JP2019142811A - イムノクロマトグラフィー用のニューデリーメタロβ−ラクタマーゼ（ＮＤＭ型ＭＢＬ）に対するモノクローナル抗体、ＮＤＭ型ＭＢＬ用のイムノクロマトグラフィー装置及びそのキット、並びにＮＤＭ型ＭＢＬの検出方法 - Google Patents

Abstract

【課題】 迅速かつ簡便にＮＤＭ型ＭＢＬを検出可能とする装置を提供する。【解決手段】 イムノクロマトグラフィー装置（１００）は、ＮＤＭ型ＭＢＬ及びその亜型（６３）に対するモノクローナル抗体からなり標識物質で標識化された第１特異的抗体（３１）と、第１特異的抗体の下流側に離れて配置され且つ下流方向に交差する方向に直線状にメンブレン体に固相化されＮＤＭ型ＭＢＬ及びその亜型に対するモノクローナル抗体からなる第２特異的抗体（３３）と、を備える。【選択図】図１

Description

本発明は、イムノクロマトグラフィー法を用いたニューデリーメタロβ−ラクタマーゼ（ＮＤＭ型ＭＢＬ）産生菌を検出するためのモノクローナル抗体、ＮＤＭ型ＭＢＬ用のイムノクロマトグラフィー装置及びそのキットに関する。さらに、ＮＤＭ型ＭＢＬ用の検出方法に関するものである。

多剤耐性菌が地球規模で拡大し、世界の医療安全を根底から脅かすようになってきた（非特許文献１）。特に、「切り札」といわれている抗菌薬カルバペネムに耐性の細菌が術後感染の原因として分離されるようになり、感染症の治療では死亡率を押し上げる要因となっており、深刻な問題となっている。

細菌が抗菌薬に耐性を示す機序はさまざまであり、その中の代表的な機序として、β−ラクタム系抗菌薬の分解酵素であるβ−ラクタマーゼの産生がある。β−ラクタマーゼの中にはカルバペネマーゼと呼ばれるカルバペネム分解酵素があり、細菌はこのカルバペネマーゼを産生することで、カルバペネムに耐性を示す。

このカルバペネマーゼは、酵素の活性中心にセリン残基を持つセリンβ−ラクタマーゼ及び亜鉛原子を活性発現に必要とするメタロβ−ラクタマーゼ（ＭＢＬ）の２種類が知られている。特に、ＭＢＬは、その活性中心に存在する亜鉛原子に結合した不安定な水分子がβ−ラクタム環を攻撃し、加水分解するとされている。それゆえＭＢＬは、セリンβ−ラクタマーゼにより分解されにくいβ−ラクタマーゼ阻害剤をも容易に分解・不活化してしまうという憂慮すべき性質を示している。基本的にβ−ラクタム系抗菌薬はほとんど全てに耐性を示す。

ＭＢＬは、これまでに５０種類以上の報告がなされている。特にＮＤＭ（ニューデリーメタロベータラクタマーゼ）型、ＩＭＰ型、ＶＩＭ型、ＳＰＭ型と呼ばれる４種類のＭＢＬ産生菌は、分離頻度が高く、院内感染事例の報告も多いため、その蔓延が警戒されている。

これらのＭＢＬの中で、ＮＤＭ型は、最も近年に発見され、２００９年にインドから帰国したスェーデン人からはじめて分離された。その後、インドやパキスタン・バングラデッシュにおいてＮＤＭ型産生菌が蔓延していることが指摘され、今や、英国、ベルギー、フランス、オランダ、スウェーデン、アメリカ合衆国、カナダ、オーストラリア、香港などにおいても、インド、パキスタンで医療行為を受けて帰国した者に感染が確認されている。

ＮＤＭ型のＭＢＬには亜型（ｓｕｂｔｙｐｅ）が存在し、現在まででＮＤＭ−１からＮＤＭ−１４までの１４種の亜型が知られている。亜型は互いに蛋白質の一次構造であるアミノ酸配列の一部が異なる。

ＮＤＭ型ＭＢＬは、その伝播様式についても問題視されている。ＮＤＭ型ＭＢＬの遺伝子は、ＮＤＭ産生菌自体の染色体とは別に存在する独立したＤＮＡ分子であるプラスミドに存在することが多く、菌同士の接触のみでＮＤＭ遺伝子の伝搬が行われる。菌種をも超えて伝達されるために耐性菌が広範囲に劇的に拡散する仕組みを持っている。

このようにはＮＤＭ型ＭＢＬは臨床的に大きな問題を抱えており，国際的にも非常に警戒されている。耐性菌の早期検出は、医療現場において抗生物質が効かない危険な耐性菌の感染蔓延を防止する目的でたいへん重要である。これまでの検出方法では、ＭＢＬを簡便・容易に検出することは困難であった。

特許文献１は、ＭＢＬ阻害剤のチオグリコール酸（メルカプト酢酸）を使用したディスク拡散法、２価イオンキレート剤のエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）もしくはジピコリン酸を使用した方法を開示する。

