TW201610435A - 肺炎黴漿菌檢測試劑及其用途 - Google Patents

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Abstract

本發明之課題係提供一種具特異性的抗體及使用該具特異性抗體的檢測試劑等，該等可適用於利用免疫層析法的肺炎黴漿菌感染的檢測。 本發明提供一種包含有針對肺炎黴漿菌的P30蛋白質具特異性的抗體之肺炎黴漿菌檢測試劑及套組，以及免疫層析檢測分析試驗裝置。

Description

肺炎黴漿菌檢測試劑及其用途
本發明係關於肺炎黴漿菌檢測試劑及其用途(免疫層析檢測分析(immunochromatography)試驗裝置、肺炎黴漿菌感染檢查法)等。
與細菌性的典型肺炎不同，在胸部X光影像中呈現肺浸潤影像的非細菌性肺炎，其30~40%的原因為肺炎黴漿菌。從人體分離的黴漿菌中，其病原性明顯為肺炎黴漿菌。
黴漿菌肺炎常見於幼兒、學童。潛伏期平均為14天。有報告指出其具有多種併發症，對於幼童來說，較常見的如腦炎、格林-巴利症候群、發疹等的皮膚炎等的併發症。細菌性肺炎雖急遽減少，但肺炎整體之中，黴漿菌肺炎的比例卻正在提高。肺炎黴漿菌作為社區感染性肺炎的原因菌種，其數量僅次於肺炎球菌。
黴漿菌係可自我增生的最小微生物，難以藉由光學顯微鏡觀察。與其他細菌不同的是其不具有細胞壁，故對於青黴素及頭孢菌素(cephem)系抗生素並不呈現感受性(susceptibility)，在治療上，一般係使用四環素系或巨環內酯系的抗生素。
為了診斷肺炎黴漿菌感染，使用以下各種方法。從咽喉擦拭液、痰所進行的分離培養法雖用於確診，但需要特殊的培養基及較長的天數(2~4週)，故無法用於迅速診斷。在由於肺炎黴漿菌感染所產生之抗體 的檢測方法中，例如會使用粒子凝集法(PA)、紅血球凝集反應(IHA)等，以檢測出血清抗體。然而，這些方法皆無法應用於急性期的診斷。
利用咽喉擦拭液、痰等的檢體中的肺炎黴漿菌核酸之基因增幅技術的檢測方法之中，憑藉聚合脢連鎖反應(PCR)所進行的判斷，與確診的分離培養法結果高度相關。再者，亦報告指出使用恆溫環狀擴增(LAMP；Loop-Mediated Isothermal Amplification)法，以作為比PCR更為簡便的方法。然而，上述任一方法皆需要複雜的操作，且需要大量勞力來進行測定，並無法應用於迅速的診斷。
黴漿菌肺炎中，因為有效的抗生素有限，故在臨床醫療高度需要在感染初期即判定是否為肺炎黴漿菌感染。一般而言，若能夠得到特異性抗體，則可使用ELISA法等的酵素免疫分析法(EIA；enzyme immunoassay)。再者，可應用於化學發光法、色素法、螢光法等各種測定法。然而，任一方法皆需要各別專用的測定裝置，此點並不能說是符合臨床醫療的需求。另一方面，免疫層析檢測分析法(以下稱為免疫層析法)，其操作簡便，不需要特別的裝置，且可在短時間(例如10~20分)內進行測定。但是，能夠以EIA法檢測出來的抗體，並不一定也能使用於免疫層析法，通常需要特異性更高及高敏感度的抗體。關於肺炎黴漿菌感染，抗P1蛋白質的單株抗體(專利文獻1)或是使用抗核糖體蛋白(Ribosomal Protein)L7/L12蛋白質具特異性抗體的免疫層析用試劑(專利文獻2)目前已在市面上販售，並且應用於診斷，但其不能說具有高敏感度，亦難以說充分表現對臨床狀況所需要的性能。
[先前技術文獻]
[專利文獻]
[專利文獻1]日本特開2013-72663號公報
[專利文獻2]日本特開2012-6968號公報
[非專利文獻]
[非專利文獻1]Varshney AK et al., Clin Vaccine Immunol. Feb 2008；15(2)：215-220.
