JP5124601B2 - オキサ型β−ラクタマーゼ産生菌の検出方法、同定方法及びキット - Google Patents
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Description
抗原に用いるOXA−23、OXA−40、OXA−51、OXA−54及びOXA−58タンパクの入手は困難であった。まず、発明者らが所有していたアシネトバクター菌株及び世界中の研究者に分与を依頼して入手したアシネトバクター菌株の中から、OXA−23、OXA−40、OXA−51、OXA−54及びOXA−58の遺伝子をゲノム中に持つアシネトバクター菌株を探索した。
アシネトバクターのゲノム上にオキサ型β−ラクタマーゼ遺伝子が存在するだけでは、オキサ型β−ラクタマーゼ遺伝子は発現しない。そして、オキサ型β−ラクタマーゼ遺伝子が発現するためには、遺伝子組換えによりオキサ型β−ラクタマーゼ遺伝子の上流にISAba配列が隣接する必要があることが明らかにされている(FEMS Microbiol. Lett.258:72−77,2006)。そこで、マルチプレックスPCRによってオキサ型β−ラクタマーゼ遺伝子の存在が確認された菌株について、ISAba配列とオキサ型β−ラクタマーゼ遺伝子が隣接しているか否かをPCRによって検討した。
ISAba配列と隣接したオキサ型β−ラクタマーゼ遺伝子を持つアシネトバクター菌株から、オキサ型β−ラクタマーゼ遺伝子をクローニングし、発現ベクターを構築した。
構築した発現ベクターを大腸菌株BL21DE3(タカラバイオ社)に導入して発現させた。具体的には、培養液のOD600が0.4〜0.5に到達するまで培養を行った後、pET28を用いた場合は終濃度0.5mMのIPTGを培養液に添加し、pCold1ベクターを用いた場合は培養温度を15度にシフトして、さらに約18時間培養した。培養液を8000gで遠心し、大腸菌ペレットを回収した。続いて大腸菌ペレットをOXA−40の場合は0.05Mリン酸バッファー(pH 7.0)、OXA−23、OXA−51、OXA−54及びOXA−58の場合は0.02Mトリス塩酸バッファー(pH8.0)に懸濁し、超音波破砕した後、40000gで遠心して上清を回収した。超音波破砕装置にはSonifier150(Branson社、米国)を使用した。続いて回収した上清を0.05Mリン酸バッファー(pH7.0)中で透析し、AKTAシステム(GEヘルスケアバイオサイエンス社)を用いて、発現させたオキサ型β−ラクタマーゼタンパクを精製した。
各アシネトバクター菌株1コロニーを、LB培地4mLに釣菌し、一晩培養した。続いて培養液をエッペンドルフチューブに移し、室温にて6500gで15分遠心した後、上清を捨て、ペレットをリン酸バッファー(20mM、pH7.4)に懸濁した。続いて菌液を30秒で5回の処理で超音波破砕し、4℃にて40000gで30分遠心した後、上清を回収し、これを電気泳動用のサンプルとした。各サンプル10μLにSDSサンプルバッファーを10μLずつ加え、100℃にて5分間加熱後、10μLずつウェルにアプライし、30mAで80分電気泳動した。分子量マーカー(New England Biolabs社)及びコントロールサンプルも同時に電気泳動した。コントロールサンプルとしては、大腸菌で発現させて精製したOXA−23及びOXA−40タンパクを用いた。ポリアクリルアミドゲルにはe・パジェル(登録商標)(アトー株式会社、E−R10L)を用いた。
OXA−23を産生するアシネトバクター菌株を、平板培地上で培養した。続いて、培地表面の菌体を掻き取り、1mLの懸濁用希釈液に懸濁した。菌体が均一に分散するようにボルテックスミキサーで撹拌し、エッペンドルフチューブに100μL分取し、感染菌サンプルとした。懸濁用希釈液には0.01容量%の界面活性剤が含有されており、菌体内のOXA−23が抽出された。なお、この界面活性剤は、抗体によるオキサ型β−ラクタマーゼの検出に悪影響を与えないことが分かっている。この感染菌サンプルに、金コロイドで標識した、抗OXA−23抗体及び抗OXA−40抗体の抗体混合物10μLを添加してよく混合した。この溶液をイムノクロマト用テストプレートの感染菌サンプル滴下領域に全量滴下し、20分間静置した。この過程で、滴下した金コロイド標識抗体混合物と感染菌サンプル中のOXA−23が複合体を形成し、毛細管現象によりテストプレートの他端に向かって移動し、テストプレートの途中に位置する検出領域に固定された抗OXA−23抗体及び抗OXA−40抗体の抗体混合物に結合し、目視で識別が可能なバンドを形成した。
0、10、20、50及び500ng/mL濃度の精製したOXA−23溶液各100μLに、金コロイドで標識した、抗OXA−23抗体及び抗OXA−40抗体の抗体混合物10μLを添加してよく混合した。この溶液をイムノクロマト用テストプレートの感染菌サンプル滴下領域に全量滴下し、20分間静置した。結果を図8に示す。10、20、50及び500ng/mL濃度のOXA−23溶液を滴下したテストプレートの検出領域に目視で識別が可能なバンドが形成された。
感染菌サンプル中のオキサ型β−ラクタマーゼ産生菌を検出又はオキサ型β−ラクタマーゼ産生菌のタイプを同定するためのイムノクロマト法によるキットを作製した。図9にキットの写真を示す。図9において、(a)は金コロイドで標識された抗オキサ型β−ラクタマーゼ抗体であり、(b)はイムノクロマト用テストプレート(イムノクロマト用ストリップ)であり、(c)は懸濁用希釈液である。金コロイドで標識された抗オキサ型β−ラクタマーゼ抗体としては、抗OXA−23抗体、抗OXA−40抗体、抗OXA−51抗体及びOXA−58抗体の4種類を使用した。また、検出感度の観点から、抗OXA−23抗体及び抗OXA−40抗体は、混合して抗OXA−23/40抗体として使用した。抗OXA−51抗体及び抗OXA−58抗体は、それぞれ単独で使用した。なお、OXA−54の産生菌は、臨床検査において、現在のところ大きな問題となっていないため、本実施例においては、抗OXA−54抗体は使用しなかった。
