JPS63298A - イムノブロツトによる抗原の直接同時アツセイ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ この発明は、異る複数の疾患の病因体（ｅｔｉｏｌｏｇ
ｉｃａｇｅｎ　ｔ）に対する複数のモノクローナル抗体
を導入することにより、ウェスタンとして知られている
イムノブロット試験の診断的用途を拡大する。この発明
は、１つのアッセイにおける、微生物からの種々の抗原
の同時的検出を提供する。従って、この発明は、１つの
臨床検体からの複数の病因体の分別診断のための非常に
改良された方法を提供し、この分別診断は複数のアッセ
イではなく１つのアッセイにおいて行われる点において
改良がなされている。

この発明はまた、約４３キロダルトン（Ｋ）の分子量の
マイコプラズマ・ニューモニア（ｂ忽鮭旦ユ　ｐ剪虹並
）膜ポリペプチド上のプロテアーゼ感受性で過ヨウ素酸
塩非惑受性のエピトープに結合するネズミＩｇＧ１モノ
クローナル抗体に関する。この発明はまた特に、イムノ
ブロット分析（ウェスタン）においてこのモノクローナ
ル抗体を使用してＭ、ニューモニア（Ｌ匹赳柱旦並）を
検出する診断的方法に関する。

〔従来の技術〕

Ｔｏｗｂｉｎ等（文献１１　、１４　、１６）及びＢｉ
ｔｔｅｒ等（文献１５）はウェスタン・イムノブロット
・アッセイ（Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｔｍｍｕｎｏｂｌｏｔ　
ａｓｓａｙ）技法の一般的背景を与えている。Ｔｏｗｂ
ｉｎ等、米国特許（文献１４）及びＥｒ１ｉｃｈ等の英
国特許隘００５０４２４はポリクローナル抗体を用いて
抗原を検出するためのウェスタン・イムノブロットの診
断的使用を記載している。

ｒＥｒｌｉｃｈ等の英国特許及びＴｏｗｂ　ｉ　ｎ等の
米国特許のいずれも異る複数の抗原の同時的アッセイの
ためのウェスタン・イムノブロットの使用を教示してい
ないのみならず、ウェスタン・イムノブロットへのモノ
クローナル抗体の導入も記載していない。

ＭｃＭｉｃｈａｅｌ等（文献１７）はポリクローナル抗
体を使用して肝炎８表面抗原を検出するためのイムノブ
ロット（ウェスタン）アッセイを記載している。Ｇａ１
ｌｏ等（米国特許Ｎａ　４，５２０，１１３）は、ウェ
スタン・プロット技法を基礎にするストリップラジオイ
ムノアッセイ　（ＲＩＡ）により又はエンザイムリンク
ド・イムノソルベント・アッセイ（ＥＬＩＳＡ）により
、ＡＩＤＳ（Ａｃｑｕｉｒｅｄ　Ｉｍｍｕｎ　Ｄｅｆｉ
ｃｉｅｎｃｙＳｙｎｄｒｏｍｅ　：後天性免疫不全症候
群）又は前−ＡＩＤＳを有する患者の血清中のＨＴＬＶ
−ＤＩウィイルスに対する抗体を検出した。Ｇａ１ｌｏ
等は、偽陽性試験結果として記録されるであろうＥＬＩ
ＳＡ試験における非特異的結合を除去するためにイムノ
ブロア）（ウェスタン）アッセイを使用した。本発明の
診断的方法は、臨床検体中の抗原を直接検出するために
イムノブロット　（ウェスタン）アッセイを使用する点
及びポリクローナル抗体ではなくモノクローナル抗体を
使用する点において前記の方法と区別される。

モノクローナル抗体の使用は、多くのポリペプチド及び
種々の抗原を含有する臨床検体を試験することができる
という利点をもたらす。この様な検体を試験するための
ウェスタン・イムノブロットにおけるポリクローナル抗
体の使用は過剰なバックグラウンド、すなわち非特異的
検体ポリペプチド及び多数の病原体特異的抗原へのポリ
クローナル抗体の非特異的結合、をもたらす。ポリクロ
ーナル抗体のこの様な交差反応性は、正確な診断のため
には不明瞭過ぎるあいまいな試験結果をもたらす。これ
に対して、特定のエピトープに対するモノクローナル抗
体のウェスタン・イムノブロットにおける使用は、バッ
クグラウンド染色から容易に識別することができる明瞭
なバンドをもたらす。すなわち、診断的ウェスタン・イ
ムノブロットにおいてモノクローナル抗体を用いること
により、精製されているか、部分的に精製されているか
又は培養された感染性疾患生物ではなく臣ｎ床検体を使
用することができる点において、従来技術に対する明ら
かな改良が得られる。

さらに、モノクローナル抗体を導入したイムノブロット
・アッセイは効率的である。この様なアッセイは後で記
載する様に臨床検体について直接実施することができる
のみならず、プレキャストミニゲル（１００鰭Ｘ８０ｕ
）を用いる場合５時間以内に完了することができる。

ラジオイムノアッセイ及び醍素イムノアフセイのための
同時的イムノアッセイが記載されている。

Ｍ、Ｋｕｒｉｙａｍａ等（文献２１）はヒト前立腺特異
的起原の２種類の蛋白質、すなわち前立腺酸性ホスファ
ターゼ及び前立腺抗原、の存在を検出するために組織特
異的マーカーの組合せ試験を使用する利点を記載してい
る。しかしながら、Ｋｕｒｉｙａｍａ等は１つの同時的
方法により２種類の抗原を検出したのではなく、各抗原
の別々の測定の結果を組合わせた。

Ｍｉｔｓｕｍａ等（１９７２）　（文献２２）、Ｌｊ　
ｕｎｇｇｒｅｎ等（文献２３）、及びＨａｙｎｅｓ等（
文献２４）は、わずか８日間の半減期を有する＋３１１
を含む２種類の異るヨウ素アイソトープによる抗原の標
識により１個のチューブ中の１種類より多くの成分を測
定するために間接的競争ラジオイムノアッセイを使用し
た。Ｖｉｈｋｏ等（文献２５）は、小試験管の異る切片
に２種類のタイプの抗体を画定化し、そしてこれらを連
結して１個の多成分試験管を形成することを開示してい
る。ハブテンが１２ＳＴにより標識され、この標識が間
接ヲジオイムノアソセイにより検出される。この方法は
固相キャリヤーの分離を含む比較的複雑な手順を用いる
。

Ｆｒ１ｄｌｅｎｄｅｒ等の米国特許１１ｍ　４，３１５
，９０７及びＧｅｈｌｅ等（文献２９）は、別々に分離
され得る各抗原に対応する同相結合剤及び各抗原のため
の標識された結合剤を用いて複数の抗原を測定するため
の特異的結合アッセイを記載している。各同相結合種は
インキュベーションの後他のすべての種から分離される
。

Ｂｌａｋｅ等（文献２８）は２種類の甲状腺ホルモンの
同時的エンダイム・イムノアッセイを記載しており、こ
の方法はそれが安定であり且つ容易な分別測定を可能に
する点においてラジオアイソトープに卓越する利点を有
する。酵素は吸着分光光度法により相互に容易に区別す
ることができる生成功を生成せしめる。Ｂｌａｋｅ等は
両抗原を検出するために単一のアッセイ化合物ではなく
、２個の別個の固体担体上に固定化された２種類の抗体
を使用した。

１９８６年１１月２６日に許可された南アフリカ特許１
ｋ８５／２５７４は、１種類より多くの抗原、最も好ま
しくは前立腺抗原及び前立腺酸性ホスファターゼを同時
に検出するための改良された方法を開示している。試験
液体中のすべての抗原を検出するために単一の免疫アッ
セイ材料が使用される。すなわち、測定のためのアッセ
イ混合物中に使用されるべき接合体の量の最適化が単純
化される。さらに、このアッセイにおいては間接的競争
イムノアッセイとは異り測定が直接的である。

しかしながら、ラジオイムノアッセイ及びエンザイム・
イムノアッセイのために記載された上記の同時的イムノ
アッセイはすべて、検出される各特定の抗体のために異
る標識（酵素的又は放射性）を必要とする。さらに、こ
れらのアッセイは一般に２種類の、そして多くても可能
性として３種類の抗原の検出に限定される。本発明の同
時的検出系の大きな利点は、提供される時間効率及び臨
床検体を直接試験できる可能性のみならず、種々の抗原
を同時にアッセイする系の能力である。

同時的検出系において特に肺炎の分別診断のために又は
マイコプラズマ・ニューモニア（ｂ並鮭旦懸Ｐｎｅｕｍ
ｏｎ　１ａｅ）　　ＣＭ　、ニューモニア（Ｌｐ＝匹剪
旦並）〕を直接検出するために単独で使用され得る例示
的モノクローナル抗体は、４３にのＭ、ニューモニア膜
ポリペプチド上のプロテアーゼ感受性で過ヨウ素酸塩不
惑受性のエピトープに結合するネズミＩ　ｇＧｌである
。この様なエピトープはすべての試験された臨床的Ｍ、
ニューモニア単離株中に存在するが、正常な画用のマイ
コプラズマ種又はヒトの呼吸器中に見出される他の生物
中には見出されなかった。

マイコプラズマ・ニューモニアは、一般に気管気管支炎
、異型肺炎（ａｔｙｐｉｃａｌ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）
及び咽頭炎を惹起するヒト呼吸器病原体である。

（Ｃａｓｓｅｌ、Ｇ、Ｈ，及びＢ、Ｃ，Ｃｏ１ｅ＋１９
８１＋Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａａｓ　ａｇｅｎｔｓ　ｏｆ
　ｈｕｎａｎ　ｄｉｓｅａｓｅ、　　Ｎ、Ｅｎｇｌ、Ｊ
、Ｍｅｄ、３０４：８０−８９　；　　Ｃ１ｙｄｅ、Ｗ
、Ａ、Ｊｒ、、１９７９．　勺μ狙ＤｌｕＬ組匹１並１
ｎｆｅｃｔｉｏｎｓ　ｉｎ　ｍａｎ、　２７５−３０６
頁、Ｊ、Ｇ、Ｔｕｌｌｙ及びＲ，Ｆ、Ｗｈｉｔｃｏｍｂ
ｍ、Ｔｈｅ　Ｍｙｃｏｌａｓｍａｓ。

Ｖｏｌ　　２、アカデミツクプレス、ニューヨーク。〕
Ｍ、ニューモニアはまた、神経疾患、多形性紅疹、水庖
性鼓膜炎、神経性貧血、心筋炎及び心膜炎にも関与する
。（Ｌｅｖｉｎｅ、　Ｄ、Ｐ、、及びＡ、Ｍ、Ｌｅｖｎ
ｅｒ。

１９７８、　Ｔｈｅ　ｃｌｉｎｉｃａｌ　ｓｐｅｃｔｒ
ｕｍ　ｏｆ　　ｂ印旦姪旦り赳赳１並　感染、Ｍｅｄ、
Ｃｌ１ｎ、　Ｎｏｒｔｈ　Ａｍ、６２：９６１−９７８
；Ｍｕｒｒａｙ、　Ｈ，Ｗ、、Ｈ，Ｍａｓｕｒ、Ｌ、Ｂ
、５ｅｎｔｅｒｆｉｔ、及びＲ，Ｂ、Ｂｏｂｅｒｔｓ、
１９７５．Ｔｈｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｍａｎｉｆｅｓｆ
ａｔｉｏｎｓｏｆ　ｂ刈鮭且懸り些懸虹並１ｎｆｅｃｔ
ｉｏｎ　ｉｎ　ａｄｕｌｔｓ。

Ａｍ、Ｊ、Ｍｅｄ、　５８　：　２２９−２４２　　；
並びにＰｏｎｋａ、　Ａ、１９７９＋Ｔｈｅ　ｏｃｃｕ
ｒｒｅｎｃｅ　ａｎｄ　ｃｌｉｎｉｃａｌ　ｐｉｃｔｕ
ｒｅ　ｏｆｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ　ｖｅｒｉｆｉ
ｅｄ　　ｐ　　７ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ　ｗｉｔｈ　ｅ
ｍｐｈａｓｉｓ　ｏｎ　ｃｅｎｔｒａｌ　ｎｅｒｖｏｕ
ｓｓｙｓｔｅｍ、　ｃａｒｄｉａｃ　ａｎｄ　ｊｏｉｎ
ｔ　ｍａｎｉｆｅｓｔａｔｉｏｎｓ、、Ａｎｎ。