於是，本發明之課題係提供一種具特異性的抗體及使用該特異抗體的檢測試劑等，該等可適用於利用免疫層析法之肺炎黴漿菌感染的檢測。
為了解決上述課題而進行的研究中，本案發明人著眼於P30蛋白質，其敏感度高於P1蛋白質而能夠用於檢測肺炎黴漿菌感染之標的蛋白質。P30係富含脯胺酸(proline)(20.7%)的黏合蛋白質，其分子量為29,743。目前為止，P30分子經過鑑定，且亦取得對於P30的抗體。再者，雖有報告指出，以ELISA法作為使用該抗體的測定方法(非專利文獻1)，但尚未有報告記載將該抗體應用於免疫層析法。此次，嶄新地嘗試製作適用於免疫層析法之抗體，結果得到呈現優良性能的抗體。使用該抗體的免疫層析法中，相較於使用針對P1蛋白質之抗體的情況，很顯然地可進行高敏感度的檢測。
以下的發明係根據上述成果。
[1]一種肺炎黴漿菌檢測試劑，包含：針對肺炎黴漿菌之P30蛋白質具特異性的抗體。
[2]如[1]所述之檢測試劑，其中其係用於免疫層析檢測分析。
[3]如[1]或[2]所述之檢測試劑，其中該特異抗體為單株抗體。
[4]如[3]所述之檢測試劑，其中該單株抗體係藉由寄存編號NITE BP-01880的融合瘤(hybridoma)或寄存編號NITE BP-01881的融合瘤所產生的抗體。
[5]如[1]~[4]中任一項所述之檢測試劑，其中該特異抗體，係將從N末端至95號胺基酸去除的重組P30蛋白質作為抗原所調製的抗體。
[6]如[5]所述之檢測試劑，其中該重組P30蛋白質係由SEQ ID NO：02的胺基酸序列所構成。
[7]如[1]~[6]中任一項所述之檢測試劑，其中該特異抗體，係以染色合成高分子粒子或金屬膠體粒子進行標記。
[8]如[7]所述之檢測試劑，其中該金屬膠體粒子係金膠體粒子。
[9]一種肺炎黴漿菌檢測套組，包含：如[1]~[8]中任一項所述之檢測試劑。
[10]一種免疫層析檢測分析試驗裝置，包含：針對肺炎黴漿菌之P30蛋白質的第一特異抗體；針對肺炎黴漿菌之P30蛋白質的第二特異抗體；及膜載體；該第一特異抗體被固定於該膜載體，而構成檢測部；該第二特異抗體被標記物質所標記，且被載持於偏離該檢測部的位置。
[11]如[10]所述之試驗裝置，其中該第一特異抗體係由寄存編號NITE BP-01881的融合瘤所產生的抗體；該第二特異抗體係由寄存編號NITE BP-01880的融合瘤所產生的抗體。
[12]如[10]或[11]所述之試驗裝置，其中該標記物質係染色合成高分子粒子或金屬膠體粒子。
[13]如[12]所述之試驗裝置，其中該金屬膠體粒子係金膠體粒子。
[14]一種肺炎黴漿菌感染檢查法，=其使用如[10]~[13]中任一項所述之免疫層析檢測分析試驗裝置。
[15]如[14]所述之檢查法，其中將源自活體的材料用於檢體。
[16]如[15]所述之檢查法，其中該活體材料為咽喉擦拭液或鼻腔抽吸液。
[17]一種對於肺炎黴漿菌之P30蛋白質具特異性的單株抗體，其係由寄存編號NITE BP-01880或NITE BP-01881的融合瘤所產生。
[18]一種標記化抗體，其係以金屬膠體粒子標記如[17]所記載之具特異性的單株抗體。
[19]如[18]所述之標記化抗體，其中該金屬膠體粒子為金膠體粒子。
[20]一種融合瘤，其係寄存編號NITE BP-01880或NITE BP-01881的融合瘤。
第一圖為測試條(test strip)之構成實例。
本發明提供一種對於肺炎黴漿菌的檢測有用的試劑(肺炎黴漿菌檢測試劑)及套組。本發明的肺炎黴漿菌檢測試劑，具有亦可適用於免疫層析法的特徵(將其應用於EIA法及西方墨點法(western blot method)等亦無妨)。亦即，本發明的試劑，可利用免疫層析法高敏感度地檢測出肺炎黴漿菌感染。本發明的套組，包含本發明的試劑作為主要構成要件。套組中，亦可包含在實施檢測法時所使用的其他試劑(展開用溶劑、緩衝液等)及/或裝置乃至於器具(容器、反應裝置等)。再者，套組中亦可包含抗原(P30蛋白質或其一部分)。此外，一般而言，本發明的套組附有操作說明書。
本發明之試劑的有效成分，係針對肺炎黴漿菌之P30蛋白質具特異性的抗體。構成本發明之試劑的抗體，雖可為多株抗體或單株抗體的任一者，但從敏感度的觀點來看，單株抗體特佳。