上述のキットを用いてオキサ型β−ラクタマーゼ産生菌を検出した。まず、感染菌サンプル(被検菌株)を静置培養法により培養した。続いて、培地表面の菌体を掻き取り、1mLの懸濁用希釈液に懸濁し、菌体懸濁液を調製した。続いて、菌体懸濁液を100μL分取し、金コロイドで標識された抗オキサ型β−ラクタマーゼ抗体10μLと混合し、抗体反応液を調製した。続いて、抗体反応液の全量をテストプレートの感染菌サンプル滴下領域に滴下した。続いて、30分間静置後、検出領域におけるバンドの有無を目視により判定した。
日本全国の医療施設において、PCR法によりオキサ型β−ラクタマーゼ産生菌を検出した。その結果、OXA−23の産生菌6株、OXA−40の産生菌1株、OXA−51の産生菌15株及びOXA−58の産生菌5株の合計27株のオキサ型β−ラクタマーゼ産生菌が検出された。結果を表9に示す。OXA−23陽性株はいずれもOXA−51陽性であった。
26サンプル/27サンプル×100=96.3(%)・・・(1)
以上の結果は、検査が簡便で、臨床検査においても使用することが可能なイムノクロマト法による検査により、より正確なPCR法による検出結果と非常によく一致した検出結果が得られることを示す。
上記のイムノクロマト法によるキットを用いた検査により、入院中の患者由来の感染菌サンプルからオキサ型β−ラクタマーゼ産生菌を検出した。この結果、OXA−23及びOXA−51の両方を産生する産生菌が3株検出された。
続いて、イムノクロマト法によるキットにより検出された、上述のOXA−23及びOXA−51の両方を産生する3株の産生菌それぞれをサンプルとして、PCR法により、OXA−23及びOXA−51の産生菌であるか否かを検討した。
Claims (10)
- 日本国内で採取された感染菌サンプル中の、以下の(a)〜(e)のタンパク質:
(a)配列番号1に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号1に記載のアミノ酸配列と90%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなりオキサシリナーゼ活性を有するタンパク質;
(b)配列番号2に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号2に記載のアミノ酸配列と90%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなりオキサシリナーゼ活性を有するタンパク質;
(c)配列番号3に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号3に記載のアミノ酸配列と90%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなりオキサシリナーゼ活性を有するタンパク質;
(d)配列番号4に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号4に記載のアミノ酸配列と90%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなりオキサシリナーゼ活性を有するタンパク質;及び
(e)配列番号5に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号5に記載のアミノ酸配列と90%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなりオキサシリナーゼ活性を有するタンパク質;
の存在を検出する、検出ステップと、
検出ステップにおいて、前記(a)〜(e)のタンパク質のうち、いずれか1つ以上のタンパク質が検出された場合に、前記感染菌サンプル中にオキサ型β−ラクタマーゼ産生菌が存在すると判定する、判定ステップと
を含む、前記感染菌サンプル中のオキサ型β−ラクタマーゼ産生菌の検出方法。 - 日本国内で採取された感染菌サンプル中の、以下の(a)〜(e)のタンパク質:
(a)配列番号1に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号1に記載のアミノ酸配列と90%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなりオキサシリナーゼ活性を有するタンパク質;
(b)配列番号2に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号2に記載のアミノ酸配列と90%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなりオキサシリナーゼ活性を有するタンパク質;
(c)配列番号3に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号3に記載のアミノ酸配列と90%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなりオキサシリナーゼ活性を有するタンパク質;
(d)配列番号4に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号4に記載のアミノ酸配列と90%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなりオキサシリナーゼ活性を有するタンパク質;及び