Ｃｌ１ｎ、Ｒｅｓ、５ｕｐｐｌ　２４：１−６０゜〕出
現率は子供及び若い成人の間で最高である［Ｆｏｙ、Ｈ
，Ｍ、＋Ｇ、Ｆ、Ｋｅｎｎｙ。

Ｍ、　Ｆ　、　Ｃｏｎｎｅｙ　％及び１．Ｐ、Ａ１１ｅ
ｎ、１９７９．Ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍｅｐｉｄｅｍｉｏｌ
ｏｇｙ　ｏｆ　　ｉｎｆｅｃｔｉｏｎＳｗｉｔｈ　　　
ｐ匹些肌虹憇、Ｊ、Ｉｎｆｅｃｔ　Ｄｉｓ、　１３９　
：　６８１−６８７　　；並びにＦｏｙ、　Ｈ，Ｍ、及
び１．Ｄ、Ａｌ］ｅｎ＋１９８２．Ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ
　ｏｆ５且圧ハμ臆　肛ｌ徂邦■狙肺炎、Ｌａｎｃｅｔ
　ｘｘ：３９２　）が、Ｍ、ニューモニアの感染はすべ
ての年令グループにおいて観察されている（Ｍｕｒｒａ
ｙ　Ｉｌ、Ｗ、等、前掲；及びＰｏｎｋａ、Ａ、、前掲
）、Ｍ、ニューモニアの感染においてテトラサイクリン
又はエリスロマイシン療法が効果的であることが示され
ている。

（Ｄｅａｎ、Ｎ、Ｉ、、、１９８１　Ｍｙｃｏｐｌａｓ
ｍａｌ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ　１ｎｔｈｅ　ｃｏｍｍ
ｕｎｉｔｙ　ｈｏｓｐｉｔａｌ、Ｃｌ１ｎ、Ｃｈｅｓｔ
、Ｍｅｄ、　２　：１２１−１３１　　（文献１）；並
びにＳｈａｍｅｓ、Ｊ、Ｍ、、Ｒ，Ｉ’ｌ。

Ｇｅｏｒｇｅ、及び−、Ｂ、Ｈｏ１１ｉｄａｙ＋１９７
０．Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｍ　ｏｆａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ
ｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｔｒｅａｔａ＋ｅｎｔ　ｏｆ　ｍｙ
ｃｏｐｌａｓｍａｌｐｎｅｕｍｏｎｉａ、Ａｒｃｈ、Ｉ
ｎＬｅｒｎ、Ｍｅｄ、　１２５　：　６８０−６８４　
ｏ　）臨床症状は診断を支持するが、しかしこれらはウ
ィルス感染、グループＡストレプトコッカス感染又は他
の細菌性呼吸器感染による症状と区別できない。（Ｃ１
ｙｄｅ、Ｗ、Ａ、Ｊｒ、、前掲。）最近、生物の培養物
の単離又は急性及び回復期の対の血清の間の特異抗体の
４倍の上昇により決定的な診断が示される。（Ｃ１ｙｄ
ｅ同上。）結果は１〜３週間を必要とし、そして事後に
情報が得られるが、最初の療法の指針としては有用では
ない。さらに、多くの検体について、正常画用の細菌の
一層速い増殖により培地が覆われるために培養結果を得
ることができない。（Ｔｕｌｌｙ、Ｊ、Ｇ、、ＲＦ、Ｗ
ｌｉｔｃｏｍｂ及びＴ、Ｆ、Ｃ１ａｒｋ、１９７７、　
Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ　ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｓ　：ｃ
ｕｌｔｉｖａＨｏｎ　ａｎｄ　ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ　
ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ　ｏｆａ　ｎｅｗ　ｓｐｉ
ｒｏｐｌａｓｍｄ、　５ｃｉｅｎｃｅ、　１９５　　：
　８９２−８９４）。

Ｍ、ニューモニア感染についての今日の血清学的診断法
は、コールド・ヘマグルチニンについての試験（Ｉ　ｇ
Ｍ抗−Ｉｇ抗体）　　（Ｇｒｉｆｆｉｎ、＾ｎ。

Ｉｎｔｅｒｎ、Ｍｅｄ、　７０　：　７０１（１９６７
）　）及び補体固定によるＭ９ニューモニア特異抗体の
試験（Ｋｅｎｎｙ等、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、９５　：　
１９（１９６５））　、酵素イムノアッセイ（Ｂｕｓｏ
ｌｏ等、Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｍｉｃｒｏ、　１２　：　６９
（１９８０）　；Ｄｕｓｓｄｉｘ等、Ｊ、Ｃｌ１ｎ、　
３６　：　２２８　（１９８３））及び間接蛍光イムノ
アッセイ（Ｕｍｅｔｓｕ等、Ｔｏｈｏｋ　Ｊ、Ｅｘｐ。

Ｍｅｄ、　１１６　：　２１３　（１９７５））を含む
。喀痰又は咽喉綿棒からのＭ、ニューモニアの単離は決
定的情報を提供するが、結果を得るまでに７日〜３週間
を要する。今日の診断法は、これらの感染における療法
に指針を与えるのに十分に迅速に実施され得ないので、
迅速診断試験は非常に有用であろう。

臨床検体中のＭ、ニューモニア抗原の直接検出が、ポリ
クローナル抗体を用いてカウンター免疫電気泳動により
（Ｗｉｅｒｎｉｋ等、５ｃａｎｄ、Ｊ、　Ｔｎｆ、Ｄｉ
ｓ。

１０　：　１７３−１７６（１９７８）　）及び蛍光抗
体測定（Ｂａｙｅｒ等、Ａｎａｌ、ｏｆ　ｒｎｆ、Ｍｅ
ｄ、９４　：　１５（１９８０）　；　Ｈｅｒｓ、Ａｍ
。

Ｒｅｖ、Ｒｅ５ｐ、Ｄｉｓ、　８８　：　３１６（１９
８３）　（文献５）〕により試みられているが、あまり
成功していない。Ｍ。

ニューモニア抗原を検出するための酵素イムノアッセイ
が報告されている（Ｈｅｌｂｉｇ、Ｊ、Ｈ，及び−。

Ｗｉｔｚｌｅｂ、、１９８４．Ｅｎｚｙｍｅ−１ｉｎｋ
ｅｄ　ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔａｓｓａｙ（ＥＬＩ
ＳＡ）、Ｚｕｍ　Ａｎｔｉｇｅｎｎａｃｈ　ｗｅｉｓ　
ｖｏｎムリ鮭粒懸肌肥赳ｎＬ、Ｚ４ｅｓ、Ｈｙｇ、　３
０　：　１０６−１０７；並びにＭ、Ｅ、Ｊａｃｏｂｓ
及びＷ、Ｂｒｅｄｔ、１９８２．Ｒｅ１ｅａｓｅ　ｏｆ
ｈ並鮭且懸り赳赳１並５ｕｂｓｔａｎｃｅｓ　ａｆｔｅ
ｒｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ　　ｂｙ　ｇｕｎｅａ　ｐ
ｉｇ　ａｌｖｅｏｌａｒ　ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ、。

Ｉｎｆｅｃｔ、Ｉｍｍｕｎ、　３６　：　３５７−３６
２　）が、しかし臨床検体については試験されていない
。

Ｍ、ニューモニア全体生物に対するモノクローナル抗体
（Ｂｕｃｋ、Ｄ、Ｗ、、Ｒ，Ｈ，Ｋｅｎｎｅｔｔ　％及
びＧ。

ＭｃＧａｒｒｉｔｙ、１９８２　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ
　ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　５ｐｅｃｉｆｉｃｆｏｒ　ｃ
ｅｌｊｃｕｌｔｕｒｅ　ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｓ、Ｉｎ
　Ｖｉｔｒｏ、１８　：３７７−３８１　）　、表面付
着蛋白￥（ｐｔに対するモノクローナル抗体（Ｆｅｌｄ
ｎｅｒ等、１９Ｂ２．Ｎａｔｕｒｅ　　２９８　ニア６
５−７６７　；　Ｈｕ等、１９８１．Ｉｄｅｎｔｉｆｉ
ｃａｔｉｏｎ　ｏｆｉｍｍｕｎｏｇｅｎｓ　ｏｆ　ｐ　
　胚匹肌旦ａｅ　ｂｙｐｒｏｔｅｉｎ　ｂｌｏｔｔｉｎ
ｇ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｍ
ｍｕｎ。

１０３　：　１９６３−１３７０）　、及び脂質抗原に
対するモノクローナル抗体（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ−Ｐｌｕ
ｍｍｅｒ、　ＪｌＤ、Ｈ，Ｊｏｎｅｓ及びＪ、Ｂ、Ｂａ
ｓｅｍａｎ＋　１９８３＋八ｍ　ＥＬＩＳＡ　ｔｏ　ｄ
ｅｔｅｃｔｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　ａｎｔｉｂｏｄｉｅ
ｓ　５ｐｅｃｉｆｉｃ　ｆｏｒ　ｌｉｐｉｄｄｅｔｅｒ
ｍｉｎａｎｔｓ　ｏｆ　ｈ匹紅且旦り並凹紅並、　Ｊ。

Ｉｍｍｕｎｏｌ、Ｍｅｔｈ、６４　　：　１６５−１７
８　］がすでに記載されているが、これらの診断的使用
はまだ報告されていない。

４３にポリペプチドは、マイコプラズマの膜の全乾燥重
量の５０％以上を占める多数の膜ポリペプチドの１つで
あると考えられ一４ｐ゛（Ｒａｚｉｎ、Ｓ、１９７９゜
Ｍｅｍｂｒａｎｅ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ、２８９−３２２
頁、Ｍ、Ｆ、Ｂａｒｉｌｅ及びＳ、Ｒａｚｉｎ　５、Ｔ
ｈｅ　Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｓ、Ｖｏｌ　　ｌ、アカデ
ミツクプレス、ニューヨーク〕、そしてイムノブロット
パターンによる推定ではこの生物の抗原成分の１つであ
る。これは、本発明者等及び他の研究者（Ｈｕ等、Ｂｉ
ｏｃｈｅｓ＋、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍｕｎ
、　１０３　＋１３６３−１３７０（１９８１）　；並
びにＫｅｎｎｙ、Ｇ、Ｅ、及びＦ、Ｄ。

Ｃａｒｔｗｒｉｇｈｔ、　１９８４＋　Ｉｍｍｕｎｏｂ
ｌｏｔｔｉｎｇ　ｆｏｒｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　
ｏｆ　ｔｈｅ　ａｎｔｉｇｅｎｉｃ　５ｐｅｃｉｆｉｃ
ｉｔｉｅｓｏｆ　ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ｏｆ　ｔｈｅ
　　Ｍ　ｃｏ　Ｉａｓｍａｔａｌｅｓ、、　Ｉｓｒ。

Ｊ、Ｍｅｄ、Ｓｃｉ、２０　：　９０Ｂ−９１１）によ
り観察されたものである。しかしながら、これらの他の
研究者はいずれも、約４３にの抗原として抗原を命名せ
ず又は記載していない。Ｋａｈａｎｅ等（Ｉｎｆ、ａｎ
ｄ　ｆｍｕｎ。

Ｖｏｌ　５０　、　Ｎｎ　３　：　９４４−９４６（１
９８５）　）は４１Ｋ及び４２に抗原を命名しているが
、しかしこれらの抗原又はこれらの抗原に対するモノク
ローナル抗体を診断に使用することを示唆していない。

（本発明の記載） この発明は、広い意味で、臨床検体中の特定の抗原を検
出するためのウェスタン・イムノブロット・アッセイに
おけるモノクローナル抗体の使用に関する。この様なア
ッセイは、約４３にの分子量およプロテアーゼ感受性で
過ヨウ素酸非感受性のエピトープを有するものとして定
義される特定のマイコプラズマ・ニューモニア膜ポリペ
プチドに結合するネズミＩｇＧ１モノクローナル抗体の
使用によってこの明細書において例示される。