針對P30蛋白質具特異性的多株抗體，可依照一般方法製作。例如，因應需求將與適當佐劑混合之P30蛋白質，投予適當的哺乳動物(例如小鼠、大鼠、兔子)的皮下或腹腔內。初次免疫後，在第二至三週，依照一般方法進行追加免疫，而可得到高力價(titer)的抗血清。例如，在最終免疫1週後，採取血液並分離血清，再以硫酸銨進行鹽析，藉由與一般精製抗體相同的離子層析等方法，使免疫球蛋白分離。
另一方面，若參考本說明書的資訊，可從依照一般方法製作的融合瘤得到P30蛋白質單株抗體。例如，藉由因應需求而與適當佐劑混合的P30蛋白質，使適當的哺乳動物(例如小鼠、大鼠等)免疫。接著，使該動物的脾臟細胞、B淋巴球等的產生抗體的細胞，與源自適當之動物(例如 小鼠、大鼠等)的骨髓瘤細胞融合，藉此可得到融合瘤。細胞融合，可藉由例如聚乙二醇(PEG)法等來進行，其係在適當的培養基中，使產生抗體的細胞與骨髓瘤細胞於聚乙二醇等的存在下融合。細胞融合後，藉由HAT培養基(包含次黃嘌呤、胺喋呤、胸腺核苷的培養基)等的選擇培養基篩選融合瘤，並依照一般方法(例如，EIA法)，針對產生辨別P30蛋白質之抗體的融合瘤的能力進行篩選。接著，依照一般方法(例如有限稀釋法)，對產生預期抗體之融合瘤進行選殖，以選擇產生單株抗體的融合瘤。
製作抗體時用於免疫的P30蛋白質(抗原)，可藉由基因重組，以大腸桿菌大量生產。P30係由274個胺基酸所構成的蛋白質，但從N末端至95號的序列中，存在兩個疏水性的穿膜區(transmembrane domain)。因此，若以大腸桿菌產生全長的P30蛋白質，則溶解性差而難以處理。於是，較佳為表現將95號以前的胺基酸序列去除的重組P30蛋白質(將胺基酸序列顯示為SEQ ID NO：02)並進行調製，以作為抗原蛋白質加以利用。
如後述的實施例所示，本案發明人成功取得特異地辨識P30蛋白質之複數單株抗體。該等的抗體中，為了識別，而賦予#1~#19的殖株編號。各別產生於在該等的抗體之中在免疫層析法呈現高敏感度的抗體#3與抗體#9的融合瘤殖株#3以及融合瘤殖株#9，如下所述，已寄存於指定的寄存機構。
<融合瘤殖株#3>
寄存機構：獨立行政法人製品評價技術基盤機構 專利微生物寄存中心(〒292-0818)日本國千葉縣木更津市KAZUSA鎌足2-5-8 122號室
寄存日：2014年6月23日
寄存編號：NITE BP-01880
<融合瘤殖株#9>
寄存機關：獨立行政法人製品評價技術基盤機構 專利微生物寄存中心(〒292-0818)日本國千葉縣木更津市KAZUSA鎌足2-5-8 122號室
寄存日：2014年6月23日
寄存編號：NITE BP-01881
抗P30蛋白質抗體(多株抗體或單株抗體)會因應需求被標記化。可以一般方法進行標記化。作為標記化中所使用的標記物質，期望為不溶性粒狀物質。作為不溶性粒狀物質，可列舉：以色素分子對「乳膠、聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、苯乙烯-丁二烯共聚物、聚氯乙烯、聚乙酸乙烯酯、聚丙烯醯胺、聚丙烯酸甲酯、苯乙烯-丙烯酸甲酯共聚物、聚環氧丙基丙烯酸甲酯、丙烯醛-乙二醇二丙烯酸甲酯共聚物等的合成高分子」進行標記所得到的染色合成高分子粒子、金屬膠體粒子(金、銀、銅、鐵、鉑、鈀以及該等金屬之混合物(例如，金與鉑的混合物、金與銀的混合物、鈀與鉑的混合物)的膠體粒子)、紅血球等。較佳為可以目視簡便且迅速地觀察變化的粒子，可採用染色合成高分子粒子或金屬膠體粒子。粒子的粒徑為例如15~100nm，較佳為30~80nm。金屬膠體粒子可使用市售品，亦可以一般方法調製。金屬膠體粒子之中，從容易使用等的理由來看，較佳為金膠體粒子。
若以金屬膠體粒子的情況為例說明標記化的方法，相對於1L的金屬膠體粒子溶液(一般而言，540nm的吸光度約為2.0)，一般係添加0.1~100mg，較佳為0.5~20mg的抗P30蛋白質抗體，並在冷藏或室溫下攪拌5 分鐘~24小時。接著，在牛血清蛋白(BSA)(一般為0.01~10g，較佳為0.1~2g)等之中進行阻斷(blocking)，作為離心分離後的沉澱物，可得到經金屬膠體粒子標記的抗P30蛋白質抗體。可使用一般用於免疫學試驗的緩衝液，例如托立斯緩衝液(Tris buffer)、磷酸緩衝液等作為緩衝液。緩衝液的pH值的範圍一般為4.5~9.5，較佳為5.5~8.5。
