JPS63184064A - 抗マイコプラズマ・ニユ−モニエモノクロ−ナル抗体及びその製造法並びにこれを利用するマイコプラズマ・ニユ−モニエの同定用及び診断用試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〈産業上の利用分野〉 本発明ハマイコプラズマ・ニューモニエ（以下ｒＭ、Ｉ
）Ｊと略称する）に特異反応性を有するモノクローナル
抗体及びこれを用いる、Ｍ、ｐの同定又は診断用試薬に
関するものである。

〈従来の技術及びその問題点〉 Ｍ６ｐ感染症はおよそ４年周期で流行し、小児や若年者
では重症化や中枢神経障害等の重篤な合併症を招来する
ことがある。Ｍ、ｐ感染症はかぜ症候群の中ではウィル
スによるものに次いで多く、治療にはマクロライド系な
いしテトラサイクリン系の抗生物質が有効であるので、
重症の発病初期に於ける迅速な確定診断が必要とされて
きた。しかしながら、今日性われている重症の診断方法
としては培養法や血清学的方法などがあげられるが、い
ずれも長期間を必要とするものであった。特に、血清学
的診断法における抗体の検出は回復期に至って初めて可
能となるものであり、非特異反応も少なくないという欠
点があった。

く問題点を解決するための手段〉 本発明者は斯かる現状に鑑み鋭意研究の結果、Ｍ、ｐの
検出に有効な、Ｍ、ｐに特異的なモノクローナル抗体の
調製に成功した。

また、このモノクローナル抗体は各種免疫測定法におけ
る特異抗体として利用でき、簡単な操作で容易、迅速且
つ、高精度にＭ、ｐの検出を行うことができることを見
出した。

即ち本発明の第１の目的は、Ｍ、ｐで免疫した１＠乳動
物の免疫細胞と骨髄腫細胞との融合細胞（ハイプリドー
マ）によシ産生され、Ｍ、ｐに特異反応性を有すること
を特徴とするモノクローナル抗体及びその製法を提供す
るものである。

また、本発明の第２の目的は、該モノクローナル抗体を
用いるＭ、ｐの同定用及び診断用試薬を提供するもので
ある。

本発明のモノクローナル抗体は、以下の如くして調製さ
れる。

（５）抗体産生ハイブリドーマの調製 本発明抗体は特定の融合細胞（ハイプリドーマ）から産
生されるものである。ノ・イブリドーマの作製に用いら
れる抗体産生細胞はＭ、ｐで免疫した嶋乳動物の免疫担
当細胞（例えば膵臓細胞など）が用いられる。Ｍ、ｐの
免疫原の調製はＭ、ｐの研究で通常用いられる方法によ
シ行われる（例えば、「ヒト・動物および植物マイコプ
ラズマの分離と同定」日本細菌学会教育委員会第８〜１
０頁、第７４〜７６頁及び佐々木、新香、氷原ら６ゾヤ
ーナルΦオプ拳クリニカル・マイクロパイオロゾ−（Ｊ
、　Ｃ１１ｎ、　Ｍｉｃｒｏ、）　　（１９８３）″１
８巻第１ｌ６７〜１１７３頁参照）。

また、上記免疫原で免疫する捕乳動物としては特に限定
されないが、細胞融合に用いる他方の骨髄腫細胞（ミエ
ローマ細胞）との適合性を考慮して選択されるのが望ま
しく一般にはマウス、ラット等を使用するのがよい。

本発明において免疫は、二重又はそれ以上に行うことが
好ましく、例えば同一のＭ、ｐをそれぞれ異なる組成の
培地で培養して異なる免疫原を調製し、これらを用い、
時間間隔をおいて動物を免疫することが望ましい。

異なる免疫原を調製するための具体的手段としては、例
えば培地のコレステロール源トして動物血清を用いたマ
イコプラズマ増殖用培地及びコレステロール源として卵
黄を用いたマイコプラズマ増殖用培地のそれぞれで同一
のＭ、ｐを培養する方法があげられる。

また、この免疫原を用いて免疫する手段としては、まず
上記免疫原のうちの一種を通常の緩衝液や生理食塩水に
懸濁させ光もの、あるいはこれとフロイントのアゾユパ
ンドとの混合液を暉乳動物の腹腔内、皮下等適当な経路
で投与して一次刺激後、必要に応じて投与ルートを選択
して同様の操作を繰シ返して第一免疫原による免疫を与
え、次いで、他の免疫原を用い、以下同様に処理して第
二免疫原による免疫を与える方法があげられる。

免疫原の投与量は投与経路、哺乳動物の種類等に応じて
適宜決定されるが、マウスに投与する場合は通常投与量
が１回当たり１〜１０００μｆ／マウス程度とするのが
適当である。

細胞融合に用いる免疫担当細胞は、第二免疫原の最終投
与の２〜５日後に摘出した牌細胞が好適である。また、
上記免疫担当細胞と融合させるミエローマ細胞としては
既に確立されている公知の各種細胞株、例えばマウスに
おけるＰ３　（Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８）、Ｐ３Ｕｌ　　
（Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８−Ｕｌ　）、Ｎ５−１　　（Ｐ
３−ＮＳＩ／１−Ａｇ４−１　）、Ｘ６３゜６、５．３
（Ｘ６３−Ａｇ８−６．　５．　３）等やラットにおけ
る２１０．　ＲＣＹ、　Ａｇ１．　２．　３、Ｙ３．Ａ
ｇ１．２．３等をいずれも使用できる。

