、17、18和20的核酸分子。
4.权利要求1的核酸分子，其中所述分子可用作探针。
5.权利要求4的核酸分子，其中所述分子是选自SEQ ID NO：3、6、9、16和19的核酸分子。
6.对于碳青霉烯酶特异的PCR引物组，所述引物组包含具有SEQ IDNO：1和SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：8，或者SEQ ID NO：17和18中所示的序列的寡核苷酸对，其中所述引物在用于检测样品中包含碳青霉烯酶的细菌的存在情况的PCR测定法中是有效的。
7.通过使用在编码碳青霉烯酶的核苷酸序列中存在的靶核酸区域的基于聚合酶的扩增，来检测样品中具有碳青霉烯抗性的细菌的存在情况的方法，所述方法包括：
a)提供怀疑包含所述碳青霉烯抗性细菌的测试样品；
b)在足以提供包含所述靶核酸区域的基于聚合酶的核酸扩增产物的条件下，使所述样品与至少第一和第二寡核苷酸引物接触，其中所述至少第一和第二寡核苷酸引物选自：
i)包含SEQ ID NO：1的第一寡核苷酸引物和包含SEQ ID NO：2的第二寡核苷酸引物；
ii)包含SEQ ID NO：4的第一寡核苷酸引物和包含SEQ ID NO：5的第二寡核苷酸引物；
iii)包含SEQ ID NO：7的第一寡核苷酸引物和包含SEQ ID NO：8的第二寡核苷酸引物；
iv)包含SEQ ID NO：14的第一寡核苷酸引物和包含SEQ ID NO：2的第二寡核苷酸引物；
v)包含SEQ ID NO：4的第一寡核苷酸引物和包含SEQ ID NO：15的第二寡核苷酸引物；
vi)包含SEQ ID NO：20的第一寡核苷酸引物和包含SEQ ID NO：8的第二寡核苷酸引物；
vii)包含SEQ ID NO：17的第一寡核苷酸引物和包含SEQ IDNO：18的第二寡核苷酸引物；和
c)检测扩增出的产物。
8.权利要求7的方法，其中所述样品是直接样品。
9.权利要求7的方法，其中所述基于聚合酶的核酸扩增是实时定量扩增。
10.用于检测来自患者的样品中包含碳青霉烯酶的细菌的存在情况的方法，所述方法包括：
(a)提供来自所述患者的样品；
(b)从所述样品中分离和纯化出核酸；
(c)形成聚合酶链式反应溶液，其包含来自步骤(b)的核酸的至少部分、核苷三磷酸单体的混合物、缓冲溶液中的酶Taq聚合酶、和PCR引物组，所述PCR引物组选自：
i)包含SEQ ID NO：1的第一寡核苷酸引物和包含SEQ ID NO：2的第二寡核苷酸引物；
ii)包含SEQ ID NO：4的第一寡核苷酸引物和包含SEQ ID NO：5的第二寡核苷酸引物；
iii)包含SEQ ID NO：7的第一寡核苷酸引物和包含SEQ ID NO：8的第二寡核苷酸引物；
iv)包含SEQ ID NO：14的第一寡核苷酸引物和包含SEQ ID NO：2的第二寡核苷酸引物；
v)包含SEQ ID NO：4的第一寡核苷酸引物和包含SEQ ID NO：15的第二寡核苷酸引物；
vi)包含SEQ ID NO：20的第一寡核苷酸引物和包含SEQ ID NO：8的第二寡核苷酸引物；
vii)包含SEQ ID NO：17的第一寡核苷酸引物和包含SEQ IDNO：18的第二寡核苷酸引物；和