ＭＢＬは活性中心に亜鉛を持っているため、亜鉛とキレートすることで活性を不活化することができ、ＥＤＴＡ、ジピコリン酸、チオグリコール酸や２−メルカプトプロピオン酸もＭＢＬの阻害剤として用いることができる。特許文献１の方法を用いた製品としては、ドライプレート'栄研'ＤＰＤ１（栄研化学株式会社、商標）やメタロ−β−ラクタマーゼＳＭＡ'栄研'（栄研化学株式会社、商標）がある。

具体的には、分離培養した菌懸濁液を培地上に塗布し、培地上の一方に抗菌薬のみをもう一方には抗菌薬とＭＢＬ阻害剤を近接して置いた状態で培養する。培地上に設置した抗菌剤や阻害剤の周辺に、発育の阻害を受けて作る阻止帯の有無や大きさを比較することで、ＭＢＬ産生株かどうかを検出することができる。

しかしながら、当該検査には１６時間以上の培養が必要となり、長時間を要してしまう。また阻止帯の大きさによっては判定不能となること、菌体数を濁度法などで正確に定量する必要があることから、簡便・迅速な測定方法とは言い切れない。また、院内感染事例の報告が多く、その蔓延が警戒されているＭＢＬの種類を特定することはできない。それゆえ、ＮＤＭ型のＭＢＬ産生株（Ｎｅｗ Ｄｅｌｈｉ ｍｅｔａｌｌｏ−β−ｌａｃｔａｍａｓｅ−ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｂａｃｔｅｒｉａ）のみを検出することはできない。

別の方法として、特許文献２は、クロモジェニックセファロスポリン法を利用してＥＳＢＬを検出することができる新規化合物を開示する。しかしながら特許文献２には、特定のβ−ラクタマーゼ阻害剤との併用については開示されておらず、ＥＳＢＬ以外の他のβ−ラクタマーゼのクラスを検出できる可能性も示唆されていない。

特許文献２に開示されるクロモジェニックセファロスポリン法を利用した製品としては、シカベータテストＩ／ＭＢＬ（関東化学株式会社、商標）という検出試薬が市販されている。ＥＳＢＬかＭＢＬかを特定するために、発色基質のみのものと、発色基質と共にＭＢＬ阻害剤を塗ったものとを用意し、同一検体で同時に測定して結果を比較する必要がある。

ここでＭＢＬ過剰産生菌の場合は、阻害剤の阻害能を超えてしまうことで基質が変色し、判定を誤る可能性もある。検査に使用する菌体を過剰にテストストリップに塗布すると偽陽性、少量であると偽陰性が生じる可能性もあり、適量を塗布するのに技量が必要となる。

従って、特許文献２に開示する方法は、１５分と短時間での測定が可能ではあるが、簡便性には欠けているといわざるを得ない。さらに、２〜８℃で保存する必要があり貯法と使用時の温度にも注意を要する。また、この方法でも、その蔓延が警戒されているＭＢＬの種類を特定することはできない。それゆえ、ＮＤＭ型のＭＢＬ産生株のみを検出することはできない。

さらに別の方法としては、特許文献３は、遺伝子増幅用のプライマーを使って、ＭＢＬ遺伝子を増幅後、その塩基配列を読み取る方法を開示する。遺伝子検査であるため検出感度が高く、各種のプライマーを用意することで遺伝子型まで特定できるが、全ての亜型を検出するプライマーはないため、塩基配列を読み取る必要がある。さらに高価な機械や、高度な手技、抽出作業といった手間が必要となり、測定可能な施設や人が限られてしまう問題がある。

特開２００１−２９９３８８号公報 ＷＯ ０２／２４７０７号公報 特開２００７−１９５４２１号公報 Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ： ｇｌｏｂａｌ ｒｅｐｏｒｔ ｏｎ ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ ２０１４, ＷＨＯ Ｌｅｅ ＣＲ， Ｌｅｅ ＪＨ， Ｐａｒｋ ＫＳ， Ｋｉｍ ＹＢ， Ｊｅｏｎｇ ＢＣ， Ｌｅｅ ＳＨ：Ｇｌｏｂａｌ Ｄｉｓｓｅｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃａｒｂａｐｅｎｅｍａｓｅ−Ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ: Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ, Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｃｏｎｔｅｘｔ, Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ Ｏｐｔｉｏｎｓ, ａｎｄ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ. Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ in Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ. ２０１６. Ｖｏｌ.１３（７）：８９５

そこで本発明は、迅速かつ簡便にＮＤＭ型ＭＢＬを検出するため、イムノクロマトグラフィー法に使用される、ＮＤＭ型ＭＢＬ産生菌を検出するためのモノクローナル抗体、ＮＤＭ型ＭＢＬ用のイムノクロマトグラフィー装置及びそのキットに検出キットを提供する。

本発明の実施形態のモノクローナル抗体は、イムノクロマトグラフィー法に使用される、ＮＤＭ‐１及びその亜型の抗体である。また、そのモノクローナル抗体を着色合成高分子粒子又は金属コロイド粒子で標識した標識化抗体である。