モノクローナル抗体産生ハイプリドーマの調製は、ケー
ラー及びミルシュタインらの公知の方法に準じて行えば
よい。融合促進剤としては通常用いられる？リエテレン
グリコール（ＰＥＧ　）やセンダイウィルス（ＨＶＪ　
）等を使用でき、更に融合効率を高めるためにジメチル
スルホキシド等の補助剤を添加することもできる。免疫
担当細胞とミエローマ細胞との使用比は通常の方法と同
様、約１＝１〜１０：１の割合とすればよい。

上記融合時の培地としては、この種の細胞培養に使用さ
れる通常の各種栄養培地をいずれも使用できる。その代
表例としては、例えばＲＰＭＩ−１６４０培地、ダルベ
ツコ改良■Ｍ１（以下１’−ＤＭＥＭ　Ｊと略称する）
培地等を挙げることができ、これらの培地には通常知ら
れているようなウシ胎児血清、非必須アミノ酸混合液、
ピルビン酸ナトリウム、２−メルカプトエタノール等の
補液を加えてもよい。

融合は上記免疫担当細胞とミエローマｍ胞と所定量を血
清を含まない上記培地内でよく混ぜ遠沈し、上清を除去
した後、予め３７℃程度に加温しｆｃＰＥＧ、例えば平
均分子量１０００〜６０００のものを、培地に約３０〜
６０％（Ｗ／Ｖ）の濃度になるように加えたものを細胞
の沈渣に滴下して混ぜ合わすことにより行われる。これ
を３７℃で６０秒ないし数分間反応させ、適当な培地を
遂次添加して室温放置後遠心し、上清を除去した後、好
適にはウシ胎児血清を１％以上含むＲＰＭＩ−１６４０
培地等の適当な培地を加えて、１日程度培養するのが好
ましい。

このようにして得られたハイプリドーマの分離は通常の
選択培地、例えばＨＡＴ培地（ヒ？キナンテン・アミノ
ゾテリン及びチミジンを含む培地）を用いて行われる。

該ＨＡＴ培地での細胞培養は、ハイプリドーマ以外の細
胞（未融合細胞）が死滅するのに充分な時間、通常数日
〜数週間を要して行われる。その後ハイプリドーマはＨ
Ｔ培地（ヒ？キサンチン及びチミジンを含む培地）で更
に数日〜数週間培養する。なお、ハイプリドーマは最終
的には通常培地で培養するのが好ましい。

斯くして得られたハイプリドーマの中で、目的とする抗
体を産生じているものの検索が行われる。検索の方法と
してはＥＬＩＳＡ法［Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙ
ｍｏｌｏｄｙ　７０　、　Ｐ、　４１９〜４３９、’８
０に記載の方法〕、凝集反応性、プラーク法、ス？ット
法、オフタロニー法、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ　
）法等の一般の抗体の検出に利用される各種方法を利用
することができる。具体的な例としてＥＬＩＳＡ法を記
すと、ｉＶｌ、ｐ抗原（蛋白として１〜２μ２相轟量）
をプレートにコーティングし、該プレートと被検抗体（
上記）・イブリドーマの培養上清又はその希釈液）とを
反応させ、結合した抗体の存在を、通常の方法、例えば
融合にマウスの細胞を用いた場合は、例えばノリ−オキ
シダーゼ標識−抗マウスイムノグロブリン抗体を用いて
検出する。抗体の産生が確認されたならば、ただちに限
界希釈法等を用いて単一クローン化を行う。該目的抗体
産生株の単一クローン化の操作は数回繰返して行うこと
が望ましい。

斯くして得られる目的抗体産生株（ハイブリ忙°−マ）
は通常の培地で継代培養でき、また液体窒素中でウシ胎
児血清及びジメチルスルホキシドを含むＲＰＭＩ−１６
４０培地等の適宜培地で容易に長期間安定に保存するこ
とができる。該ハイブリドーマの代表例は後記実施例に
示す通りであシ、これは本発明者らによシ分虐可能な状
態で保持されている。

（Ｂ）モノクローナル抗体の製造 上記ハイプリドーマからの本発明モノクローナル抗体の
製造法としては、常法に従い、適当な培地中で該ハイプ
リドーマを培養し、培養上清から分離する方法、あるい
は上記ハイプリドーマをこれと適合性のある哺乳動物に
投与し、増殖させ該動物の腹水より分離する方法等があ
げられる。前者の方法は特に高純度のものを得るのに適
しており、後者は大量生産に適している。

具体的な培＃法としては、該ハイプリドーマを適当な栄
養培地、例えば１０％（Ｖ／Ｖ）の牛胎児血清、５Ｘ１
０”Ｍのメルカゾトエタノール及び抗生物質を含有した
ＲＰＭＩ−１６４０培地を用いることができるＪＲＰＭ
Ｉ−１６４０培地に代えて４．５ｆ／ｌのグルコースを
含むａαを用いてもよい。細胞を増殖させる時の適当な
初期濃度は約１０５個／７！であり、ｌｏ６個／−とな
るまで培養を継続する。得られた培養液から遠心分離等
で細胞を除去した培養上清は粗製抗体液として用いられ
る。