この発明はさらに、検出されるべき各抗原に対するモノ
クローナル抗体をアッセイ系に導入することにより単一
のウェスタン・イムノブロット・ア・ノセイにおいて種
々の抗原を同時に検出することができる方法を提供する
。現在一般に使用されているウェスタンイムノブロット
ゲルの物理的寸法のため、検出されるべき抗原の好まし
い数は２〜１０であり、最も好ましくは２〜８抗原であ
る。

モノクローナル抗体がそれに向けられている抗原の分子
量に依存して、試験結果においてバンドを識別するため
に適当な間隔の分離を適切にもたらす様に分離ゲルを選
択する。当業者は、アッセイにおいて使用するモノクロ
ーナル抗体の特定のパネルに従って適当なグラジェント
ゲル又はパーセントゲルを選択することができよう。経
験則として、低分子量抗原に向けられた一連のモノクロ
ーナル抗体のために高パーセントゲルが使用されよう。

例えば、１０％アクリルアミドゲルは、２５により低分
子量の抗原を分離するには十分でないであろう。この様
な状況では、より高いパーセントゲル、例えば１２％又
は１４％ゲルを使用することが必要であろう。

この発明はまた分別診断法に関する。この方法は、（ａ
）診断のもとで患者により示される臣ｎ床症状の１つの
可能性ある病因体についてそれぞれが診断的であるモノ
クローナル抗体の適切なバふルを選択する段階、（ｂ）
これらのモノクローナル抗体をウェスタン・イムノブロ
ット・アッセイにおいて使用して前記患者の一つの臨床
検体を試験する段階、及び（Ｃ）前記病原体からの標的
抗原の分子量に対応する試験結果中の特定のバンドの存
在又は不存在を試験することによりイムノブロットにお
いて試験された病因体を診断し又は排除する段階を含ん
で成る。

さらに、この発明はマイコプラズマ・ニューモニア、レ
ジオネラ・ニューモフイラ（匡旦匹１ハ稈徂ｖ遼助土肋
−）、及び／又はクラミジア・プシッタシー坦坦１ジ止
櫨　匹旦圏虱）及びクラミジア・トラコマチスー匹が１
町止ｉａ　　ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）の存在を検出す
るための特異的分別診断法に関する。

この発明はまた、ウェスタン・イムノブロットにおいて
使用するための、特定の病原体の抗原に対するモノクロ
ーナル抗体を含んでなる診断キットに関する。この診断
キットはまた指示系及びこの発明のアッセイを実施する
ために当業者が使用することができる他の成分をも含む
ことができる。

この発明はまた、クラミジア（Ｃｌａｍｙｄｉａ）　、
すなわちそのトラコマチス種又はプシッタシ種について
診断的な５に属特異的抗原に対するモノクローナル抗体
又はレジオネラ・ニューモフィラに対して診断的な２９
に抗原に対するモノクローナル抗体のウェスタン・イム
ノブロットにおける使用に関する。これらの抗原の両分
子量は当業者により知られている方法によって概算され
る。

代替的な又は改良された酵素検出系は、培養法に比べて
本発明のアッセイ系の感度を上昇せしめることができた
。下記の例においては、酵素検出系、特に、ビオチン化
抗−マウスｆｇＧ及びアビジン−ビオチン−パーオキシ
ダーゼ複合体を色原体としての３．３′−ジアミノベン
ジジンと共に用いるが、他の任意の酵素検出系も有効で
あることが当業者により認識されるであろう。さらに、
蛍光標識又は放射性標識を使用することもできる。

さらに、この発明において使用される種特異的モノクロ
ーナル抗体はまた、直接検出系のためにそれ自体標識さ
れていてもよい。さらに、検出系のために標識されたス
タフィロコッカス（針並社（５）−ｃｏｃｃｕｓ）プロ
ティンＡを使用することもできる。

この発明はまた、４３キロダルトン（Ｋ）の分子量を有
するマイコプラズマ・ニューモニア膜ポリペプチド上の
プロテアーゼ感受性で過ヨウ素酸塩非感受性のエピトー
プに結合するネズミＩｇＧ１モノクローナル抗体に関す
る。ポリペプチドＧこ与えられる分子量は記載される数
値の±５％内にあると当業界において理解される。イム
ノブロット分析（ウェスタン）の際、４３にポリペプチ
ドがＭ、ニューモニアの主要抗原成分として機能した。

Ｍ、ニューモニア種特異的モノクローナル抗体（ＭＡｂ
）並びにエンザイム・リンクド・イムノアッセイ　（Ｅ
ＩＡ）、免疫染色アッセイ及びイムノブロットアッセイ
におけるその反応性をこの明細書において記載する。モ
ノクローナル抗体はＭ、ニューモニアの２９の異る単離
体と反応したが正常画用のマイコプラズマ種又はやはり
正常なもしくは疾患を有するヒトの呼吸器に生息するこ
とができる１８の他の微生物とは反応しなかった。

この発明はさらに、イムノブロット分析（ウェスタン）
において前記モノクローナル抗体を使用してＭ、ニュー
モニアを検出するための診断的方法に関する。イムノブ
ロット・アッセイにおいてＭ、ニューモニア種特異的モ
ノクローナル抗体を用いて、異型肺炎を有する患者から
の喀痰検体及び咽頭炎を有する患者からの咽喉綿棒を４
３に分子量のポリペプチドの存在について試験した。

４３にポリペプチドは、肺炎患者からの３個のＭ、ニュ
ーモニア培養陽性喀痰検体中３個において検出された。

結合したＭＡｂはビオチン化抗−マウスＩｇＧ及びアビ
ジン−ビオチン−パーオキシダーゼ複合体を色原体とし
ての３，３′−ジアミノベンジシンと共に用いて検出さ
れた。このアッセイはＭ、ニューモニア・ロウリー（Ｌ
ｏｗｒｙ）蛋白質８ｎｇを含有すする喀痰サンプルの中
の特定の４３．０００ＭＷポリペプチドを検出すること
が示された。皐−≧−１２８のコールドーアグルチニン
力価を有する異型肺炎患者から得られた喀痰検体をＭ。

ニューモニア特異的ポリペプチドについて引き続いてア
ッセイした。細菌の増殖のためこれらの喀痰は通常のマ
イコプラズマ培養法によっては検出できなかった。こと
Ｍ、ニューモニア特異的４３、ＯＯＯＭＷポリペプチド
は２４個の異型肺炎検体中１０個において検出されたが
、正常固体からの１０個の喀痰検中には検出されなかっ
た。このイムノブロット・アッセイにおけるラビットポ
リクローナル抗−Ｍ、ニューモニア抗体の使用は、非特
異的喀痰蛋白質への結合を示し、これはＭ、ニューモニ
ア特異的ポリペプチドの検出を妨害した。

このイムノブロット・アッセイは５時間以内に実施する
ことができ、そして喀痰検体中のＭ、ニューモニア抗原
を検出するため９鋭敏で有用な方法であることが示され
た。さらに、４３にポリペプチドはまた咽頭炎を有する
患者からのＭ４ニューモニア培養確認された咽喉綿棒１
０個中２９個において検出可能であった。しかしながら
、４３にポリペプチドはレジオネラ・ニューモフィラに
ついて培養確認された３個の喀痰検体中に検出されなか
ったのみならず、正常なすなわち呼吸器疾患の症状を有
しない個体からの１０個の喀痰検体中にも、正常な呼吸
器の健全な個体からの２５個の咽喉綿棒中にも検出され
なかった。

喀痰検体においてＭ、ニューモニア特異的抗原をイムノ
アッセイにより直接検出する試みは幾つかの困難な技術
的問題を提供する。サンプルの液化及び抗原の可溶化を
行わなければならない。他の問題点が、このタイプの検
体のマトリクスの付着性により生ずる非特異的偽陽性反
応である。

この発明のＭＡｂイムノブロット・アッセイはこれらの
困難に直接立ち向う。電気泳動に先立ちＳＤＳ及びＤＴ
Ｔ処理を用いることによりサンプルが完全に液化されそ
してＭ、ニューモニアポリペプチドが可溶化される。さ
らに、４３にポリペプチドは、非特異的偽陽性反応を生
じさせる可能性があるすべての検体蛋白質から部分的に
分離される。このアッセイ法の１つの追加の利点は、す
でに抗体と複合体を形成している抗原を検出する能力を
有することである（Ｂｕｒｎｅｔｔｅ、Ｗ、Ｎ、１９８
１゜Ｗｅｓｔｅｒｎ　Ｂｌｏｔｔｉｎｇ、”　Ｅｌｅｃ
ｔｒｏ　ｐｈｏｒｅｔｉｃ　ｔｒａｎｓｆｅｒｏｆ　ｐ
ｒｏｔｅｉｎｓ　ｆｒｏｍ　Ｈｏｄｉｕｍ　ｄｏｄｅｃ
ｙｌ　ｓｕｌｆａｔｅ−ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ
　ｇｅｌｓ　ｔｏ　ｕｎｍｏｄｉｆｉｅｄ　ｎ１ｔｒｏ
ｃｅ−１１ｕｌｏｓｅ　ａｎｄ　ｒａｄｉｏｇｒａｐｈ
ｉｃ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｗｉｔｈａｎｔｉｂｏｄｙ
　ａｎｄ　ｒａｄｉｏｉｏｄｉｎａｔｅｄ　ｐｒｏｔｅ
ｉｎ　Ａ、、Ａｎａｌ。

Ｂｉｏｃｈｅｌｌ、、　１１２　：　１９５−２０３　
）　、免疫複合体の形での抗原は従来のイムノアッセイ
によっては検出することができず（Ｍｉｚｕｔａｎｉ、
Ｈ，＋及びＨ，Ｍｉｚｕｔａｎｉ。

１９８４、Ｃ１ｒｃｕｌａｔｉｏｎ　ｉｍａｍｕｎｅ　
ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ　ｉｎ　ｐａｔｉｅｎｔｓｗｉｔｈ
　ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｌ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａ、　Ａ
ｍ、　Ｒｅｖ、　Ｒｅ５ｐｉｒ。

Ｄｉｓ、　１３０　：　６２７−６２９　）　、そして
培養によって検出されないであろう。このアッセイ法は
また、他のイムノアッセイにおいては偽陽性結果を惹起
する検体中のスタフィロコッカスによる抗体のプロティ
ン−Ａ結合により影響を受けない。（Ｇｏｓｔｉｎｇ。

し、Ｈ，、に、Ｃａｂｒｉａｎ＋Ｊ、Ｃ，Ｓｔｕｒｇｅ
　、及びり、Ｃ，Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ＋１９８４、Ｉｄ
ｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　ｓｐｅｃｉｅｓ
−ｓｐｅｃｉｆｉｃａｎｔｉｇｅｎｉｎ　匡紅並１圏　
ｎｅｕｍｏ　ｈｉｌａ　　ｂｙａｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ
　ａｎｔｉｂｏｄｙ、、Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｍｉｃｒｏｂｉ
ａｌ、　２０：１０３１−１０３５　）。

この発明はさらに、Ｍ、ニューモニア感染の検出のため
に特異的な診断試検キットに関する。このキットは主と
して、約４３にの分子量を有するＭ、ニューモニア膜ポ
リペプチドを認識するこの発明の種特異的モノクローナ
ル抗体を含む。

この発明のアッセイ技法は、プレキャストミニゲル（３
Ｑ　ｕ＋　Ｘ　１００ｍ＋１）を使用する場合、５時間
以内に結果を与える点において効率的である。市販のプ
レキャストゲルを使用することにより、この系は標準的
酵素イムノアッセイ程複雑ではない。

この発明は、正常画用生物の増殖のために従来の培養法
によって試験することができなかったサンプルのアッセ
イ法を提供する。さらに、この発明のイムノブロット・
アッセイは臨床検体に対して直接行うことができる。

■ 例１及び例２は、この発明の種特異的ＭＡｂの調製、そ
の特徴付け、及びＭ、ニューモニア感染を診断するため
のウェスタン・イムノブロットにおけるその使用を記載
する。