本実施形態のイムノクロマトグラフィー装置は、ＮＤＭ型ＭＢＬ及びその亜型に対するモノクローナル抗体からなり標識物質で標識化された第１特異的抗体と、第１特異的抗体の下流側に離れて配置され且つ下流方向に交差する方向に直線状にメンブレン体に固相化され、ＮＤＭ型ＭＢＬ及びその亜型に対するモノクローナル抗体からなる第２特異的抗体と、を備える。また、第１特異的抗体はコンジュゲートパッドに配置されてもよく、コンジュゲートパッドの上流側に抗原抽出液を含む検体試料液が滴下されるサンプルパッドが配置されてもよい。

本実施形態のＮＤＭ型ＭＢＬの検出キットは、イムノクロマトグラフィー装置と、検体からＮＤＭ型ＭＢＬ及びその亜型を抽出する抗原抽出液とを備えてもよい。

本実施形態のＮＤＭ型ＭＢＬ及びその亜型の検出方法は、滴下区域に抗原抽出液を含む検体試料液を滴下する工程と、ＮＤＭ型ＭＢＬ及びその亜型に対するモノクローナル抗体からなり標識物質で標識化された第１特異的抗体が、第１特異的抗体の下流側に離れて固相化されたＮＤＭ型ＭＢＬ及びその亜型に対するモノクローナル抗体からなる第２特異的抗体に反応したかを、画像処理で判定する判定工程と、を備える。

本発明によれば、ＮＤＭ型ＭＢＬを特異的、迅速かつ簡便に検出することができる。

（ａ）本実施形態におけるイムノクロマトグラフィー装置の原理図である。（ｂ）本実施形態におけるイムノクロマトグラフィー装置の断面図である。 （ａ）から（ｃ）は、イムノクロマトグラフィー装置１００を使ってＮＤＭ型ＭＢＬを含有する試料液からＮＤＭ型ＭＢＬの検出する原理を説明した図である。 イムノクロマトグラフィー装置１００の検出区域１４及び対照区域１５の実験例の拡大図である。

本実施形態は、ＮＤＭ（ニューデリーメタロベータラクタマーゼ）型ＭＢＬに対するモノクローナル抗体、そのモノクローナル抗体を使ったイムノクロマトグラフィー装置である。

（抗ＮＤＭ抗体）
本実施形態の抗ＮＤＭモノクローナル抗体は、ハイブリドーマから得ることができる。例えば、必要に応じて適切なアジュバントと混合したＮＤＭ−１で適切な哺乳動物（例えばマウス、ラットなど）を免疫する。そして、当該動物の脾臓細胞、Ｂリンパ球などの抗体産生細胞を、適切な動物（例えばマウス、ラットなど）由来の骨髄腫細胞と融合させることにより、ハイブリドーマを得ることができる。細胞融合は、例えば適切な培地中で抗体産生細胞と骨髄腫細胞とをポリエチレングリコールなどの存在下で融合させるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）法などにより実施できる。細胞融合後、ＨＡＴ培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジンを含む培地）などの選択培地でハイブリドーマを選別し、ＮＤＭ−１およびその亜型を認識する抗体を産生するハイブリドーマの能力について、常法（例えば、ウエスタンブロット法）に従ってスクリーニングする。次いで、所望の抗体を産生するハイブリドーマを常法（例えば限界希釈法）に従ってクローニングし、抗ＮＤＭモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを選択する。

（イムノクロマトグラフィー装置）
本実施形態における好ましい実施形態として、出願人はイムノクロマトグラフィー法を用いた免疫学的なイムノクロマトグラフィー装置１００を説明する。
図１は、イムノクロマトグラフィー装置１００の原理を説明した図である。イムノクロマトグラフィー装置１００は、抗原抽出液を含む検体試料液の毛細管現象による流動方向に沿って、上流側から順に、滴下区域１１、標識区域１２、検出区域１４、対照区域１５及び吸液区域１６を有している。そしてそれぞれが所定距離だけ離れて配置されている。

滴下区域１１は、抗原抽出液を含む検体試料液である試料液を滴下する区域であり、サンプルパッド２１が配置されている。短冊形状のサンプルパッド２１は、例えば、ポリエステル、レーヨンもしくはポリプロピレン等からなる不織布、又はセルロース、パルプもしくはガラス繊維等からなる濾紙である。

標識区域１２は、標識化抗体３１を保持するコンジュゲートパッド２２からなる区域である。短冊形状のコンジュゲートパッド２２は、例えば、ポリエステル、レーヨンもしくはポリプロピレン等からなる不織布、又はセルロース、パルプもしくはガラス繊維等からなる濾紙である。コンジュゲートパッド２２は、抗ＮＤＭモノクローナルを有色粒子により標識化した標識化抗体３１を乾燥状態で保持する。標識化抗体３１はコンジュゲートパッド２２上を溶液により流動可能である。試料液が滴下区域１１に滴下後、試料液がコンジュゲートパッド２２へ毛細管現象で浸透し、コンジュゲートパッド２２が湿潤された状態において標識化抗体３１を溶解しながら下流へ流動していく。