一方、該ハイプリドーマを生体の腹腔内に移植して増殖
させ、その生体より体液（主として腹水がよく用いられ
る）を採取することによシ、該ハイプリドーマが産生ず
る抗体を得ることもできる。この方法によって得られる
粗製抗体液は、不純物として宿主の生体由来の種々の物
質を含むという欠点を持つが、一方、生体外の培養によ
って得られる抗体液に比べて高濃度の抗体を含んでいる
という点で優れている。ハイプリドーマの移植の前、好
ましくは３〜１４日前にシリスタン（２゜６．１０．１
４−テトラメチルペンタデカン）を腹腔内に投与してお
くことにより、粗製抗体液の収量を高めることができる
。移植する動物はハイプリドーマと同種同系の動物が望
ましい。

以上のような方法に従って得られたモノクローナル抗体
は、Ｍ、ｐに特異的に反応するＩ　ｇＧ３の抗体であっ
た。

Ｃ）モノクローナル抗体の精製 該モノクローナル抗体は、粗製抗体液のまま使用しても
良いが、硫酸アンモニウム分画法やイオン交換クロマト
グラフィーなど免疫グロブリンの精製法に基づいてｆｆ
Ｍしてもよいし、あるいはプロティンＡセファロースＣ
Ｌ−４Ｂ（ファルマシア社製）や抗原によるアフィニテ
ィークロマトグラフィー法等によシ精製して用いること
ができる。

次に本発明のモノクローナル抗体を用いたＭ、ｐの同定
及び測定法について説明する。

該ハイプリドーマが産生ずるモノクローナル抗体は既に
明らかにしているように、時異性が高い事から、抗原抗
体反応によって各種の測定方法に利用できる。

■例えば、該モノクローナル抗体と、いわゆるこのモノ
クローナル抗体に対する異種動物由来の抗体に螢光色素
（例えばフルオレッセンス）を標識したものによって測
定する螢光抗体法（間接法）やあるいは該モノクローナ
ル抗体に螢光色素（例えばフルオレッセンス）を直接結
合させた螢光抗体法（直接法）があげられる。

■同様に螢光色素の代わりに酵素、例えばペルオキシダ
ーゼで標識されたモノクローナル抗体と、ペルオキシダ
ーゼの基質である〇−フェニレンシアミンと過酸化水素
によるＥＩＡ法（直接法）やあるいは該モノクローナル
抗体とペルオキシダーゼ標識二次抗体およびペルオキシ
ダーゼ発色基質からなるＥＩＡ法（間接法）があげられ
る。

■同様に酵素の代わりに例えば放射性物質１２５　工又
は１３１１で標識したモノクローナル抗体によって測定
するラジオイムノアッセイ法（直接法）あるいは放射性
物質１２５１又は１３１　Ｉを該モノクローナル抗体に
対する異種動物由来抗体に標識することによって測定す
るラジオイムノアッセイ法（間接法）があげられる。

■一方、該モノクローナル抗体をラテックスやカオリン
あるいは動物の赤血球などの担体に感作して、”Ｌｐを
含む検体と反応させることによって凝集反応をみる方法
もあげられる。

■上記モノクローナル抗体を感作した担体と検体を反応
させることによって起きる１疑果反応を自動測定装置（
近赤外分光光度計）によシ測定する方法もあげられる。

これらの測定方法において、該七ノ゛クローナル抗体は
直接用いるか又は酵素、螢光物質、ラゾオアイントーノ
等を標識するか、担体に吸着せしめる等の処理を施すこ
とによって有効に利用することができる。

これらの方法はＭ、ｐを含むと考えられるものであれば
如何なる検体でも適用することができる。例えば、患者
由来の咽頭ぬぐい液、喀痰、胸水、脳を髄液、血液など
やそれらの培ｆｉｌも用いることができる。また、これ
らの方法は、螢光顕微鏡、光学顕微鏡、自動測定装置（
近赤外分光光度計）あるいは肉眼観察によって迅速、簡
便、容易にＭ、ｐの検出ができる。そして更にはＭ、ｐ
の同定にも利用することができる。

