CN104774949B - 一种肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶基因型检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶基因型检测方法，所述方法为：以待测菌株基因为模板，在引物1和引物2作用下进行PCR扩增反应，然后以扩增产物为模板，在引物3‑引物8的混合引物作用下进行SNaPshot PCR反应；根据SNaPshot PCR反应产物进行分型；本发明首次提供了一种同时对KPC1‑KPC15共14种亚型的分型检测方法，检测通量较传统的定量检测方法都高，准确度可与测序检测方法相当，费用更低。
Description
(一)技术领域
本发明涉及一种肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶基因型检测方法。
(二)背景技术
肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)为常见院感病原菌，是临床医院感染重点监测的病原菌之一。随着碳青霉烯类抗生素的大范围使用，多药耐药株肺炎克雷伯菌不断出现。由肺炎克雷伯菌感染导致巴西大规模流行的“超级细菌”事件使全球的目光又聚焦到了“多重抗生素耐药”和“肺炎克雷伯菌”上。
据报道，一些肠杆科属细菌体内也发现携带肺炎克雷伯菌型碳青霉烯酶，如大肠埃希菌、沙门菌、阴沟肠杆菌、产酸克雷伯菌、沙雷菌等，使得利用临床抗生素治疗细菌感染性疾病失败或者造成治病疗程延缓。肺炎克雷伯菌产生耐药性的机理主要是菌体产生质粒介导的超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)和头孢菌素酶(AmpC酶)，进而导致菌体外膜孔蛋白丢失、抗菌药物主动外排、生物被膜形成、基因变异等，因此针对于抑制上述两种酶活性的抗生素治疗是解决肺炎克雷伯菌耐药性的关键。碳青霉烯类抗生素是目前临床使用的抗菌活性最强、抗菌谱最广的一类抗生素，尤其对产超广谱β-内酰胺酶和头孢菌素酶的菌株治疗效果极佳，因此在临床上被广泛使用。随着该类抗生素使用频率的不断提高，在世界范围内不断出现了产碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae carbapenemase，KPC)。碳青霉烯酶是一种由质粒编码并能够被克拉维酸抑制的酶类，能够水解碳青霉烯类、青霉素类、头孢菌素类和氨曲南等抗生素，因此该类菌株的出现是导致临床抗生素治疗失败的主要原因。肺炎克雷伯菌型碳青霉烯酶是近年来发现的新型碳青霉烯酶类，属于Bush分类的2f组，Ambler分类的A类，能够水解碳青霉烯类、青霉素类、头孢菌素类和氨曲南等临床常用的抗生素。肺炎克雷伯菌型碳青霉烯酶基因位于可转移的质粒上，可依靠质粒、整合子、插入序列的基因元件进行传播，这也是多药耐药菌株易于传播的重要原因。
目前有报道采用多重荧光定量PCR技术结合酶切的方法针对肺炎克雷伯菌KPC-2和KPC-3型碳青霉烯酶进行分型。最新的文献报道采用多重荧光定量PCR结合分子信标技术对11种类型的肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶基因进行区分。该11种碳青霉烯酶基因型是由5个不同的基因多态性位点构成。
对于肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶基因分型及新基因筛查相关工作开展较少，国内并无该方面研究，而且对于每种肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶基因亚型的生物学功能尚不清楚。
(三)发明内容
本发明目的是提供一种肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶基因型分类方法，该方法对肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶(Klebsiella pneumoniae carbapenemase，KPC)基因KPC 1-15共14种亚型进行分型，该方法涉及一对大片段扩增引物，六条SNaPshot检测用引物，扩增结果使用毛细管测序基因分析仪检测，操作方便。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一种肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶基因型检测方法，所述方法为：以待测菌株基因为模板，在引物1和引物2作用下进行PCR扩增反应，然后以扩增产物为模板，在引物3-引物8的混合引物作用下进行SNaPshot PCR反应，对SNaPshot PCR产物进行测序；
若SNaPshot PCR产物在147位、308位和814位均为C碱基(即胞嘧啶)，272位为T碱基(即胸腺嘧啶)，502位为G碱基(即鸟嘌呤)，716位为A碱基(即腺嘌呤)，则待测菌株的碳青霉烯酶基因型为KPC-1或KPC-2；
若SNaPshot PCR产物在147位、308位为C碱基，272位和814位为T碱基，502位为G碱基，716位为A碱基，则待测菌株的碳青霉烯酶基因型为KPC-3；
若SNaPshot PCR产物在147位、716位和814位为C碱基，在308位和502位为G碱基，在272位为T碱基，则待测菌株的碳青霉烯酶基因型为KPC-4；
若SNaPshot PCR产物在147位和814位为C碱基，在308位和502位为G碱基，在272位为T碱基，在716位为A碱基，则待测菌株的碳青霉烯酶基因型为KPC-5；
若SNaPshot PCR产物在147位、308位、716位和814位为C碱基，在272位为T碱基，在502位为G碱基，则待测菌株的碳青霉烯酶基因型为KPC-6；
若SNaPshot PCR产物在147位、272位和814位为T碱基，在308位为C碱基，在502位为G碱基，在716位为A碱基，则待测菌株的碳青霉烯酶基因型为KPC-7；
若SNaPshot PCR产物在147位、308位和716位为C碱基，在272位和814位为T碱基，在502位为G碱基，则待测菌株的碳青霉烯酶基因型为KPC-8；
若SNaPshot PCR产物在147位和308位为C碱基，在272位和814位为T碱基，在502位和716位为G碱基，则待测菌株的碳青霉烯酶基因型为KPC-9；
若SNaPshot PCR产物在147位为C碱基，在308位和502位为G碱基，在272位和814位为T碱基，716位为A碱基，则待测菌株的碳青霉烯酶基因型为KPC-10；
若SNaPshot PCR产物在147位和814位为C碱基，在502位为G碱基，在308位和272位为T碱基，716位为A碱基，则待测菌株的碳青霉烯酶基因型为KPC-11；
若SNaPshot PCR产物在147位、308位和814位为C碱基，在272位和502位为T碱基，716位为A碱基，则待测菌株的碳青霉烯酶基因型为KPC-12；
若SNaPshot PCR产物在147位、308位和272位为C碱基，在502位为G碱基，在814位为T碱基，716位为A碱基，则待测菌株的碳青霉烯酶基因型为KPC-13；
若SNaPshot PCR产物在147位、308位、272位和814位为C碱基，在502位为G碱基，716位为A碱基，则待测菌株的碳青霉烯酶基因型为KPC-14；
若SNaPshot PCR产物在147位和716位为C碱基，在308位和502位为G碱基，在272位和814位为T碱基，则待测菌株的碳青霉烯酶基因型为KPC-15；
引物1为：5’-CTGTATCGCCGTCTAGTTCTGCTGT-3’；
引物2为：5’-CAGAGCCTTACTGCCCGTTGA-3’；
引物3为：5’-(T)3GCGCCTGAGCCGGTATC-3’，(T)3表示有3个T，即(T)3为TTT；
引物4为：5’-(T)9GCAAAAATGCGCTGGTTC-3’，(T)9含义同(T)3；
引物5为：5’-(T)14CCGTAACGGATGGGTGTG-3’，(T)14含义同(T)3；
引物6为：5’-(T)20GGGATGGCGGAGTTCA-3’，(T)20含义同(T)3；
引物7为：5’-(T)28GTCATTTGCCGTGCCATAC-3’，(T)28含义同(T)3；
引物8为：5’-(T)38GCGCCTAACAAGGATGACAAG-3’，(T)38含义同(T)3。
进一步，所述PCR扩增反应体系为：基因组DNA0.5μL、反应混合物10.0μL，0.1-3.5μM引物混合物5.0μL、5U/μL热启动Taq酶1.0μL，sdH2O补足至25.0μL；所述反应混合物为2.5×PCR缓冲液、MgCl21.2-3.0mM和dNTPs 200μM。
进一步，所述PCR扩增程序为95℃初始变性5分钟，30个循环：94℃1分钟，58℃1分钟，72℃1分钟，72℃终延伸5分钟，4℃保温。
PCR产物经2.5U CIAP(宝生物碱性磷酸酶)和5U Exo I处理后，以美国生命科技公司(life technology)的ABI PRISM SNaPshot Multiplex Kit进行反应，所述SNaPshotPCR反应体系为：反应缓冲液Reaction Mix0.5μL，PCR产物2.0μL，引物混合物1.0μL，水1.5μL。所述SNaPshot PCR反应程序为：预变性96℃，10秒，96℃变性10秒，53℃延伸5秒，60℃30秒，30个循环；终延伸60℃10秒，4℃保温。
本发明首先从NCBI数据库下载KPC 1-15序列(KPC-1：AF297554；KPC-2：GU086225；KPC-3：AF395881；KPC-4：FJ473382；KPC-4：AY700571；KPC-5：EU400222；KPC-6：EU555534；KPC-7：EU729727；KPC-8：FJ234412；KPC-9：FJ624872；KPC-10：GQ140348；KPC-11：HM066995；KPC-12：HQ641422；KPC-13：HQ342889.1；KPC-14：JX524191；KPC-15：KC433553)，经序列比对之后，选择了6个SNP位点(nt147，nt272，nt308，nt502，nt716及nt814)，这些位点可以将KPC1-KPC15分成14种不同的亚型(KPC1与KPC2基因型相同)；其次设计一对大片段引物(引物1和引物2)对检测模板进行富集，富集后模板经纯化后，通过6条引物(引物3-引物8)，应用SNaPshot分型检测技术，对14种亚型进行分型。SNaPshot是一种基于单碱基延伸原理的基因分型新方法，可以同时对多种基因突变位点高通量鉴别，方法为设计单条检测探针，使其将要延伸的第一个碱基就是需进行基因分型的位点，用荧光标记的双脱氧NTPs(ddNTPs)作为测序底物，使其测序反应只延伸一个碱基，从而能够鉴定该SNP。SNaPshot能同时对7-8个不同的SNP位点进行96个样本基因分型，是一种快速、高通量的基因分型新方法，可加快基因分型的研究速度，该技术的出现为大规模基因突变位点的筛查提供了一种快速、准确、高通量的诊断方法，弥补了基因芯片方法不稳定、荧光定量PCR检测数量有限等不足。
本发明首次提供了一种同时对KPC1-KPC15共14种亚型的分型检测方法，检测通量较传统的定量检测方法都高。准确度可与测序检测方法相当，费用更低。
(四)附图说明
图1 KPC-2型菌株检测结果，分型结果分别为：nt147C、nt308C、nt272T、nt502G、nt716A及nt814C。
图2 KPC-3型菌株检测结果，分型结果分别为：nt147C、nt308C、nt272T、nt502G、nt716A及nt814T。
图3 KPC-4型菌株检测结果，分型结果分别为：nt147C、nt308G、nt272T、nt502G、nt716C及nt814C。
图4 KPC-5型菌株检测结果，分型结果分别为：nt147C、nt308G、nt272T、nt502G、nt716A及nt814C。
图5 KPC-8型菌株检测结果，分型结果分别为：nt147C、nt308C、nt272T、nt502G、nt716C及nt814T。
图6 KPC-11型菌株检测结果，分型结果分别为：nt147C、nt308T、nt272T、nt502G、nt716A及nt814C。
图7 临床收集的耐药KPC菌株检测结果，分型结果分别为：nt147C、nt308C、nt272T、nt502G、nt716A及nt814C。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1 KPC1-15的分型位点的选择及引物设计
NCBI数据库下载KPC 1-15序列(KPC-1：AF297554；KPC-2：GU086225；KPC-3：AF395881；KPC-4：FJ473382；KPC-4：AY700571；KPC-5：EU400222；KPC-6：EU555534；KPC-7：EU729727；KPC-8：FJ234412；KPC-9：FJ624872；KPC-10：GQ140348；KPC-11：HM066995；KPC-12：HQ641422；KPC-13：HQ342889.1；KPC-14：JX524191；KPC-15：KC433553)。序列经ClusterX比对之后，选择了6个SNP位点(nt147，nt272，nt308，nt502，nt716及nt814)。
设计了一对大片段引物进行模板富集，其扩增区域包含所需要检测的6个SNP位点。Snapshot可以检测多重的SNP，选择6个位点做一个组合，对这些目的SNP位点进行引物的设计。每个SNP设计的引物是延伸ddNTP，设计在SNP位点的上游或者是反向的下游。具体见表1。KPC1-15的分型见表2。
表1.大片段扩增引物及SNaPshot PCR引物
表2 KPC1-15的14种亚型分型
实施例2、已知菌株的检测
1、6种不同KPC亚型菌株DNA(KPC-2、KPC-3、KPC-4、KPC-5、KPC-8及KPC-11)由浙江省疾病预防控制中心提供，浓度为1ng/μl，分型结果经测序验证。
2、模板富集，用大片段引物(KPCF和KPCR)扩增模板：
PCR扩增体系：
扩增热循环
(l)将PCR扩增管置于热循环仪上；
(2)选择下面推荐的程序进行扩增；
(3)扩增后的样品应避光保存；
热循环仪的扩增程序：
PCR产物的处理
分别取6株菌株的PCR扩增产物3μL+0.7μL酶混合液(含2.5U CIAP(宝生物碱性磷酸酶)和5U Exo I)，振荡混匀，37℃孵育保温1h，然后75℃保温15min，以灭活CIAP和Exo I酶。处理后的产物可以在4℃保存24h或-20℃长期保存。
3、SNaPshot PCR
先将SNP引物(即引物3-引物8)稀释到100μM，混合SNaPshot的PCR引物：每种引物在反应体系中的终浓度分别为1.6μM(每个SNP引物加4-10μl到100μl ddH2O中)。以美国生命科技公司(life technology)的ABI PRISM SNaPshot Multiplex Kit试剂盒进行反应。
反应体系:
SNaPshot的PCR扩增程序：
SNaPshot PCR纯化
在5μL上述SNaPshot PCR产物中加入0.5U CIAP酶或者1U CIP，震荡混匀，37℃保温1h，75℃保温15min以灭活酶，4℃可保存24h或-20℃长期保存。
4、扩增产物在遗传分析仪上荧光检测
由去离子甲酰胺与系统中分子量内标(liz-120)组成上样混合物〔(0.5μL liz-120)×(进样数)+(12μL去离子甲酰胺)×(进样数)〕。将12.5μL上样混合物与SNaPshot PCR纯化后产物混合，避免产生气泡。95℃变性3分钟，冰浴3分钟，并尽快电泳。用遗传分析仪检测分析。
5、分型分析
用片段分析软件GeneMapper分析步骤4中遗传分析仪检测收集的数据，软件根据产物测序仪电泳结果，出峰的大小确定位点，峰的颜色对应的不同碱基(绿色为A碱基、红色为T，黑色为C，蓝色为G)。分析结果如图1-图6，得到实际样品的基因分型数据，分型结果与预期相符。分析后结果如下表3。
表3 6株已知分型KPC菌株SNaPshot检测结果
实施例3临床样本SNaPshot分型检测
1、样本收集
收集海宁市2008-2012年间各医院上送的肺炎克雷伯菌临床分离株。在本实验室内做进一步鉴定，在麦康凯培养基平板上分离纯化，经法国生物梅里埃Vitek-compact全自动细菌分析鉴定为肺炎克雷伯菌的，刮取菌落至专用的磁珠保存管中制成均匀的菌悬液，吸干液体，置于-70℃的低温冰箱保存。将菌株在麦康凯培养基平板上复苏培养，采用K-B(也称纸片扩散法)，挑一定量细菌配成0.5麦氏比浊的菌液，均匀涂布于MH平板上，室温干燥3～5min。分别贴亚胺培南、美罗培南和厄他培南3种纸片，各纸片中心大于24mm，纸片距离平板边缘应大于15mm。置37℃孵育16～18h后读取结果，判断标准参照CLSI(2008)。676株肺炎克雷伯菌中，有21株存在对亚胺培南，美罗培南，厄他培南不同程度的耐药。
详见表4。
表4 耐药的肺炎克雷伯菌的KB法药敏结果
2、21株耐药肺炎克雷伯菌做KPC SNaPshot分型检测
1)模板富集，用大片段引物扩增模板：
PCR扩增体系
扩增热循环
a)将PCR扩增管置于热循环仪上；
b)选择下面推荐的程序进行扩增；
c)扩增后的样品应避光保存；
热循环仪的扩增程序
2)PCR产物的处理
分别取21株菌株PCR扩增产物3μL+0.7μL酶混合液(含2.5U CIAP和5U Exo I)，振荡混匀，37℃孵育保温1h，然后75℃保温15min以灭活CIAP和Exo I酶。处理后的产物可以在4℃保存24h或-20℃长期保存。
3)SNaPshot PCR
先将SNP引物稀释到100μM，混合SNaPshot的PCR引物：每种引物在反应体系中的终浓度分别为1.6μM(每个SNP引物加4-10μl到100μl ddH2O中)。以美国生命科技公司(lifetechnology)的ABI PRISM SNaPshot Multiplex Kit试剂盒进行反应，试剂盒组分有Reaction Mix，水。
反应体系:
反应程序：
4)SNaPshot PCR纯化
在5μL上述SNaPshot PCR产物中加入0.5U CIAP酶或者1U CIP，震荡混匀，37℃保温1h，75℃保温15min以灭活酶，4℃可保存24h或-20℃长期保存。
5)扩增产物在遗传分析仪上荧光检测
由去离子甲酰胺与系统中分子量内标(liz-120)组成上样混合物〔(0.5μL liz-120)×(进样数)+(12μL去离子甲酰胺)×(进样数)〕。将12.5μL上样混合物与SNaPshot PCR纯化后产物混合，避免产生气泡。95℃变性3分钟，冰浴3分钟，并尽快电泳。用遗传分析仪检测分析。
6)分型分析
用片段分析软件GeneMapper分析步骤5)中遗传分析仪检测收集的数据。检测结果表明，筛选出的21株耐药菌均为KPC-2型。这也是国内外报道较多的一种亚型。其中一个检测图见图7。
Claims (5)
1.一种非疾病诊断目的的肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶基因型检测方法，其特征在于所述方法为：以待测菌株基因为模板，在引物1和引物2作用下进行PCR扩增反应，然后以扩增产物为模板，在引物3-引物8的混合引物作用下进行SNaPshot PCR反应，对SNaPshot PCR产物进行测序；
若SNaPshot PCR产物在147位、308位和814位均为C碱基，272位为T碱基，502位为G碱基，716位为A碱基，则待测菌株的碳青霉烯酶基因型为KPC-1或KPC-2；
若SNaPshot PCR产物在147位、308位为C碱基，272位和814位为T碱基，502位为G碱基，716位为A碱基，则待测菌株的碳青霉烯酶基因型为KPC-3；
若SNaPshot PCR产物在147位、716位和814位为C碱基，在308位和502位为G碱基，在272位为T碱基，则待测菌株的碳青霉烯酶基因型为KPC-4；
若SNaPshot PCR产物在147位和814位为C碱基，在308位和502位为G碱基，在272位为T碱基，在716位为A碱基，则待测菌株的碳青霉烯酶基因型为KPC-5；
若SNaPshot PCR产物在147位、308位、716位和814位为C碱基，在272位为T碱基，在502位为G碱基，则待测菌株的碳青霉烯酶基因型为KPC-6；
若SNaPshot PCR产物在147位、272位和814位为T碱基，在308位为C碱基，在502位为G碱基，在716位为A碱基，则待测菌株的碳青霉烯酶基因型为KPC-7；
若SNaPshot PCR产物在147位、308位和716位为C碱基，在272位和814位为T碱基，在502位为G碱基，则待测菌株的碳青霉烯酶基因型为KPC-8；
若SNaPshot PCR产物在147位和308位为C碱基，在272位和814位为T碱基，在502位和716位为G碱基，则待测菌株的碳青霉烯酶基因型为KPC-9；
若SNaPshot PCR产物在147位为C碱基，在308位和502位为G碱基，在272位和814位为T碱基，716位为A碱基，则待测菌株的碳青霉烯酶基因型为KPC-10；
若SNaPshot PCR产物在147位和814位为C碱基，在502位为G碱基，在308位和272位为T碱基，716位为A碱基，则待测菌株的碳青霉烯酶基因型为KPC-11；
若SNaPshot PCR产物在147位、308位和814位为C碱基，在272位和502位为T碱基，716位为A碱基，则待测菌株的碳青霉烯酶基因型为KPC-12；
若SNaPshot PCR产物在147位、308位和272位为C碱基，在502位为G碱基，在814位为T碱基，716位为A碱基，则待测菌株的碳青霉烯酶基因型为KPC-13；
若SNaPshot PCR产物在147位、308位、272位和814位为C碱基，在502位为G碱基，716位为A碱基，则待测菌株的碳青霉烯酶基因型为KPC-14；
若SNaPshot PCR产物在147位和716位为C碱基，在308位和502位为G碱基，在272位和814位为T碱基，则待测菌株的碳青霉烯酶基因型为KPC-15；
引物1为：5’-CTGTATCGCCGTCTAGTTCTGCTGT-3’；
引物2为：5’-CAGAGCCTTACTGCCCGTTGA-3’；
引物3为：5’-(T)3GCGCCTGAGCCGGTATC-3’；
引物4为：5’-(T)9GCAAAAATGCGCTGGTTC-3’；
引物5为：5’-(T)14CCGTAACGGATGGGTGTG-3’；
引物6为：5’-(T)20GGGATGGCGGAGTTCA-3’；
引物7为：5’-(T)28GTCATTTGCCGTGCCATAC-3’；
引物8为：5’-(T)38GCGCCTAACAAGGATGACAAG-3’。
2.如权利要求1所述非疾病诊断目的的肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶基因型检测方法，其特征在于所述PCR扩增反应体系为：基因组DNA0.5μL、反应混合物10.0μL，0.1-3.5μM引物混合物5.0μL、5U/μL热启动Taq酶1.0μL，sdH2O补足至25.0μL；所述反应混合物为2.5×PCR缓冲液、MgCl2 1.2-3.0mM和dNTPs 200μM。
3.如权利要求1所述非疾病诊断目的的肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶基因型检测方法，其特征在于所述PCR扩增程序为95℃初始变性5分钟，30个循环：94℃1分钟，58℃1分钟，72℃1分钟；72℃终延伸5分钟，4℃保温。
4.如权利要求1所述非疾病诊断目的的肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶基因型检测方法，其特征在于所述SNaPshot PCR反应体系为：反应缓冲液Reaction Mix0.5μL，PCR产物2.0μL，引物混合物1.0μL，水1.5μL。
5.如权利要求1所述非疾病诊断目的的肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶基因型检测方法，其特征在于所述SNaPshot PCR反应程序为：预变性96℃，10秒，96℃变性10秒，53℃延伸5秒，60℃30秒，30个循环；终延伸60℃10秒，4℃保温。
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| 肺炎克雷伯菌耐碳青霉烯类抗菌药物的基因型研究;耿荣华等;《中华实验和临床感染杂志(电子版)》;20130831;第7卷(第4期);第56-59页 * |
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