有色粒子としては、例えば、金もしくはセレンからなる金属コロイド、シリカからなる粒子、又は、スチレン、塩化ビニル、アクリロニトリル、酢酸ビニル、アクリル酸エステル、メタクリル酸エステル等のビニル系モノマーの単一重合体や共重合体、スチレン−ブタジエン共重合体、もしくはメチルメタクリレート−ブタジエン共重合体等のブタジエン系共重合体等に着色してなる着色合成高分子粒子を挙げることができる。

これら有色粒子のうち、モノクローナル抗体又は抗原の吸着性が優れ、かつ、生物学的活性を長期間安定に保持できる等の理由から、金コロイド、またはポリスチレン系の着色合成高分子粒子が有色粒子として好適に用いられる。抗ＮＤＭモノクローナルを有色粒子に結合するには、例えば、物理的又は化学的な吸着法等によることができる。

検出区域１４及び対照区域１５は、補足抗体３３及びコントロール用抗体３５を保持するメンブレン体２３からなる区域である。短冊形状のメンブレン体２３（例えば、ニトロセルロース膜からなる）を主として構成される。

検出区域１４は補足抗体３３を含む。補足抗体３３は、抗ＮＤＭモノクローナル抗体を含む液体をメンブレン体２３の短辺方向に平行に塗布し、その液体を乾燥して形成される。つまり補足抗体３３は、メンブレン体２３上に直線状に固相化されている。

対照区域１５はコントロール用抗体３５を含む、コントロール用抗体３５は、標識化抗体３１の成分に対して特異的に結合するモノクローナル抗体を含む液体を、検出区域１４の下流で且つメンブレン体２３の短辺方向に平行に塗布し、その液体を乾燥して形成される。つまりコントロール用抗体３５は、メンブレン体２３上に直線状に且つ補足抗体３３の下流側に固相化されている。コントロール用抗体３５は、ＮＤＭ型ＭＢＬまたはその亜型の有無にかかわらず、対照区域１５に直線状の反応が現れる。このため観察者はイムノクロマトグラフィー試験が正常に行われたかどうかを判定できる。

吸液区域１６は、吸液パッド２４を含み余分な試料液を吸液する区域である。短冊形状の吸液パッド２４は、例えば、ポリエステル、レーヨンもしくはポリプロピレン等からなる不織布、又はセルロース、パルプもしくはガラス繊維等からなる濾紙である。

図１（ｂ）はイムノクロマトグラフィー装置１００の構成の断面図である。図１（ｂ）に示されるように、 イムノクロマトグラフィー装置１００は、サンプルパッド２１、コンジュゲートパッド２２、メンブレン体２３及び吸液パッド２４をそれぞれ一部重ね合わせて連続して設置される。サンプルパッド２１、コンジュゲートパッド２２、メンブレン体２３及び吸液パッド２４の下には、プラスチック等よりなるベース４５に固定されて強度が付与されてもよい。また、サンプルパッド２１、コンジュゲートパッド２２、メンブレン体２３及び吸液パッド２４の保護のためにそれらの表面に透明なフィルム等（不図示）が貼られていてもよい。これらサンプルパッド２１、コンジュゲートパッド２２、メンブレン体２３及び吸液パッド２４はプラスチック等よりなる容器４１に収納されることが望ましい。容器４１は、試料液用のスロープ部４３及び検出区域１４及び対照区域１５を観察する観察用開口部４４を含む。スロープ部４３は下側が狭くなっており、試料液用の液滴を滴下区域１１に確実に導く構造である。観察用開口部４４を介して、観察者は、検出区域１４の補足抗体３３又は対照区域１５のコントロール用抗体３５に付着した標識化抗体３１の有色粒子を観察できる。なおイムノクロマトグラフィー装置１００の構成の平面図が図３に描かれているため、図３を参照するとスロープ部４３及び観察用開口部４４を把握しやすい。

（抗原抽出液）
検体の抽出用に抗原抽出液５１を用意してもよい。抗原抽出液５１は強アルカリ溶液に界面活性剤を加えて作成した。作成された抗原抽出液５１はスクリュー管瓶５０に入れられて封止される。また中和溶液（不図示）に強酸性のＴＥＳ緩衝液（（Good's buffer：グッドバッファー））を用意してもよい。

（検出キット）
イムノクロマトグラフィー装置１００は、抗原抽出液５１を入れたスクリュー管瓶５０又は中和溶液を入れたスクリュー管瓶とともに検出キットとして流通させることが望ましい。さらに検出キットにピペット（不図示）もしくは滅菌された綿棒などを加えても良い。イムノクロマトグラフィー装置１００及びスクリュー管瓶５０等は、乾燥材を入れたアルミ箔もしくはアルミラミネート袋などの密封袋で包まれる。この検出キットは４〜３０℃の中で長期間保管できる。