例３及び例４は、例において使用した方法に従って調製
されたマイコプラズマ・ニューモニア、並びにレジオネ
ラ・ニューモニア及びクラミジア・リポポリサッカライ
ドに対する種特異的ＭＡｂの、この発明の同時アッセイ
法における使用を記載し、そしてウェスタン・イムノブ
ロットにおいてモノクローナル抗体のパネルを用いるこ
の発明の分別診断法を例示する。

以下の例において使用した参照微生物株はアメリカン・
タイプ・カルチニア・コレクション（ＡＴＣＣ）及びナ
ショナル・インスティテユーツ・オプ・ヘルス（Ｎ　Ｉ
　Ｈ）から得た。マイコプラズマ。

ニュー−Ｅニア（、Ｍ印■旦髭　Ｌ些肌紅並）ＡＴＣＣ
１５３３１Ｆマイコプラズマ・ホミニス（ｈ並紅且胆ｈ
ｏｍｉｎｉｓ）ＡＴＣＣ２３１１４：マイコプラズマ・
ファウシウム（ｈ図鮭且観ハ匹り紅ＡＴＣＣ２５２９３
；マイコプラズマ・リポフィルム（ｂ並鮭Ｕ胆　旦凹画
旦憇）ＡＴＣＣ２７１０４；マイコプラズマ・プフカレ
（勺μ阻ハｌ阻ｂｕｃｃａｌｅ）ＮＴＨＭ７１４−０１
２−０８４；　マイコプラズマ・ファーメンタンス（ｈ
印鮭閃駐ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）ＮＩＢ　Ｍ７１３−０
０２−０８４；マイコプラズマ・オラレ（ｂ並且且租ｏ
ｒａｌｅ）ＮＩＨＭ７１４−００１−０８４；マイコプ
ラズマ・サリバリウム（ｂ並吐且肌ｓａｌｉｖａｒｉｕ
ｍ）ＮＩＨＭ７１２−００２−０８４；ブランハメラ・
カタルハリス（Ｂｒａｎｈａｍｅｌｌａ　　ｃａｔａｒ
ｒｈａｌｉｓ）　ＡＴＣＣ８１７６、キャンディダ・ア
ルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａａｌｂｉｃａｎｓ）ＡＴＣ
ＣＥ−１０２３１；ニジエリシャ・コリ（Ｅｓｃｈｅｒ
ｉｃｈｉａ　ｃｏ旦）ＡＴＣＣ８７３９；　ヘモフィル
ス・インフルエンザ（ル狙懸且１士工ｓ　１ｎｆｌｕｅ
ｎｚａｅ）ＡＴＣＣ３３３９１；ヘモフィルス・パライ
ンフルエンザ（動μ臆り一−ｓ　　ａｒａｉｎｆｌｕｅ
ｎｚａｅ）ＡＴＣＣ３３３９２：ナイｉｌｕ ゼリア・シソ力（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　５ｉｃｃａ）Ａ
ＴＣＣ２９２５６；シュードモナス・アエルギノーサ（
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ憇ユ紅低ｕ）　Ａ　Ｔ　ＣＣ９
０２７：　スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａ　
ｈ　１ｏｃｏｃｃｕｓ　　ａｕｒｅｕｓ）ＡＴＣＣ２５
９２３；スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａ　ｈ
　１ｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ）　Ｃｏｗａｎ株ＡＴ
ＣＣ１２５９８；スタフィロコッカス・エビデルミゾイ
ス（Ｓｔａ　ｈ　１ｏｃｏｃｃｕｓｅ　ｉｄｅｒｍｉｄ
ｉｓ）ＡＴＣＣ１４９９０；ストレプトコッカス（針ユ
鮭匹匹印ｓ）ＭＧ　ＡＴＣＣ９８９５；ストレプトコッ
カス瞭ニューモニア（Ｓｔｒｅ　ｔｏｃｏｃｃｕｓ肋匹
竺旦憇）ＡＴＣＣ３３４００：　ストレプトコッカス・
ピオゲネス（Ｓｔｒｅ　ｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｕ且七μ狙
）ＡＴＣＣ１２３４４：ストレプトコッカス・サリバリ
ウス（針胆μ匹虹靭し５ａｌｉｖａｒｉｕｓ）ＡＴＣＣ
１３４１９ｍクレブシラ・ニューモニア（Ｋｌｅｂｓｉ
ｅｌｌａ　　Ｌ些竺１川）及びプロテウス・ミラビリス
（Ｐｒｏｔｅｕｓ　ｍｉ工ゆ上７−はカリポルニア大学
、デービス／サクラメント・メディカルセンターから、
そしてストレプトコッカス・ミュタンス（Ｓｔｒｅ　ｔ
ｏｃｏｃｃｕｓ　ｍｕｔａｎｓ）はジョンズ・ホプキン
ス大学のＨａｎ＋１ｌｔｏｎ　Ｓｍ１ｔｈから得た。レ
ジオネラ。

ニューモフィリア（ｋれ坦１圏　匹叩懸酋■亘）血清型
■はカリポルニア大学、ロサンゼルス医学校のＰａｕｌ
　Ｅｄｅｌｓｔｅｉｎから得た。

下記の例により、この発明がさらに容易に理解されよう
。しかしながら、これによりこの発明の範囲を限定する
ものではない。

劫坑盃■里製：Ｍ、ニューモニアを改良ニューヨークシ
ティ−液体培地（ＧｒａｌＩＩａｔｏ等、１９８０、　
Ａｍ、Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｐａｔｈ、７３ニア０２−７０５
）中で５〜６日間、３２−０２ガラス処方ビン中で増殖
せしめた。ガラスに付着した生物体をかき取ることによ
って培養物を集め、そしてこれをリン酸緩衝化塩溶液（
Ｐ　Ｂ　Ｓ）中で３回洗浄した（Ｂａｓｅｏ＋ａｎ等、
１９８２゜Ｊ、Ｂａｃｔ、、　１５１　：　１５１４−
１５２２）　、他のマイコプラズマ種はＰＰＬＯグルコ
ース又はＰＰＬＯアルギニン液体培地（Ｖｅｌｌｃｃａ
等、１９８０　、１１３−１１９頁、田植■ｕ■Ｄｉａ
　ｎｏｓｉｓ　ｏｆ　Ｍ　ｃｏ　Ｉａｓｗａ　Ｉｎｆｅ
ｃｔｉｏｎｓ　、　Ｕ、Ｓ。

Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｈｅａｌｔｈ　ａｎｄ　
Ｈｕｍａｎ　５ｅｒｖｉｃｅｓ　、アトランタ、ＧＡ、
）中で増殖せしめ、そして微生物をトリプシン・ソイ・
ブロス（ディフコ）中又はチョコレート寒天上で増殖せ
しめた。

ポリクローナル　　−二うビット抗−Ｍ、ニューモニア
抗血清をブロース・ウェルカム（ＢｕｒｒｏｕＢｈｓＷ
ｅｌｌｃｏｍｅ）から得た。Ｍｕｌｅ抗−Ｍ、ニューモ
ニアＭ７１０−５０１−５６９、Ｍｕｌｅ抗−Ｍ、サリ
バリウムＭ７１２−５０１−５６９　、Ｍｕｌｅ抗−Ｍ
、オラレト７１４−５０１−５６９、Ｍｕｌｅ抗−Ｍ、
ブッカレＭ７１４−５１１−５６９、Ｍｕｌｅ抗−Ｍ。

ファーメンタンスＭ７１３−５０１−５６９、及びＭｕ
ｌｅ抗−Ｍ。

ホミニスＭ７１１−５０１−５６０がＮＩＨから得たマ
イコプラズマ種特異的抗血清である。

免疫皿立’　Ｂａ　１　ｂ　／　’マウスを完全フロイ
ンドアジュバント中１００μｇのＭ、ニューモニア全生
物体により腹腔内（ｉ、ｐ、）に免疫感作した０次に、
これらを２週間ごとに２０μｇの抗原により追加免疫し
、最後の注射は融合の３日前に行い、合計５回注射した
。

敗企：Ｂａ１ｂ／ｃ牌細胞を６−チオグアニン耐性（Ｉ
ＩＧＰＰＴ−）マウス骨髄腫セルラインＳρ２１０Ａｇ
１４（Ｓｈｕｌｍａｎ等、１９７８、Ｎａｔｕｒｅ　２
７６　：　２６９−２７０）と融合せしめた。細胞の融
合は、Ｏｌ等、１９８０、Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉ
ｎ−ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ　ｈｙｂｒｉｄ　ｃｅｌｌ　１
ｉｎｅｓ　。

３５１−３７１頁、Ｂ、Ｓｍ１ｃｈｅｌｌ及びＳ、Ｓｃ
ｈｉｉｇｉ　’１ｍ、５ｅｌｅｃｔｅｄ　　ｍｅＬｈｏ
ｄ　　ｉｎ　　ｃｅｌｌｕｌａｒ　　ｉｍｍｕｎｏｌｏ
ｇｙ　　、Ｗｊ。

Ｆｒｅｅｔｍａｎ　Ｃｏ、サンフランシスコ中に記載さ
れている方法にわずかに変更を加えた方法に従って行っ
た。融合培地は、１５　ｍＭ　ｔｌｅｐｅｓを含むダル
ベコ改変イーグル培地（ＧｒＩＩＣＯ）中４０％ポリエ
チレングリコール１４５０（Ｊ、Ｔ、Ｂａｋｅｒ）であ
った。次に、２０％ウシ胎児血清、１０％ＮＣＴＣ培地
（Ｇｒ［１ＣＯ）、２ｍＭグルタミン、１．１　Ｘｌ０
−’Ｍシスーオキサル酢酸、５．６　Ｘｌ０−’Ｍピル
ビン酸及び０．５ユニット７ｍｌのウシインシュリンを
含有し、１５ｍＭＨｅ　ｐｅ　ｓを伴うダルベコ改変イ
ーグル培地中、９６−ウェルプレート中に５Ｘ１０’細
胞／ウエルププレートした。１８時間後に、Ｉ　Ｘｌ０
−’Ｍヒポキサンチン及び１．ｌＸ１０−’Ｍチアザリ
ンを添加することによって選択を適用した（Ｆｏｕｎｇ
等、１９８２　。

Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　ＵＳＡ）７
９　：　７４８４−７４８８）　、融合の１０〜１２日
後、増殖したバイブリド細胞の上清を酵素イムノアッセ
イ　（ＥＩＡ）により抗−Ｍ。

ニューモニア抗原活性についてアッセイした。陽性の親
ウェルを限界稀釈法により２回クローン化した。

ハイプリドーマをスフ１−ニングするためのＥ　Ｉ　Ａ
　：　Ｍ、ニューモニア抗原を２０分間音波処理し、次
にミクロヒュージ中で２０分間遠心した。音波処理上清
をＰＢＳ中に稀釈して１μｇ１、ｏｗｒｙ蛋白質蛋白質
７レｌそして５０ｔｔｌを３７℃にて６０分間、ポリ塩
化ビニルプレートのウェルに加えた。材料を吸引し、そ
してウェルを３７℃にて３０分間ＰＢＳ中１％ウシ血清
アルブミン（Ｂ　Ｓ　Ａ）でブロックした。Ｐ　Ｂ　Ｓ
　＋　０．１％トウィーン２０（ＰＢＳＴ）で３回洗浄
した後、５０μｌの未稀釈の細胞培養上清液をウェルに
加え、そして３７℃にて６０分間インキュベートした。

ＰＢＳＴにより３回洗浄した後、１％ＢＳＡ　＋　ＰＢ
ＳＴ中に稀釈されたオースラディッシュパーオキシダー
ゼ（ＨＲＰ）−標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（ビオ−ラド）
５０μｌを加え、そしてウェルを３７℃にて６０分間イ
ンキュベートした。未結合の接合体をＰＢＳＴ中で４回
洗浄し、次に１００μｌの基質緩衝液（５０ｍＭクエン
酸ナトリウム、１００ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ５，
５）中、３　ｍ　ｇ　／　ｍ　ｌのＯ−フェニレンジア
ミン・２ＨＣ１ｚ（シグマ）〕をウウニに加えた。室温
にて１５分間の後、１００μｌのＩＮＨ（Ｊにより反応
を停止し、そして分光光度計で４９２ｎｍにおいて吸光
を読み取った。