(d)对所述PCR反应溶液施行聚合酶链式反应，以扩增出任何编码所述碳青霉烯酶的核苷酸序列；
(e)就碳青霉烯酶PCR产物的存在情况来分析在所述聚合酶链式反应中获得的核酸，其中所述产物的存在是所述样品中存在有所述细菌的指示。
11.权利要求10的方法，其中所述聚合酶链式反应是实时定量PCR。
12.用于治疗感染的方法，所述方法包括：
(a)从怀疑具有感染的患者中获得样品；
(b)通过PCR就碳青霉烯酶基因的存在情况来测试所述样品，其中使用选自下列的引物组：
i)包含SEQ ID NO：1的第一寡核苷酸引物和包含SEQ ID NO：2的第二寡核苷酸引物；或
ii)包含SEQ ID NO：4的第一寡核苷酸引物和包含SEQ ID NO：5的第二寡核苷酸引物；或
iii)包含SEQ ID NO：7的第一寡核苷酸引物和包含SEQ ID NO：8的第二寡核苷酸引物；或
iv)包含SEQ ID NO：14的第一寡核苷酸引物和包含SEQ ID NO：2的第二寡核苷酸引物；或
v)包含SEQ ID NO：4的第一寡核苷酸引物和包含SEQ ID NO：15的第二寡核苷酸引物；或
vi)包含SEQ ID NO：20的第一寡核苷酸引物和包含SEQ ID NO：8的第二寡核苷酸引物；或
vii)包含SEQ ID NO：17的第一寡核苷酸引物和包含SEQ IDNO：18的第二寡核苷酸引物；
其中阳性测试表明有着显示出碳青霉烯抗性的细菌菌株，
并且对所述患者给予备选的抗生素。
13.权利要求12的方法，其中所述样品是直接样品。
14.权利要求12的方法，其中所述PCR是实时定量PCR。
15.用于检测具有碳青霉烯抗性的细菌菌株的试剂盒，其包含选自下列的引物组：
a)包含SEQ ID NO：1的第一寡核苷酸引物和包含SEQ ID NO：2的第二寡核苷酸引物；或
b)包含SEQ ID NO：4的第一寡核苷酸引物和包含SEQ ID NO：5的第二寡核苷酸引物；或
c)包含SEQ ID NO：7的第一寡核苷酸引物和包含SEQ ID NO：8的第二寡核苷酸引物；或
c)包含SEQ ID NO：14的第一寡核苷酸引物和包含SEQ ID NO：2的第二寡核苷酸引物；或
d)包含SEQ ID NO：4的第一寡核苷酸引物和包含SEQ ID NO：15的第二寡核苷酸引物；或
e)包含SEQ ID NO：20的第一寡核苷酸引物和包含SEQ ID NO：8的第二寡核苷酸引物；或
f)包含SEQ ID NO：17的第一寡核苷酸引物和包含SEQ ID NO：18的第二寡核苷酸引物。
16.权利要求15的试剂盒，其中所述试剂盒进一步包含寡核苷酸，所述寡核苷酸包含至少一种选自SEQ ID NO：3、6、9、16和19的核酸分子。
CN200880016405.7A 2007-04-06 2008-04-07 用于鉴定碳青霉烯酶基因的组合物和方法 Active CN101680034B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510917644.1A CN105349685B (zh) 2007-04-06 2008-04-07 用于鉴定碳青霉烯酶基因的组合物和方法