使用抗P30蛋白質抗體，可建構肺炎黴漿菌感染檢測用的試驗器具(免疫層析檢測分析試驗裝置)。亦即，本發明係提供一種使用抗P30蛋白質抗體的免疫層析檢測分析試驗裝置。本發明的裝置中，具備針對肺炎黴漿菌之P30蛋白質的第一特異抗體(第一抗P30蛋白質抗體)、針對肺炎黴漿菌之P30蛋白質的第二特異抗體(第二抗P30蛋白質抗體)，以及膜載體。接著，第一抗P30蛋白質抗體被固定於膜載體，而構成檢測部。另一方面，第二特異抗體被標記物質所標記，並且被載持於偏離檢測部的位置。
本說明書中，「固定」意指為了不使抗體移動而將其配置於膜等的載體。「載持」則意旨可移動地配置於載體之中或其表面。以下，一邊參照第一圖(具體例為測試條)，一邊說明試驗裝置的構成。第一特異抗體與第二特異抗體，對於P30蛋白質皆具有特異性。第一特異抗體與第二特異抗體，較佳為針對P30蛋白質具有不同特異性的抗體，例如，各別的抗P30蛋白質抗體。第一特異抗體為捕捉抗體，其被固定於載體，並構成檢測部。「檢測部」係指以抗原抗體反應所形成的部位，其捕捉檢體中之抗原與第一特異抗體的複合體，而檢測出抗原的存在。
作為所使用的載體材質，可藉由靜電作用及疏水相互作用等的物理作用而與蛋白質結合，且可展開檢體中的成分、抗原-第一特異抗體 複合體、對照用標記物質等。作為膜載體的材質，可列舉：硝化纖維、聚偏二氟乙烯(PVDF)、乙酸纖維素。載體較佳為膜狀(膜載體)。除了檢測部以外，載體較佳為具備用以確認檢體是否適當展開的對照部。對照部中固定有可與對照用標準物質結合的物質。檢測部與對照部較佳為以展開方向截斷的方向上，線狀地設置在載體上(亦分別稱為「測試線」及「對照線」)。雖未限制載體上的檢測部及對照部的位置關係，但一般而言，對照部形成在相對檢測部的下游側。
可與補足抗體及對照用標記物質結合之物質的固定方法，可對應載體的種類，依照一般方法進行。例如，使用市售的抗體塗布機，塗布經適當稀釋的抗體溶液並將其乾燥，藉此可將其固定。固定於檢測部位的捕捉抗體的量，較佳為0.05~10μg，更較佳為0.1~3μg。
第二特異抗體，係經標記物質所標記的抗體，亦即「標記抗體」，其在偏離檢測部位的位置，被載持於膜等的載體。典型而言，載持標記抗體的載體，與將捕捉抗體固定化的載體，係不同的構件。然而，亦可將標記抗體載持於固定捕捉抗體的載體。載持第二特異抗體(標記抗體)的標記抗體載持構件，係配置於比檢測部的上游側。標記抗體載持構件，在乾燥狀態下載持標記抗體，若浸潤於液體中則釋放標記抗體。作為標記抗體載持構件的材質，可列舉：玻璃纖維、纖維素纖維、塑膠纖維等。將標記抗體載持構件含浸於包含標記抗體的適當緩衝液，或將包含有標記抗體的適當緩衝液添加標記抗體載持構件中，藉此可將標記抗體載持於標記抗體載持構件。標記抗體載持構件所載持的標記抗體的量，較佳為0.01~1μg，更較佳為0.03~0.3μg。
檢體添加構件，配置於標記抗體載持構件的上游側，較佳的態樣，係檢體添加構件中的至少下游側區域的底面與標記抗體載持構件中的上游側的區域的頂面接觸。標記抗體載持構件的一部分，較佳為夾入檢體載持構件的底面與載體上游側之區域的頂面之間。較佳為具備配置於載體下游之檢體吸收構件。檢體吸收構件係配置成其上游側區域的底面，與存在於比載體之檢測部更下游側之區域的頂面接觸的態樣。
本發明的試驗裝置中，若因應需求將經前處理的液狀檢體滴下至檢體添加構件，則其浸潤於標記抗體載持構件，使得檢體與標記抗體的混合物往載體(典型而言為膜載體)移動；而在載體中朝向檢測部位展開。檢體中包含P30蛋白質(抗原)的情況(亦即，肺炎黴漿菌感染病例的情況)，該抗原與標記抗體形成免疫複合體。接著，因為檢測部中的抗原抗體反應，該複合體被捕捉抗體所捕捉而聚集，進而顯色。因此，可以目視觀察檢測部中的顯色程度，而能夠判定檢體中有無抗原。載體具備對照部的情況中，從標記抗體載持構件釋放的對照用標記物質，被可與對照部的對照用標記物質結合的物質所捕捉而聚集，進而顯色。在亦使用標記抗體作為對照用標記物質的情況中，未與檢體中之抗原形成複合體而殘留的標記抗體，通過檢測部位，被能與固定於下游之對照部標記抗體結合的物質捕捉而聚集，進而顯色。
供給至本發明之試驗裝置的檢體，係可能包含肺炎黴漿菌的檢體。可作為檢體使用的源自活體的材料，可列舉咽喉擦拭液、鼻腔擦拭液、鼻腔抽吸液、鼻腔洗淨液、痰、肺泡洗淨液等，但不限定於該等材料。