腹水■生皮：Ｂａ１ｂ／ｃマウスにＱ、５　ｍ　Ａ’の
ブリスタン（アルドリッチ）をｉ、ｐ、注射した。２週
間後、２回サブクローニングしたハイブリドーマ細胞５
Ｘ１０ｈをマウスに注射した。７日後に腹水を得た。

ゲル電気泳動：９％アクリルアミドゲル又は６〜２０％
グラジェントアクリルアミドゲルを用いるドデシル硫酸
ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＯ５
−ＰＡＧＥ）を、不運ＶＦ、ｓＤｓ　Ｔｒｉｓ　−グリ
シン緩衝液系を用いて行った（Ｌａｅｍａ＋１ｉ、Ｖ、
に、＋１９７０　、　Ｎａｔｕｒｅ　（ロンドン）２２
７　：　　６８０−６８５）　、サンプルを、０．０１
％ブロモフェノールブルーを含有するＯ、　ｌ　Ｍ　Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐ）１６．８　）中２％ＳＯ５、０，
１Ｍジチオスレイトール（ＤＴＴ）　、１０％グリセリ
ンの濃度にし、そして１００℃にて５〜１０分間加熱し
た。すでに記載されている様にして銀染色を行った（Ｔ
ｓａｉ等、１９Ｂ２　、　Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、
　　１１９　：１１５−１１９）。

イムノブロッティング：　Ｂｕｒｎｅｔｔｅ　、　Ｗ、
Ｎ、　、　１９８ＬＡ、Ａｍａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｗ、１
１２　：　１９５−２０３及びＴｏｗｂ　ｉ　ｎ等、１
９７９　　、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、八ｃａｄ、Ｓｃｉ　
（ＵＳＡ）　　７５　　：　　４３５０　　４３５４に
記載されている電気泳動的移行法を用いてポリペプチド
をＳＯＳ　−ＰＡＧＥゲルからニトロセルロースシート
に移した。移行は、トランス−プロット・セル（ビオ−
ラド；リッチモンド、ＣＡ）中で４０　Ｖ　、　　２０
０ｍＡにて６０分間、移行緩衝液（２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ
、　１９２ｍＭグリシン（ｐＨ８，８）２０％メタノー
ル〕を用いて行った。ニトロセルロースシートを、１％
オブアルブミン及び５％脱脂粉乳（１８）を含有する１
Ｍグリシン溶液中で３０分間室温にてブロックした。Ｐ
ＢＳＴ中で３回洗浄した後、シートを、洗浄液＋０．１
％脱脂粉乳及び０、１％オプアルブミン中に１’ｓ、ｏ
ｏｏに稀釈された腹水により３７℃にて６０分間プロー
ブした。

シートをＰＢＳＴ中で３回洗浄し、そして次にＨＲＰ−
標識されたヤギ抗マウスＩｇＧと共に室温にて３０分間
インキュベートした。ＰＢＳＴ中で４回洗浄した後、１
０　ｍ　Ｍ　Ｔｒｉｓ−ｔｌｃｊ２　　（ｐＨ７，４）
中０．５ｍｇ／ｍｉの３，３′−ジアミノベンジジン・
４Ｈ（／！（ＤＡＢ：シグマ”）　、０．０２％Ｎ１Ｃ
ｊ２ｚ及び０．０５％Ｈ２０ｔから成る酵素基質溶液に
シートを暴露した（Ｈｓｕ等、１９８２　、　Ｊ、旧ｓ
ｔｏｃｈｅｍ、Ｃｙｔｏｃｈｅｍ、　３０：１０７９−
１０８２）。３〜５分間後に蒸留水により反応を停止し
た。

免疫染色”　Ｂ　Ｓ洗浄されたＭ、ニューモニアの全生
物体を顕微鏡スライド上で空気乾燥し、そして室温にて
２０分間、アセトン、エタノール、又はＰＢＳ中１％グ
ルタルアルデヒドにより固定した。１０％ウシ胎児血清
を含有するＰＢＳ中に稀釈された腹水をスライドに適用
し、そして３７°Ｃにて３０分間インキュベートした。

スライドをＰＢＳ中で３回洗浄した。次に、スライドを
ＨＲＰ−標識ヤギ抗マウスＩｇＧと共に３７℃にて１５
分間インキュベートし、次に３回洗浄した。

次に、上記の様にしてスライドをＤＡＢ溶液と共にイン
キュベートし、そして顕微鏡観察した。

股少猜製：にａｈａｎｅ等、１９７７　、　Ｉｎｆｅｃ
ｔ、　Ｉｍｍｕｎ、１８：２７３−２７７に記載されて
いる様にして膜を精製した。

要約すれば、グリセリン負荷された生物体を蒸留水中で
細胞溶解せしめた。膜を遠心分離により４回洗浄し、そ
して次に３０〜５４％（Ｗ／Ｖ）のシュークロース・グ
ラジェントに適用し、そしてベックマン５Ｗ２８中で２
８．０００μｌｍにて３．５時間、４　’Ｃニて超遠心
した。

゛ヨウ、声　びブローアーゼ感　　：過ヨウ素酸塩及び
プロテアーゼ処理に対する結合部位の感受性を次の様に
して決定した。９６−ウェルのポリ塩化ビニルプレート
を１μｇ　／　ｍ　１のＭ、ニューモニア音波処理物（
５０μｌ／ウエル）と共に室温にて２時間インキュベー
トした。プレートをＰＢＳＴで洗浄し、次に０．０５Ｍ
酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８，８）中０．０５Ｍ過ヨ
ウ素酸ナトリウム（５０μｌ／ウエル）と共に４℃にて
一夜、又はＰＢＳ中１００ｍ　ｇ　／　ｍ　ｌのプロテ
ア−ゼＫ（シグマ、タイプＸＩ）（５０μｌ／ウエル）
と共に３７℃にて２時間、Ｃａｌｄｗｅｌｌ等、１９８
４　、　Ｉｎｆｃｔ、Ｉｍｍｕｎ、。

４４　：　３０６−３１４に記載されている様にしてイ
ンキュベートした。プレートをＰＢＳＴにより６回洗浄
した後、細胞培養上清ではなく　ＰＢＳＴ中に１：５０
００に稀釈された腹水を用いて上記のＥＴＡによりＭＡ
ｂ結合を決定した。

マウス−グロブリンのアイソタイプ：ＭＡｂの免疫グロ
ブリンアイソタイプをＥＩＡにより決定した。ラビット
抗マウスＩｇＧアイソタイプ特異的抗血清ＩｇＧ１．　
ＩｇＧ２ａ、　ｒｇＧ２ｂ、及び１ｇＧ３　（チメド・
ラボラトリーズ（Ｚｙｍｅｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅ
ｓ））及びこれに続きＨＲＰ−標識ヤギ抗ラビットＩｇ
Ｇ（カペル）を用いて結合したＭＡｂを検出した。

インキュベーションは室温にて６０分間行った。

−Ｍ、ニューモニアＭＡｂを生　するバイブ１　ドーマ
セル−インの−１：ＥＩＡにより陽性であるハイブリド
ーマ細胞培養上清をイムノブロットアッセイによりさら
にスクリーニングした。

４３．０００　（４３Ｋ）の見かけ分子量を有するポリ
ペプチドに結合するＭＰ１６Ｃ９と称する１つのＭＡｂ
生産性ハイプリドーマを同定した。ＭＰ１６Ｃ９のＥＩ
Ａアッセイにより、それがＩｇＧ１アイソタイプである
ことが示された。このＭＡｂはまた、第１Ｍに示すよう
に、精製された脱調製物中の４３にポリペプチドにも結
合した。この４３にポリペプチドはラビットポリクロー
ナル抗体に強く結合する４３にポリペプチドに相当する
様であった。ＥＩＡにおいて、ＭＰ１６Ｃ９ＭＡｂ結合
部位はプロテアーゼ消化により破壊されるがしかし過ヨ
ウ素酸塩酸化処理によっては破壊されない様であった。

−４３Ｋ　　ＭＡｂと也のマイコブ−ズマとの反庭性：
第２図に示すように銀染色パターンにより正常マイコプ
ラズマ種において４３にポリペプチドが観察されたが、
イムノブロットアッセイにおいて、第３図に示すように
これらの生物からのこれらのポリペプチドのいずれとも
ＭＡｂの結合は起らなかった。このＭＰ１６Ｃ９ＭＡｂ
をさらに、Ｍ。

ファーメンタンス、Ｍ、ホミニス、Ｍ、サリノマリウム
、Ｍ、オラレ、Ｍ、プツカレ、Ｍ、リポフィルム、及び
Ｍ、ファウシウムに対する反応性についてＥＩＡにより
試験した（第１表）。ＥＩＡにより、これらのマイコプ
ラズマ種のいずれとの反応性も観察されなかった。

Ｍ、ニューモニア１−　　との［心−：ＭＰ１６Ｃ９Ｍ
Ａｂを１８個のＭ、ニューモニア臨床単離体との反応性
について評価した。１８個すべての単離体中の４３にポ
リペプチドがＭＰ１６Ｃ９ＭＡｂと反応することが見出
された。

正′　　の　　との　心４：正常な又は疾患を有するヒ
トの呼吸器中に潜在的に見出される代表的生物を、イム
ノブロットによりＭＰ１６Ｃ９門Ａｂに対する反応性に
ついて試験した。結果を第２表に示す。試験したいずれ
の生物もＭＰ１６Ｃ９ＭＡｂに結合するポリペプチドを
含有しないことが見出された。

免疫染亘称独：第４回に示すように、エタノール又はア
セトンにより固定された全体生物体がＭＰ１６Ｃ９ＭＡ
ｂに結合した。グルタルアルデヒドにより固定された生
物体はＭＰ１６Ｃ９ＭＡｂに結合しなかった。

以下余白 ストレプトコツカス・ミュータンス　（Ｓｔｒｅ　　ｔ
ｏｃｏｃｃｕｓ　　　　ｍｕｔａｎｓ）　　　　　　　
　　　（−）ストレプトコツカス・サリバリウス　（Σ
に旦Ｒ１仝９９９９竺且−５ａｌｉｖａｒｉｕｓ）　　
　　　（）ストレプトコツカス・ニューモニア　　（Ｓ
ｔｒｅ　　ｔｏｃｏｃｃｕｓ　　　　且ユ旦旦見立ユ１
１旦）（−）ストレプトコツカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏ
ｃｃｕｓ）ＭＧ　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　（−）ストレプトコツカス・ピオゲネス（
Ｓｔｒｅ　　ｔｏｃｏｃｃｕｓ　　　　、Ｉ！ｌ立に旦
ユ旦且）（−）プランハメラ・カタルハリス（Ｂｒａｎ
ｈａｍｅｌｌａ　　　　ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓΣ　　
　　　　　　　（−）へモフィルス・インフルｘンｆ　
　（）Ｉａｅｍｏ　　ｈｉｌｕｓ　　　　１ｎｆｌｕｅ
ｎｚａｅ）　　　　　　　　　（−）ナイゼリア・シフ
力（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　　　　５ｉｃｃａ）　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　（）へモフィル
ス・パライシフルエンザ　（ｔｌａｅｍｏ　　ｈｉｌｕ
ｓ　　　　Ｊ！旦り旦１ユＬ１旦旦ユ乙旦旦）（−）ク
ラミジア・トラコマチス　（Ω九ｌａｗり尾１ｉａ　　
　　ｔｒ且９に免！且１１且Σ　　　　　　　　　　　
（−）キｔンティダ・フルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ　
　　　ａｌｂｉｃａｎｓ）　　　　　　　　　　　　　
　　　　（−）レジオネフ・ニューモフィラ（Ｌ旦且１
９ユ旦１１旦　　２１旦且二立λ１１１且Σ　タイプｌ
　　　　　　（−）（＊）ＰＢＳで洗浄した微生物をレ
ーン当り約１１００ｎ負荷し、そして９％ＳＯＳ　−Ｐ
ＡＧＥで泳動せしめた。次に、電気泳動的にニトロセル
ロースシートに移し、このシートをＭＰ１６Ｃ９Ｍ八す
により、この明細書に記載する方法によりプローブした
。