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US91053507P 2007-04-06 2007-04-06
US60/910,535 2007-04-06
PCT/US2008/059535 WO2008124670A2 (en) 2007-04-06 2008-04-07 Compositions and methods for the identification of a carbapenemase gene

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201510917644.1A Division CN105349685B (zh) 2007-04-06 2008-04-07 用于鉴定碳青霉烯酶基因的组合物和方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN101680034A true CN101680034A (zh) 2010-03-24
CN101680034B CN101680034B (zh) 2015-12-16

Family

ID=39615688

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201510917644.1A Active CN105349685B (zh) 2007-04-06 2008-04-07 用于鉴定碳青霉烯酶基因的组合物和方法
CN200880016405.7A Active CN101680034B (zh) 2007-04-06 2008-04-07 用于鉴定碳青霉烯酶基因的组合物和方法

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201510917644.1A Active CN105349685B (zh) 2007-04-06 2008-04-07 用于鉴定碳青霉烯酶基因的组合物和方法

Country Status (8)

Country Link
US (3) US7968292B2 (zh)
EP (1) EP2132333B1 (zh)
JP (1) JP5684563B2 (zh)
CN (2) CN105349685B (zh)
AT (1) ATE534753T1 (zh)
AU (1) AU2008237203B2 (zh)
CA (1) CA2682299C (zh)
WO (1) WO2008124670A2 (zh)

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102002529A (zh) * 2010-11-22 2011-04-06 浙江省疾病预防控制中心 碳青霉烯酶肺炎克雷伯氏菌的荧光检测试剂盒及检测方法
CN102652751A (zh) * 2011-03-04 2012-09-05 珠海联邦制药股份有限公司 一种含有头孢噻肟的药物组合物及其制剂和制备方法
CN102899414A (zh) * 2012-10-10 2013-01-30 南方医科大学 超级细菌ndm和kpc基因双重荧光定量pcr检测方法及其试剂盒
CN103088144A (zh) * 2013-01-30 2013-05-08 中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所 一种肺炎克雷伯菌kpc型碳青霉烯酶基因核酸检测试剂盒
CN103088146A (zh) * 2013-02-06 2013-05-08 台州市立医院 一种检测含有kpc-15基因肺炎克雷伯菌的pcr试剂盒
CN103130881A (zh) * 2013-02-06 2013-06-05 台州市立医院 一种肺炎克雷伯菌的耐药新基因
CN104169436A (zh) * 2011-12-01 2014-11-26 基因欧姆科技加拿大公司 革兰氏阴性菌中负责对碳青霉烯高水平抗性的kpc基因的扩增和检测的分子测定
CN104774949A (zh) * 2015-04-20 2015-07-15 海宁市疾病预防控制中心 一种肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶基因型检测方法

Families Citing this family (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2682299C (en) * 2007-04-06 2015-12-22 Becton, Dickinson And Company Compositions and methods for the identification of a carbapenemase gene
WO2010096723A1 (en) 2009-02-19 2010-08-26 Geneohm Sciences, Inc. Methods for the detection and identification of extended spectrum beta lactamases
FI20095544A0 (fi) * 2009-05-15 2009-05-15 Juha Kirveskari Menetelmä ja kitti antibioottiresistenttien bakteerien tunnistusta varten
CN103160574A (zh) * 2011-12-09 2013-06-19 中山大学达安基因股份有限公司 肺炎克雷伯菌核酸检测试剂盒(pcr-荧光探针法)
ES2689308T3 (es) 2012-12-31 2018-11-13 Fundación Para El Fomento De La Investigación Sanitaria Y Biomédica De La Comunitat Valenciana Cebadores para detección y tipado de cepas bacterianas productoras de carbapenemasas, método y kit de detección
WO2014178401A1 (ja) * 2013-05-01 2014-11-06 学校法人帝京大学 カルバペネム系薬耐性菌（ＫＰＣ β－ラクタマーゼ産生菌）の検出方法
WO2016094162A1 (en) 2014-12-12 2016-06-16 Elitechgroup B.V. Methods and compositions for detecting antibiotic resistant bacteria
WO2016094607A2 (en) 2014-12-12 2016-06-16 Elitechgroup B.V. Methods and compositions for detecting antibiotic resistant bacteria
EP4219734A1 (en) 2015-11-04 2023-08-02 The Translational Genomics Research Institute Systems and methods of diagnosing and characterizing infections
US11466329B2 (en) 2017-06-14 2022-10-11 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Detection of blaIMP antibacterial resistance genes
CN107523618A (zh) * 2017-08-15 2017-12-29 北京紫萌医药科技有限公司 包含产碳青霉烯酶基因的耐药菌的pcr检测试剂盒及其应用
EP3911754A4 (en) * 2019-01-15 2022-10-12 Tangen Biosciences Inc. METHOD FOR REMOVAL OF NON-SPECIFIC AMPLIFICATION PRODUCTS IN NUCLEIC ACID AMPLIFICATION TECHNOLOGIES
CN110904199A (zh) * 2019-11-22 2020-03-24 南方医科大学南方医院 检测碳青霉烯酶blaKPC基因的引物、方法及试剂盒
CN115369179A (zh) * 2022-10-08 2022-11-22 深圳盛源生物技术有限公司 一种用于快速检测kpc-2的试剂盒及方法
CN116875717B (zh) * 2023-09-07 2023-11-21 四川大学华西医院 检测肺炎克雷伯菌及碳青霉烯耐药基因的引物和探针、方法及试剂盒