（サンドイッチ法によるＮＤＭ型ＭＢＬの検出原理）
図２（ａ）から（ｃ）は、イムノクロマトグラフィー装置１００を使ってＮＤＭ型ＭＢＬを含有する試料液からＮＤＭ型ＭＢＬの検出する原理を説明した図である。

観察者は、試料を抗原抽出液５１で懸濁して抗原を抽出し、これに中和溶液を滴下する。観察者は中和された溶液である検体試料液６１を、ピペット等で容器４１のスロープ部４３に滴下する。例えば、図２（ａ）のように、検体試料液６１はスロープ部４３からサンプルパッド２１に滴下される。検体試料液６１はサンプルパッド２１からコンジュゲートパッド２２へ毛細管現象によって下流側に進む。

検体試料液６１中にＮＤＭ型ＭＢＬまたはその亜型６３が存在する場合、この検体試料液中のＮＤＭ型ＭＢＬまたはその亜型６３は、検体試料液６１の毛細管現象に従った流動により、コンジュゲートパッド２２上の標識化抗体３１との抗原抗体反応によって、ＮＤＭ型ＭＢＬまたはその亜型６３と標識化抗体３１との複合体６５を形成する。複合体６５は溶液による毛細管現象によってメンブレン体２３に流れる。また抗原抗体反応しなかった一部の標識化抗体３１も溶液による毛細管現象によってメンブレン体２３に流れる。

メンブレン体２３の補足抗体３３はＮＤＭ型ＭＢＬまたはその亜型６３を認識するため、この複合体６５は補足抗体３３に捕捉される。例えば、図２（ｃ）のように、補足抗体３３が線状に固相化されていれば、複合体６５（標識化抗体３１）の有色粒子により色づけされ、直線状の着色ラインが現れることになる。観察者は試料に、ＮＤＭ型ＭＢＬまたはその亜型６３が含まれていることを確認できる。

抗原抗体反応しなかった一部の標識化抗体３１は、補足抗体３３に捕捉されることなく毛細管現象により下流に流れ、標識化抗体３１の成分に対して特異的に結合するコントロール用抗体３５に結合する。このため、図２（ｃ）のように、コントロール用抗体３５が線状に固相化されていれば、標識化抗体３１の有色粒子により色づけされ、直線状の着色ラインが現れることになる。対照領域１５に着色ラインが観察されることにより、観察者は滴下区域１１に滴下された検体試料液６１が、対照区域１５に、さらに吸液区域１６まで到達したことを確認できる。つまり、試料にＮＤＭ型ＭＢＬまたはその亜型６３が含まれている場合には、検出区域１４及び対照区域１５で、それぞれ直線状の着色ラインが観察される。

検体試料液６１中にＮＤＭ型ＭＢＬまたはその亜型６３が存在しない場合、コンジュゲートパッド２２上の標識化抗体３１との抗原抗体反応がなく、ＮＤＭ型ＭＢＬまたはその亜型６３と標識化抗体３１との複合体６５を形成しない。溶液によって標識化抗体３１が毛細管現象によってメンブレン体２３に流れる。そして標識化抗体３１は、補足抗体３３に捕捉されることなくコントロール用抗体３５に結合する。つまり、試料にＮＤＭ型ＭＢＬまたはその亜型６３が含まれていない場合には、対照区域１５のみ直線状の着色ラインが観察される。検体試料液６１の滴下から約１５分で対照区域１５のみ直線状の着色ラインが観察される。

なお、観察者が手動で検体試料液を滴下するのではなく、電動マイクロピペットで多数のサンプルパッド２１に検体試料液を滴下してもよい。また観察者の目視ではなくカメラ等の画像撮影装置で、検出区域１４及び対照区域１５を撮影してもよい。そして撮影された画像データに基づいて、イムノクロマトリーダーなどの画像処理装置が検出区域１４又は対照区域１５に直線状の着色ラインが発生しているかを画像処理し（例えば２値化処理し）、ＮＤＭ型ＭＢＬまたはその亜型６３が検体試料液に含まれているか否かを判定するようにしてもよい。

以下に、サンドイッチ法によるＮＤＭ型ＭＢＬの検出について実例をあげて、詳細に説明する。
［実施例１：ＮＤＭ型ＭＢＬに特異的なモノクローナル抗体の作製］
以下の方法で取得を試みた。

（免疫原の調整）
モノクローナル抗体の作製は、免疫源にＮＤＭ−１発現タンパク質を使用した。すなわち、ＮＤＭ−１蛋白質発現プラスミドで形質転換した大腸菌株を、カナマイシンを含むＬＢ培地中にて３７℃で培養した。