３０、０００〜６０．０００の分子量範囲のポリペプチ
ドに結合するＭＡｂが存在しない場合を陰性反応を定義
した。

プラズマ・ニューモニア（ＡＴＣＣ１５５３１）を、改
変ニューヨークシティ−培地（Ｇｒａｎａ　ｔｏ等、１
９８３　、　Ｊ。

Ｃｌ１ｎ、Ｍｉｃｒｏ、　、　１７　：　１０７７−１
０８０）を用いて３２−、、処方ビン中で４〜６日間増
殖せしめた。ガラスに付着したコロニーを前記のように
してかき取りそして集めた。　Ｖｅｌｌｅｃａ等、前掲
、１０５頁に記載されている様にして色の変化のアッセ
イにより感染性を定量した。

璽璽雄欅：咽頭炎綿棒を、１９８０年１２月〜１９８１
年４月の間にシラクス（Ｓｙｒａｃｕｓ）大学学生健康
センターを訪れた学生から得た。これらの患者は咽喉の
痛み、鼻の充血、又は咳の主な訴えを伴う呼吸器感染の
症状を有していた。トウィーン２０を含有するリン酸緩
衝化塩溶液（Ｐ　Ｂ　Ｓ）に綿棒を入れ、そして−７０
℃にて凍結貯蔵した。

亙灰検体：異型肺炎を存するものと診断された若い成人
から喀痰試料を得た。血清コールドーアグルチニン活性
は２１　：　１２８であった。Ｇｒａｎａｔ。

等、前掲によりすでに記載されている方法によりＭ、ニ
ューモニアの存在について培養した。

モノクローナル　　：Ｍ、ニューモニアの４３．０００
分子量ポリペプチドに対する腹水から精製したＭＡｂを
例１に記載したようにして調製した。

ＭＡｂイムノブロットアッセイ：臨床検体をまず、不連
続５ＯＳ−Ｔｒｉｓ−グリシン緩衝液系（Ｌａｅｍｍｌ
ｉ、Ｌｌ、に、１９７０　、　Ｎａｔｕｒｅ　（ロンド
ン）２２７　：６８０−６８５）を用いるドデシル硫酸
ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＯ３−
ＰＡＧＥ）にかけた。ゲルは９％アクリルアミド分離ゲ
ル及び６％アクリルアミド・スタック・ゲルキャスト（
１，５ｘ３Ｑｘ　１００ｍｍの“ミニゲル”中）から成
る。臨床検体を同量の検体処理緩衝液［０，２Ｍ　Ｔｒ
ｉｓ−１１Ｃｊ！　　（ｐＨ６，８）　、４Ｗ／Ｖ％Ｓ
ＯＳ、　０．２　Ｍ　　ジチオスレイトール、２０　Ｖ
／Ｖ％グリセリン、０．０２％ブロモフェノールブルー
〕中で５分間沸騰せしめた。レーン当り３０μｌを負荷
し、そして５０ｍＡの定電流にて６０分間電気泳動を行
った。電気泳動分離の進行を見るため、あらかじめ染色
した分子量マーカーを含めた。Ｂｕｒｎｅｔｔｅ、前掲
；及びＴｏｗｂｉｎ、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ、Ａｃａｄ、
Ｓｃｉ、　（１９７９）前掲に記載されている方法を用
いて、分離したポリペプチドをニトロセルロースに電気
泳動した。この移行は、トランスーブロフトセル（ビオ
−ラド；リソチモンド、ＣＡ）中で４０　Ｖ　、　　２
００ｍＡにて、２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ−１１ｃｊ！　、　
　１９２ｍＭグリシン及び２０■／■％メタノールから
成る移行緩衝液を用いて行った。ニトロセルロースを１
Ｍグリシン、５％脱脂粉乳及び１％オバルブミン中で１
５分間ブロックした。このブロッキング剤は、Ｊｏｈｎ
ｓｏｎ等、１９８４゜Ｇｅｎｅ　Ａｎａｌ、Ｔｅｃｈｎ
、　１　：　３−８中に記載されているイムノブロット
・ブロッキング溶液を変更したものである。Ｐ　Ｂ　Ｓ
　＋　Ｏ，１％トウィーン（ＰＢＳＴ）中で５分間洗浄
した後、ＰＢＳＴ　＋２０％ウシ胎児血清（ＦＰＢＳ）
中に稀釈されたＭＡｂにより３７℃にて６０分間プロー
ブした。ＮＣを合計１０分間にわたり３回洗浄し、次に
ＦＰＢＳ中ビオチン化ウマ−抗マウスＩｇＧ　（ベクタ
ー・ラボラトリーズ）と共に室温にて３０分間インキュ
ベートした。洗浄の後、ＮＣをアビジン−ビオチン−ホ
ースラディツシュパーオキシダーゼ試験（ベクター・ラ
ボラトリーズ）に室温にて１５分間暴露した。次に、Ｎ
ＣをＰＢＳＴにより２回手早くすすぎ、次に固定緩衝液
（１ｍ　ＭＥＤＴＡを含有する０、　１　Ｍフマル酸ナ
トリウム（ｐＨ４，８））により２回洗浄した。固定緩
衝液をデカントし、そして酵素基質溶液（０，１Ｍフマ
ル酸ナトリウム、０．１　ｍ　Ｍ　ＥＤＴＡ（ｐＨ４，
８）中０．１ｍｇ／ｍｌテトラメチルベンジン、０．０
２％１１．０□〕を加えた。１５分間又は紫色のバンド
が現われるまで発色を行った。蒸留水中ですすぐことに
より反応を停止せしめた。

ＭＡｂイムノブロッ　・アッセイの′±　：喀痰検体の
最初の評価を１４ｃｍＸ１４ｃｍのゲル上で行った。

結果を第５図に示す。４３にポリペプチドに結合する特
異的ＭＡｂを免疫グロブリン重鎮及び軽鎖に結合する非
特異的ＭＡｂが良好に識別することができた。従って、
本発明者等は、ミニゲル電気泳動装置を使用して５時間
以内に完了することができるイムノブロット法を開発し
た。このアッセイ法を実施する場合の時間経過の概要を
第３表に示す。

Ｍ込］イＪノじθし仁ヒＬＬ１進Δ容度：このアッセイ
の感度を、一連の稀釈抗原により正常喀痰をスパイクす
ることにより決定した。使用したＭ。

ニューモニアのストックは３．２　ｍ　ｇ　／　ｍ　１
のロウリー蛋白質及び５　Ｘ　１０’ＣＣＩＪ／　ｍ　
ｊｌ！の力価を含んでいた。第６図に示す様に、４３に
ポリペプチド抗原は１０ｎｇ／レーンのロウリー蛋白質
の全生物体という少量において検出可能であった。生物
体のこの量は２００ｎｇ／ｍｊ！の検体潤度に対応する
。

本発明者等の予想では、この量は３２００ＣＣＵ　／　
ｍ　ｊｌ！の感度レベルに相当する。

異　　二′　　のＭＡｂイムノブロット・アッセーイー
二第７図に示すように、ＭＡｂイムノブロット・アッセ
イは、２４個の異型肺炎喀痰サンプル中の１０個におい
て４３にポリペプチドを検出した。正常画用の細菌の増
殖のため、これらの検体のＭ、ニューモニア培養確認は
不可能であった。

このアッセイは、Ｍ、ニューモニアの培養６１　認が得
られた３個の喀痰検体のそれぞれにおいても４３にポリ
ペプチドを検出した。正常固体からの１０個の喀痰サン
プルからは４３にポリペプチドを検出することができな
かった。さらに、レジオネラ・ニューモフィラについて
培養確認された３個の喀痰検体が試験され、そして４３
にポリペプチドについて陰性であることが見出された。

Ｉ　′　　　　のＭＡｂイムノブロット・アソセ−（：
ＭＡｂイムノブロット・アッセイにおいて、Ｍ、ニュー
モニアについて培養陽性であることが確認されている３
０個の咽喉綿棒検体の内２９個において４３にポリペプ
チドが検出された。これらの結果を第８図に示す。喀痰
検体に比べてこれらの検体について、免疫グロブリン重
鎮及び軽鎖の少い非特異的染色が観察された。正常個体
からの２５個の咽喉綿棒においては抗原が検出されなか
った。ＭＡｂイムノブロット・アッセイによる検体の試
験を第４表に要約する。

男−≦Ｌ−表 ミニゲルを用いるＭＡｂイムノブロット・アッセイの方
法及び時間（１） 一一没一撃一一　　　　　　　　　−片一皿−１、サン
プルの可溶化及びゲルへの負荷　１５分２、電気泳動　
　　　　　　　　　　　　６ｏ分３、移行　　　　　　
　　　　　　　　　４５分４、　ブロック　　　　　　
　　　　　　　　１５分５、　洗浄　　　　　　　　　
　　　　　　　５分６、第−ＭＡｂのブロービング　　
　　　６０分３７℃７、洗浄　　　　　　　　　　　　
　　　１ｏ分８、　ビオチン化第二抗体　　　　　　　
　３０分９、洗浄　　　　　　　　　　　　　　　１０
分１０、アビジン−ＨＲＰ　　　　　　　　　　１５分
１１、洗浄／固定　　　　　　　　　　　　１０分１２
、７Ｍ８　　　　　　　　　　　　　　　１５分２９０
分く４．８時間） （１）プレキャストゲルを使用した場合。

勇−コし一表 ４３Ｋ　　ＭＡｂイムノブロット・アッセイによる喀痰
検体試験の概要 正常　　　　　喀痰　　０／１０ 正　常　　　　　　　　　　咽喉綿棒　　　Ｏ／２０肺
炎は米国における感染性疾患による死亡の主要なケース
であると考えられる（文献４）、これらの感染に対する
経験療法は特異的病原体の同定に先立って開始されなけ
ればならない。迅速な診断が困難だからである。これら
の困難にはダラム染色される喀痰の感受性の欠如、培養
結果の時間的遅れ、及び病原体の増殖の困難さが含まれ
る。

これは、マイコプラズマ・ニューモニア及びレジオネラ
・ニューモフイラにより惹起される肺炎の場合に妥当す
る。これらの病原体のユニークな臨床的特徴又はＸ線写
真の特徴が存在しないため（文献１）、診断はしばしば
専門的経験及び培地を必要とする単離及び血清に全く依
存する（文献２．１２）。イムノブロット法においてモ
ノクローナル抗体を使用して喀痰検体中の前記Ｍ、ニュ
ーモニア特異的抗原の存在を直接検出するためのアッセ
イ法の開発を前に記載した。このア・ノセイにおける電
気泳動により達成される抗原の空間的分離のため、この
方法は異る病原体からの異る分子量の抗原を同時にヰ食
出するために使用される可能性を有する。電気泳動によ
り分離されそして次に電気泳動によりニトロセルロース
に移された後、これらの異る抗原をそれぞれの抗原に対
して特異的なモノクローナル抗体によって検出すること
ができる。

２種類の種特異的モノクローナル抗体（Ｍ、ニューモニ
アの４３にの分子量のポリペプチドに結合するもの、及
びり、ニューモフィラの２９にの分子量のポリペプチド
に結合するもの）を用いることにより、単一のイムノブ
ロット・アッセイにより臨床検体中のこれら２種類の抗
原を同時にアッセイすることができる。このアッセイ系
の特徴及び感度を記載する。

この例において記載する実験のため、４３にのＭ、ニュ
ーモニア−ポリペプチドに対して特異的なモノクローナ
ル抗体を例１の方法に従って調製する。

同様に、２９にレジオネラ抗原に対するモノクローナル
抗体を例１に記載した方法に従って調製することができ
る。レジオネラを富化レジオネラ寒天（ディフコ）上で
増殖せしめた。培養物をＰＢＳ中で３回洗浄した。種特
異的抗原であるレジオネラ・ニューモフィラの約２９に
の分子量のポリペプチドがＧｏｓｔｉｎｇ等、Ｊ、ＣＩ
　ｉｎ、Ｍｉｃｌｏｂｉｏｌ、　。