Family Cites Families (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NL154598B (nl) 1970-11-10 1977-09-15 Organon Nv Werkwijze voor het aantonen en bepalen van laagmoleculire verbindingen en van eiwitten die deze verbindingen specifiek kunnen binden, alsmede testverpakking.
US3817837A (en) 1971-05-14 1974-06-18 Syva Corp Enzyme amplification assay
US3939350A (en) 1974-04-29 1976-02-17 Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Fluorescent immunoassay employing total reflection for activation
US3996345A (en) 1974-08-12 1976-12-07 Syva Company Fluorescence quenching with immunological pairs in immunoassays
US4277437A (en) 1978-04-05 1981-07-07 Syva Company Kit for carrying out chemically induced fluorescence immunoassay
US4275149A (en) 1978-11-24 1981-06-23 Syva Company Macromolecular environment control in specific receptor assays
US4458066A (en) 1980-02-29 1984-07-03 University Patents, Inc. Process for preparing polynucleotides
US4366241A (en) 1980-08-07 1982-12-28 Syva Company Concentrating zone method in heterogeneous immunoassays
KR100236506B1 (ko) 1990-11-29 2000-01-15 퍼킨-엘머시터스인스트루먼츠 폴리머라제 연쇄 반응 수행 장치
US6582908B2 (en) * 1990-12-06 2003-06-24 Affymetrix, Inc. Oligonucleotides
CA2218875C (en) 1991-07-23 2000-11-07 The Research Foundation Of State University Of New York Improvements in the in situ pcr
US5612473A (en) 1996-01-16 1997-03-18 Gull Laboratories Methods, kits and solutions for preparing sample material for nucleic acid amplification
GB9812768D0 (en) 1998-06-13 1998-08-12 Zeneca Ltd Methods
US6242223B1 (en) 1998-09-28 2001-06-05 Creighton University Primers for use in detecting beta-lactamases
US20040002080A1 (en) * 2001-12-14 2004-01-01 Creighton University Primers for use in detecting beta-lactamases
CA2682299C (en) * 2007-04-06 2015-12-22 Becton, Dickinson And Company Compositions and methods for the identification of a carbapenemase gene

Cited By (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102002529A (zh) * 2010-11-22 2011-04-06 浙江省疾病预防控制中心 碳青霉烯酶肺炎克雷伯氏菌的荧光检测试剂盒及检测方法
CN102652751A (zh) * 2011-03-04 2012-09-05 珠海联邦制药股份有限公司 一种含有头孢噻肟的药物组合物及其制剂和制备方法
CN104169436A (zh) * 2011-12-01 2014-11-26 基因欧姆科技加拿大公司 革兰氏阴性菌中负责对碳青霉烯高水平抗性的kpc基因的扩增和检测的分子测定
CN102899414A (zh) * 2012-10-10 2013-01-30 南方医科大学 超级细菌ndm和kpc基因双重荧光定量pcr检测方法及其试剂盒
CN103088144A (zh) * 2013-01-30 2013-05-08 中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所 一种肺炎克雷伯菌kpc型碳青霉烯酶基因核酸检测试剂盒
CN103088146A (zh) * 2013-02-06 2013-05-08 台州市立医院 一种检测含有kpc-15基因肺炎克雷伯菌的pcr试剂盒
CN103130881A (zh) * 2013-02-06 2013-06-05 台州市立医院 一种肺炎克雷伯菌的耐药新基因
CN103088146B (zh) * 2013-02-06 2014-07-16 台州市立医院 一种检测含有kpc-15基因肺炎克雷伯菌的pcr试剂盒
CN104774949A (zh) * 2015-04-20 2015-07-15 海宁市疾病预防控制中心 一种肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶基因型检测方法
CN104774949B (zh) * 2015-04-20 2017-08-11 海宁市疾病预防控制中心 一种肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶基因型检测方法