大腸菌の対数増殖期に、イソプロピル-β-チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を最終濃度が０．５ｍＭ（ｍｍｏｌ／Ｌ）になるように加え、組換えＮＤＭ−１タンパク質の発現を誘導した。誘導後、２時間培養し菌体を回集した。これを６Ｍ（ｍｏｌ／Ｌ）グアニジン塩酸塩、０．１Ｍリン酸水素二ナトリウム、１０ｍＭトリス、５ｍＭイミダゾール、（ｐＨ８．０）に溶解して、Ｎｉ−ＮＴＡアガロースカラムに発現ＮＤＭ−１タンパク質を結合させた。８Ｍ尿素、０．１Ｍリン酸水素二ナトリウム、１０ｍＭトリス、１０ｍＭイミダゾール（ｐＨ８．０）で洗浄した後、更にイミダゾールを最終濃度２５０ｍＭになるように加えて組換えＮＤＭ−１をカラムから溶出した。

（免疫）
免疫法は、文献；生化学［６９：１２８−１３１（１９９７）．佐渡義一，香川恵：ラットリンパ節を用いる，効率的で，しかも，抗原量，労力，時間を節約できるモノクローナル抗体作製法］の方法に従い実施した。

１００μｇの免疫源を含む溶液に等量のフロインド完全アジュバント（ＤＩＦＣＯ社製）を加え完全に混合した後、ＷＫＹラットのフットパッドに投与した。その２週間後に同量の抗原をフロインド不完全アジュバントと混合し、ラット尾根部に投与し、さらに２週間後に同様の追加免疫を実施した。最終免疫後、３〜４日でＰＥＧを用いてラット腸骨リンパ節細胞とミエローマ細胞（ＳＰ２／０）とを融合した。培養液にはＨＡＴ選択培地を使用し、約１週間後に培養上清を採取しスクリーニングに供試した。

（モノクローナル抗体のスクリーニング）
モノクローナル抗体のスクリーニングには、ＮＤＭ−１産生菌の溶菌物とＮＤＭ−１発現タンパク質を抗原とし、１次抗体に各抗ＮＤＭ−１ラットモノクローナル抗体の培養上清を使用したウエスタンブロッティング法を使用した。
その結果、ＮＤＭ−１産生菌の溶菌物及びＮＤＭ−１発現タンパク質に強い反応性を示す４種のクローン（１Ｅ２−７、３Ａ８−３、４Ｄ５−４、４Ｅ４−４）を得た。

（標識成分の調製）
金コロイド粒子は、Ｇ．Ｆｒｅｎｓ（Ｎａｔｕｒｅ，２４１，２０−２２，１９７３）の方法に従い作製した。この金コロイド溶液に対し、ＮＤＭ型ＭＢＬまたはその亜型に特異的な抗ＮＤＭモノクローナル抗体１Ｅ２−７、３Ａ８−３、４Ｄ５−４、４Ｅ４−４をそれぞれ室温にて混合し、金コロイド標識の抗ＮＤＭモノクローナル抗体４種を調製した。

（標識区域１２の形成）
金コロイド標識の抗ＮＤＭモノクローナル抗体４種を調製した調製液をそれぞれコンジュゲートパッド２２であるガラス繊維パッドに塗布した後、真空乾燥させる。これより、標識区域１２である金コロイド標識の抗ＮＤＭモノクローナル抗体が塗布されたパッドを形成した。

（検出区域１４の形成）
ＮＤＭ型ＭＢＬまたはその亜型に特異的な抗ＮＤＭモノクローナル抗体１Ｅ２−７、３Ａ８−３、４Ｄ５−４、４Ｅ４−４をそれぞれ２０ｍＭ ＭＯＰＳ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．０）で希釈し、メンブレン体２３であるニトロセルロースメンブレンの所定位置に直線状に塗布し乾燥させた後、検出区域１４を形成した。

（対照区域１５の形成）
また、検出区域１４の下流側に、抗マウスＩｇＧ抗体を同様に塗布し乾燥させた後、反応確認のための対照区域１５を形成した。

（イムノクロマトグラフィー装置１００の作製）
サンプルパッド２１として繊維不織布を用い、金コロイド標識の抗ＮＤＭモノクローナル抗体を塗布したコンジュゲートパッド２２と、抗ＮＤＭモノクローナル抗体を固相化したメンブレン体２３と、濾紙である吸液パッド２４とをそれぞれ重ね合わせ、粘着剤付きのベースに貼付してイムノクロマトグラフィーサンドイッチ法を利用したＮＤＭ型ＭＢＬ検出装置を作製した。

（抗原抽出液）
検体の抽出には、強アルカリ溶性の抗原抽出液および界面活性剤を使用した。中和溶液には強酸性のＴＥＳ緩衝液を使用した。
（検体試料液の調製）
肺炎桿菌のＮＤＭ型ＭＢＬ産生株はＡＴＣＣ ＢＡＡ−２１４６株を使用した。これを標準寒天培地上にて３５℃の条件下で静置培養した。検査前に抗原抽出液を用時調整した。０．２７ｍＬの強アルカリ溶液に界面活性剤を添加し、抗原抽出液とした。ここに滅菌された綿棒でかきとった生育コロニー（５コロニー相当）を懸濁し、抗原を抽出した。これに中和溶液を滴下した。これを検体試料液として用いた。陰性対照として、ＮＤＭ型ＭＢＬ不含の抗原抽出液を試料液とした。

（反応性試験）
検体試料液にフィルター付きノズルを装着し、作製した検出装置に３滴の検体試料液を滴下した後、１５分後の検出区域１４の着色ラインを確認した。

（結果の検討）

結果は、表１および図２のとおりである。ＮＤＭ型ＭＢＬ非産生肺炎桿菌（Ｎｅｗ Ｄｅｌｈｉ ｍｅｔａｌｌｏ−β−ｌａｃｔａｍａｓｅ ｎｏｎ−ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）検体では、図３のＡ（上側）に示されるように、検出区域１４に着色ラインが認められなかった。これはＮＤＭ型ＭＢＬが検体試料液に含まれず、抗ＮＤＭモノクローナル抗体と反応しないためである。

一方、ＮＤＭ型ＭＢＬ産生肺炎桿菌（Ｎｅｗ Ｄｅｌｈｉ ｍｅｔａｌｌｏ−β−ｌａｃｔａｍａｓｅ−ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）検体では、図３（ｂ）に示されるように、検出区域１４に明確な着色ラインが認められた。これはＮＤＭ型ＭＢＬが検体試料液に含まれているため、金コロイド標識抗ＮＤＭモノクローナル抗体とニトロセルロースメンブレンに固相化された金コロイド標識抗ＮＤＭモノクローナル抗体がそれぞれＮＤＭ型ＭＢＬと特異的に反応し、検出区域１４でこれらがサンドイッチ的に結合したため着色したことによる。

サンドイッチ法を利用した検出装置によって、検体試料液中のＮＤＭ型ＭＢＬを検出することができた。実際の菌株を用いても菌株と用時調整した抗原抽出液とを混合させるのみで検体試料液を調製することができ、さらに、滴下後１５分以内で反応性が確認できるため、非常に簡便かつ迅速に検出することが実証された。

［実施例２：イムノクロマトグラフィーサンドイッチ法とＰＣＲ法による測定の比較］
大腸菌４５株を検体として用いた。

（サンドイッチ法を利用したイムノクロマトグラフィー装置での測定）
実施例１の（標識成分の調製）から（抗原抽出液）までと同様の方法でサンドイッチ法を利用したＮＤＭ型ＭＢＬのイムノクロマトグラフィー装置を作製した。

（検出装置の検体試料液の調製）
供試菌株４５株を寒天培地上にて３７℃にて静置培養した。検査前に抗原抽出液を用時調整した。即ち、０．２７ｍＬの強アルカリ溶液に界面活性剤を添加し、抗原抽出液とした。ここに滅菌された綿棒でかきとった生育コロニー（５コロニー相当）を懸濁し、抗原を抽出した。これに中和溶液を滴下し、検体試料液として用いた。

（反応性試験）
検体試料液にフィルター付きノズルを装着し、作製したイムノクロマトグラフィー装置に３滴の検体試料液滴下した後、１５分後の検出区域１４の着色ラインを確認した。着色ラインが認められたものを陽性とした。

（ＰＣＲ法での測定）
ＰＣＲに用いる鋳型ＤＮＡは、ＤＮＡ抽出キット（キアゲン株式会社)を用いて抽出した。
ＰＣＲは以下のプライマーセットを使用して行った。詳細な亜型は、ＰＣＲ検出により得られた増幅断片のダイレクトシークエンスを実施することで決定した。

プライマーセットのヌクレオチド配列は以下の通りとした。
ＮＤＭ−Ｆ：ＴＴＧＧＣＣＴＴＧＣＴＧＴＣＣＴＴＧ
ＮＤＭ−Ｒ：ＡＣＡＣＣＡＧＴＧＡＣＡＡＴＡＴＣＡＣＣＧ

（結果の検討）
結果をまとめると次表の通りである。

表２において、本実施例とＰＣＲ法との結果を比較すると、陽性２４株、陰性２１株と、全て一致した。このことにより、本法は感度・特異度よくＮＤＭ型ＭＢＬを検出することが確認できた。さらに陽性２４株についてはダイレクトシークエンスでの分析の結果、ＮＤＭ−１が８株、ＮＤＭ−３が２株、ＮＤＭ−４が４株、ＮＤＭ−５が４株、ＮＤＭ−７が３株、ＮＤＭ−８が１株、ＮＤＭ−１２が１株およびＮＤＭ−１３が１株となり、ＮＤＭ−１，ＮＤＭ−３，ＮＤＭ−４，ＮＤＭ−５、ＮＤＭ−７、ＮＤＭ−８、ＮＤＭ−１２およびＮＤＭ−１３が検体中に含まれていることが分かった。同一検体を本実施例でも検出できているため、実際にＮＤＭ型ＭＢＬおよびその亜型を産生する菌株にも反応することが実証された。

ここで、判定するまでの手間や時間を考えると、ＰＣＲ法では、菌体からＤＮＡの抽出作業を行う必要がある。さらに、測定の為には高価な機器や設置場所を必要とするため、簡便さや迅速さに欠けてしまう。