以下、各測定法について、更に詳しく説明する。

○酵素免疫測定法による測定 Ｍ、ｐの膜抗原の他に培養液やその希釈液又は臨床から
得られた検体をエンザイムイムノアツセイ（ＥＩＡ　）
用のマイクロプレート（例えばフロー・う？ラドリーズ
社製、日本インターメノド■製等）に０．１−分注し、
３７℃で１時間反応した後、０．０１Ｍリン酸緩衝食塩
液（ｐＨ７゜２、以下「ＰＢＳ　Ｊと略称する）にて１
〜２回洗浄する。ＰＢＳに１％の濃度に牛血清アルブミ
ン（以下［ＢＳＡ　Ｊと略称する）を添加した液を０．
３　Ｗｌを加えて、室温で３０分以上放置するか又は４
℃で一晩放置し、ウェルをブロッキングする。ＰＢＳに
て３回洗浄した後膣モノクローナル抗体液（培妥上清の
１〜１００倍希釈液相轟）を０．１−加えて、３７℃で
１時間反応させる。反応終了後０．０５％ツイーン２０
’を含むＰＢＳで３回洗浄した後、酵素標識抗マウスイ
ムノグロブリン抗体（フナコシ薬品■製等）をウェルの
ブロッキングに用いた液で１０００〜２０００　倍に希
釈した溶液を１００μ！加え、３７℃で１時間反応した
後、Ｏ，ＯＳ％ツイーン２０Ｏを含むＰＢＳにて５回洗
浄し、次いで基質溶液を５０〜１００μｇ加えて、室温
又は３７℃で１５分〜３０分反応させてその吸光度を測
定する。尚、必要に応じて反応停止剤を用いてもよい。

標識する＃素は通常ペルオキシダーゼ、アルカリフォス
ファターゼ、又はβ−ガラクトシダーゼ等が用いられる
がこれに限定されるものではない。基質溶液は酵素の種
類によって決定される。例えばペルオキシダーゼの基質
としては０．　ＯＩ　Ｍの酢酸緩衝７１７．　（ｐＨ５
，５）にＯ−７エニレンゾアミンを０．５％（Ｗ／Ｖ）
および３１％過酸化水素水ヲ０．０７６％（Ｖ／Ｖ）に
加えたものや、２．２′−アゾ７’／　（３−ｘ　テｈ
　ベンズチアゾリンスルホネート）　（ＡＢＴＳ　）溶
液（フナコシ薬品■製）等が用いられる。

○凝集反応 該°モノクローナル抗体をラテックス、カオリン又は動
物の赤血球等の担体に吸着させてＭ、ｐの同定や感染症
の診断に利用することは操作が簡便であることや特殊な
技術がいらないことや迅速に行うことができる等の特徴
を有した優れた方法である。ラテックスとしては、例え
ば？リステレン、？リビニールトルエン、？リプタジエ
ン等のラテックスが適当でおる（ラテックスにつめては
、例えば、アメリカン・シャーナル・オブ・メディスン
。

２１．８８８〜８９２（１９５６）を参照）。ラテック
スの感作法としては１％ポリスチレンラテックス（粒径
０．１２〜２５μ）に等量の該モノクローナル抗体（１
０〜５０μ？蛋白／−）を３７℃で２〜４時間感作し、
グリシン緩衝食塩液（ＰＨ８，２、以下１’−ＧＢＪと
略称する）で３回洗浄後、０．５％ＢＳＡ加ＧＢで１％
浮遊液として調製する。

Ｍ、ｐの培養液又は臨床検体（咽頭ぬぐい液）と上記抗
体感作ラテックスとをスライドグラス上で反応させ、３
〜５分放置し、そ、７５４Ｊ集像を観察して、陽性か陰
性が判定する。

Ｏ螢光抗体法による同定法 Ｍ−ｐをチャノックらの寒天培地（以１「ｐｐＬＯ寒天
培地」と略称する）上で培養してコロニーを形成させる
。その上に該モノクローナル抗体を含む培養上清を１〜
１００倍に希釈して３７℃で１時間反応させる。ＰＢＳ
にて未反応の抗体を除いた後、フルオレソセイン結合抗
マウス免疫グロブリン（米国カッペル社製を１−１００
０倍、好ましくは１００倍に希釈して３７℃で１時間反
応させた。未反応のフルオレツセイン結合抗マウス免疫
グロブリンをＰＢＳにて洗浄することによって除き、被
検菌の螢光の有無を螢光顕微鏡にて観察した。

その結果、コロニー周囲に特異的に螢光が認められた。

また、螢光抗体法については間接螢光抗体法のみならず
、螢光物質を直接モノクローナル抗体に標識して行う直
接螢光抗体法によって観察を行ってもよい。

螢光抗体法に使用する検体は培誉して形成したコロニー
のみならず、臨床材料やマイコグラズマ感染細胞を用い
て行うことができる。

用いた抗体は粗製したものや精製したものでもよい。

○発育阻止試験による同定 Ｍ、ｐをチャノックらの液体培地（以Ｔ　ｌ’−ＰＰｆ
、０液体培地」と略称する）で培養して菌数が１０４〜
１０５／−となるよう希釈して調製する。この菌液をＰ
ＰＬＯ寒天培地に塗抹して乾燥する。

一方、該モノクローナル抗体の培養液又はその濃縮液（
通常２〜１００倍濃縮液）か精製したものを濾紙ディス
クに２５μｌしみこませる。このディスクを予めＭ、ｐ
を接種しておいた培地上に軽くおしあて、３７℃にて培
養する。

培養３〜７日後、実体顕微鏡にてディスク周辺のコロニ
ーの集落の有無を観察する。コロニーがディスク周辺に
発育していないか、あるいは明らかに発育の抑制が認め
られる。