作為檢體的前處理，可舉例如：將從疑似感染肺炎黴漿菌之 被檢測體所採集的源自活體的材料溶解於前處理試劑，以調製用於滴至試驗裝置的液體。這樣的前處理，是為了可使檢體展開，或是為了可良好地使檢體展開所進行。前處理試劑中，可使用各種緩衝液。作為緩衝液，可使用免疫學的試驗中常用的緩衝液，例如，托立斯緩衝液(Tris buffer)、磷酸緩衝液、古德氏緩衝液(Good buffer)等。以降低非特異之結合反應為目的，亦可使前處理試劑中含有界面活性劑。作為界面活性劑，可使用Triton X-100(商品名，聚乙二醇單對異辛基苯基醚)、Tween20(聚氧乙烯去水山梨醇單月桂酸酯)、Tween80(聚氧乙烯去水山梨醇單油酸酯)、CHAPS(3-[(3-膽醯胺基丙基)二甲基銨基]丙磺酸)、SDS(十二基硫酸鈉)等。亦可併用2種以上的界面活性劑。
以下，雖使用實施例更詳細說明本發明，但本發明並不限於實施例。
[實施例]
1.對肺炎黴漿菌P30蛋白質具特異性的單株抗體的製備
1-1.抗原蛋白質的調製
P30蛋白質(SEQ ID NO：01)中，從N末端至95號的序列中，存在2個疏水性的穿膜區域。藉由大腸桿菌表現將N末端至95號胺基酸去除的重組P30蛋白質(將胺基酸序列表示為SEQ ID NO：02)，以作為抗原蛋白質使用。以下概略顯示調製抗原蛋白質之方法。首先，將肺炎黴漿菌(M.Pneumoniae)M129株的基因體(genome)DNA作為模板，並以PCR法使P30基因的片段增幅。作為PCR的引子序列，係使用AGGCATATGGGACTGCCAATTGTGAAGCG(SEQ ID NO：03)與CAGGTCGACTTAGCGTTTTGGTGGAAAAC(SEQ ID NO：04)(底線部 係分別被限制酵素NdeI與SalI所切斷的部位)。將增幅的P30基因片段嵌入至Takara Bio公司的pcold ProS2表現載體(expression vector)的NdeI-SalI部位，以作為重組P30表現載體。將P30表現載體導入大腸桿菌BL21株，藉由添加1mM的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，並藉由在15℃下的低溫培養，表現重組P30蛋白質。藉由His-tag精製管柱與凝膠過濾，精製透過大腸桿菌表現的重組P30蛋白質。定量已精製的重組P30蛋白質，並取適量作為免疫用抗原使用。
1-2.免疫及抗體的精製
藉由以下的方法嘗試取得對抗原蛋白質具特異性的單株抗體。
<材料>
(1)抗原
重組P30精製蛋白質
(2)免疫動物
BALB/cA小鼠，6週齡，雌性(CLEA Japan股份有限公司)3隻
(3)佐劑
TiterMaxGold(G-3 FUNAKOSHI)
(4)小鼠骨髓瘤細胞(Myeloma cell)
P3U1
(5)培養基、器材、試劑
RPMI-1640培養基(11875-119 GIBCO)
丙酮酸鈉溶液(11360-070 GIBCO)
青黴素-鏈黴素-麩醯胺(penicillin-streptomycin-glutamine)溶液 (10378-016 GIBCO)
HAT添加劑(21060-017 GIBCO)
HT添加劑(11067-030 GIBCO)
FBS(S1560 BWT公司)
PEG1500(783641 Roche)
DMSO(D2650 SIGMA)
96孔培養盤(92696 TPP)
24孔培養盤(92424 TPP)
殺菌培養皿(34153 NIPRO)
凍結用試管(MS-4503住友BAKELITE)
(6)抗體篩選器材、試劑
ELISA微盤(442404 nunc)
抗小鼠IgG標記抗體(1030-04 COSMO BIO)
單株抗體同型(isotyping)套組(1493027 Roche)
(7)小鼠腹水化、抗體精製
BALB/cA小鼠，成鼠，雌性(CLEA Japan股份有限公司)
異十八烷(Pristane)(42-002 COSMO BIO)
HiTrapProtein G(17-0404-03 GE Health Care)
<方法>
(1)小鼠的免疫敏化
將調整為1.6mg/ml的P30蛋白質與TiterMaxGold等量混合，使用玻璃針 筒(syringe)，調製乳液(emulsion)。相隔兩週地分兩次將相當於100μg的抗原投予BALB/cA小鼠的皮下，在其1~2週後，僅將40μg的P30抗原溶液投予皮下，3天後在麻醉下進行放血，以採取脾臟及各種淋巴節。