(e)配列番号5に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号5に記載のアミノ酸配列と90%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなりオキサシリナーゼ活性を有するタンパク質;
の存在を検出する、検出ステップと、
検出ステップにおいて、前記(a)〜(e)の各タンパク質の発現の有無に基づいて前記感染菌サンプル中のオキサ型β−ラクタマーゼ産生菌のタイプを同定する、同定ステップと
を含む、前記感染菌サンプル中のオキサ型β−ラクタマーゼ産生菌のタイプの同定方法。 - 前記検出ステップが、以下の(a)〜(e)のタンパク質:
(a)配列番号1に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号1に記載のアミノ酸配列と90%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなりオキサシリナーゼ活性を有するタンパク質;
(b)配列番号2に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号2に記載のアミノ酸配列と90%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなりオキサシリナーゼ活性を有するタンパク質;
(c)配列番号3に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号3に記載のアミノ酸配列と90%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなりオキサシリナーゼ活性を有するタンパク質;
(d)配列番号4に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号4に記載のアミノ酸配列と90%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなりオキサシリナーゼ活性を有するタンパク質;及び
(e)配列番号5に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号5に記載のアミノ酸配列と90%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなりオキサシリナーゼ活性を有するタンパク質;
に対する抗体の抗原抗体反応により行われる、請求項1又は2に記載の方法。 - 請求項1又は2に記載の方法によって、感染菌サンプル中のオキサ型β−ラクタマーゼ産生菌を検出又はオキサ型β−ラクタマーゼ産生菌のタイプを同定するためのキットであって、以下の(a)〜(e)のタンパク質:
(a)配列番号1に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号1に記載のアミノ酸配列と90%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなりオキサシリナーゼ活性を有するタンパク質;
(b)配列番号2に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号2に記載のアミノ酸配列と90%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなりオキサシリナーゼ活性を有するタンパク質;
(c)配列番号3に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号3に記載のアミノ酸配列と90%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなりオキサシリナーゼ活性を有するタンパク質;
(d)配列番号4に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号4に記載のアミノ酸配列と90%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなりオキサシリナーゼ活性を有するタンパク質;及び
(e)配列番号5に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号5に記載のアミノ酸配列と90%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなりオキサシリナーゼ活性を有するタンパク質;
に対する抗体を含む、キット。 - 日本国内で採取された感染菌サンプル中の、以下の(a)〜(d)のタンパク質:
(a)配列番号1に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号1に記載のアミノ酸配列と90%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなりオキサシリナーゼ活性を有するタンパク質;
(b)配列番号2に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号2に記載のアミノ酸配列と90%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなりオキサシリナーゼ活性を有するタンパク質;
(c)配列番号3に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号3に記載のアミノ酸配列と90%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなりオキサシリナーゼ活性を有するタンパク質;及び
(d)配列番号5に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号5に記載のアミノ酸配列と90%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなりオキサシリナーゼ活性を有するタンパク質;