〈発明の効果〉 本発明のモノクローナル抗体はＭ、ｐに対して特異性が
高く、臨床材料から分離したＭ、ｐと極めて強い反応を
示した。そして、他のマイコプラズマ及びウレアプラズ
マとは反応しなかったため、Ｍ、ｐ感染症の診断を確実
に行うことができ、治療後の経過についても確実に知り
得るのでＭ、ｐ感染症の治療にも応用できる。

従来、マイコプラズマ感染症の診断法としては寒冷血球
凝集反応、間接赤血球凝集試験、　・培養法等が知られ
ていたが、これらの方法には低特異性ないし診断期間が
長期を要する等の欠点ｔ−’ＩＶしていた。しかし、本
発明によるモノクローナル抗体は特異性が極めて高いこ
とから前記した方法を用いれば、Ｍ、ｐの存在を簡便且
つ迅速にしかも正確に知ることができ、優れた診断法を
提供することが可能である。そしてまた、”Ｐの同定法
としても潰れた方法を提供するものである。

〈実施例〉 以下実施例をあげ、本発明を更に詳しく説明する。

実施例１゜ ハイブリドーマの調製法： ］１）抗体産生細胞の調製 ■マイコプラズマ・ニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍ
ａｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ　）　Ｍａｃ株をＰＰＬＯ液体
培地に接種して３７℃で５日間前培養を行った。この培
養液を同培地１０００ｍに接種し、各１００−を５００
−容のルーピンに移して３７℃で５日間静置して培養を
行った。培養後、培養液を捨て、ガラス面に吸着した菌
体を、ＰＢＳを加えてラバー−リスマンにてかき集めた
。この菌液について凍結融解を４回縁シ返し、ＰＢＳで
３回洗浄しＭＰ膜抗原（１）とした。この抗原の蛋白濃
度をローリ−らの方法に準じて測定しえ。（注） ■　同様に、Ｍａｃ株を佐々木らが報告しているＥＹ培
地（卵黄２％含有）に接種して３７℃で５日間前培養を
行った。この培養液を、同培養ｔ１．１ｏｏｏ−に接種
して、３７℃で５日間静置して培養を行った。培養後、
培養液を捨てガラス面に吸着した菌体をＰＢＳを加えて
ラバーホリスマンにてかき集めた。この菌液について凍
結融解を４回行い、ＰＢＳで３回洗浄してＭＰ膜抗原（
２）とした。この抗原についもローリ−らの方法に準じ
て蛋白濃度を求めた。

■　ＭＰ膜抗原（１）（蛋白として１００μを相当）を
そのまま、ＢＡＬＢ／ｃ系雌性マウス（６＝７週令）の
腹腔内に投与した。１週後、同量を腹腔内に追加免疫し
た。更に６週後、ＭＰ膜抗原（２）を同量静脈内に追加
免疫を施した。１〜２週後、血中抗体価が上昇している
ことを確認した後、ＭＰ膜抗原（２）を蛋白として１０
μを相当量を静脈内に投与した。

（注）　　Ｌｏｗｒｙ、　０．　Ｈ，Ｎ、　Ｊ、　Ｒｏ
ｓｅｎｂｒｏｕｇｈ　、Ａ。

Ｌ、　Ｆａｒｒ、　ａｎｄ　Ｒ，Ｊ　、Ｒａｎｄａｌｌ
、　ｌ　９５１　。

Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、１９３　：　２６５−２
７５■最終免疫３日後に膵臓を無菌的に採取した。

採取した牌ｌ藏はピンセットでほぐし、メツシュ（＃１
００）を通過させて細胞浮遊液とした。トリス塩化アン
モニウム緩衝液を１０倍量加えて水冷中２〜３分放置し
て赤血球を除去した。イーグル■×培地（以丁「■Ｍ」
と略称する）にて３回洗浄後５．０Ｘ１０’個／ｒｎｌ
に調製した。

（１１）細胞融合及び抗体産生ハイブリドーマの調製 ■　予め培養しておいたミエローマ細ａ（Ｘ６３−Ａｇ
３．６．５．３）を■■にて３回洗浄した後、５．０Ｘ
１０’個／−に調製した。（１）■で調製した牌細胞５
．０−とミエローマ細胞５、０１ｎ！、を４０−の遠沈
管にと９．１１００　ｒ、ｐ、ｍ。

で、５分間遠心して上清を除去して細胞を集めた。ベレ
ットをよく解きほぐし、予め３７℃に温めておいた５０
％？リエテレングリコール１０００溶液０．５−を約１
〜２分間で徐々に加えた。次に３７℃に保温しておいた
■盃１０−を約２−７分の速度でゆっくりと加えて反応
を停止させた。１１００　ｒ、ｐ、ｍ、で５分間遠心し
て上清を除去した後、１０％牛脂児血清を含むＲＰＭＩ
−１６４０培地を加え、ミエローマ細胞が５．０Ｘ１０
５／−になるように調製し、９６穴マイクロプレートに
２００　μＪ／ｗｅ１１分注した。５％Ｃ０２，３７℃
にてインキュベーターで１日培養した後、培地の半量を
捨てＨＡＴ培地（１０％牛脂児血清を含むＲＰＩＶＩｌ
　−１６４０培地にヒ？キサンチン１．　ＯＸ　１０−
’　Ｍ。

アミノプテリン４．　ＯＸ　１０°７Ｍ、テミゾン１．
６Ｘ　１　（”　Ｍを加えたもの）１００μＥを添加す
る。以後、２〜３日毎に半量をＨＡＴ培地で交換した。

１０〜１４日後、細胞の増殖がみられたら、培地の半量
をＨＴ培地（ＨＡＴ培地からアミノプテリンを除いたも
の）で交換する。

２口径ＨＴ培地で半量交換した後は、２〜３日毎に１０
％牛脂児血清を含むＲＰＭＩ−１６４０培地で交換した
。約２週間後、ＥＬＩＳＡ法及び間■ 接界血球凝集反応（セロディアマイコ　、富士レビオ■
製を使用）によシ抗Ｍ、ｐ抗体産生ハイブリドーマをス
クリーニングした。その結果、融合細胞は１００％のウ
ェルに認められ、そのうち抗体産生が認められたウェル
は６．８％であったが、培養経過後も再現性の認められ
たものは３．７％であった。

■　抗体産生の認められたハイプリドーマは限界希釈法
により、クローニングを行った。即ち、ハイブリドーマ
を６．０個／−に調製し、正常ＢＡＬＢ　／　ｃ系マウ
スの肩線細胞を１０７個／−に調製した液を１＝１に混
合して、９６穴マイクロプレートに２００μｊずつウェ
ルに分注した。３７℃でＣＯ２インキュベーターにて培
養し、約２〜３週後に培養上清中の抗体産生を前記の方
法にて検討した。その結果抗体産生の良好なハイブリド
ーマについては再度クローニングを繰り返した。２回ク
ローニングをして得られたハイブリドーマは、培養上清
中の抗体を得ること及び長期の培養でも安定に産生ずる
ことを確認する目的で、９６穴マイクロプレートから２
４穴マルチプレートに移しかえ、更に５０ゴ組織培養フ
ラスコに移しかえた。その結果、抗体産生は長期の継代
にても安定に産生された。

実施例２　モノクローナル抗体の生産：（培養法） 上記実施例１．で得たハイブリドーマＣ２−Ｇ３、Ｇｌ
−Ｂ８、又はＧ１−Ｅ６を、１０％牛脂児血清、２ｍＭ
グルタミン、５　Ｘ　１０−５Ｍのβ−メルカプトエタ
ノール、５０　ｕｎｉｔ／７のペニシリンＧカリウム及
び５０μｔ／−の硫酸ストレプトマイシンを含むＲＰ■
−１６４０培地に、ｉ、ｏｘｉｏｓ個／　ｍｅになるよ
うに懸濁し、この細胞浮遊液７−を２５−２組織培養用
フラスコ（ファルコン社ｍ　、４３０１３）に分注し、
３７℃で５％炭酸ガスを含む炭酸ガス培養器中で培養を
行った。増殖がほぼ定常に達した４日目に培養上清を採
取した。この時の細胞数は約ＺＯＸＩＯ’個／　ｍｅで
あり、受身赤血球凝集反応（セロディア＝イコ＠の感作
赤血球２５μｊと培養上清又はその希釈液２５μｌを混
和して室温で２時間後の凝集像を観察する）による抗体
価は３２〜１２８倍の力価を示した。

（腹水からの採取） 雌性ＢＡＬＢ　／　ｃ系マウス（６〜・７週）にプリス
タン（２，６，１０，１４−テトラメチルペンタデカン
）を０６５−腹腔内に投与後７〜１０日後、同マウスの
腹腔内に、培養で増殖させたハイブリドーマＣ２−Ｇ３
、Ｇｌ−Ｂ８、又はＧ　１−Ｅ　６を２．ＯＸ１０ｇ個
接種し九０接種後１０〜３０日後に腹水を採取し、遠心
分離（４℃、２５００ｒ、ｐ、ｍ、、１０分間）により
腹水上清を得た。採取された腹水量は約２〜３ゴ／マウ
スであり、培養上清と同様に受身赤血球凝集反応で抗体
価を測定したところ、２５６〜５０００倍の力価を示し
た。

実施例３．　モノクローナル抗体の精製：実施例２に記
載した方法により、ハイブリドーマＣ２−Ｇ３、Ｇｌ−
Ｂ８、又はＧｌ−Ｅ６を、培養して培養上清を得た（　
５０ｍｊ）。

以下にプロティンＡ−セファロースＣＬ−４Ｂ（ファル
マシア社製）による１７１Ｒ法を示す。

まず粗抗体液に飽和硫安液（ｐＨ７，２）を氷水中で冷
却しながら滴下し４５％飽和液とした。この液を４℃で
一晩放置した後、１００００ｒ、ｐ、ｍ、　”？’　１
５分間（日立遠心機２０ＰＲ−５）遠心して沈澱部分を
得た。０．０５　Ｍ　ト＋）ス緩衝食塩液（ｐＨ８，６
）８．０−にて溶解し、４℃で一晩同緩衝液にて透析し
た。透析後、内液を１００００　ｒ、ｐ、ｍ、で１５分
間遠心して不溶部を除いた後、プロティンＡ−セファロ
ースＣＬ−４Ｂ　１．５　ｔ　（ｂｅｄ　ｖｏｌｕｍｅ
　６．０＋Ａ’）　ツカ５ムにのせ、０．０５ＭＩＪス
緩衝食塩液（ｐＨ８，６）にて充分に洗う。次に０．０
５　Ｍクエン酸緩衝食塩液（ｐＨ５，５）　３０ｍｌに
て溶出し、更に０．０５　Ｍ酢酸緩衝食塩液（ｐＨ４，
３）にて各フラクションを１０−ずつとり溶出した。

得られた各フラクションにつき、吸光度（Ｅ２８０　）
を測定すると共に、ＰＨＡ活性を測定した。この結果を
図１に示した。ＰＨＡの活性は０．０５Ｍ酢酸緩衝食塩
／ｇ、（ｐ）（４，３）のフラクションに確認された。

また、ノ・イブリドーマをＢＡＬＢ／Ｃ系マウスの腹水
に接種して得られた腹水についても同様な方法にて精製
を行うことができた。

実施例４゜ 得られたモノクローナル抗体の性質：　　　Ｍ、ｐのン
ニケート膜抗原及び各種マイコプラズマのンニケート膜
抗原を蛋白として１０μ？／−の濃度で１００μｌマイ
クロタイターゾレートにコーティングし、培養上清及び
腹水をＥＬＩＳＡ法によってどの抗原と反応するか測定
した。

その結果、抗マイコプラズマ・ニューモニエに対する特
異反応性を有する前出のＧｌ−Ｅ６、Ｇｌ−Ｂ８及びＣ
２−Ｇ３と名づけた３抗体を得た。これらは臨床分離株
を含む１Ｖ１．ｐに対し、極めて強い反応を示したが、
ウレアプラズマを含む他のマイコプラズマに対しては全
く反応を示さなかった。その結果を表１〜表３に示した
。

以下余白 表２　モノクローナル抗体の特異性と抗体価（培養上清
）１）ＥＬＩＳＡ法：マイコデラズマ膜抗原　１μノ蛋
白／　ｗｅ　ｌ　ｌハ（７’ｌＪ　トー？培髪上清（Ｘ
Ｉ　）　１００μｌ／ｗｅｌｌ測定波長　　　　　４０
５ｎｍ ２）ＰＨＡ　　　：受身赤血球凝集反応３）ＣＦ　　　
：補体結合反応 ＊Ｍｙｃｏ、：Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａの略また、マイコ
ゾラズマ感染Ｖｅｒｏ（サル腎株化）細胞およびＪ７７
４−１（マウスマクロファージ株化）細胞をアセトン固
定し、モノクローナル抗体を３７℃で３０分反応させ、
フルオレツセイン（ＦＩＴＣ）　標識抗マウスＩｇ（４
体を３７℃で３０分反応後、螢光顕微説にて観察したと
ころ、Ｍ、ｐ　（Ｍａｃ休および臨床分離株）感染細胞
周辺に特異螢光が認められた。

一方、他のマイコゾラズマを感染させた細胞には特異螢
光は認められなかった。この結果を表４に示す。

以下余白 表４　螢光抗体間接法を用いたモノクローナル抗体によ
るマイコゾラズマ感染細胞 の検出 実施例５゜ モノクローナル抗体のクラス・サブクラス：培養上清を
そのままか又は５０％飽和硫安で塩析後濃縮し、これを
オクタロニ−（Ｏｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ）法にかけ、ク
ラス・サブクラスを検討した。

尚、抗マウスＩｇＧｔ、ＩｇＧｚａｓ　ＩｇＧｚｂ、　
ＩｇＧｓ、ＩｇＭ及びＩｇＡ抗体はマイルス社のものを
使用した。

その結果、得られた抗体３種類はいずれもＩ　ｇＧ、で
あることが確認された。この結果を表５に示した。

表５　モノクローナル抗体のクラス・サブクラス オフタロニー法 実施例６．　モノクローナル抗体の利用：直接治療に結
びつく迅速診断法の開発を目的として、Ｍ、ｐｗ異的モ
ノクローナル抗体（ＭｏＡｂ　）を用いたラテックス凝
集反応（ＬＸ法）による同定および検体中の抗原検出に
ついて検討した。このＬＸ法は特別な機器も特殊な技術
も必要とせず、どこでも誰でも簡便に分単位で迅速に行
うことがでさ、古くよりある方法ではあるが、近年性に
見直されている方法である。

く材料および方法〉 抗原：Ｍ、ｐとしてＭａ　ｃ株、臨床分離株４５株、Ｍ
、ｐ以外のマイコゾラズマとして、Ｍ・５ａｌｉ　−ｖ
ａｌｉｕｍ、　Ｍ、　ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ、　Ｍ、　
ｈｏｍｉｎｉｓ（ＰＧ−２１株）　、　Ｍ、　ｏｒａｌ
ｅ、　Ｍ、　ｂｕｃｃａｌｅ、　Ｍ。