(2)骨髓瘤細胞的培養
小鼠骨髓瘤細胞(P3U1)，係在RPMI1640培養基中添加丙酮酸與麩胺酸，使添加有青黴素-鏈黴素的培養基(RPMI培養基)中的FBS成為10%的態樣，並進行隔代培養。細胞融合，係使用對數增殖期的形態完整者。
(3)細胞融合
在#200網目之上，將從經敏化的小鼠所採取的各淋巴組織細切，並以裝設有矽栓的玻璃棒輕壓，一邊加入培養基，一邊過濾並採取淋巴球。以1200rpm、10分鐘的離心處理洗淨細胞，並計算細胞數。將骨髓瘤細胞移至50ml錐形管，並計算細胞數，藉由1000rpm、5分鐘的離心處理進行洗淨。之後，調整細胞數，以使淋巴球與骨髓瘤細胞的比例在5：1~10：1的範圍內混合，並藉由離心(1200rpm 10分)，得到細胞沉澱。
細胞融合，係花費1分鐘將1ml的PEG液同時攪拌並緩慢混入細胞沉澱，之後攪拌2分鐘以使其反應。接著，花費1分鐘加入1ml的RPMI1640液，進行同樣的操作3次，再花費3分鐘，添加12ml的RPMI1640液。在37℃的培養箱中靜置10分鐘之後，藉由進行1000rpm的離心5分鐘採集細胞，並使其懸浮於包含添加HAT添加劑之15%FBS的RPMI培養基中，再散佈至10個96孔培養盤之中。此時，可使用小鼠胸腺細胞作為餵養細胞(feeder cell)。
在CO2培養箱中培養1週，以使融合瘤選擇性增殖。
(4)抗體篩選
在ELISA用96孔微盤中，置入以PBS稀釋為1μ/ml的P30蛋白質50μl，在室溫下使其反應2小時，或冷藏一晚使其反應，之後，加入0.5%的脫脂乳(skim milk)100μl進行阻斷，以作為抗原結合盤。
在細胞融合後的第一週，從各培養皿採集無菌培養上清液約50μl，並置入抗原結合盤，使其在室溫下反應1小時。之後，以生理食鹽水，進行3次的盤體洗淨，接著，在室溫下，與藉由0.5%脫脂乳稀釋為2500倍的酵素標記抗小鼠IgG抗體反應1小時。同樣地進行洗淨之後，以酵素基質液使其顯色，並選擇與抗原結合的單株抗體陽性孔。
(5)選殖
對於以ELISA選擇的融合瘤以有限稀釋法進行選殖。亦即，以每1孔具有1個融合瘤細胞的方式，調製細胞懸浮液並將其散播至先前散佈餵養細胞的96孔培養盤。1週後，確認增殖的菌落，並且進行同樣的抗體篩選。進行2次選殖，確認係完全單一的細胞。再者，培養基係使用添加有15%FBS與HT添加劑的RPMI培養基。
(6)殖株培養、細胞凍結
成為單一細胞的融合瘤，從24孔培養盤移至培養皿以進行擴大培養，並在每管2~5×108個的情況下進行凍結保存。凍結培養基係使用下述培養基：在包含15%FBS與HT添加劑的RPMI培養基中，以使其為10%的方式添加DMSO的培養基；並將其包入紙巾，保管於-85℃的超低溫冷凍器。
(7)子類別(subclass)測定
使用充分進行選殖的培養上清液，並藉由市售的免疫層析法，依照手 冊進行子類別的測定。
(8)小鼠腹水化、抗體精製
將0.5~1×107個的融合瘤細胞接種至BALB/cA成鼠的腹腔(在1週以上之前已將0.5ml的異十八烷投予該小鼠的腹腔內)，約7~10天後，得到所積存之腹水。在腹水充分凝固之後，以3000rpm、15分鐘的離心處理，使固體成分沈殿分離上清液。在上清液中，添加疊氮化鈉0.1%以作為防腐劑，並保存於冷藏之中直至精製。
在精製來自腹水的抗體時，使用HiTrapProteinG管柱；使用PBS進行蛋白質G管柱的抗體結合與洗淨；使用0.1M甘胺酸鹽酸緩衝液(pH值2.8)進行洗淨後的抗體溶出；使用1M Tris中和溶出的IgG。溶出的抗體，在50%飽和硫酸銨中進行濃縮，並在PBS中充分透析，再加入0.05%疊氮化鈉，並冷藏保存。
精製抗體的純度檢定，係進行乙酸纖維素膜電泳，確認γ區域係單一條帶。
<結果>
使用3隻小鼠進行細胞融合實驗。結果，在1次篩選中，從No.1小鼠選擇14殖株，從No.2小鼠選擇1殖株，從No.3小鼠選擇14殖株。之後，研究非特異的反應及菌落增殖，共針對19殖株進行選殖，以培養單株抗體產生融合瘤(殖株#1~#19)。經培養的融合瘤，進行小鼠腹水化，而得到2~7ml的腹水。所得之腹水，在乙酸纖維素膜電泳中，確認抗體含量，之後以HiTrapProteinG精製為IgG。以免疫層析法評價各精製抗體。19殖株中， 殖株#3與#9的組合得到良好的結果，而可用於測定系統。#3、#9的子類別皆為IgG1κ。融合瘤殖株#3及#9，如以下所述，進行寄存。