の存在を検出する、検出ステップと、
検出ステップにおいて、前記(a)〜(d)のタンパク質のうち、いずれか1つ以上のタンパク質が検出された場合に、前記感染菌サンプル中にオキサ型β−ラクタマーゼ産生菌が存在すると判定する、判定ステップと
を含む、前記感染菌サンプル中のオキサ型β−ラクタマーゼ産生菌の検出方法。 - 日本国内で採取された感染菌サンプル中の、以下の(a)〜(d)のタンパク質:
(a)配列番号1に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号1に記載のアミノ酸配列と90%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなりオキサシリナーゼ活性を有するタンパク質;
(b)配列番号2に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号2に記載のアミノ酸配列と90%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなりオキサシリナーゼ活性を有するタンパク質;
(c)配列番号3に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号3に記載のアミノ酸配列と90%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなりオキサシリナーゼ活性を有するタンパク質;及び
(d)配列番号5に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号5に記載のアミノ酸配列と90%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなりオキサシリナーゼ活性を有するタンパク質;
の存在を検出する、検出ステップと、
検出ステップにおいて、前記(a)〜(d)の各タンパク質の発現の有無に基づいて前記感染菌サンプル中のオキサ型β−ラクタマーゼ産生菌のタイプを同定する、同定ステップと
を含む、前記感染菌サンプル中のオキサ型β−ラクタマーゼ産生菌のタイプの同定方法。 - 前記検出ステップが、以下の(a)〜(d)のタンパク質:
(a)配列番号1に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号1に記載のアミノ酸配列と90%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなりオキサシリナーゼ活性を有するタンパク質;
(b)配列番号2に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号2に記載のアミノ酸配列と90%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなりオキサシリナーゼ活性を有するタンパク質;
(c)配列番号3に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号3に記載のアミノ酸配列と90%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなりオキサシリナーゼ活性を有するタンパク質;及び
(d)配列番号5に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号5に記載のアミノ酸配列と90%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなりオキサシリナーゼ活性を有するタンパク質;
に対する抗体の抗原抗体反応により行われる、請求項5又は6に記載の方法。 - 請求項5又は6に記載の方法によって、感染菌サンプル中のオキサ型β−ラクタマーゼ産生菌を検出又はオキサ型β−ラクタマーゼ産生菌のタイプを同定するためのキットであって、以下の(a)〜(d)のタンパク質:
(a)配列番号1に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号1に記載のアミノ酸配列と90%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなりオキサシリナーゼ活性を有するタンパク質;
(b)配列番号2に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号2に記載のアミノ酸配列と90%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなりオキサシリナーゼ活性を有するタンパク質;
(c)配列番号3に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号3に記載のアミノ酸配列と90%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなりオキサシリナーゼ活性を有するタンパク質;及び
(d)配列番号5に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号5に記載のアミノ酸配列と90%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなりオキサシリナーゼ活性を有するタンパク質;
に対する抗体を含む、キット。 - 凝集アッセイ用である、請求項4又は8に記載のキット。
- イムノクロマト用である、請求項4又は8に記載のキット。
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