しかし、本実施例は菌体と抽出液を混合させるだけで検体試料液を調製でき、さらに判定は１５分以内と短時間であり、判定も着色ラインの有無を目視にて確認できるためより容易に測定することができる。以上、出願人はサンドイッチ法によるＮＤＭ型ＭＢＬの検出についての実例を説明した。

（イムノクロマトグラフィーにおける競合法）
サンドイッチ法に代えて、競合法も適用できる。
標識区域１２のコンジュゲートパッド２２には、乾燥されたモノクローナル抗体の標識化抗体３１が載置されている。検出区域１４には、ＮＤＭ型ＭＢＬまたはその亜型６３がメンブレン体２３上に固相化されている。

検体試料液中にＮＤＭ型ＭＢＬが存在しないとき、標識化抗体３１は検出区域１４において固相化されているＮＤＭ型ＭＢＬまたはその亜型６３との抗原抗体反応によって複合体を形成する。複合体を形成することで、検出区域１４が有色粒子により色づけされ、直線状の着色ラインが現れる。

検体試料液中にＮＤＭが存在する場合に、検体試料液がサンプルパッド２１に滴下されたとき、この検体試料液中のＮＤＭ型ＭＢＬまたはその亜型６３は、溶液の毛細管現象の流れに従って下流に流れ、まず、標識区域１２の標識化抗体３１と抗原抗体反応して、複合体６５を形成する。

標識化抗体３１のＮＤＭ型ＭＢＬ認識部位がＮＤＭ型ＭＢＬまたはその亜型６３との結合により妨げられているため、検出区域１４のＮＤＭ型ＭＢＬまたはその亜型６３は抗原抗体反応することができない。つまり検出区域１４で直線状の着色ラインが現れない。そして標識化抗体３１は下流に流れていくため、観察者は直線状の有色ラインが出現しないことを確認することにより検体試料液中のＮＤＭの存在を検出することができる。

本実施形態はイムノクロマトグラフィー法に適用可能な、ＮＤＭ型ＭＢＬおよびその亜型に対するモノクローナル抗体を提供する。当該モノクローナル抗体を用いたイムノクロマトグラフィー法によれば、ＮＤＭ型ＭＢＬ産生菌の簡便、迅速且つ高感度の検出が可能となる。

この発明は、上記実施形態又は実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。本明細書の中で明示した論文、公開特許公報、及び特許公報などの内容は、その全ての内容を援用によって引用することとする。

１１…滴下区域、 １２…標識区域、 １４…検出区域、 １５…対照区域、 １６…吸液区域
２１…サンプルパッド、 ２２…コンジュゲートパッド、 ２３…メンブレン体、 ２４…吸液パッド２４
３１…標識化抗体、 ３３…補足抗体、 ３５…コントロール用抗体
４１…容器、 ４３…スロープ部、 ４４…観察用開口部
５０…スクリュー管瓶、 ５１…抗原抽出液

６１…検体試料液、 ６３…ＮＤＭ型ＭＢＬまたはその亜型、 ６５…複合体
１００…イムノクロマトグラフィー装置

Claims (6)

1. イムノクロマトグラフィー法に使用される、ＮＤＭ型ＭＢＬ及びその亜型に対するモノクローナル抗体。
2. 請求項１に記載のモノクローナル抗体を着色合成高分子粒子又は金属コロイド粒子で標識した標識化抗体。
3. ＮＤＭ型ＭＢＬ及びその亜型に対するモノクローナル抗体からなり標識物質で標識化された第１特異的抗体と、
   前記第１特異的抗体の下流側に離れて配置され且つ前記下流方向に交差する方向に直線状にメンブレン体に固相化され、ＮＤＭ型ＭＢＬ及びその亜型に対するモノクローナル抗体からなる第２特異的抗体と、を備えるイムノクロマトグラフィー装置。
4. 前記第１特異的抗体はコンジュゲートパッドに配置され、
   前記コンジュゲートパッドの上流側に抗原抽出液を含む検体試料液が滴下されるサンプルパッド
   が配置された請求項３に記載のイムノクロマトグラフィー装置。
5. 請求項３又は４に記載のイムノクロマトグラフィー装置と、
   検体から前記ＮＤＭ型ＭＢＬ及びその亜型を抽出する抗原抽出液と、
   を備える、ＮＤＭ型ＭＢＬ検出キット。
6. ＮＤＭ型ＭＢＬ及びその亜型の検出方法であって、
   滴下区域に抗原抽出液を含む検体試料液を滴下する工程と、
   ＮＤＭ型ＭＢＬ及びその亜型に対するモノクローナル抗体からなり標識物質で標識化された第１特異的抗体が、前記第１特異的抗体の下流側に離れて固相化されたＮＤＭ型ＭＢＬ及びその亜型に対するモノクローナル抗体からなる第２特異的抗体に反応したかを、画像処理で判定する判定工程と、
   を備える、イムノクロマトグラフィー法による検出方法。