Ｖｏｌ　２０　、　Ｎｎ　６　：　１０３１−１０３５
　（１９８４年１２月）（文献２０）に記載されている
。

他方、この２９に抗原に対するモノクローナル抗体はま
たゼネティソク・システムス社（シアトル、ＷＡ）から
の免疫蛍光レジオネラ抗体試験キット（製品１０．１４
９−００４０）から商業的に入手することもできる。こ
れに代ってさらに、Ｐａｒａ等（１９８５゜Ａｂｓｔｒ
ａｃｔｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　１９８５１ｎｔｅｒｓｃｉｅ
ｎｃｅ　Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅｏｎ　Ａｎｔｉｍｉｃｒ
ｏｂｉａｌ　Ａｇｅｎｔｓ　ａｎｄ　Ｃｈｅｍｏｔｈｅ
ｒｓｐｙ＃１０７９．２９１頁）により記載されたよう
な、レジオネラ・ニューモフィラの約２９にの分子量の
ペプチドに対するモノクローナル抗体をこの例において
使用することもできる。レジオネラ・ニューモフィラ血
清型１はＵＣＬＡ医科学校のＰａｕｌ　Ｅｄｅｌｓｔｅ
ｉｎから得られた。

例１に記載したイムノブロット法の変法を用いた。例１
において使用したＨＲＰ−ラベル化抗マウスＩｇＧ接合
体の代りに、モノクローナル抗体でプローブされたニト
ロセルロースをビオチン化抗−マウスＩｇＧと共に室温
にて３０分間インキュベートし、次に洗浄した。アビジ
ン−ビオチン−ＨＲＰ複合体を加えて室温にて１５分間
装いた。

■生捜体：異型肺炎を有する患者から喀痰サンプルを得
た。これらの検体をマイコプラズマ・ニューモニア又は
レジオネラ・ニューモフィラについて培養し、そして標
準的技法により陽性コロニーを同定した。

ヱニ丸不！度：この方法の段階を第５表に例示する。こ
こに例示するようにプレキャストミニゲルを使用する場
合、５時間以内にアッセイを行うことができる。Ｌ、ニ
ューモフィラ及びＭ、ニューモニアの全体生物体を正常
個体からの喀痰にスパイクすることにより感度を決定し
た。第１０図に示すように、特異的４３Ｋ及び２９に抗
原を１１００ｎ／ｍｌの生物体のレベルで検出すること
ができた。これは１０”ＣＦＵ／　ｍ　ｌのレジオネラ
及び３２００　ＣＣＵ／　ｍ　ｌのＭ、ニューモニアに
相当する。

露床抜生：被験喀痰検体の結果を第９図に示す。

Ｍ、ニューモニア４３に抗原がＭ、ニューモニアについ
て培養確認された３個すべての喀痰検体において検出さ
れた。Ｌ、ニューモフィラ２９に抗原もレジオネラの患
者からの培養Ｗ１認された３個の喀痰検体中３個におい
て検出された。

とのアッセイは、ここで試験された検体数においてＭ、
ニューモニア特異抗原及びり、ニューモニア特異抗原の
間を明瞭に識別する。肺炎患者からの検体中の異る病原
体の抗原を検出するため免疫蛍光（文献５）、カウンタ
ー・免疫電気泳動（文献１３）及びラテックス凝集アッ
セイ　（文献６．１０）が従来使用されている。これら
のアッセイ系は、サンプルの液化及び抗原の溶解の問題
に係る技術的困難を有していた。一般にラテックス凝集
アッセイはまた、このタイプの検体材料の付着性によっ
て惹起される非特異的偽陽性に遭遇した。

ここに記載する同時的モノクローナル抗体イムノブロッ
トアッセイはこれらの困難を直接解決することができる
。電気泳動に先立ち加熱を伴うＳＤＳ及びＤＴＴ処理を
用いることにより、サンプルが液化され、そしてＭ、ニ
ューモニアのポリペプチド及びり、ニューモフィラのポ
リペプチドの両者が可溶化される。この方法はまた、非
特異的偽陽性反応を潜在的に惹起するすべての検体蛋白
質から４３にポリペプチド及び２９にポリペプチドを部
分的に分離する。このアッセイ法は、市販のプレキャス
トゲルを使用する場合、標準的イムノアッセイ程複雑で
はない。このアッセイ法は、正常な画用の生物の増殖の
ために常用の培養によっては試験することができないサ
ンプルの従来の方法に代るアッセイ法を提供する。第５
表に示すように、プレキャストミニゲルを使用する場合
５時間以内に実施することができる。

この方式はまた、反応性ポリペプチドが２９にポリペプ
チド及び４３にポリペプチドから部分的に識別され得る
のであれば、他の病原体に対するモノクローナル抗体の
添加を許容する。この様な分離のために適切なグラジェ
ントゲルを選択するのが好ましい。このアッセイにより
ヘモフィルス・インフルエンザ（ハ亜吐■旦ｓ　１ｎｆ
ｌｕｅｒ＋ｚａｅ）−、ストレプトコッカス・ニューモ
ニア（釘」庭匹ｏｃｃｕｓ７）　、クラミジア、及びイ
ンフルエンザウィルスをこのアッセイにより分別検出す
ることができる。これらの微生物のそれぞれについて特
徴的である分子量を異にするポリペプチドに対する上記
のようなモノクローナル抗体を調製する必要がある。後
記の例４において、クラミジアに対して特徴的な５に属
特異的リポポリサンカライドを同時的イムノアッセイに
おいて用いる。

以下余白 芽−」Ｌ−表 ミニゲルを用いるモノクローナル・イムツブロフト・ア
ッセイ法及び時間＋１） −一没一限−−−片一国一 １、　サンプルの可溶化及びゲルへの負荷　１５分２、
電気泳動　　　　　　　　　　　　　６０分３、移行　
　　　　　　　　　　　　　　４５分４、　ブロック　
　　　　　　　　　　　　　１５分５、洗浄　　　　　
　　　　　　　　　　５分６、第−ＭＡｂのプロービン
グ　　　　　６０分３７℃７、洗浄　　　　　　　　　
　　　　　　１０分８、　ビオチン化第二抗体　　　　
　　　　３０分９、洗浄　　　　　　　　　　　　　　
　１０分１０、アビジン−ビオチン−ＨＲＰ　　　　　
１５分１１、洗浄　　　　　　　　　　　　　　　１０
分１２、ＤＡ８　　　　　　　　　　　　　　　５分２
８０分（４，７時間） （１）プレキャストミニゲルを使用する場合。

１Ｍ、ニューモニア、Ｌ、ニューモフィＭ、ニューモニ
ア及びり、ニューモフィラに対するモノクローナル抗体
は例３に記載したのと同様にして調製され又は入手され
る。さらに、この例のため、例１の方法と同様にして、
Ｃａｌｄｗｅｌｌ等、１９８４、　　Ｉｎｆ＆Ｉｍ＋＋
ｕｎ、、　Ｖｏｌ　、４４．ｌ１ｋＬ２　：３０６−３
１４（文献１９）に記載されている約５にの分子量の属
特異的クラミジア・リポポリサッカライド抗原に対する
（すなわち、Ｃ，トラコマチス及びＣ，ブシッタシに対
する）モノクローナル抗体を調製する。

不 Ｂｕｒｎｅｔｔｅ等、Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、１１
２　：　１９５（１９８１）の方法の変法によりイムノ
ブロット（ウェスタン）を行うことができる。喀痰検体
及び咽喉綿棒並びにレジオネラ、マイコプラズマ、及び
クラミジア陽性対照サンプルを０．０１％ブロムフェノ
ールブルーを含む２％ＳＯ５，０，１Ｍ　ＤＴＴ、　１
０％グリセリン及び０．　Ｉ　Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣ＃　
　（ｐＨ６，８）に調製し、そして１００℃にて５〜１
０分間加熱してサンプルを完全に液化した。

各生物体を１ｍｌのＰＢＳ当り１０’ＣＦυに懸濁する
ことにより、レジオネラ、クラミジア及びマイコプラズ
マの陽性対照材料を調製する。クラミジアの陽性対照材
料を、１ｍｌのＰＢＳ当り１０６ＰＦＵに懸濁すること
により調製する。

熱処理の後、これらのサンプルを、０．１％ＳＯ３及び
０．１　Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ２　　（ｐＨ１６，８）
中４％スクッキングゲルを有する１０〜１６％グラジェ
ントポリアクリルアミド１４　Ｘ　１４ｃｍスラブゲル
、０．１％ＳＤＳ、　０．１Ｍ　Ｔｒｉｓ−ｔｌｃｊ！
　（ｐｉｆ８．８５）に適用し、そして２５ｍＡの一定
電流で電気泳動した（Ｌａｅｍｍｌｉ、Ｏ，に、、Ｎａ
ｔｕｒｅ。

２２７　：　６８０．１９７０）。

抗原を、２０％メタノール、０．０２５Ｍ　Ｔｒｉｓ−
Ｈ（Ｊ　、０．１９２Ｍグリシン（ｐｉ（９，０）緩衝
液中で４０■の一定電圧において１時間、０．４５ミク
ロンのニトロセルロースシートに移行せしめた。ニトロ
セルロースを１Ｍグリシン、１％オバルブミン及び５％
粉乳により室温にて１５分間プロ・ツクした。

０、１％トウィーン２０を含有するＰＢＳでシートをす
すいだ後、異る病原体に対するモノクローナル抗体の混
合物により３７℃にて１時間シートをプローブする。

この混合物は、前記の４３に分子量ポリペプチドに結合
する種特異的抗−Ｍ、ニューモニアモノクローナル抗体
、２９に分子量ポリペプチドに結合する種特異的抗〜Ｌ
、ニューモフィラモノクローナル抗体（Ｇｏｓｔｉｎｇ
、Ｊ、ｏｆ　Ｃ１１ｎ、Ｍｉｃｒｏ、　２０　：　１０
３１゜１９８４）　（文献２０）、及び５に分子量りポ
ボリサソカライドに結合する属特異的抗−クラミシアモ
ノクローナル抗体（Ｃａｌｄｗｅｌｌ等、Ｉｎｆｅｃｔ
＋＆Ｉｍｍｕｎ、４４：３０６、１９８４）　（文献１
９）を含有する。

Ｐ　Ｂ　Ｓ　＋　０．１％トウィーン２０　（ＰＢＳ↑
）中でニトロセルロースシートをすすいり後、ＰＢＳＴ
中１０％ウシ胎児血清に稀釈されたビオチン化抗−マウ
スＩｇＧ抗体により室温にて３０分間検出する。

ＰＢＳＴ中で洗浄した後、ニトロセルロースをアビジン
−ビオチン−ＨＲＰと共に室温にて１５分間インキュベ
ートする。

ＰＢＳＴ中でニトロセルロースシートをすすいだ後、Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣ７！（ｐＨ８，０）中にジアミノベンジジ
ン及び過酸化水素を含有する溶液と共にインキュベート
することにより、結合した酵素接合体を検出する。

Ｍ、ニューモニア陽性対照を含むレーンにおいて、約４
３．０００の分子量に暗いバンドが出現する。

Ｌ、ニューモフィラ陽性対照を含むレーンにおいて、分
子量約２９，０００に暗いバンドが出現する。クラミジ
ア陽性対照を含むレーンにおいて、色素フロントに現わ
れる分子量約５，０００のに暗いバンドが出現する。

患者の検体を含むレーンにおいて、Ｍ、ニューモニア陽
性対照に対応する４３．０００の分子量に暗いバンドが
出現する場合このサンプル中にＭ、ニューモニアが存在
する。Ｌ、ニューモフィラ陽性対照に対相する２９　、
０００の分子量に暗いバンドが出現する場合、このサン
プルはり、ニューモフィラを含有する。クラミジア陽性
対照に対応する５、　０００の分子量に暗いバンドが出
現すれば、このサンプル中にクラミジアが存在する。