Also Published As

Publication number Publication date
US7968292B2 (en) 2011-06-28
CA2682299A1 (en) 2008-10-16
EP2132333A2 (en) 2009-12-16
WO2008124670A3 (en) 2008-12-04
EP2132333B1 (en) 2011-11-23
US20100016276A1 (en) 2010-01-21
US9085806B2 (en) 2015-07-21
WO2008124670A2 (en) 2008-10-16
JP2010523128A (ja) 2010-07-15
JP5684563B2 (ja) 2015-03-11
ATE534753T1 (de) 2011-12-15
CA2682299C (en) 2015-12-22
CN105349685B (zh) 2020-08-04
CN105349685A (zh) 2016-02-24
US20120071642A1 (en) 2012-03-22
US8324364B2 (en) 2012-12-04
AU2008237203B2 (en) 2014-08-14
AU2008237203A1 (en) 2008-10-16
US20130172309A1 (en) 2013-07-04
CN101680034B (zh) 2015-12-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101680034B (zh) 用于鉴定碳青霉烯酶基因的组合物和方法
Sakai et al. Simultaneous detection of Staphylococcus aureus and coagulase-negative staphylococci in positive blood cultures by real-time PCR with two fluorescence resonance energy transfer probe sets
De Baere et al. Classification of Ralstonia pickettii biovar 3/'thomasii'strains (Pickett 1994) and of new isolates related to nosocomial recurrent meningitis as Ralstonia mannitolytica sp. nov.
EP1370694B1 (en) Detection of methicillin-resistant staphylococcus aureus (mrsa)
Motoshima et al. Rapid and accurate detection of Pseudomonas aeruginosa by real-time polymerase chain reaction with melting curve analysis targeting gyrB gene
WO2011138402A1 (en) Assays, compositions and methods for detecting drug resistant micro-organisms
WO2016013940A2 (en) Novel test for microbial blood infections
US20120052492A1 (en) Oligonucleotides for detecting listeria spp. and use thereof
CN104169436A (zh) 革兰氏阴性菌中负责对碳青霉烯高水平抗性的kpc基因的扩增和检测的分子测定
KR20130094714A (ko) 비-정제된 샘플에서 세포 생존력을 결정하는데에 유용한 효소 활성을 측정하기 위한 방법
US5747252A (en) Nucleic acid probes and amplification oligonucleotides for Neisseria species
KR101775406B1 (ko) 그람음성균 및 항생제 내성에 관련된 유전자들의 동시 검출을 위한 방법 및 그 조성물
US6355435B1 (en) Methods for detecting and enumerating Campylobacter jejuni in environmental samples and for identifying antibiotic-resistant strains
US6268143B1 (en) Automated high throughput E. coli o157:H7 PCR detection system and uses thereof
EP0747489B1 (en) Nucleic acid probes and amplification oligonucleotides for Neisseria species
US20090017456A1 (en) Detection, identification and differentiation of eubacterial taxa using a hybridization assay
EP1798294B1 (en) Genetic process for multiplex terminal restriction fragment length polymorphism analysis
EP2566979B1 (en) Assays, compositions and methods for detecting drug resistant micro-organisms
EP2959012B1 (en) Sequences and their use for detection and characterization of e. coli o157:h7
WO2001018017A1 (en) Methods for detecting and enumerating campylobacter jejuni in environmental samples and for identifying antibiotic-resistant strains
AU2015289612A1 (en) Sequences and their use for detection of Listeria monocytogenes
Havaei et al. Comparison of PCR and culture methods for diagnosis of enteropathogenic Campylobacter in fowl feces
Al-Majali ASSESSMENT OF THE ANTIBACTERIAL EFFECTS OF MORINGA PEREGRINA EXTRACTS

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant