CN105073992B - 用于检测A类、B类、C类及D类β-内酰胺酶基因的菌落多重PCR用的引物和试剂盒及其使用方法 - Google Patents

用于检测A类、B类、C类及D类β-内酰胺酶基因的菌落多重PCR用的引物和试剂盒及其使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供供用于检测A类、B类、C类和D类β‑内酰胺酶基因的菌落多重PCR用的试剂盒和引物。通过使用根据本发明的试剂盒和引物快速检测bla基因允许开出适当抗生素处方，这可以降低患者的死亡率并使抗生素抗性减至最低。本发明提供用于快速和准确分子方法的试剂盒和引物，所述方法(a)用以检测所有临床上重要的bla基因以及(b)用以通过使用54个引物对来充分解释表型试验结果，所述引物经由新型和精巧的优化方法来设计。在172种对照菌株和403种临床菌株中，以完美的特异性和灵敏性，本发明提供鉴别细菌性病原体中的所有bla基因的迅速和临床应用。

Description

用于检测A类、B类、C类及D类β-内酰胺酶基因的菌落多重PCR 用的引物和试剂盒及其使用方法
技术领域
本发明涉及一种用于检测β-内酰胺酶基因的引物对。本发明还涉及用于检测β-内酰胺酶基因的试剂盒。
背景技术
在病原菌中的多重抗生素抗性的出现和传播是全球性的健康危机1。β-内酰胺抗生素是用于治疗细菌感染的最成功的药物之一并且占据了全球抗生素市场总额的大约65％2。因此，通过获得编码β-内酰胺酶的基因所致的对β-内酰胺抗生素的抗性是如以下的革兰氏阴性病原菌中最严重的问题之一：各种肠杆菌科、假单胞菌属以及鲍氏不动杆菌中的菌3,4。在1940年公开了观察β-内酰胺酶的首篇报告之后5，也就是引入首个商用抗生素(青霉素)的前一年，超过1,200个不同的β-内酰胺酶(bla)基因已经在临床菌株中得到鉴别，显示了bla基因由于其连续突变所致的显著多样性4。所述bla基因基于其氨基酸序列和官能团可被分成4种主要类别A-D。A类、C类及D类酶利用丝氨酸用于β-内酰胺水解，而B类金属酶需要二价锌离子用于底物水解4。在这些酶中，吸引最多临床关注的β-内酰胺酶是超广谱β-内酰胺酶(ESBL)，其水解大多数青霉素和第三或第四代具有氧亚氨基侧链的头孢菌素；以及碳青霉烯酶，其可水解几乎所有β-内酰胺类，包括碳青霉烯类6-8。具有ESBL基因和具有碳青霉烯酶基因的革兰氏阴性病原体是造成死亡率增加和严重的医院爆发的原因，这提出了严重的治疗和感染控制挑战3,7。
发明内容
技术问题
为实现爆发的早期检测并使耐药菌传播减至最小，用于检测抗性基因的快速诊断方法的可用性也是非常重要的。使用经典的基于培养的表型试验测定易感性或抗性是临床微生物实验室中使用的一般方法，但此项工序耗时并且不容易检测到由肠杆菌科引起的ESBL和碳青霉烯酶产生，这是由于酶表达的可变水平以及一些抗生素组合的不良特异性9,10。相反，基于分子的诊断方法的实施轻易克服了这些限制并且可以提高检测抗性基因的速度和准确性，这对于感染控制和在医院和社区环境中的治疗选择是重要的9。然而，先前开发的用于bla基因检测的方法受限于若干bla基因的鉴别并且用于检测所有临床上重要的bla基因的分子诊断方法是不可用的11-17。因为这些方法仅可以检测部分类型的bla基因，所以其不能代替易感性测试。
为了解决这类问题，本发明人设计了即用型的54个PCR引物对，其最佳特征在于容易用于以完美的特异性和灵敏性快速和准确地检测所有临床上重要的bla基因。此大规模bla检测方法(被命名为LARGE-SCALEblaFinder)可快速和准确地以低成本测定临床菌株的bla基因分型且因此可以帮助使抗生素抗性减至最小。显而易见的是，LARGE-SCALEblaFinder检测先前研究的菌株中的24个额外的未报道的bla基因，表明此方法具有检测存在临床菌株中的所有bla基因的能力。
问题的解决方案
根据第一方面，本发明提供用于鉴别β-内酰胺酶核酸的引物对。所述引物对可选自由以下引物对组成的引物对组的引物对：序列号1和2对、序列号3和4对、序列号5和6对、序列号7和8对、序列号9和10对、序列号11和12对、序列号13和14对、序列号15和16对、序列号17和18对、序列号19和20对、序列号21和22对、序列号23和24对、序列号25和26对、序列号27和28对、序列号29和30对、序列号31和32对、序列号33和34对、序列号35和36对、序列号37和38对、序列号39和40对、序列号41和42对、序列号43和44对、序列号45和46对、序列号47和48对、序列号49和50对、序列号51和52对、序列号53和54对、序列号55和56对、序列号57和58对、序列号59和60对、序列号61和62对、序列号63和64对、序列号65和66对、序列号67和68对、序列号69和70对、序列号71和72对、序列号73和74对、序列号75和76对、序列号77和78对、序列号79和80对、序列号81和82对、序列号83和84对、序列号85和86对、序列号87和88对、序列号89和90对、序列号91和92对、序列号93和94对、序列号95和96对、序列号97和98对、序列号99和100对、序列号101和102对、序列号103和104对、序列号105和106对以及序列号107和108对；以及上述引物的全长互补引物对。具体来说，这些引物对可具有至少两(2)个选自所述引物对组的引物对。更具体来说，这些引物对可具有至少五(5)个选自所述引物对组的引物对。更具体来说，这些引物对可具有至少八(8)个选自所述引物对组的引物对。更具体来说，这些引物对可以是具有所有引物对(总共54个引物对)的引物对组。
如本文所用的术语“互补”和“互补的”是指能够在严格杂交条件下杂交到特定核酸分子的核酸。因此，如果在特定的DNA分子与核酸之间发生杂交，那么特定的DNA分子通常与核酸“互补”。如果特定的DNA分子杂交到全长核酸分子，那么特定的DNA分子通常是“全长互补的”。“互补”进一步是指嘌呤和嘧啶核苷酸在双链核酸分子中经由氢键缔合的能力。以下碱基对是互补的：鸟嘌呤和胞嘧啶；腺嘌呤和胸腺嘧啶；以及腺嘌呤和尿嘧啶。
在下文中使用根据安布勒分子分类(Ambler's molecular classification)的β-内酰胺酶分类。最广泛使用的β-内酰胺酶分类是安布勒分类35，该分类基于其氨基酸序列将β-内酰胺酶分为四类(A、B、C以及D)。安布勒最初划分了两类：A类，活性位点丝氨酸β-内酰胺酶；和B类，金属-β-内酰胺酶，其为了活性需要二价金属离子，通常是Zn2+。之后，发现一类新的丝氨酸β-内酰胺酶，其与随后知道的A类酶几乎不具有序列相似性。被命名为C类的其成员也被称为‘AmpC’β-内酰胺酶。发现另一类丝氨酸β-内酰胺酶(熟悉地称为OXAβ-内酰胺酶)与A类或C类几乎不具有相似性并且被命名为D类。这三类丝氨酸β-内酰胺酶充分不同，比对程序如BLAST没有发现可检测的序列相似性，但在这三类丝氨酸β-内酰胺酶中存在充分的结构相似性，很明显它们是同源的，也就是说来自同一祖先。
根据第二方面，本发明提供用于鉴别A类β-内酰胺酶核酸的一个或多个引物对。所述引物对可以是选自由以下组成的引物对组的一个或多个引物对：序列号1和2对、序列号3和4对、序列号5和6对、序列号7和8对、序列号9和10对、序列号11和12对、序列号13和14对、序列号15和16对、序列号17和18对、序列号19和20对、序列号21和22对、序列号23和24对以及序列号25和26对；以及用于鉴别A类β-内酰胺酶核酸的其各自的全长互补引物对。具体来说，本发明提供由以下组成的引物对：用于鉴别A类β-内酰胺酶核酸的序列号1和2对、序列号3和4对、序列号5和6对、序列号7和8对、序列号9和10对、序列号11和12对、序列号13和14对、序列号15和16对、序列号17和18对、序列号19和20对、序列号21和22对、序列号23和24对以及序列号25和26对。
根据第三方面，本发明提供选自由以下组成的引物对组的一个或多个引物对：序列号27和28对、序列号29和30对、序列号31和32对、序列号33和34对、序列号35和36对、序列号37和38对、序列号39和40对、序列号41和42对、序列号43和44对、序列号45和46对、序列号47和48对、序列号49和50对、序列号51和52对、序列号53和54对、序列号55和56对以及序列号57和58对；以及用于鉴别B类β-内酰胺酶核酸的其各自的全长互补引物对。具体来说，本发明提供由以下组成的引物对：用于鉴别B类β-内酰胺酶核酸的序列号27和28对、序列号29和30对、序列号31和32对、序列号33和34对、序列号35和36对、序列号37和38对、序列号39和40对、序列号41和42对、序列号43和44对、序列号45和46对、序列号47和48对、序列号49和50对、序列号51和52对、序列号53和54对、序列号55和56对以及序列号57和58对。
根据第四方面，本发明提供选自由以下组成的引物对组的一个或多个引物对：序列号59和60对、序列号61和62对、序列号63和64对、序列号65和66对、序列号67和68对、序列号69和70对、序列号71和72对、序列号73和74对、序列号75和76对以及序列号77和78对；以及用于鉴别C类β-内酰胺酶核酸的其各自的全长互补引物对。具体来说，本发明提供由以下组成的引物对：用于鉴别C类β-内酰胺酶核酸的序列号59和60对、序列号61和62对、序列号63和64对、序列号65和66对、序列号67和68对、序列号69和70对、序列号71和72对、序列号73和74对、序列号75和76对以及序列号77和78对。
根据第五方面，本发明提供选自由以下组成的引物对组的一个或多个引物对：序列号79和80对、序列号81和82对、序列号83和84对、序列号85和86对、序列号87和88对、序列号89和90对、序列号91和92对、序列号93和94对、序列号95和96对、序列号97和98对、序列号99和100对、序列号101和102对、序列号103和104对、序列号105和106对以及序列号107和108对；以及用于鉴别D类β-内酰胺酶核酸的其各自的全长互补引物对。具体来说，本发明提供由以下组成的引物对：用于鉴别D类β-内酰胺酶核酸的序列号79和80对、序列号81和82对、序列号83和84对、序列号85和86对、序列号87和88对、序列号89和90对、序列号91和92对、序列号93和94对、序列号95和96对、序列号97和98对、序列号99和100对、序列号101和102对、序列号103和104对、序列号105和106对以及序列号107和108对。
根据第六方面，本发明提供一种用于鉴别β-内酰胺酶核酸的检测试剂盒，其中所述试剂盒包括：
a)至少一个能够杂交到β-内酰胺酶核酸的引物对；
b)至少一个阳性对照和至少一个阴性对照；以及
c)用于鉴别β-内酰胺酶核酸的方案；
其中引物对选自由以下组成的组：序列号1和2对、序列号3和4对、序列号5和6对、序列号7和8对、序列号9和10对、序列号11和12对、序列号13和14对、序列号15和16对、序列号17和18对、序列号19和20对、序列号21和22对、序列号23和24对、序列号25和26对、序列号27和28对、序列号29和30对、序列号31和32对、序列号33和34对、序列号35和36对、序列号37和38对、序列号39和40对、序列号41和42对、序列号43和44对、序列号45和46对、序列号47和48对、序列号49和50对、序列号51和52对、序列号53和54对、序列号55和56对、序列号57和58对、序列号59和60对、序列号61和62对、序列号63和64对、序列号65和66对、序列号67和68对、序列号69和70对、序列号71和72对、序列号73和74对、序列号75和76对、序列号77和78对、序列号79和80对、序列号81和82对、序列号83和84对、序列号85和86对、序列号87和88对、序列号89和90对、序列号91和92对、序列号93和94对、序列号95和96对、序列号97和98对、序列号99和100对、序列号101和102对、序列号103和104对、序列号105和106对以及序列号107和108对；以及其各自的全长互补引物对。
具体来说，试剂盒用于鉴别A类β-内酰胺酶核酸，所述A类β-内酰胺酶核酸包括选自由以下组成的组的一个或多个引物对：序列号1和2对、序列号3和4对、序列号5和6对、序列号7和8对、序列号9和10对、序列号11和12对、序列号13和14对、序列号15和16对、序列号17和18对、序列号19和20对、序列号21和22对、序列号23和24对以及序列号25和26对；以及其各自的全长互补引物对。
具体来说，试剂盒用于鉴别A(A1)类β-内酰胺酶核酸，所述A(A1)类β-内酰胺酶核酸包括选自由以下组成的组的一个或多个引物对：序列号1和2对、序列号3和4对、序列号5和6对、序列号7和8对、序列号9和10对、序列号11和12对、序列号13和14对以及序列号15和16对。
具体来说，试剂盒用于鉴别A(A2)类β-内酰胺酶核酸，所述A(A2)类β-内酰胺酶核酸包括选自由以下组成的组的一个或多个引物对：序列号17和18对、序列号19和20对、序列号21和22对、序列号23和24对以及序列号25和26对；以及其各自的全长互补引物对。
具体来说，试剂盒用于鉴别B类β-内酰胺酶核酸，所述B类β-内酰胺酶核酸包括选自由以下组成的组的一个或多个引物对：序列号27和28对、序列号29和30对、序列号31和32对、序列号33和34对、序列号35和36对、序列号37和38对、序列号39和40对、序列号41和42对、序列号43和44对、序列号45和46对、序列号47和48对、序列号49和50对、序列号51和52对、序列号53和54对、序列号55和56对以及序列号57和58对；以及其各自的全长互补引物对。
具体来说，试剂盒用于鉴别B(B1)类β-内酰胺酶核酸，所述B(B1)类β-内酰胺酶核酸包括选自由以下组成的组的一个或多个引物对：序列号27和28对、序列号29和30对、序列号31和32对、序列号33和34对、序列号35和36对、序列号37和38对、序列号39和40对以及序列号41和42对；以及其各自的全长互补引物对。
具体来说，试剂盒用于鉴别B(B2)类β-内酰胺酶核酸，所述B(B2)类β-内酰胺酶核酸包括选自由以下组成的组的一个或多个引物对：序列号43和44对、序列号45和46对、序列号47和48对、序列号49和50对、序列号51和52对、序列号53和54对、序列号55和56对以及序列号57和58对；以及其各自的全长互补引物对。
具体来说，试剂盒用于鉴别C类β-内酰胺酶核酸，所述C类β-内酰胺酶核酸包括选自由以下组成的组的一个或多个引物对：序列号59和60对、序列号61和62对、序列号63和64对、序列号65和66对、序列号67和68对、序列号69和70对、序列号71和72对、序列号73和74对、序列号75和76对、序列号77和78对；以及其各自的全长互补引物对。
具体来说，试剂盒用于鉴别C(C1)类β-内酰胺酶核酸，所述C(C1)类β-内酰胺酶核酸包括选自由以下组成的组的一个或多个引物对：序列号59和60对、序列号61和62对、序列号63和64对、序列号65和66对以及序列号67和68对；以及其各自的全长互补引物对。
具体来说，试剂盒用于鉴别C(C2)类β-内酰胺酶核酸，所述C(C2)类β-内酰胺酶核酸包括选自由以下组成的组的一个或多个引物对：序列号69和70对、序列号71和72对、序列号73和74对、序列号75和76对、序列号77和78对；以及其各自的全长互补引物对。
具体来说，试剂盒用于鉴别D类β-内酰胺酶核酸，所述D类β-内酰胺酶核酸包括选自由以下组成的组的一个或多个引物对：序列号79和80对、序列号81和82对、序列号83和84对、序列号85和86对、序列号87和88对、序列号89和90对、序列号91和92对、序列号93和94对、序列号95和96对、序列号97和98对、序列号99和100对、序列号101和102对、序列号103和104对、序列号105和106对以及序列号107和108对；以及其各自的全长互补引物对。
具体来说，试剂盒用于鉴别D(D1)类β-内酰胺酶核酸，所述D(D1)类β-内酰胺酶核酸包括选自由以下组成的组的一个或多个引物对：序列号79和80对、序列号81和82对、序列号83和84对、序列号85和86对、序列号87和88对、序列号89和90对、序列号91和92对以及序列号93和94对；以及其各自的全长互补引物对。
具体来说，试剂盒用于鉴别D(D2)类β-内酰胺酶核酸，所述D(D2)类β-内酰胺酶核酸包括选自由以下组成的组的一个或多个引物对：序列号95和96对、序列号97和98对、序列号99和100对、序列号101和102对、序列号103和104对、序列号105和106对以及序列号107和108对；以及其各自的全长互补引物对。
根据第七方面，本发明提供一种鉴别来自样品中的β-内酰胺酶类型的方法，其包括：
(a)将所述样品与选自包括以下的引物对组的一个或多个引物对在溶液中接触：序列号1和2对、序列号3和4对、序列号5和6对、序列号7和8对、序列号9和10对、序列号11和12对、序列号13和14对、序列号15和16对、序列号17和18对、序列号19和20对、序列号21和22对、序列号23和24对、序列号25和26对、序列号27和28对、序列号29和30对、序列号31和32对、序列号33和34对、序列号35和36对、序列号37和38对、序列号39和40对、序列号41和42对、序列号43和44对、序列号45和46对、序列号47和48对、序列号49和50对、序列号51和52对、序列号53和54对、序列号55和56对、序列号57和58对、序列号59和60对、序列号61和62对、序列号63和64对、序列号65和66对、序列号67和68对、序列号69和70对、序列号71和72对、序列号73和74对、序列号75和76对、序列号77和78对、序列号79和80对、序列号81和82对、序列号83和84对、序列号85和86对、序列号87和88对、序列号89和90对、序列号91和92对、序列号93和94对、序列号95和96对、序列号97和98对、序列号99和100对、序列号101和102对、序列号103和104对、序列号105和106以及序列号107和108对；以及其各自的全长互补引物对；
(b)在一个反应室中使用所述引物对通过聚合酶链反应(PCR)同时扩增以产生扩增的核酸产物；以及
(c)通过凝胶电泳检测所述核酸产物。
具体来说，本发明可以是鉴别来自样品中的β-内酰胺酶类型的方法，其包括：
(a)将所述样品与以下在溶液中接触：选自包括序列号1和2对、序列号3和4对、序列号5和6对、序列号7和8对、序列号9和10对、序列号11和12对、序列号13和14对、序列号15和16对的组的用于A1类β-内酰胺酶的一个或多个引物对；选自包括序列号17和18对、序列号19和20对、序列号21和22对、序列号23和24对、序列号25和26对的组的用于A2类β-内酰胺酶的一个或多个引物对；选自包括序列号27和28对、序列号29和30对、序列号31和32对、序列号33和34对、序列号35和36对、序列号37和38对、序列号39和40对、序列号41和42对的组的用于B1类β-内酰胺酶的一个或多个引物对；选自包括序列号43和44对、序列号45和46对、序列号47和48对、序列号49和50对、序列号51和52对、序列号53和54对、序列号55和56对、序列号57和58对的组的用于B2类β-内酰胺酶的一个或多个引物对；选自包括序列号59和60对、序列号61和62对、序列号63和64对、序列号65和66对、序列号67和68对的组的用于C1类β-内酰胺酶的一个或多个引物对；选自包括序列号69和70对、序列号71和72对、序列号73和74对、序列号75和76对、序列号77和78对的组的用于C2类β-内酰胺酶的一个或多个引物对；选自包括序列号79和80对、序列号81和82对、序列号83和84对、序列号85和86对、序列号87和88对、序列号89和90对、序列号91和92对、序列号93和94对的组的用于D1类β-内酰胺酶的一个或多个引物对；以及选自包括序列号95和96对、序列号97和98对、序列号99和100对、序列号101和102对、序列号103和104对、序列号105和106以及序列号107和108对的组的用于D2类β-内酰胺酶的一个或多个引物对；
(b)在用于每类β-内酰胺酶的不同的反应室中使用每类引物对通过聚合酶链反应(PCR)同时扩增以产生扩增的核酸产物；以及
(c)通过凝胶电泳检测每个反应室的所述核酸产物。
更具体来说，本发明可以包括用于PCR产物的测序的其他步骤。
本发明的有益效果
本发明提供一种快速和准确的分子方法，其克服了以下失败之处：(a)检测所有临床上重要的bla基因以及(b)通过使用54个引物对充分解释表型试验结果，所述引物对经由新型和精巧的优化方法来设计。在172种对照菌株和403种临床菌株中，以完美的特异性和灵敏性，本方法(LARGE-SCALEblaFinder)可以检测所有临床上重要的bla基因。因此，LARGE- SCALEblaFinder的此大规模bla检测能力能够实现鉴别细菌性病原体中的所有bla基因的迅速和临床应用。
附图说明
图1显示使用单菌落的大规模bla检测方法(LARGE-SCALEblaFinder)。将来自过夜培养物的单菌落悬浮在含有0.1％Triton X-100的溶液中，之后立即在100℃下加热细胞悬浮液10分钟。通过离心步骤在18,000×g下持续1分钟除去细胞碎片之后，使上清液(1μl，模板)经受具有8个多重PCR管(A1、A2、B1、B2、C1、C2、D1以及D2)的多重PCR。每个多重PCR管的34μl反应混合物含有1×DiaStarTM多重PCR Smart混合物和0.2μM bla型特异性引物(例如，在多重PCR管Al的情况下16个引物，表1)。在8个多重PCR管中的所有扩增都是以相同和以下热循环条件来进行：在95℃下初始变性5分钟；95℃30秒、64℃40秒和72℃50秒的30次循环；以及在72℃下持续7分钟的最终延伸步骤。将所有多重PCR产物(5μl)在2％琼脂糖凝胶中分离。每个bla基因型通过将琼脂糖凝胶上的每个条带尺寸与图2中所示的相应尺寸(或表1的相应扩增子尺寸)比较来测定。在假阳性和/或阴性条带的情况下，54个引物对的优化方法经由本发明的新型和独特方法来进行。
图2显示通过单重和多重PCR分析的引物对的验证。为了证实引物对是否能正确地扩增其各自的基因座，在单重和多重PCR分析中评估引物对。将从具有每个bla基因型的单菌落(图1)获得的上清液用作模板。上清液是分别获自54个具有54个bla基因型的代表性和阳性对照菌株。54种类型特异性的bla PCR产物(A1-1～D2-7)的每个(预期)尺寸显示于表1中。来自100(包括上述54)个阳性对照菌株中的优化多重PCR分析的结果显示于图3中。将多重(泳道1)与单重(除1之外的泳道)PCR产物在2％琼脂糖凝胶中分离。在54个单重和8个多重PCR中的所有PCR产物的直接测序证实了54个bla基因型的精确检测。泳道M是分子尺寸标记物，(a)用于检测A1-特异性bla基因的多重和单重PCR的模板如下：泳道1，在泳道2-9中使用的8个模板；泳道2，来自肺炎克雷伯菌CHAK36的GES-5；泳道3，来自大肠杆菌CF0022的TEM-30；泳道4，来自大肠杆菌pCCLLimiA的IMI-1；泳道5，来自肺炎克雷伯菌CL5761的KPC-3；泳道6，来自大肠杆菌ECLA-4的SHV-2a；泳道7，来自大肠杆菌TOPVEB02的VEB-2；泳道8，来自大肠杆菌TOPPER02的PER-2；泳道9，来自大肠杆菌TOPSME01的SME-1。(b)用于检测A2-特异性bla基因的多重和单重PCR的模板如下：泳道1，在泳道2-6中使用的5个模板；泳道2，来自大肠杆菌TOPC027的CTX-M-27；泳道3，来自雷特格氏变形杆菌PS022的CTX-M-114；泳道4，来自大肠杆菌TOPC025的CTX-M-25；泳道5，来自大肠杆菌TOPC043的CTX-M-43；泳道6，来自大肠杆菌TOPC008的CTX-M-8。(c)用于检测B1-特异性bla基因的多重和单重PCR的模板如下：泳道1，在泳道2-9中使用的8个模板；泳道2，来自大肠杆菌TOPTHINB的THIN-B；泳道3，来自大肠杆菌TOPCAU01的CAU-1；泳道4，来自大肠杆菌TOPSIM01的SIM-1；泳道5，来自大肠杆菌TOPCPHA的CphA；泳道6，来自大肠杆菌TOPIND06的IND-6；泳道7，来自大肠杆菌JAEE1的IMP-1；泳道8，来自大肠杆菌TOPNDM01的NDM-1；泳道9，来自弗劳地枸橼酸盐杆菌11-7F4560的VIM-2。(d)用于检测B2-特异性bla基因的多重和单重PCR的模板如下：泳道1，在泳道2-9中使用的8个模板；泳道2，来自大肠杆菌TOPAIM01的AIM-1；泳道3，来自大肠杆菌TOPKHM01的KHM-1；泳道4，来自大肠杆菌TOPFEZ01的FEZ-1；泳道5，来自大肠杆菌TOPGOB01的GOB-1；泳道6，来自大肠杆菌TOPBLAB01的BlaB-1；泳道7，来自大肠杆菌TOPSPM01的SPM-1；泳道8，来自大肠杆菌TOPEBR01的EBR-1；泳道9，来自大肠杆菌TOPJOHN01的JOHN-1。(e)用于检测C1-特异性bla基因的多重和单重PCR的模板如下：泳道1，在泳道2-6中使用的5个模板；泳道2，来自大肠杆菌TOPACC04的ACC-4；泳道3，来自大肠杆菌E07-39524的DHA-1；泳道4，来自大肠杆菌C600的MIR-1；泳道5，来自大肠杆菌TOPPDC03的PDC-3；泳道6，来自大肠杆菌TOPADC002的ADC-2。(f)用于检测C2-特异性bla基因的多重和单重PCR的模板如下：泳道1，在泳道2-6中使用的5个模板；泳道2，来自大肠杆菌JM109的CMY-3；泳道3，来自大肠杆菌TOPEAR01的Ear1；泳道4，来自大肠杆菌520R的520R；泳道5，来自产气肠杆菌K9911729的CMY-10；泳道6，来自大肠杆菌BER的BER。(g)用于检测D1-特异性bla基因的多重和单重PCR的模板如下：泳道1，在泳道2-9中使用的8个模板；泳道2，来自鲍曼不动杆菌K0420859的OXA-23；泳道3，来自铜绿假单胞菌08PAE4的OXA-2；泳道4，来自铜绿假单胞菌WK20的OXA-10；泳道5，来自大肠杆菌TOPOXA069的OXA-69；泳道6，来自大肠杆菌TOPOXA031的OXA-31；泳道7，来自大肠杆菌TOPOXA040的OXA-40；泳道8，来自大肠杆菌TOPOXA063的OXA-63；泳道9，来自大肠杆菌TOPOXA042的OXA-42。(h)用于检测D2-特异性bla基因的多重和单重PCR的模板如下：泳道1，在泳道2-8中使用的7个模板；泳道2，来自大肠杆菌TOPOXA235的OXA-235；泳道3，来自大肠杆菌TOPOXA228的OXA-228；泳道4，来自大肠杆菌TOPOXA058的OXA-58；泳道5，来自大肠杆菌TOPOXA048的OXA-48；泳道6，来自大肠杆菌TOPOXA214的OXA-214；泳道7，来自大肠杆菌TOPOXA211的OXA-211；泳道8，来自大肠杆菌TOPOXA020的OXA-20。
图3显示来自阳性或阴性对照菌株中的多重聚合酶链反应(PCR)分析的结果。具有已知的(报道的)bla基因的充分表征的100个细菌菌株被用作阳性对照并且不具有任何靶向bla基因的72个细菌菌株被用作阴性对照(图3a-3h)。在用于检测A1-特异性bla基因(在表1中的8个bla型)的图3a的情况下，前9个菌株(1-9)在多重PCR管A1(泳道A1)中没有显示条带(靶向bla型)，而在其他PCR管(泳道A2-D2)中显示一些条带。在所有实验中(图3a-3h)，前9个菌株用作阴性对照。根据如在线方法中所述的使用单菌落的大规模blaFinder进行所有多重PCR。将所有多重PCR产物(10μl)在2％琼脂糖凝胶中分离。为了精确地找出假阳性条带(如果假阳性结果可能发生的话)，使用10μl(而非5μl)PCR产物。然而，并未在所有多重PCR中检测到任何假阳性或阴性结果，表明大规模blaFinder的完全特异性和灵敏性(图3a-3h)。
图3a显示来自用于在阳性(17)或阴性(9)对照菌株中检测A1-特异性bla基因的多重PCR分析的结果。(1)具有CTX-M-15(泳道A2)和BER(EC2，KL，AmpC-10)型(泳道C2)的大肠杆菌TOPC015。(2)具有CTX-M-55(泳道A2)和BER(EC2，KL，AmpC-10)型(泳道C2)的大肠杆菌TOPC055。(3)具有IMP-1(泳道B1)和BER(EC2，KL，AmpC-10)型(泳道C2)的大肠杆菌JAEE1。(4)具有MIR-1(泳道C1)和BER(EC2，KL，AmpC-10)型(泳道C2)的大肠杆菌C600。(5)具有ACT-2(泳道C1)的阴沟肠杆菌10-12703。(6)具有CMY-10(泳道C2)和BER(EC2，KL，AmpC-10)型(泳道C2)的大肠杆菌TOPCMY010。(7)具有BER(泳道C2)的大肠杆菌BER。(8)具有OXA-2(泳道D1)和MIR(ACT,CHE,GC1,AmpC-3)型(泳道C1)的铜绿假单胞菌08PAE8。(9)具有OXA-210(泳道D1)和BER(EC2，KL，AmpC-10)型(泳道C2)的大肠杆菌TOPO210。(10)具有TEM-8(泳道A1)和BER(EC2，KL，AmpC-10)型(泳道C2)的大肠杆菌CF804。(11)具有TEM-15(泳道A1)和BER(EC2，KL，AmpC-10)型(泳道C2)的大肠杆菌CF244。(12)具有TEM-30(泳道A1)和BER(EC2，KL，AmpC-10)型(泳道C2)的大肠杆菌CF0022。(13)具有TEM-31(泳道A1)和BER(EC2，KL，AmpC-10)型(泳道C2)的大肠杆菌CF0012。(14)具有TEM-34(泳道A1)和BER(EC2，KL，AmpC-10)型(泳道C2)的大肠杆菌57461。(15)具有TEM-35(泳道A1)和BER(EC2，KL，AmpC-10)型(泳道C2)的大肠杆菌CF0042。(16)具有TEM-49(泳道A1)和SHV型(泳道A1)的肺炎克雷伯菌L-867。(17)具有TEM-47(泳道A1)和BER(EC2，KL，AmpC-10)型(泳道C2)的大肠杆菌L267。(18)具有SHV-2a(泳道A1)的大肠杆菌ECLA-4[此外，TEM型(泳道A1)和BER(EC2，KL，AmpC-10)型(泳道C2)新近由bla检测方法检测出]。(19)具有SHV-11(泳道A1)和BER(EC2，KL，AmpC-10)型(泳道C2)的大肠杆菌HB101。(20)具有SHV-12(泳道A1)的大肠杆菌ECZP-1[此外，TEM型(泳道A1)和BER(EC2，KL，AmpC-10)型(泳道C2)新近由bla检测方法检测出]。(21)具有KPC-3(泳道A1)的肺炎克雷伯菌CL5761[此外，TEM型(泳道A1)和SHV型(泳道A1)新近由bla检测方法检测出]。(22)具有SME-1(泳道A1)、TEM型(泳道A1)和BER(EC2，KL，AmpC-10)型(泳道C2)的大肠杆菌TOPSME01。(23)具有GES-5(泳道A1)、SHV-12(泳道A1)和OXA-17(泳道D1)的肺炎克雷伯菌CHAK36[此外，TEM型(泳道A1)新近由bla检测方法检测出]。(24)具有IMI-1(泳道A1)和BER(EC2，KL，AmpC-10)型(泳道C2)的大肠杆菌pCCLLimiA。(25)具有VEB-2(泳道A1)、TEM型(泳道A1)和BER(EC2，KL，AmpC-10)型(泳道C2)的大肠杆菌TOPVEB02。(26)具有PER-2(泳道A1)、TEM型(泳道A1)和BER(EC2，KL，AmpC-10)型(泳道C2)的大肠杆菌TOPPER02。泳道M1，100bpDNA尺寸标记物(Biosesang，韩国)；泳道M2，100bp加DNA尺寸标记物(Bioneer，韩国)；泳道A1，A1多重管；泳道A2，A2多重管；泳道B1，B1多重管；泳道B2，B2多重管；泳道C1，C1多重管；泳道C2，C2多重管；泳道D1，D1多重管；泳道D2，D2多重管。
图3b显示来自用于在阳性(11)或阴性(9)对照菌株中检测A2-特异性bla基因的多重PCR分析的结果。(1)具有TEM-8(泳道A1)和BER(EC2，KL，AmpC-10)型(泳道C2)的大肠杆菌CF804。(2)具有TEM-15(泳道A1)和BER(EC2，KL，AmpC-10)型(泳道C2)的大肠杆菌CF244。(3)具有VIM-2(泳道B1)、TEM型(泳道A1)、CMY-2(CFE,LAT,BIL,AmpC-6)型(泳道C2)、CMY-1(MOX,FOX,AmpC-9)型(泳道C2)、OXA-1型(泳道D1)以及OXA-23型(泳道D1)的弗劳地枸橼酸盐杆菌11-7F4560。(4)具有IND-6(泳道B1)、TEM型(泳道A1)和BER(EC2，KL，AmpC-10)型(泳道C2)的大肠杆菌TOPIND06。(5)具有ACC-4(泳道C1)、TEM型(泳道A1)和BER(EC2，KL，AmpC-10)型(泳道C2)的大肠杆菌TOPACC04。(6)具有PDC-3(泳道C1)、TEM型(泳道A1)和BER(EC2，KL，AmpC-10)型(泳道C2)的大肠杆菌TOPPDC03。(7)具有OXA-2(泳道D1)、TEM型(泳道A1)、MIR(ACT,CHE,GC1,AmpC-3)型(泳道C1)以及CMY-1(MOX,FOX,AmpC-9)型(泳道C2)的铜绿假单胞菌08PAE4。(8)具有OXA-40(泳道D1)、TEM型(泳道A1)和BER(EC2，KL，AmpC-10)型(泳道C2)的大肠杆菌TOPOXA040。(9)具有OXA-20(泳道D2)、TEM型(泳道A1)和BER(EC2，KL，AmpC-10)型(泳道C2)的大肠杆菌TOPOXA020。(10)具有CTX-M-3(泳道A2)的大肠杆菌A15R(+)[此外，TEM型(泳道A1)和BER(EC2，KL，AmpC-10)型(泳道C2)新近由bla检测方法检测出]。(11)具有CTX-M-8(泳道A2)、TEM型(泳道A1)和BER(EC2，KL，AmpC-10)型(泳道C2)的大肠杆菌TOPC008。(12)具有CTX-M-15(泳道A2)的大肠杆菌K0519020[此外，TEM型(泳道A1)、BER(EC2，KL，AmpC-10)型(泳道C2)和OXA-1型(泳道D1)新近由bla检测方法检测出]。(13)具有CTX-M-15(泳道A2)和BER(EC2，KL，AmpC-10)型(泳道C2)的大肠杆菌TOPC015。(14)具有CTX-M-25(泳道A2)、TEM型(泳道A1)和BER(EC2，KL，AmpC-10)型(泳道C2)的大肠杆菌TOPC025。(15)具有CTX-M-27(泳道A2)、TEM型(泳道A1)和BER(EC2，KL，AmpC-10)型(泳道C2)的大肠杆菌TOPC027。(16)具有CTX-M-43(泳道A2)、TEM型(泳道A1)和BER(EC2，KL，AmpC-10)型(泳道C2)的大肠杆菌TOPC043。(17)具有CTX-M-55(泳道A2)、TEM型(泳道A1)和BER(EC2，KL，AmpC-10)型(泳道C2)的大肠杆菌T034。(18)具有CTX-M-55(泳道A2)和BER(EC2，KL，AmpC-10)型(泳道C2)的大肠杆菌TOPC055。(19)具有CTX-M-114(泳道A2)的雷特格氏变形杆菌PS022。(20)具有CTX-M-114(泳道A2)和BER(EC2，KL，AmpC-10)型(泳道C2)的大肠杆菌TOPC114。
图3c显示来自用于在阳性(10)或阴性(9)对照菌株中检测B1-特异性bla基因的多重PCR分析的结果。(1)具有TEM-30(泳道A1)和BER(EC2，KL，AmpC-10)型(泳道C2)的大肠杆菌CF0022。(2)具有TEM-47(泳道A1)和BER(EC2，KL，AmpC-10)型(泳道C2)的大肠杆菌L267。(3)具有TEM-31(泳道A1)和BER(EC2，KL，AmpC-10)型(泳道C2)的大肠杆菌CF0012。(4)具有AIM-1(泳道B2)、TEM型(泳道A1)和BER(EC2，KL，AmpC-10)型(泳道C2)的大肠杆菌TOPAIM01。(5)具有DHA-1(泳道C1)、TEM型(泳道A1)、CTX-M-1型(泳道A2)、CTX-M-9型(泳道A2)、BER(EC2，KL，AmpC-10)型(泳道C2)以及OXA-1型(泳道D1)的大肠杆菌E07-39524。(6)具有CMY-10(泳道C2)、TEM型(泳道A1)、SHV型(泳道A1)以及MIR(ACT,CHE,GC1,AmpC-3)型(泳道C1)的气肠杆菌K9911729。(7)具有CMY-11(泳道C2)的大肠杆菌K986110[此外，TEM型(泳道A1)、OXA-1型(泳道D1)和BER(EC2，KL，AmpC-10)型(泳道C2)新近由bla检测方法检测出]。(8)具有OXA-2(泳道D1)和BER(EC2，KL，AmpC-10)型(泳道C2)的大肠杆菌TOPO002。(9)具有OXA-48(泳道D2)、TEM型(泳道A1)和BER(EC2，KL，AmpC-10)型(泳道C2)的大肠杆菌TOPOXA048。(10)具有IMP-1(泳道B1)和BER(EC2，KL，AmpC-10)型(泳道C2)的大肠杆菌JAEE1。(11)具有VIM-2(泳道B1)、TEM型(泳道A1)、CMY-2(CFE,LAT,BIL,AmpC-6)型(泳道C2)、CMY-1(MOX,FOX,AmpC-9)型(泳道C2)、OXA-1型(泳道D1)以及OXA-23型(泳道D1)的弗劳地枸橼酸盐杆菌11-7F4560。(12)具有IND-6(泳道B1)、TEM型(泳道A1)和BER(EC2，KL，AmpC-10)型(泳道C2)的大肠杆菌TOPIND06。(13)具有NDM-1(泳道B1)、TEM型(泳道A1)和BER(EC2，KL，AmpC-10)型(泳道C2)的大肠杆菌TOPNDM01。(14)具有CphA(泳道B1)、TEM型(泳道A1)和BER(EC2，KL，AmpC-10)型(泳道C2)的大肠杆菌TOPCPHA。(15)具有ImiS(泳道B1)、TEM型(泳道A1)和BER(EC2，KL，AmpC-10)型(泳道C2)的大肠杆菌TOPIMIS。(16)具有CAU-1(泳道B1)、TEM型(泳道A1)和BER(EC2，KL，AmpC-10)型(泳道C2)的大肠杆菌TOPCAU01。(17)具有Mbllb(泳道B1)、TEM型(泳道A1)和BER(EC2，KL，AmpC-10)型(泳道C2)的大肠杆菌TOPMBL1B。(18)具有SIM-1(泳道B1)、TEM型(泳道A1)和BER(EC2，KL，AmpC-10)型(泳道C2)的大肠杆菌TOPSIM01。(19)具有THIN-B(泳道B1)、TEM型(泳道A1)和BER(EC2，KL，AmpC-10)型(泳道C2)的大肠杆菌TOPTHINB。
图3d显示来自用于在阳性(8)或阴性(9)对照菌株中检测B2-特异性bla基因的多重PCR分析的结果。(1)具有TEM-34(泳道A1)和BER(EC2，KL，AmpC-10)型(泳道C2)的大肠杆菌57461。(2)具有TEM-35(泳道A1)和BER(EC2，KL，AmpC-10)型(泳道C2)的大肠杆菌CF0042。(3)具有CTX-M-3(泳道A2)的大肠杆菌A15R(+)[此外，TEM型(泳道A1)和BER(EC2，KL，AmpC-10)型(泳道C2)新近由bla检测方法检测出]。(4)具有NDM-1(泳道B1)、TEM型(泳道A1)和BER(EC2，KL，AmpC-10)型(泳道C2)的大肠杆菌TOPNDM01。(5)具有GC1(泳道C1)、TEM型(泳道A1)和BER(EC2，KL，AmpC-10)型(泳道C2)的大肠杆菌TOPGC1。(6)具有520R(泳道C2)和BER(EC2，KL，AmpC-10)型(泳道C2)的大肠杆菌520R。(7)具有BER(EC2，KL，AmpC-10)型(泳道C2)的大肠杆菌MG1655。(8)具有OXA-10(泳道D1)和BER(EC2，KL，AmpC-10)型(泳道C2)的大肠杆菌TOPO010。(9)具有OXA-58(泳道D2)、TEM型(泳道A1)和BER(EC2，KL，AmpC-10)型(泳道C2)的大肠杆菌TOPOXAO058。(10)具有AIM-1(泳道B2)、TEM型(泳道A1)和BER(EC2，KL，AmpC-10)型(泳道C2)的大肠杆菌TOPAIM01。(11)具有KHM-1(泳道B2)、TEM型(泳道A1)和BER(EC2，KL，AmpC-10)型(泳道C2)的大肠杆菌TOPKHM01。(12)具有FEZ-1(泳道B2)、TEM型(泳道A1)和BER(EC2，KL，AmpC-10)型(泳道C2)的大肠杆菌TOPFEZ01。(13)具有GOB-1(泳道B2)、TEM型(泳道A1)和BER(EC2，KL，AmpC-10)型(泳道C2)的大肠杆菌TOPGOB01。(14)具有BlaB-1(泳道B2)、TEM型(泳道A1)和BER(EC2，KL，AmpC-10)型(泳道C2)的大肠杆菌TOPBLAB01。(15)具有SPM-1(泳道B2)、TEM型(泳道A1)和BER(EC2，KL，AmpC-10)型(泳道C2)的大肠杆菌TOPSPM01。(16)具有EBR-1(泳道B2)、TEM型(泳道A1)和BER(EC2，KL，AmpC-10)型(泳道C2)的大肠杆菌TOPEBR01。(17)具有JOHN-1(泳道B2)、TEM型(泳道A1)和BER(EC2，KL，AmpC-10)型(泳道C2)的大肠杆菌TOPJOHN01。
图3e显示来自用于在阳性(9)或阴性(9)对照菌株中检测C1-特异性bla基因的多重PCR分析的结果。(1)具有SHV-2a(泳道A1)的大肠杆菌ECLA-4[此外，TEM型(泳道A1)和BER(EC2，KL，AmpC-10)型(泳道C2)新近由bla检测方法检测出]。(2)具有SHV-11(泳道A1)和BER(EC2，KL，AmpC-10)型(泳道C2)的大肠杆菌HB101。(3)具有CphA(泳道B1)、TEM型(泳道A1)和BER(EC2，KL，AmpC-10)型(泳道C2)的大肠杆菌TOPCPHA。(4)具有ImiS(泳道B1)、TEM型(泳道A1)和BER(EC2，KL，AmpC-10)型(泳道C2)的大肠杆菌TOPIMIS。(5)具有FEZ-1(泳道B2)、TEM型(泳道A1)和BER(EC2，KL，AmpC-10)型(泳道C2)的大肠杆菌TOPFEZ01。(6)具有CMY-11(泳道C2)和BER(EC2，KL，AmpC-10)型(泳道C2)的大肠杆菌TOPCMY011。(7)具有BER(EC2，KL，AmpC-10)型(泳道C2)的大肠杆菌ATCC25922。(8)具有OXA-31(泳道D1)、TEM型(泳道A1)和BER(EC2，KL，AmpC-10)型(泳道C2)的大肠杆菌TOPOXA031。(9)具有OXA-97(泳道D2)、TEM型(泳道A1)和BER(EC2，KL，AmpC-10)型(泳道C2)的大肠杆菌TOPOXAO097。(10)具有ACC-4(泳道C1)、TEM型(泳道A1)和BER(EC2，KL，AmpC-10)型(泳道C2)的大肠杆菌TOPACC04。(11)具有DHA-1(泳道C1)、TEM型(泳道A1)、CTX-M-1型(泳道A2)、CTX-M-9型(泳道A2)、BER(EC2，KL，AmpC-10)型(泳道C2)以及OXA1型(泳道D1)的大肠杆菌E07-39524。(12)具有PDC-3(泳道C1)、TEM型(泳道A1)和BER(EC2，KL，AmpC-10)型(泳道C2)的大肠杆菌TOPPDC03。(13)具有MIR-1(泳道C1)和BER(EC2，KL，AmpC-10)型(泳道C2)的大肠杆菌C600。(14)具有ACT-2(泳道C1)的阴沟肠杆菌10-12703。(15)具有GC1(泳道C1)、TEM型(泳道A1)和BER(EC2，KL，AmpC-10)型(泳道C2)的大肠杆菌TOPGC1。(16)具有CHE(泳道C1)的阴沟肠杆菌CHE。(17)具有ADC-2(泳道C1)、TEM型(泳道A1)和BER(EC2，KL，AmpC-10)型(泳道C2)的大肠杆菌TOPADC002。(18)具有ADC-33(泳道C1)、TEM型(泳道A1)和BER(EC2，KL，AmpC-10)型(泳道C2)的大肠杆菌TOPADC033。
图3f显示来自用于在阳性(20)或阴性(9)对照菌株中检测C2-特异性bla基因的多重PCR分析的结果。(1)具有KPC-3(泳道A1)的肺炎克雷伯菌CL5761[此外，TEM型(泳道A1)和SHV型(泳道A1)新近由bla检测方法检测出]。(2)具有GES-5(泳道A1)、SHV-12(泳道A1)、OXA-17(泳道D1)的肺炎克雷伯菌CHAK36[此外，TEM型(泳道A1)新近由bla检测方法检测出]。(3)具有CTX-M-114(泳道A2)的雷特格氏变形杆菌PS022。(4)具有CHE(泳道C1)的阴沟肠杆菌CHE。(5)具有OXA-10(泳道D1)、VIM型(泳道B1)、MIR(ACT,CHE,GC1,AmpC-3)型(泳道C1)以及OXA-23(泳道D1)的铜绿假单胞菌08PAE32。(6)具有OXA-21(泳道D1)、TEM型(泳道A1)、ADC(AmpC-5)型(泳道C1)以及OXA-10型(泳道D1)的鲍曼不动杆菌AB4-1。(7)具有OXA-23(泳道D1)的鲍曼不动杆菌K0420859[此外，ADC(AmpC-5)型(泳道C1)和OXA-10型(泳道D1)新近由bla检测方法检测出]。(8)具有OXA-10(泳道D1)和MIR(ACT,CHE,GC1,AmpC-3)型(泳道C1)的铜绿假单胞菌WK20。(9)具有OXA-240(泳道D1)和AmpCCARBA-2型(泳道C1)的铜绿假单胞菌WK28。(10)具有CMY-3(泳道C2)和BER(EC2，KL，AmpC-10)型(泳道C2)的大肠杆菌JMI09。(11)具有CMY-10(泳道C2)、TEM型(泳道A1)、SHV型(泳道A1)以及MIR(ACT,CHE,GC1,AmpC-3)型(泳道C1)的气肠杆菌K9911729。(12)具有CMY-10(泳道C2)和BER(EC2，KL，AmpC-10)型(泳道C2)的大肠杆菌TOPCMY010。(13)具有CMY-11(泳道C2)的大肠杆菌K986110[此外，TEM型(泳道A1)、OXA-1型(泳道D1)和BER(EC2，KL，AmpC-10)型(泳道C2)新近由bla检测方法检测出]。(14)具有CMY-11(泳道C2)和BER(EC2，KL，AmpC-10)型(泳道C2)的大肠杆菌TOPCMY011。(15)具有CMY-43(泳道C2)、TEM型(泳道A1)和BER(EC2，KL，AmpC-10)型(泳道C2)的大肠杆菌K0739377。(16)具有CMY-43(泳道C2)和BER(EC2，KL，AmpC-10)型(泳道C2)的大肠杆菌TOPCMY043。(17)具有MOX-1(泳道C2)、TEM型(泳道A1)、SHV型(泳道A1)以及MIR(ACT,CHE,GC1,AmpC-3)型(泳道C1)的大肠杆菌CSH-2。(18)具有FOX-3(泳道C2)的大肠杆菌J53-2R(+)[此外，TEM型(泳道A1)和BER(EC2，KL，AmpC-10)型(泳道C2)新近由bla检测方法检测出]。(19)具有BER(泳道C2)的大肠杆菌BER。(20)具有520R(泳道C2)和BER(EC2，KL，AmpC-10)型(泳道C2)的大肠杆菌520R。(21)具有Ear1(泳道C2)和BER(EC2，KL，AmpC-10)型(泳道C2)的大肠杆菌TOPEAR01。(22)具有BER(EC2，KL，AmpC-10)型(泳道C2)的大肠杆菌MG1655。(23)具有BER(EC2，KL，AmpC-10)型(泳道C2)的大肠杆菌ATCC25922。(24)具有BER(EC2，KL，AmpC-10)型(泳道C2)的大肠杆菌TOP10。(25)具有BER(EC2，KL，AmpC-10)型(泳道C2)的大肠杆菌DH5α。(26)具有BER(EC2，KL，AmpC-10)型(泳道C2)的大肠杆菌BL21(DE3)。(27)具有BER(EC2，KL，AmpC-10)型(泳道C2)的大肠杆菌HB4。(28)具有BER(EC2，KL，AmpC-10)型(泳道C2)的大肠杆菌JF701。(29)具有BER(EC2，KL，AmpC-10)型(泳道C2)的大肠杆菌JF703。
图3g显示来自用于在阳性(17)或阴性(9)对照菌株中检测D1-特异性bla基因的多重PCR分析的结果。(1)具有SHV-12(泳道A1)的大肠杆菌ECZP-1[此外，TEM型(泳道A1)和BER(EC2，KL，AmpC-10)型(泳道C2)新近由bla检测方法检测出]。(2)具有IMI-1(泳道A1)和BER(EC2，KL，AmpC-10)型(泳道C2)的大肠杆菌pCCLLimiA。(3)具有CTX-M-8(泳道A2)、TEM型(泳道A1)和BER(EC2，KL，AmpC-10)型(泳道C2)的大肠杆菌TOPC008。(4)具有CAU-1(泳道B1)、TEM型(泳道A1)和BER(EC2，KL，AmpC-10)型(泳道C2)的大肠杆菌TOPCAU01。(5)具有GOB-1(泳道B2)、TEM型(泳道A1)和BER(EC2，KL，AmpC-10)型(泳道C2)的大肠杆菌TOPGOB01。(6)具有ADC-2(泳道C1)、TEM型(泳道A1)和BER(EC2，KL，AmpC-10)型(泳道C2)的大肠杆菌TOPADC002。(7)具有CMY-43(泳道C2)和BER(EC2，KL，AmpC-10)型(泳道C2)的大肠杆菌TOPCMY043。(8)具有BER(EC2，KL，AmpC-10)型(泳道C2)的大肠杆菌DH5α。(9)具有OXA-211(泳道D2)、TEM型(泳道A1)和BER(EC2，KL，AmpC-10)型(泳道C2)的大肠杆菌TOPOXA211。(10)具有OXA-2(泳道D1)、TEM型(泳道A1)、MIR(ACT,CHE,GC1,AmpC-3)型(泳道C1)以及CMY-1(MOX,FOX,AmpC-9)型(泳道C2)的铜绿假单胞菌08PAE4。(11)具有OXA-2(泳道D1)和MIR(ACT,CHE,GC1,AmpC-3)型(泳道C1)的铜绿假单胞菌08PAE8。(12)具有OXA-2(泳道D1)和BER(EC2，KL，AmpC-10)型(泳道C2)的大肠杆菌TOPO002。(13)具有OXA-10(泳道D1)、VIM型(泳道B1)、MIR(ACT,CHE,GC1,AmpC-3)型(泳道C1)以及OXA-23型(泳道D1)的铜绿假单胞菌08PAE32。(14)具有OXA-10(泳道D1)和MIR(ACT,CHE,GC1,AmpC-3)型(泳道C1)的铜绿假单胞菌WK20。(15)具有OXA-10(泳道D1)和BER(EC2，KL，AmpC-10)型(泳道C2)的大肠杆菌TOP010。(16)具有OXA-21(泳道D1)、TEM型(泳道A1)、ADC(AmpC-5)型(泳道C1)以及OXA-10(泳道D1)的鲍曼不动杆菌AB4-1。(17)具有OXA-23(泳道D1)的鲍曼不动杆菌K0420859[此外，ADC(AmpC-5)型(泳道C1)和OXA-10型(泳道D1)新近由bla检测方法检测出]。(18)具有OXA-31(泳道D1)、TEM型(泳道A1)和BER(EC2，KL，AmpC-10)型(泳道C2)的大肠杆菌TOPOXA031。(19)具有OXA-40(泳道D1)、TEM型(泳道A1)和BER(EC2，KL，AmpC-10)型(泳道C2)的大肠杆菌TOPOXA040。(20)具有OXA-42(泳道D1)、TEM型(泳道A1)和BER(EC2，KL，AmpC-10)型(泳道C2)的大肠杆菌TOPOXA042。(21)具有OXA-63(泳道D1)、TEM型(泳道A1)和BER(EC2，KL，AmpC-10)型(泳道C2)的大肠杆菌TOPOXA063。(22)具有OXA-69(泳道D1)、TEM型(泳道A1)和BER(EC2，KL，AmpC-10)型(泳道C2)的大肠杆菌TOPOXA069。(23)具有OXA-210(泳道D1)和AmpCCARBA-2型(泳道C1)的铜绿假单胞菌PAE0831。(24)具有OXA-210(泳道D1)和BER(EC2，KL，AmpC-10)型(泳道C2)的大肠杆菌TOPO210。(25)具有OXA-240(泳道D1)和AmpCCARBA-2型(泳道C1)的铜绿假单胞菌WK28。(26)具有OXA-240(泳道D1)和BER(EC2，KL，AmpC-10)型(泳道C2)的大肠杆菌TOPO240。
图3h显示来自用于在阳性(8)或阴性(9)对照菌株中检测A1-特异性bla基因的多重PCR分析的结果。(1)具有VEB-2(泳道A1)、TEM型(泳道A1)和BER(EC2，KL，AmpC-10)型(泳道C2)的大肠杆菌TOPVEB02。(2)具有CTX-M-25(泳道A2)、TEM型(泳道A1)和BER(EC2，KL，AmpC-10)型(泳道C2)的大肠杆菌TOPC025。(3)具有Mbllb(泳道B1)、TEM型(泳道A1)和BER(EC2，KL，AmpC-10)型(泳道C2)的大肠杆菌TOPMBL1B。(4)具有SPM-1(泳道B2)、TEM型(泳道A1)和BER(EC2，KL，AmpC-10)型(泳道C2)的大肠杆菌TOPSPM01。(5)具有ADC-33(泳道C1)、TEM型(泳道A1)和BER(EC2，KL，AmpC-10)型(泳道C2)的大肠杆菌TOPADC033。(6)具有MOX-1(泳道C2)、TEM型(泳道A1)、SHV型(泳道A1)和MIR(ACT,CHE,GC1,AmpC-3)型(泳道C1)的大肠杆菌CSH-2。(7)具有BER(EC2，KL，AmpC-10)型(泳道C2)的大肠杆菌JF701。(8)具有OXA-42(泳道D1)、TEM型(泳道A1)和BER(EC2，KL，AmpC-10)型(泳道C2)的大肠杆菌TOPOXA042。(9)具有OXA-63(泳道D1)、TEM型(泳道A1)和BER(EC2，KL，AmpC-10)型(泳道C2)的大肠杆菌TOPOXA063。(10)具有OXA-20(泳道D2)、TEM型(泳道A1)和BER(EC2，KL，AmpC-10)型(泳道C2)的大肠杆菌TOPOXA020。(11)具有OXA-48(泳道D2)、TEM型(泳道A1)和BER(EC2，KL，AmpC-10)型(泳道C2)的大肠杆菌TOPOXA048。(12)具有OXA-58(泳道D2)、TEM型(泳道A1)和BER(EC2，KL，AmpC-10)型(泳道C2)的大肠杆菌TOPOXA058。(13)具有OXA-97(泳道D2)、TEM型(泳道A1)和BER(EC2，KL，AmpC-10)型(泳道C2)的大肠杆菌TOPOXA097。(14)具有OXA-211(泳道D2)、TEM型(泳道A1)和BER(EC2，KL，AmpC-10)型(泳道C2)的大肠杆菌TOPOXA211。(15)具有OXA-214(泳道D2)、TEM型(泳道A1)和BER(EC2，KL，AmpC-10)型(泳道C2)的大肠杆菌TOPOXA214。(16)具有OXA-228(泳道D2)、TEM型(泳道A1)和BER(EC2，KL，AmpC-10)型(泳道C2)的大肠杆菌TOPOXA228。(17)具有OXA-235(泳道D2)、TEM型(泳道A1)和BER(EC2，KL，AmpC-10)型(泳道C2)的大肠杆菌TOPOXA235。
图4显示在多重PCR分析中引物对的优化。在100个阳性对照菌株中的若干假阳性条带在一些多重PCR管中检测到，包括A1、A2、C1、C2以及D1多重管。在此，显示了在A1、A2以及D1多重管中引物对的代表性优化。为了鉴别哪个引物造成了假阳性条带，使用引物混合物而不是一个引物进行多重PCR分析。将所有多重PCR产物(10μl)在2％琼脂糖凝胶中分离。为了精确地找出假阳性条带(如果假阳性结果可能发生的话)，使用10μl(而非5μl)PCR产物。(a)在肺炎克雷伯菌CHAK36的情况下，在A1多重管(泳道A1)中的GES型(顶部条带)的弱强度(非优化结果)是通过在GES型引物对长度中的小增加(优化结果)而得以改善。将五个保守碱基(5’-CATTC-3’)添加到GES型-F引物的5’端，而单一保守碱基(5’-A-3’)被插入GES型-R引物的5’端，(b)在铜绿假单胞菌WK28的情况下的优化方法。用于鉴别造成假阳性条带的引物的实验工序于在线方法中描述。假阳性条带(箭头)显示于泳道2-8和10中，但假阳性条带(虚线红框)在泳道l(仅无CTX-M-1型-F引物)和泳道9(仅无CTX-M-25型-F引物)中被除去。DNA序列分析显示假阳性扩增子是在对照菌株中编码β-己糖胺酶的染色体基因的PCR产物。造成假阳性条带的CTX-M-1型的正向引物(5'-AGTTCACGCTGATGGCGAC-3')和CTX-M-25型的正向引物(5'-AAAAGCGTAAGGCGGGCGA～3')改变成新的引物(CTX-M-1-F：5'-CAGTTCACGCTGATGGCGAC-3'；CTX-M-25-F：5'-TAATGACGACAGCCTGTGTTTC-3')。泳道1：不具有CTX-M-1型-F的A2多重管；泳道2：不具有CTX-M-1型-R的A2多重管；泳道3：不具有CTX-M-2型-F的A2多重管；泳道4：不具有CTX-M-2型-R的A2多重管；泳道5：不具有CTX-M-8型-F的A2多重管；泳道6：不具有CTX-M-8型-R的A2多重管；泳道7：不具有CTX-M-9型-F的A2多重管；泳道8：不具有CTX-M-9型-R的A2多重管；泳道9：不具有CTX-M-25型-F的A2多重管；泳道10：不具有CTX-M-25型-R的A2多重管。(c)在铜绿假单胞菌WK28的情况下，A2多重PCR管(泳道A2)中的假阳性条带(具有两个不变引物的非优化结果)是通过重新设计造成假阳性条带的两个引物(具有两个新改变的引物的优化结果)而被除去，(d)在大肠杆菌CF0022情况下的优化方法。用于鉴别造成假阳性条带的引物的实验工序于在线方法中描述。一个(或两个)假阳性条带(箭头)显示于泳道4-16中，但两个假阳性条带(虚线红框)在泳道1(仅无OXA-1型-F引物)、泳道2(仅无OXA-1型-R引物)和泳道3(仅无OXA-2型-F引物)中被除去。因此，这三个引物造成了两个假阳性条带。DNA序列分析显示假阳性扩增子是对照菌株中的染色体基因的PCR产物(编码周质胞壁质肽-结合蛋白MppA和乙酰乳酸合酶的催化亚单位的两个基因)。泳道1：不具有OXA-1型-F的D1多重管；泳道2：不具有OXA-1型-R的D1多重管；泳道3：不具有OXA-2型-F的D1多重管；泳道4：不具有OXA-2型-R的D1多重管；泳道5：不具有OXA-10型-F的D1多重管；泳道6：不具有OXA-10型-R的D1多重管；泳道7：不具有OXA-23型-F的D1多重管；泳道8：不具有OXA-23型-R的D1多重管；泳道9：不具有OXA-24型-F的D1多重管；泳道10：不具有OXA-24型-R的D1多重管；泳道11：不具有OXA-42型-F的D1多重管；泳道12：不具有OXA-42型-R的D1多重管；泳道13：不具有OXA-51型-F的D1多重管；泳道14：不具有OXA-51型-R的D1多重管；泳道15：不具有OXA-63型-F的D1多重管；泳道16：不具有OXA-63型-R的D1多重管。(e)在大肠杆菌CF0022的情况下，在D1多重PCR管中的两个假阳性条带(非优化结果)是通过重新设计造成假阳性条带的引物来除去。虽然三个引物(OXA-1型-F：5’-CAATCATACACCAAAGACGTGGA-3’；OXA-1型-R：5，-GCTTCCTGTAAGTGCGGACAC-3’；OXA-2-F：5’-AGTTGTGGCAGACGAACGC-3’)造成了两个假阳性条带(非优化结果)，但两个假阳性条带可通过唯一变化的引物(OXA-1-R；5’-AGCTTCCTGTAAGTGCGGACACA-3’)(优化结果)来除去。
具体实施方式
在下文中，本发明将参考实施例进一步详细描述。然而，应理解，这些实施例仅出于说明目的并且不被视为用来限制本发明的范围。
<实施例l>用于检测所有临床上重要的β-内酰胺酶(bla)基因的引物设计
用于bla基因分型的策略是使用基因型特异性区域的引物设计。将先前所报道的bla基因分成54种类型，其中包括13种A类、16种B类、10种C类以及15种D类(表1)。
[表1]
[表2]
属于每个基因类型的所有基因的序列是使用Clustal W来比对，并且鉴别基因类型特异性保守区域。使用这些区域，在计算机上设计对每个基因类型有特异性的引物对并且将其与不同引物对的所有成员相比较以避免交叉杂交。为了容易地定义扩增子的基因类型，设计在每个多重PCR管(A1、A2、B1、B2、C1、C2、D1以及D2)中的引物对以形成不同的PCR产物尺寸(表1的预期扩增子尺寸)。因此，用包含每个引物混合物集的8个反应管设计多重PCR(例如，在多重PCR管A1的情况下8个引物对，表1)并且用于检测和区分先前所报道的1,228个bla基因，其包括453个A类基因、140个B类基因、464个C类基因以及171个D类基因。可检测的bla基因登录号的总数是7,059，但不同且可检测的bla基因的总数是1,228，这是由于多个不同登录号定位在一个bla基因上。据我们所知，此方法(大规模blaFinder)是首个大规模方法，其显示了多重PCR可以检测和区分所有临床上重要的bla基因。
为大规模β-内酰胺酶(bla)检测方法设计54个引物对(大规模blaFinder：每个临床菌株一个菌落多重PCR分析)。54个bla基因类型各自的参考基因序列(bla基因登录号的总数是7,059，但不同bla基因的总数是1,228)是获自GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/GenBank)。基于使用Clustal W(http://www.genome.jp/tools/clustalw/)的属于每个基因类型的所有基因序列的多重比对，在保守位点内特别设计引物对以扩增每个bla基因类型的所有等位基因。使用Primer331和OligoCalc(一种在线寡核苷酸性质计算器)计算设计的引物对的熔融温度。为了避免假阳性(或阴性)PCR产物的扩增并检查设计的引物对的特异性，使用称为Primer-BLAST33的软件工具(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)。54个引物对的序列和预期产物的尺寸在表1和表2中详述。为了证实PCR分析的特异性，在54个单重PCR分析中评价54个引物对以确保其正确地扩增预期的bla基因。
使用单菌落的大规模blaFinder的模板。
在许多次试错法之后，如下建立使用单菌落的多重PCR的大规模blaFinder：(a)将在琼脂平板上生长过夜的单菌落使用10μl移液管尖端在20μl的0.1％Triton X-100中乳化，并且在100℃下加热10分钟；(b)通过在18,000×g下持续1分钟的细胞悬浮液的离心步骤除去细胞碎片之后，将上清液(1μl)用作多重PCR的模板DNA。
<实施例2>使用单菌落的bla检测方法(大规模blaFinder)
为了避免耗时的步骤如基因组DNA提取，我们引入使用单菌落的简单大规模blaFinder(图1)。使用10μl移液管尖端挑取来自过夜培养物的单菌落并且将其悬浮在含有0.1％Triton X-100的特殊溶液中。将加热的菌落悬浮液在离心步骤之后用作多重PCR的模板。当将来自对照和临床(测试)菌株(大肠杆菌、阴沟肠杆菌、弗氏柠檬酸杆菌、雷特格氏变形杆菌、肺炎克雷白氏杆菌、绿脓假单胞菌、鲍氏不动杆菌、产气肠杆菌以及粘质沙雷氏菌)的加热的菌落上清液用作模板时，单菌落总是产生用于大规模blaFinder的足够的基因组DNA。经由菌落多重PCR的精确优化方法，将DNA Taq聚合酶、退火温度以及组分浓度选择用于如在线方法中所述的最有效的大规模blaFinder。在假阳性和/或阴性条带的情况下，经由我们新型和独特的方法进行54个引物对的优化方法。
<实施例3>使用先前报道具有一个或多个bla基因的对照菌株的大规模blaFinder的评估和优化
为了验证此方法的能力，对先前报道的细菌菌株进行PCR分析，这些菌株据报道在染色体或质粒上具有一个或多个bla基因(图2)。首先，在用于多重PCR中之前将所有引物对验证为单重PCR。预期地，具有预期尺寸的每个bla基因仅有一个扩增产物在用于检测54个bla基因类型的54个单重PCR中检测到(图2)。除了PCR产物的尺寸之外，54个PCR产物的直接测序证实了54个bla基因的精确检测(图2)。显而易见的是，虽然不存在任何优化方法，但具有获自54个阳性对照菌株的若干模板(5-8；例如，在C1中5个且在A1中8个，表1)的多重PCR实验显示54种bla型特异性PCR产物在8个多重PCR分析中精确地被检测到(图2a-h的8个泳道1)，表明54个设计的引物对的良好品质。类似地，bla基因的精确检测经由PCR产物的直接测序来证实(图2)。然而，每个多重PCR分析不能辨别一个临床菌株是否具有仅一个bla基因或具有超过两个bla基因。如果在含有8个引物对和8个获自8个阳性对照菌株的模板的多重PCR管A1的情况下8个菌株中的一个具有两个bla基因类型(例如，图2的A1-1和A1-5)且另一个菌株具有仅一个bla基因类型(例如，A1-5)，那么一个条带(A1-5)在此多重PCR分析的琼脂糖凝胶中是重叠的。为了解决这个问题，需要每个对照菌株的多重PCR分析必须用8个多重PCR管(A1-D2)和获自对照菌株的仅一个模板来进行。
然而，不像单重PCR分析一样，多重PCR分析引发了两个问题，GES型基因的扩增产物的弱强度和通过染色体交叉杂交产生的一些假阳性条带。需要新型优化方法来解决这些问题。用于检测所有临床上重要的bla基因的确切硅引物设计不会产生假阴性条带。然而，假阳性条带在不使用以下所述的新型和独特优化方法的条件下是不能避免的。虽然扩增产物的弱强度轻易地经由增加GES型特异性引物对的长度而得以解决(图4a)，但需要许多努力来消除由于染色体交叉杂交所致的假阳性条带的扩增。为了鉴别哪个引物造成多重PCR分析中所示的假阳性条带，使用引物混合物而不是一个引物进行许多多重PCR分析(在线方法)。因此，可以发现假阳性PCR产物是通过在一个bla基因类型的正向(或反向)引物与另一类型的反向(或正向)引物之间的染色体交叉杂交而产生的(图4b-e)。重新设计可疑的引物并且所述重新设计的引物对于具有完全特异性的优化多重PCR是有效的(图4c和4e)。这些新型优化方法可除去在使用100个对照菌株的多重PCR分析中鉴别的所有假阳性条带(表3：和图3)。
[表3]
a灵敏性＝100％，特异性＝100％，阳性预测值＝100％，阴性预测值＝100％。
与阳性对照相反，在不含任何靶向bla基因的72个阴性对照菌株的情况下(图3)，并未在测试的所有菌株中检测到任何PCR产物，例外的是(a)已经存在于大肠杆菌菌株K-12的基因组中的ampC基因及其衍生物；以及(b)通过大规模blaFinder新近检测到的额外的bla基因，因为先前报道的引物仅可检测有限类型的bla基因(图3)。因此，这些结果表明此大规模blaFinder可以完全的特异性和灵敏性检测所有临床上重要的bla基因(表3)。
显而易见的是，在12个菌株中的多重PCR实验可以在先前研究的菌株中检测到24个额外未报道的bla基因(表4)。
[表4]
例如，虽然2004年的报告显示大肠杆菌菌株K986110具有CMY-1型(CMY-11)bla基因，但大规模blaFinder检测到三个额外的bla基因类型，如OXA-1型、TEM型和BER(EC2，KL，AmpC-10)型。每个额外的bla基因的序列通过PCR产物的直接测序来鉴别。类似地，先前报告显示在纽约Tisch医院分离的克雷伯氏肺炎菌菌株CL5761对碳青霉烯类的抗性并且具有A类的KPC型bla基因。但经由大规模blaFinder，在这个产KPC-3的菌株中发现额外的两个bla基因(TEM和SHV型)(表4)。这些结果表明仅检测有限类型的bla基因的先前方法可能漏掉病原菌中存在的预期外的bla基因。总之，因为仅能检测部分bla基因类型的分子方法不能检测超出先前方法范围之外的bla基因，所以其具有给予研究者不充分结果的可能性，像大肠杆菌菌株K986110的情况。相比之下，我们的方法可以检测所有临床上重要的bla基因，包括先前方法未检测到的预期外的bla基因。因此，这些结果表明我们的方法具有给予研究者关于病原菌中存在的一个或多个bla基因的确切信息的能力。
多重PCR条件的优化方法。
为了选择最佳的Taq DNA聚合酶，多种Taq DNA聚合酶使用如下：扩展高保真PCR体系(Roche Diagnostics：无DNA的高纯度酶，不含预混合物)、2×Prime STAR Premix(TaKaRa：无DNA的高纯度酶)、2×EmeraldAmp GT PCR Master mix(TaKaRa)以及2×DiaStarTM多重PCR Smart mix(SoIGent：无DNA)。使用加热的菌落上清液作为模板DNA的多重PCR是在由每个制造商所推荐的各种条件下进行。因此，仅2×DiaStarTM多重PCR Smartmix有效用于多重PCR，所以其被选为用于多重PCR的Taq DNA聚合酶。根据我们之前的报道，商用的Taq DNA聚合酶可能被TEM型bla基因污染。因此，Taq DNA聚合酶应被处理成DNase I或无DNA。否则，假阳性PCR产物可由于TEM型bla基因的污染而被检测到。对于退火温度的优化，使用梯度PCR仪(PCR热循环仪DiceTM TP600,TaKaRa)。在多种退火温度(60℃～65℃)下进行多重PCR分析。因此，选择最佳的退火温度(64℃)。因为Dallenne等人12使用各种浓度的引物(0.2mM～0.5mM)，所以测试多个引物浓度(0.1mM～0.5mM)。在0.1mM浓度下不存在PCR产物并且在0.3mM与0.5mM之间范围内的引物浓度下检测到假阳性条带。因为仅在0.2mM的引物浓度下检测到预期的DNA产物，所以0.2mM被选为多重PCR的最佳引物浓度。总之，最佳的多重PCR条件选择如下。使用10μl移液管尖端挑取来自过夜培养物的单菌落并且将其悬浮在总体积20μl的0.1％Triton X-100中，之后立即在100℃下加热细胞悬浮液10分钟。通过在18,000×g下持续30秒的离心步骤除去细胞碎片后，将上清液(1μl)添加到含有1×DiaStarTM多重PCR Smart mix和0.2mM bla型特异性引物(A1：16个引物；A2：10；B1：16；B2：16；C1：10；C2：10；D1：16；D2：14，表5)的每个多重PCR管(每个管[A1、A2、B1、B2、C1、C2、D1或D2]的PCR混合物34μl)中。
[表5]
a1×DiaStarTM多重PCR Smart mix(0.3mM dNTP、2.5mM MgCl2以及100U/mLDiaStarTM Fh～Taq\SolGent,Korea)
b0.2μM bla型特异性引物混合物(在A1中的16个引物；在A2中的10个引物；在B1中的16个引物；在B2中的16个引物；在C1中的10个引物；在C2中的10个引物；在D1中的16个引物；
需要8个多重PCR管来测试单一菌株并且每个多重PCR混合物的总体积是35μl(表5)。用以下热循环条件来进行扩增：在95℃下初始变性5分钟；95℃30秒、64℃40秒、和72℃50秒的30次循环；以及在72℃下持续7分钟的最终延伸步骤。扩增子是通过在2％琼脂糖凝胶上在100V下电泳1小时和溴化乙锭染色来分析。100bp DNA梯(Biosesang)被用作尺寸制造物。
54个引物对的新型优化方法。
即使设计每个引物对以便仅结合至靶bla基因并且所有的引物对都通过单重和多重PCR分析来验证(图1)，但在一些多重PCR管(包括A1、A2、C1、C2以及D1多重管)中检测到在100种对照菌株中的若干假阳性条带。DNA序列分析显示假阳性扩增子是来自对照菌株的染色体基因而非特异性bla基因的PCR产物。因此，我们可以发现假阳性PCR产物是通过在一个bla基因类型的正向(或反向)引物与另一类型的正向(或反向)引物之间的染色体交叉杂交而产生的(图4c和4e)。为了鉴别哪个引物造成了假阳性条带，使用引物混合物而非一个引物进行多重PCR分析。在含有10个不同引物的多重管A2中检测的假阳性条带(图4c)的情况下，需要具有9个引物的10个多重PCR分析并且每个分析混合物不具有一个不同引物。在使用产OXA-240的菌株的管A2的多重PCR分析的情况下，不具有CTX-M-1型正向引物(5'-AGTTCACGCTGATGGCGAC-3')的多重PCR分析以及不具有CTX-M-25型正向引物(5'-AAAAGCGTAAGGCGGGCGA-3')的另一种多重PCR分析没有显示假阳性条带(图4b)。因此，这两个引物造成了假阳性条带。两个重新设计的引物(CTX-M-l-F；5'-CAGTTCACGCTGATGGCGAC-3’和CTX-M-25-F；5'-TAATGACGACAGCCTGTGTTTC-3')有效用于具有完整特异性的多重PCR，并且幸运的是，其未在多重管A2中产生任何假阳性条带(图4c)。与多重PCR管A2的情况不同的是，在使用产TEM-30的菌株作为模板的管D1的多重PCR分析的情况下，检测到两个假阳性条带。经由与多重PCR管A2相同的新型优化方法(图4d)，三个引物，即OXA-1型的引物对(5'-CAATCATACACCAAAGACGTGGA-3'和5'-GCTTCCTGTAAGTGCGGACAC-3')以及OXA-2型的正向引物(5'-AGTTGTGGCAGACGAACGC-3')，造成了两个假阳性条带。在此情况下，通过仅一个重新设计的引物(OXA-1-R；5'-AGCTTCCTGTAAGTGCGGACACA-3')，两个假阳性条带可在多重PCR分析中被除去(图4e)。在多重PCR管A1中的GES型的情况下，观察到扩增产物的弱强度(图4a)。为了增加GES型扩增子的量，增加GES型引物对的长度。随后获得更厚的条带。
阳性或阴性对照菌株
为了验证54个设计的引物对和优化多重PCR分析，具有已知的(报道的)bla基因的充分表征的100种细菌菌株被用作阳性对照且不具有任何靶向bla基因的72种细菌菌株被用作阴性对照。在所测试的所有阴性菌株中并未检测到任何PCR产物，除了以下之外：(i)已存在于大肠杆菌菌株K-12及其衍生物(大肠杆菌TOP 10、大肠杆菌MG 1655、大肠杆菌ATCC25922、大肠杆菌DH5α、大肠杆菌BL21[DE3]、大肠杆菌HB4、大肠杆菌JF701、大肠杆菌JF703等等)的基因组中的ampC基因，其在基因组中具有ampCbla基因；以及(ii)通过大规模blaFinder新近检测的额外的bla基因，因为之前报道的引物仅可以检测有限类型的bla基因(图3)。
<实施例4>bla基因在临床菌株中的检测
为了证实大规模blaFinder的可用性，对403种临床菌株进行多重PCR分析，如通过表型分析所测定而不是通过分子方法来表征。因此，所有菌株都具有至少单一的bla基因，表明此方法的惊人准确性。在78个菌株中检测单一bla基因，并且325个菌株具有超过两个bla基因。而且，所有PCR产物的直接测序验证了此大规模blaFinder可以测定临床菌株的精确bla基因分型，而不会有任何假阳性或假阴性结果(表6)。
[表6]
因此，我们的方法可充分用作用于细菌性病原体中的β-内酰胺酶的鉴别和基因分型的临床诊断技术。
用于分析(大规模blaFinder)验证的临床菌株。
大规模blaFinder进一步使用403种临床菌株来评估，这些菌株是通过表型分析如MIC(最小抑制性浓度)来选择，但不是通过任何分子方法来表征。MIC及其解释(抗性)是通过以下方法来测定：易感性是在含有连续两倍稀释的β-内酰胺的Mueller-Hinton琼脂平板(Difco Laboratories)上测定。将平板用Steers复制器(Craft Machine)接种并且将每点约104CFU在37℃下培育18小时。结果是通过使用临床和实验室标准协会(CLSI)准则来解释。所有菌株都展现对一种或多种β-内酰胺的抗性。
多重PCR产物的测序分析。
为了证实准确的bla基因类型，在多重PCR分析中扩增的所有PCR产物都通过PCR产物的直接测序来鉴别。扩增的PCR产物使用PCR纯化试剂盒(Qiagen)来纯化并且使用ABIPrism Big Dye终止子循环测序试剂盒(Applied Biosystems)根据标准工序来进行双向测序。54个设计的引物对是为那些双向测序而使用的。
在研究β-内酰胺抗性中的大问题的解决
直到现在，开发了bla基因分型的若干种分子方法来检测临床菌株中bla基因的存在(表7)。
[表7]
a未测定。
这些方法可以仅检测有限的bla基因(小于539个bla基因，表7)，如ESBL基因11-15。因为这些方法不能检测所有临床上重要的bla基因，所以其不能非常好地解释基于培养的表型试验的结果11-15,19-21。这在研究β-内酰胺抗性中是一个大问题，其可因不当的β-内酰胺使用而增加β-内酰胺抗性。然而，被设计用来解决此问题的大规模blaFinder可以100％特异性和100％灵敏性检测所有临床上重要的1,228个bla基因，并且经由403个临床菌株中的实验性测试，在临床环境中的此方法的可用性也得到了验证(表7)。虽然完美的特异性和灵敏性在3种先前方法中示出，但是这些方法具有数量较少的对照和测试(临床)菌株(表7)。此外，不像先前方法12,19,21一样，我们的方法需要每个临床菌株一个优化的多重PCR且因此其可以是快速和低成本的分子方法。因此，本发明可用作临床工具用来证实经典的基于培养的表型方法的结果。
工业实用性
由多重抗生素抗性的高涨所致的全球健康危机强烈地触发了用于检测抗生素抗性基因的快速和准确分子方法的发展。虽然报道了若干检测bla基因的方法，但这些方法仅可以检测小的bla基因。本发明人提供了新的大规模blaFinder，其能够检测所有临床上重要的bla基因并且还鉴别所检测的bla基因的确切基因类型，这是通过DNA序列分析来证实的。此优化的多重PCR方法是一种快速、低成本和准确的用于筛选在临床环境中所遇到的bla基因的技术。此方法可适用于临床微生物实验室而无需复杂的仪器，从而提供β-内酰胺抗性病原体的精确检测并提供用于基于具体情况的科学数据开出适当抗生素处方的快速和可靠指南。
研究β-内酰胺抗性中的一个大问题是以下事实：大多数研究者仅使用针对若干关注的bla基因类型的引物对在临床菌株中检测bla基因。此倾向具有的重要限制在于：这些方法不能检测存在于靶菌株中但不属于引物特异性bla基因类型的预期外的bla基因。因为所有存在的bla基因的检测对于抗生素的准确处方开出是相当重要的，所以此问题可能提高针对细菌感染的不足治疗的可能性。使用经典的基于培养的表型试验的易感性测试是能够测定对于大多数β-内酰胺抗生素的易感性的常规方法。然而，此工序可以提供关于哪些bla基因类型存在于细菌菌株，特别是具有ESBL和碳青霉烯酶基因的菌株中的不准确信息。近期研究表明基于易感性测试的ESBL和碳青霉烯酶检测使疗法失效趋于与成功病例类似的水平22。另外，虽然出于流行病学目的的不断提倡ESBL和碳青霉烯酶检测，但一些实验室不寻找用于治疗目的的这些酶22。因此，表型试验的不精确性和实验难度可通过分子基因分型方法来补充。因为我们的方法能够精确地经由每个临床菌株仅一个优化的多重PCR分析(具有8个PCR管)检测所有临床上重要的bla基因，所以此项技术可以解决在检测β-内酰胺抗性中的这个大问题。
为了除去多重PCR分析中的假阳性和假阴性结果，进行了54个引物对的新型和精巧优化方法，如除去属于不同类型的引物之间的染色体交叉杂交(图4b-c)。基于这些优化方法，将在未来报道的新bla基因可包括在此检测方法中。因此，本发明可能变成可易于升级的分子诊断工具。
本发明可成功地应用于展现对任何β-内酰胺抗生素的抗性的所有临床菌株。在403个临床菌株的研究中，在对β-内酰胺的表型抗性与通过本发明方法所检测的bla基因类型之间存在明显一致性，表明我们的分子方法的高度灵敏和特异性特征。鉴别抗生素抗性病原体的这个能力将是抗菌药物导向计划(Antimicrobial Stewardship Programs，ASP)成功的主要策略之一，ASP是一项优化抗菌药物疗法、降低治疗相关成本、改善临床结果和安全性以及降低或稳定抗生素抗性的机构性计划。
总之，本发明人开发了可以使用仅一种独特的多重PCR条件在各种致病菌株中检测所有临床上重要的bla基因的分子诊断方法。本发明使得能够快速和准确的检测所有临床上重要的bla基因，如ESBL和碳青霉烯酶基因。因此，本发明可以迅速地用作用于鉴别细菌性病原体中的bla基因的有效分子诊断技术并且将对开出适当抗生素处方和使耐药菌的传播最小化提供重要帮助。
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Claims (21)

1.一组引物对，用于鉴别β-内酰胺酶核酸，所述引物对包含：
选自由序列号1和2对、序列号3和4对、序列号5和6对、序列号7和8对、序列号9和10对、序列号11和12对、序列号13和14对以及序列号15和16对组成的组中的至少2个以上的引物对；
选自由序列号17和18对、序列号19和20对、序列号21和22对、序列号23和24对以及序列号25和26对组成的组中的至少2个以上的引物对；
选自由序列号27和28对、序列号29和30对、序列号31和32对、序列号33和34对、序列号35和36对、序列号37和38对、序列号39和40对以及序列号41和42对组成的组中的至少2个以上的引物对；
选自由序列号43和44对、序列号45和46对、序列号47和48对、序列号49和50对、序列号51和52对、序列号53和54对、序列号55和56对以及序列号57和58对组成的组中的至少2个以上的引物对；
选自由序列号59和60对、序列号61和62对、序列号63和64对、序列号65和66对以及序列号67和68对组成的组中的至少2个以上的引物对；
选自由序列号69和70对、序列号71和72对、序列号73和74对、序列号75和76对以及序列号77和78对组成的组中的至少2个以上的引物对；
选自由序列号79和80对、序列号81和82对、序列号83和84对、序列号85和86对、序列号87和88对、序列号89和90对、序列号91和92对以及序列号93和94对组成的组中的至少2个以上的引物对；以及
选自由序列号95和96对、序列号97和98对、序列号99和100对、序列号101和102对、序列号103和104对、序列号105和106对以及序列号107和108对组成的组中的至少2个以上的引物对。
2.根据权利要求1所述引物对，用于鉴别β-内酰胺酶核酸，所述引物对包含：
选自由序列号1和2对、序列号3和4对、序列号5和6对、序列号7和8对、序列号9和10对、序列号11和12对、序列号13和14对以及序列号15和16对组成的组中的至少3个以上的引物对；
选自由序列号17和18对、序列号19和20对、序列号21和22对、序列号23和24对以及序列号25和26对组成的组中的至少3个以上的引物对；
选自由序列号27和28对、序列号29和30对、序列号31和32对、序列号33和34对、序列号35和36对、序列号37和38对、序列号39和40对以及序列号41和42对组成的组中的至少3个以上的引物对；
选自由序列号43和44对、序列号45和46对、序列号47和48对、序列号49和50对、序列号51和52对、序列号53和54对、序列号55和56对以及序列号57和58对组成的组中的至少3个以上的引物对；
选自由序列号59和60对、序列号61和62对、序列号63和64对、序列号65和66对以及序列号67和68对组成的组中的至少3个以上的引物对；
选自由序列号69和70对、序列号71和72对、序列号73和74对、序列号75和76对以及序列号77和78对组成的组中的至少3个以上的引物对；
选自由序列号79和80对、序列号81和82对、序列号83和84对、序列号85和86对、序列号87和88对、序列号89和90对、序列号91和92对以及序列号93和94对组成的组中的至少3个以上的引物对；以及
选自由序列号95和96对、序列号97和98对、序列号99和100对、序列号101和102对、序列号103和104对、序列号105和106对以及序列号107和108对组成的组中的至少3个以上的引物对。
3.根据权利要求2所述的引物对，用于鉴别β-内酰胺酶核酸，所述引物对包含：
选自由序列号1和2对、序列号3和4对、序列号5和6对、序列号7和8对、序列号9和10对、序列号11和12对、序列号13和14对以及序列号15和16对组成的组中的至少4个以上的引物对；
选自由序列号17和18对、序列号19和20对、序列号21和22对、序列号23和24对以及序列号25和26对组成的组中的至少4个以上的引物对；
选自由序列号27和28对、序列号29和30对、序列号31和32对、序列号33和34对、序列号35和36对、序列号37和38对、序列号39和40对以及序列号41和42对组成的组中的至少4个以上的引物对；
选自由序列号43和44对、序列号45和46对、序列号47和48对、序列号49和50对、序列号51和52对、序列号53和54对、序列号55和56对以及序列号57和58对组成的组中的至少4个以上的引物对；
选自由序列号59和60对、序列号61和62对、序列号63和64对、序列号65和66对以及序列号67和68对组成的组中的至少4个以上的引物对；
选自由序列号69和70对、序列号71和72对、序列号73和74对、序列号75和76对以及序列号77和78对组成的组中的至少4个以上的引物对；
选自由序列号79和80对、序列号81和82对、序列号83和84对、序列号85和86对、序列号87和88对、序列号89和90对、序列号91和92对以及序列号93和94对组成的组中的至少4个以上的引物对；以及
选自由序列号95和96对、序列号97和98对、序列号99和100对、序列号101和102对、序列号103和104对、序列号105和106对以及序列号107和108对组成的组中的至少4个以上的引物对。
4.根据权利要求3所述的引物对，用于鉴别β-内酰胺酶核酸，所述引物对包含：
选自由序列号1和2对、序列号3和4对、序列号5和6对、序列号7和8对、序列号9和10对、序列号11和12对、序列号13和14对以及序列号15和16对组成的组中的至少5个以上的引物对；
选自由序列号17和18对、序列号19和20对、序列号21和22对、序列号23和24对以及序列号25和26对组成的组中的至少5个以上的引物对；
选自由序列号27和28对、序列号29和30对、序列号31和32对、序列号33和34对、序列号35和36对、序列号37和38对、序列号39和40对以及序列号41和42对组成的组中的至少5个以上的引物对；
选自由序列号43和44对、序列号45和46对、序列号47和48对、序列号49和50对、序列号51和52对、序列号53和54对、序列号55和56对以及序列号57和58对组成的组中的至少5个以上的引物对；
选自由序列号59和60对、序列号61和62对、序列号63和64对、序列号65和66对以及序列号67和68对组成的组中的至少5个以上的引物对；
选自由序列号69和70对、序列号71和72对、序列号73和74对、序列号75和76对以及序列号77和78对组成的5个引物对；
选自由序列号79和80对、序列号81和82对、序列号83和84对、序列号85和86对、序列号87和88对、序列号89和90对、序列号91和92对以及序列号93和94对组成的组中的至少5个以上的引物对；以及
选自由序列号95和96对、序列号97和98对、序列号99和100对、序列号101和102对、序列号103和104对、序列号105和106对以及序列号107和108对组成的组中的至少5个以上的引物对。
5.一组引物对，所述引物对由用于鉴别A类β-内酰胺酶核酸的序列号1和2对、序列号3和4对、序列号5和6对、序列号7和8对、序列号9和10对、序列号11和12对、序列号13和14对、序列号15和16对、序列号17和18对、序列号19和20对、序列号21和22对、序列号23和24对以及序列号25和26对组成。
6.一组引物对，所述引物对由用于鉴别B类β-内酰胺酶核酸的序列号27和28对、序列号29和30对、序列号31和32对、序列号33和34对、序列号35和36对、序列号37和38对、序列号39和40对、序列号41和42对、序列号43和44对、序列号45和46对、序列号47和48对、序列号49和50对、序列号51和52对、序列号53和54对、序列号55和56对以及序列号57和58对组成。
7.一组引物对，所述引物对由用于鉴别C类β-内酰胺酶核酸的序列号59和60对、序列号61和62对、序列号63和64对、序列号65和66对、序列号67和68对、序列号69和70对、序列号71和72对、序列号73和74对、序列号75和76对以及序列号77和78对组成。
8.一组引物对，所述引物对由用于鉴别D类β-内酰胺酶核酸的序列号79和80对、序列号81和82对、序列号83和84对、序列号85和86对、序列号87和88对、序列号89和90对、序列号91和92对、序列号93和94对、序列号95和96对、序列号97和98对、序列号99和100对、序列号101和102对、序列号103和104对、序列号105和106对以及序列号107和108对组成。
9.一种用于鉴别β-内酰胺酶核酸的检测试剂盒，所述检测试剂盒包括：
a)至少一组能够杂交到β-内酰胺酶核酸的引物对；
b)至少一个阳性对照和至少一个阴性对照；以及
c)用于鉴别β-内酰胺酶核酸的方案；
所述引物对包含：
选自由序列号1和2对、序列号3和4对、序列号5和6对、序列号7和8对、序列号9和10对、序列号11和12对、序列号13和14对以及序列号15和16对组成的组中的至少2个以上的引物对；
选自由序列号17和18对、序列号19和20对、序列号21和22对、序列号23和24对以及序列号25和26对组成的组中的至少2个以上的引物对；
选自由序列号27和28对、序列号29和30对、序列号31和32对、序列号33和34对、序列号35和36对、序列号37和38对、序列号39和40对以及序列号41和42对组成的组中的至少2个以上的引物对；
选自由序列号43和44对、序列号45和46对、序列号47和48对、序列号49和50对、序列号51和52对、序列号53和54对、序列号55和56对以及序列号57和58对组成的组中的至少2个以上的引物对；
选自由序列号59和60对、序列号61和62对、序列号63和64对、序列号65和66对以及序列号67和68对组成的组中的至少2个以上的引物对；
选自由序列号69和70对、序列号71和72对、序列号73和74对、序列号75和76对以及序列号77和78对组成的组中的至少2个以上的引物对；
选自由序列号79和80对、序列号81和82对、序列号83和84对、序列号85和86对、序列号87和88对、序列号89和90对、序列号91和92对以及序列号93和94对组成的组中的至少2个以上的引物对；以及
选自由序列号95和96对、序列号97和98对、序列号99和100对、序列号101和102对、序列号103和104对、序列号105和106对以及序列号107和108对组成的组中的至少2个以上的引物对。
10.一种用于鉴别A类β-内酰胺酶核酸的检测试剂盒，其中所述检测试剂盒包括：
a)一组能够杂交到A类β-内酰胺酶核酸的引物对；
b)至少一个阳性对照和至少一个阴性对照；以及
c)用于鉴别A类β-内酰胺酶核酸的方案；
所述引物对由序列号1和2对、序列号3和4对、序列号5和6对、序列号7和8对、序列号9和10对、序列号11和12对、序列号13和14对、序列号15和16对、序列号17和18对、序列号19和20对、序列号21和22对、序列号23和24对以及序列号25和26对组成。
11.一种用于鉴别A1类β-内酰胺酶核酸的检测试剂盒，其中所述检测试剂盒包括：
a)能够杂交到A1类β-内酰胺酶核酸的引物对；
b)至少一个阳性对照和至少一个阴性对照；以及
c)用于鉴别A1类β-内酰胺酶核酸的方案；
所述引物对由序列号1和2对、序列号3和4对、序列号5和6对、序列号7和8对、序列号9和10对、序列号11和12对、序列号13和14对以及序列号15和16对组成。
12.一种用于鉴别A2类β-内酰胺酶核酸的检测试剂盒，其中所述检测试剂盒包括：
a)能够杂交到A2类β-内酰胺酶核酸的引物对；
b)至少一个阳性对照和至少一个阴性对照；以及
c)用于鉴别A2类β-内酰胺酶核酸的方案；
所述引物对由序列号17和18对、序列号19和20对、序列号21和22对、序列号23和24对以及序列号25和26对组成。
13.一种用于鉴别B类β-内酰胺酶核酸的检测试剂盒，其中所述检测试剂盒包括：
a)一组能够杂交到B类β-内酰胺酶核酸的引物对；
b)至少一个阳性对照和至少一个阴性对照；以及
c)用于鉴别B类β-内酰胺酶核酸的方案；
所述引物对由序列号27和28对、序列号29和30对、序列号31和32对、序列号33和34对、序列号35和36对、序列号37和38对、序列号39和40对、序列号41和42对、序列号43和44对、序列号45和46对、序列号47和48对、序列号49和50对、序列号51和52对、序列号53和54对、序列号55和56对以及序列号57和58对组成。
14.一种用于鉴别B1类β-内酰胺酶核酸的检测试剂盒，其中所述检测试剂盒包括：
a)能够杂交到B1类β-内酰胺酶核酸的引物对；
b)至少一个阳性对照和至少一个阴性对照；以及
c)用于鉴别B1类β-内酰胺酶核酸的方案；
其中所述引物对由序列号27和28对、序列号29和30对、序列号31和32对、序列号33和34对、序列号35和36对、序列号37和38对、序列号39和40对以及序列号41和42对组成。
15.一种用于鉴别B2类β-内酰胺酶核酸的检测试剂盒，其中所述检测试剂盒包括：
a)能够杂交到B2类β-内酰胺酶核酸的引物对；
b)至少一个阳性对照和至少一个阴性对照；以及
c)用于鉴别B2类β-内酰胺酶核酸的方案；
其中所述引物对由序列号43和44对、序列号45和46对、序列号47和48对、序列号49和50对、序列号51和52对、序列号53和54对、序列号55和56对以及序列号57和58对组成。
16.一种用于鉴别C类β-内酰胺酶核酸的检测试剂盒，其中所述检测试剂盒包括：
a)一组能够杂交到C类β-内酰胺酶核酸的引物对；
b)至少一个阳性对照和至少一个阴性对照；以及
c)用于鉴别C类β-内酰胺酶核酸的方案；
其中所述引物对由序列号59和60对、序列号61和62对、序列号63和64对、序列号65和66对、序列号67和68对、序列号69和70对、序列号71和72对、序列号73和74对、序列号75和76对、序列号77和78对组成。
17.一种用于鉴别C1类β-内酰胺酶核酸的检测试剂盒，其中所述检测试剂盒包括：
a)能够杂交到C1类β-内酰胺酶核酸的引物对；
b)至少一个阳性对照和至少一个阴性对照；以及
c)用于鉴别C1类β-内酰胺酶核酸的方案；
其中所述引物对由序列号59和60对、序列号61和62对、序列号63和64对、序列号65和66对以及序列号67和68对组成。
18.一种用于鉴别C2类β-内酰胺酶核酸的检测试剂盒，其中所述检测试剂盒包括：
a)能够杂交到C2类β-内酰胺酶核酸的引物对；
b)至少一个阳性对照和至少一个阴性对照；以及
c)用于鉴别C2类β-内酰胺酶核酸的方案；
其中所述引物对由序列号69和70对、序列号71和72对、序列号73和74对、序列号75和76对、序列号77和78对组成。
19.一种用于鉴别D类β-内酰胺酶核酸的检测试剂盒，其中所述检测试剂盒包括：
a)一组能够杂交到D类β-内酰胺酶核酸的引物对；
b)至少一个阳性对照和至少一个阴性对照；以及
c)用于鉴别D类β-内酰胺酶核酸的方案；
其中所述引物对由序列号79和80对、序列号81和82对、序列号83和84对、序列号85和86对、序列号87和88对、序列号89和90对、序列号91和92对、序列号93和94对、序列号95和96对、序列号97和98对、序列号99和100对、序列号101和102对、序列号103和104对、序列号105和106对以及序列号107和108对组成。
20.一种用于鉴别D1类β-内酰胺酶核酸的检测试剂盒，其中所述检测试剂盒包括：
a)能够杂交到D1类β-内酰胺酶核酸的引物对；
b)至少一个阳性对照和至少一个阴性对照；以及
c)用于鉴别D1类β-内酰胺酶核酸的方案；
其中所述引物对由序列号79和80对、序列号81和82对、序列号83和84对、序列号85和86对、序列号87和88对、序列号89和90对、序列号91和92对以及序列号93和94对组成。
21.一种用于鉴别D2类β-内酰胺酶核酸的检测试剂盒，其中所述检测试剂盒包括：
a)能够杂交到D2类β-内酰胺酶核酸的引物对；
b)至少一个阳性对照和至少一个阴性对照；以及
c)用于鉴别D2类β-内酰胺酶核酸的方案；
其中所述引物对由序列号95和96对、序列号97和98对、序列号99和100对、序列号101和102对、序列号103和104对、序列号105和106对以及序列号107和108对组成。
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Application publication date: 20151118

Assignee: Antibiotic resistance research laboratory Co., Ltd

Assignor: MYONGJI UNIVERSITY INDUSTRY AND ACADEMIA COOPERATION FOUNDATION

Contract record no.: X2020990000214

Denomination of invention: Primers and kits for colony multiplex PCR for the detection of class a, b, c, and d [belta]-lactamase genes and methods of using thereof

Granted publication date: 20181130

License type: Exclusive License

Record date: 20200424