<融合瘤殖株#3>
寄存機關：獨立行政法人製品評價技術基盤機構 專利微生物寄存中心(〒292-0818)日本國千葉縣木更津市KAZUSA鎌足2-5-8 122號室
寄存日：2014年6月23日
寄存編號：NITE BP-01880
<融合瘤殖株#9>
寄存機關：獨立行政法人製品評價技術基盤機構 專利微生物寄存中心(〒292-0818)日本國千葉縣木更津市KAZUSA鎌足2-5-8 122號室
寄存日：2014年6月23日
寄存編號：NITE BP-01881
2.免疫層析試驗裝置的製作
2-1.標記抗體載持構件的調製
鑑於以上結果，將融合瘤殖株#3所產生的抗P30單株抗體(P30-3)使用於標記抗體。以5mM磷酸緩衝液(pH值7.4)將抗P30單株抗體(P30-3)稀釋為0.05mg/ml的濃度。在金膠體懸濁液(BBI：平均粒子60nm)0.5ml中加入並混合0.1ml的50mM磷酸緩衝液(pH值7.4)後，再加入上述經稀釋的抗P30單株抗體溶液0.1ml，在室溫放置10分鐘。在靜置後的溶液中，加入以10mM磷酸緩衝液稀釋的10質量%的牛血清蛋白(BSA)溶液0.1ml，並在充分攪拌後，以8,000xg進行離心分離15分鐘。再次去除上清液，並在殘渣中加入pH值7.4的10mM磷酸緩衝液，以超音波震碎機使其充分分散， 而作為標記抗體溶液。在將此標記抗體溶液均勻地添加至寬16mmx長度100mm的玻璃纖維製的墊子(Millipore公司製：GFCP203000)之後，以真空乾燥機使其乾燥，得到標記抗體載持構件。
2-2.具備檢測部及對照部的硝化纖維膜載體的調製
以包含5質量%之異丙醇的磷酸緩衝液(pH值7.4)，將與上述2-1之標記抗體不同的抗P30單株抗體(融合瘤殖株#9所產生之單株抗體P30-9)稀釋至1.3mg/ml的濃度，以調製檢測部固定用抗體(捕捉抗體)溶液。使用抗體塗布機(BioDot公司製)，以1μl/cm的塗布量，將該檢測部固定用抗體溶液從長軸側的一端(此端為展開方向的上游側端，相反側為下游側端)離開1cm的位置線狀地塗布於長度25cmx寬2.5cm的硝化纖維膜(Millipore公司製：HF120)中。更進一步，以1mg/ml的塗布量，將抗小鼠IgG抗體從上游側端離開1.5cm的位置線狀地塗布於硝化纖維膜中。塗布後，在42℃下乾燥60分鐘，而得到具備檢測部及對照部的硝化纖維膜載體。
2-3.免疫層析試驗裝置的製作
將塑膠製底板黏合於與上述2-2的硝化纖維膜載體的抗體塗布面(此面為頂面)的相反側(此面為底面)上。接著，將上述2-1的標記抗體載持構件，以與硝化纖維膜的上游側端重疊2mm的方式，配置並貼附於硝化纖維膜載體的頂面，更以與標記抗體載持構件的頂面重疊2mm的方式，配置並貼附寬度5mm×長度23mm的玻璃纖維製樣本墊(POLE公司製：8000006801)。另一方面，將寬度5mm×長度25mm的吸收墊(POLE公司製)，以與硝化纖維膜載體的下游側端重疊15mm的方式，貼附於硝化纖維膜載體的頂面。最後，沿著長軸方向，逐一切斷成5mm，而得到免疫層析試驗裝 置。
3.肺炎黴漿菌檢測敏感度的比較
使用Chanock培養基，以37℃培養黴漿菌．肺炎黴漿菌(Mycoplasma pneumonia)FH株(ATCC)7天。使用此培養液作為檢體，比較使用抗P30單株抗體的免疫層析法(使用上述免疫層析試驗裝置)與使用抗P1單株抗體的免疫層析法的敏感度。使用的單株抗體如下所述。再者，後者的方法所使用的試驗裝置，係使用抗P1單株抗體(P1-4及P1-115：富山研究所)，並依據上述方法所製作。
<P30免疫層析法>
標記抗體(用於金膠體敏化)：P30-3
捕捉抗體(用於隔膜(membrane)敏化)：P30-9
<P1免疫層析法>
標記抗體(用於金膠體敏化)：P1-4
捕捉抗體(用於隔膜敏化)：P1-115
實驗結果顯示於下表。
如表所示，使用抗P30單株抗體的免疫層析法的檢測敏感度，遠優於使用抗P1單株抗體的免疫層析法的檢測敏感度。
如以上所述，可成功取得特性優良的抗P30單株抗體，並可實現以遠優於既有方法之敏感度檢測肺炎黴漿菌的免疫層析法。