ｐｕｌｍｏｎｉｓ、　Ｍ、　ａｒｇｉｎｉｎｉ　（ｌＩ
Ｄ９０６　）オヨび患者の咽頭ぬぐい液１３検体を用い
た。

ラテックス凝集反応＝１％？リステレン２テックス（径
０．２２μｍ、ダウ・ケミカル社！！りに等量のモノク
ローナル抗体（１０μ９／ｌａｇラテックス）を３７℃
で２時間路作し、ＧＢで３回洗浄後、０．５％ＢＳＡ加
ＧＢで１％浮遊液として保存した。

臨床分離株の同定：　ＭｏＡｂ感作ラテックスのスライ
ド凝集反応による臨床分離株の同定試験を行った結果、
４５株中４５株（１００％）が陽性であった。

検体（咽頭ぬぐい液）中の抗原検出率：Ｍ、ｐ分離陽性
検体１００％（８／８検体）、Ｍ、ｐ分離陰性検体０％
（０１５検体） く結　果〉 抗Ｍ、ｐモノクローナル抗体を用いたラテックス凝集反
応によるＭ、ｐ迅速診断法について検討した結果、木矢
はＭ、ｐ迅速診断に極めて有用と判断される。

実施例７．　螢光抗体法による同定法：（１）　　Ｍ−
ｐ感染症が凝われる患者から咽頭ぬぐい液を採取し、Ｐ
ＰＬＯ寒天培地に塗抹し３７℃で１０日間培養してコロ
ニーが形成された。その上に該モノクローナル抗体を含
む培養上清を１〜１００倍に希釈して、３７℃で１時間
反応させる。ＰＢＳにて未反応の抗体を充分に除いた後
、フルオレツセイン（ＦＩＴＣ）結合抗マウスイムノグ
ロブリン（カッペル社製）を１００倍に希釈して３７℃
で１時間反応させた。未反応のＦＩＴＣ結合抗マウスイ
ムノグロブリンをＰＢＳにて洗浄することによって除き
、被検菌の螢光の有無を螢光顕微鏡にて観察した結果、
コロニー周囲に特異的な螢光が認められた。また、被検
菌を別のプレート上にコロニーを形成させ、０，３％ニ
ワトリ血球浮遊液をかけ室温で３０分間放置後、生理穴
塩水にて３回洗浄して実体′ａ微鏡で観察すると血球の
コロニーへの吸着１象がみられた。また、被検菌をＰＰ
ＬＯ９体培地で培養したところ、グルコースを分解して
フェノールレッドの色調を桃色から黄色に変え、アルギ
ニンは分解しなかった。

実施例８．　発育阻止試験による同定：Ｍ、ｐ　Ｍａｃ
株をＰＰＬＯ液体培地で培養し、菌数が５．０Ｘ１０４
／−となるよう希釈した。この菌液をＰＰＬＯ寒天培地
に塗抹して乾燥した。

一方、ハイプリドーマの培養上１（Ｇｌ−Ｂ８を、濾紙
ディスクに２５μｌしみこませる。このディスクを予め
＋Ｖ１．ｐを接種した上記培地に軽くおしあて３７℃に
て培養した。７日後のディスク周辺を実体顕微鏡で観察
すると、Ｍ、ｐのコロニー形成が抑制されていた。

【図面の簡単な説明】

図１は、本発明で用いるモノクローナル抗体の精製を示
す図面である。 以上

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、マイコプラズマ・ニューモニエで免疫した哺乳動物
   の抗体産生細胞と哺乳動物の骨髄腫細胞との融合細胞に
   よって産生され、マイコプラズマ・ニューモニエに特異
   反応性を有することを特徴とする抗マイコプラズマ・ニ
   ューモニエモノクローナル抗体。 ２、哺乳動物の免疫を、マイコプラズマ・ニューモニエ
   を組成の異なる複数の培地で培養して得た複数の免疫原
   で順次行う特許請求の範囲第１項記載のモノクローナル
   抗体。 ３、組成の異なる培地でマイコプラズマ・ニューモニエ
   を培養して得た複数の免疫原により順次免疫した哺乳動
   物の抗体産生細胞と哺乳動物の骨髄腫細胞との融合細胞
   を培地中で培養するかあるいは哺乳動物に投与して増殖
   し、その培地上清又は腹水からマイコプラズマ・ニュー
   モニエに特異反応性を有するモノクローナル抗体を分離
   することを特徴とする抗マイコプラズマ・ニューモニエ
   モノクローナル抗体の製造法。 ４、組成の異なる培地でマイコプラズマ・ニューモニエ
   を培養して得た複数の免疫原により順次免疫した哺乳動
   物の抗体産生細胞と哺乳動物の骨髄腫細胞との融合細胞
   から分泌されるモノクローナル抗体の一種又はそれ以上
   を含有するマイコプラズマ・ニューモニエの同定用及び
   診断用試薬。 ５、担体又は希釈剤を含有することを特徴とする特許請
   求の範囲第４項に記載の試薬。 ６、該抗体に酵素、螢光色素、放射活性物質を直接又は
   二次的に結合させた特許請求の範囲第４項又は第５項記
   載の試薬。 ７、該抗体をラテックス、カオリン又は動物の赤血球に
   感作して調製した試薬とマイコプラズマ・ニューモニエ
   を含む検体とを接触させ、その際に起こる凝集反応を利
   用する特許請求の範囲第４項又は第５項記載の試薬。