[產業上的利用可能性]
本發明提供可使用於免疫層析法的抗P30單株抗體。根據使用該單株抗體的免疫層析法，可簡便、迅速且高敏感度的檢測肺炎黴漿菌的感染。
本發明並不限於上述任何發明的實施形態及實施例的說明。在不脫離申請專利範圍的記載，本領域具通常知識者可輕易想到的範圍中，各種變化形態皆包含於本發明。藉由援用的方式，引用本說明書之中所明示的論文、公開專利公報及專利公報等的所有內容。
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<223> Primer
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<210> 4
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 4

Claims (24)

  1. 一種肺炎黴漿菌檢測試劑，包含：針對肺炎黴漿菌的P30蛋白質具特異性的抗體。
  2. 如申請專利範圍第1項之檢測試劑，其中係用於免疫層析檢測分析(immunochromatography)。
  3. 如申請專利範圍第1或2項之檢測試劑，其中該特異性抗體為單株抗體。
  4. 如申請專利範圍第3項之檢測試劑，其中該單株抗體係由寄存編號NITE BP-01880的融合瘤或寄存編號NITE BP-01881的融合瘤所產生的抗體。
  5. 如申請專利範圍第1、2或4項中任一項之檢測試劑，其中該特異抗體係將從N末端至95號胺基酸去除的重組P30蛋白質作為抗原所調製的抗體。
  6. 如申請專利範圍第3項之檢測試劑，其中該特異抗體係將從N末端至95號胺基酸去除的重組P30蛋白質作為抗原所調製的抗體。
  7. 如申請專利範圍第5或6項之檢測試劑，其中該重組P30蛋白質係由SEQ ID NO：02的胺基酸序列所構成。
  8. 如申請專利範圍第1、2、4、6、7項中任一項之檢測試劑，其中以染色合成高分子粒子或金屬膠體粒子標記該特異抗體。
  9. 如申請專利範圍第3項之檢測試劑，其中以染色合成高分子粒子或金屬膠體粒子標記該特異抗體。
  10. 如申請專利範圍第5項之檢測試劑，其中以染色合成高分子粒子或金 屬膠體粒子標記該特異抗體。
  11. 如申請專利範圍第8項之檢測試劑，其中該金屬膠體粒子為金膠體粒子。
  12. 如申請專利範圍第9或10項之檢測試劑，其中該金屬膠體粒子為金膠體粒子。
  13. 一種肺炎黴漿菌檢測套組，包含：如申請專利範圍第1至12項中任一項之檢測試劑。
  14. 一種免疫層析檢測分析試驗裝置，包含：針對肺炎黴漿菌的P30蛋白質的第一特異抗體；針對肺炎黴漿菌的P30蛋白質的第二特異抗體；及膜載體；該第一特異抗體固定於該膜載體，而構成檢測部；該第二特異抗體被標記物質所標記，且被載持於偏離該檢測部的位置。
  15. 如申請專利範圍第14項之試驗裝置，其中該第一特異抗體，為藉由寄存編號NITE BP-01881的融合瘤所產生的抗體；該第二特異抗體，為藉由寄存編號NITE BP-01880的融合瘤所產生的抗體。
  16. 如申請專利範圍第14或15項之試驗裝置，其中該標記物質為染色合成高分子粒子或金屬膠體粒子。
  17. 如申請專利範圍第16項之試驗裝置，其中該金屬膠體粒子為金膠體粒 子。
  18. 一種肺炎黴漿菌感染檢查法，其使用如申請專利範圍第14至17項中任一項之免疫層析檢測分析試驗裝置。
  19. 如申請專利範圍第18項之檢查法，其中將源自活體的材料使用於檢體。
  20. 如申請專利範圍第19項之檢查法，其中該活體材料為咽喉擦拭液或鼻腔抽吸液。
  21. 一種對於肺炎黴漿菌的P30蛋白質具特異性的單株抗體，其係由寄存編號NITE BP-01880或NITE BP-01881的融合瘤所產生。
  22. 一種標記化抗體，其係以金屬膠體粒子標記如申請專利範圍第21項之具特異性的單株抗體。
  23. 如申請專利範圍第22項之標記化抗體，其中該金屬膠體粒子為金膠體粒子。
  24. 一種融合瘤，其寄存編號為NITE BP-01880或NITE BP-01881。
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