幾つかの検体は、２９，０００　、４３，０００、又は
５，０００以外の分子量に対応する暗いバンドを示す。

これらは非特異的反応として説明され、そして陰性であ
る。

叉−御飯 １、　　Ｄｅａｎ＋　１９８１．　Ｍｙｃｏｐｌａｓｍ
ａｌ　Ｐｎｅｕｍｏｎｉａｓ　ｉｎ　ｔｈｅＣｏｍｍｕ
ｎｉｔｙ　Ｈｏ５ｐｉｔａ１．　Ｃ１１ｎｉｃｓ　ｉｎ
　ＣｈｅｓｔＭｅｄｉｃｉｎｅ　　２　：　１２１−１
３１゜２、　　Ｅｄｅｌｓｔｅｉｎ等、１９８５．　Ｃ
ｌ１ｎｉｃａｌ　Ｕｔｉｌｉｔｙ　ｏｆａ　Ｍｏｎｏｃ
ｌｏｎａｌ　Ｄｉｒｅｃｔ　Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　
ＲｅａｇｅｎｔＳｐｅｃｉｆｉｃ　ｆｏｒ　　７上！ａ
　　ｎｅｕｍｏ　ｈｉｌａ　　：Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖ
ｅ　５ｔｕｄｙ　Ｗｉｔｈ　０ｔｈｅｒ　Ｒｅａｇｅｎ
ｔｓ。

Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｍｉｃｒｏ、　２２　：　４１９−４２
１゜以下余白 ３、　　Ｅｒ１ｉｃｈ等、１９７９．　Ｆｉｌｔｅｒ　
Ａｆｆｉｎｉｔｙ　Ｔｒａｎｓｆｅｒ：Ａ　ｎｅｗ　ｔ
ｅｃｈｎｉｑｕｅ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｉｎ　　５ｔｔｕ
ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　　ｏｆ　　ｐｒｏｔｅ
ｉｎｓ　　ｉｎ　　ｇｅｌｓ、Ｊ。

Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ　　２５４　　：　１２，２４０
−１２，２４７　。

４、　　Ｆｉｎｅｇｏｌｄ等、１９８５．　Ｌｏｗｅｒ
　Ｒｅ５ｐｉｒａｔｏｒｙＴｒａｃｔｒｎｆｅｃｔｉｏ
ｎ、　Ａｍｅｒ、Ｊ、　Ｍｅｄ、　７９　（３５Ｂ）　
ニア３−７７　　。

５、　　Ｈｅｒｓ＋　　１９６３．Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅ
ｎｔ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｉｎ　　
Ｒｅ５ｐｉｒａｔｏｒｙ　Ｄｉｓｅａｓｅ、　　Ａｍ、
　　Ｒｅｖ、　　Ｒｅ５ｐ。

Ｄｉｓ、　　８８　：　３１６−３３３　。

６、Ｌｅｉｎｍｅｎ等、１９７８．　Ｃｏｍｐａｒｉｓ
ｏｎ　ｏｆ　ｃｏｕｎｔｅｒ−ｃｕｒｒｅｎｔ　　ｉｍ
ｍｕｎｏｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ、　　ｌａｔ
ｅｘａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｒａａｉｏ
ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ　　１ｎｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　
　ｏｆ　　ｓｏ！ｕｂｌｅ　　ｃａｐｓｕｌａｒ　　ｐ
ｏｌｙ−ｓａｃｃｈａｒｉｄｅ　ａｎｔｉｇｅｎｓ　　
ｏｆ　　Ｈａｅｍｏ　ｈｉｌｕｓｉｎｆｕｅｉｎｚａｅ
　　ｔｙｐｅ　　ｂ　ａｎｄ　　Ｎｅ１ｓｓｅｒｉａ７
±ｉｓ　ｏｆ　ｇｒｏｕｐ　Ａ　ｏｒ　Ｃ，Ｊ、　Ｃｌ
１ｎ、　Ｐａｔｈ。

旦：　１１７２−１１７６゜ ？、　　Ｄｒｏｕｉｌｌａｒｄ等、Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ
　ｏｆ　ＡｄｄｉｔｉｏｎａｌＰｒｏｔｅｉｎｓ　　Ｉ
ｍｐｌｉｃａｔｅｄ　　ｉｎ　　Ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ　
ａｎｄＨｅｍａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ　ｏｒ　　ル浅立酊
ユ計！７゜Ａｂｓｔｒａｃｔｓ　　ｆｏｒ　　１９８５
　　八ｎｎｕａｌ　　Ｍｅｅｔｉｎｇ　　ｏｆ　　ｔｈ
ｅＡｍｅｒｉｃａｎ　　５ｏｃｉｅｔｙ　　ｆｏｒ　　
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　　Ａｂｓｔ。

Ｇ２０　　。

８、Ｋａｈａｎｅ等、１９８５　１２月、　Ｄｅｔｅｃ
ｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅＭａｊｏｒ　　Ａｄｈｅｓｉｎ
　　ＰＩ　　ｉｎ　　Ｔｒｉｔｏｎ　　５ｈｅｌｌｓ　
　ｏｆＶｉｒｕｌｅｎｔ　　勺μ狙りμ！ｖ旦す卯±ａ
ｅ、　　Ｉｎｆ、＆Ｉｍｍｕｎ、　５０　（Ｎ［Ｌ　３
　）：９４４−９４６　。

９、　　ＭｃＫｅｌｌｅｒ、１９８５．Ｔｒｅａｔｍｅ
ｎＬ　ｏｆ　　Ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ−Ａｃｑｕｉｒｅｄ
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１０、　Ｔｈｉｒｕｍｏｕｒｔｈｉ等、１９７９．　Ｊ
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１１、　　Ｔｏｗｂｉｎ等、　１９７９．　　Ｐｒｏｃ
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Ｕ、Ｓ、Ａ、刀し４３５０−４３５４　。

１２、　Ｔｕｌｌｙ等、１９７９．　Ｅｎｈａｎｃｅｄ
　ｌ５ｏｌａｔｉｏｎ　ｏｆ５ｋ」１旦胛鼠稈咀μ恕ユ
ｕ狙ｆｒｏｍ　　ｔｈｒｏａｔ　ｗａｓｈｉｎｇｓｗｉ
ｔｈ　　ａ　　ｎｅｗｌｙ　ｍｏｄｉｆｉｅｄ　　ｃｕ
Ｈｕｒｅ　ｍｅｄｉｕｍ、Ｊ。

Ｉｎｆ、　Ｄｉｓ、　１３９　　：　４７８−４８２゜
１３、　Ｗｉｅｒｎｉｋ等、１９７８．　Ｔｈｅ　Ｖａ
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ｃａｌ　　Ｄｉａｇｎｏｓｊｓ　ｏｆ　　Ａｃｕｔｅ　
Ｒｅ５ｐｉｒａｔｏｒ□Ｔｒａｃｔ　　［ｎｆｅｃｔｉ
ｏｎｓ　　ｄｕｅ　　ｔｏ　　Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｉ
　ａｎｄ小浅Ｊ１且すｖλ猛μ■ユｕ馴５ｃａｎｄ、　
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１４、　Ｔｏｗｂｉｎ等、米国特許ｍ　４，４５２，９
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１５、　Ｂｉｔｔｎｅｒ等、１９８０．　Ｅｌｅｃｔｒ
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ｉｎｓ　ａｎｄ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　ｆｒｏ
ｍ　５ｌａｂＧｅｌｓ　　ｔｏ　　ロｉａｚｏｂｅｎｚ
ｙｌｏｘｙｍｅｔｈｙｌ　　Ｃｅ１ｌｕｌｏｓｅ　　ｏ
ｒＮｉｔｒｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ　５ｈｅｅｔｓ、　Ａ
ｎａｌ、　Ｂｔｏｃｈｅｍ。

刊２　　：４５９−４７１゜ １６、　Ｔｏｈｂｉｎ等、１９８４．１ｍｍｕｎｏｂｌ
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４５　：　７９−９４゜ １８、　Ｇａ目０等、米国特許Ｉｔ　４，５２０，１１
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１９、　Ｃａｌｄｗｅｌｌ等、Ｐｌａｙ、　１９８４．
門ｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉ−ｂｏｄｙ　Ａｇａｉ
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ｇｅｎ　ｏｆｌ　　　　　助１本Δ±ａ　　５ｐｅｃｉ
ｅｓ　：　Ｌｏｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅＥｐｉｔｏ
ｐｅ　ｏｎ　Ｃｈｌａｍｙｄｉａｌ　Ｌｉｐｏｐｏｌｙ
ｓａｃｃｈａｒｉｄｅ。

Ｉｎｆ、　＆　１ｍｔ＠ｕｎ、４４　（ｆｌｈ　２　）
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８４　１２月、　　Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆ
　ａ　５ｐｅｃｉｅｓ−５ｐｅｃｉｆｉｃ　Ａｎｔｉｇ
ｅｎ　ｉｎ７±１ａ　　月μ遍■がユａ　　ｂｙ　ａ　
ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｙ、　Ｊ、　Ｃｌ
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２１、　Ｋｕｒｉｙａｍａ等、１９８２．　ＪＮＣｌ、
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、１９７２．８ｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒ
ｅｓ。

Ｃｏｍｍｕｎ、　　４６　：　２１０７−２１１３゜２
３、　Ｌｊｕｎｇｇｒｅｎ等、１９７６、　Ａｃｔａ　
Ｅｎｄｏｃｒ４ｎｏ１８１　：４８７−４９４　　。

２４、　　Ｈａｙｎｅｓ等、１９７７、　　八ｎｎ、　
　Ｃｉｎ、　　８ｉｏｃｈｅｍ、　１４　　：１２〜１
５　。

２５、　Ｖｉｈｋｏ等、１９８１．　Ｍｕｌｔｉｃｏｍ
ｐｏｎｅｎｔＲａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ　：　
Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ　Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｏ
ｆ　Ｃｈｏｒｉｏｍａｍｍｏｔｒｏｐｉｎ　ａｎｄ　Ｐ
ｒｅｇｎａｎｃｙ−３ｐｅｃｉｆｉｃβ、−Ｇｌｙｃｏ
ｐｒｏｔｅｉｎ　ｉｎ　Ｐｒｅｇｎａｎｃｙ　Ｓｅｒｕ
ｍ。

Ｃｉｎ、　Ｃｈｅｍ、　２７　：　１７４４−１７４６
゜２６、　Ｆｒ１ｄｌｅｎｄｅｒ等、米国特許１ｋ　４
，３１５，９０７゜Ｃｏｍｂｉｎｅｄ　　Ｈｅｔｅｒｏ
　ｅｎｅｏｕｓ　Ｓ　ｅｃｉｆｉｃ　Ｂｉｎｄｉｎ−船
ト徂ｙ、１９７９年１０月２９日出願、１９７９年２月
１６日発行。

２７、　Ｇｅｈｌｅ等、Ｊ、　ｒｍｍｕｎｏｌ、　Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ　、　２６　：　３８１−３８９　（１９７
９）。

２８、　Ｂｌａｋｅ等、１９８２．　Ｃｌ１ｎ、Ｃｈｅ
ｍ、２８　：　１４６９−１４７３　。

猪−一輪 この発明は、多数の病原体の分別診断又は同時検出を行
うために臣ｎ床医により現在必要とされている迅速診断
試験を提供する。臨床検査室において現在使用されてい
る診断法において本質的な長い待ち時間及び不正確さが
この発明の診断法により除去される。

さらに、この発明はＭ６ニユーモニア怒染の診断法を提
供する。この発明は臨床医により現在必要とされている
迅速診断試験を提供する。

この明細書に記載された具体例に加えて、この発明の範
囲内において多くの変更を行うことができよう。

【図面の簡単な説明】

第１図はラビットポリクローナル抗体及び？ＩＡｂＭＰ
１６Ｃ９のイムノブロットを示す。Ｍ、ニューモニアの
全体生物体又は精製された脱調製物のＳＯＳ　−ＰＡＧ
Ｅグラジェントゲルを電気泳動的にニトロセルロース紙
に移行せしめ、そしてラビット−ポリクローナル抗−Ｍ
、ニューモニア血清の１：２０Ｏｆ４釈物又ハＭＡｂ　
ＭＰＩ６Ｃ９腹水ノ１：５０ＱＯ稀釈物と反応せしめた
ものである。 図中、レーン１はＭ、ニューモニア全体生物体をラビッ
ト−ポリクローナル抗血清でプローブしたものであり；
レーン２はＭ、ニューモニア全生物体をＭＡｂ　ＭＰ１
６Ｃ９によりプローブしたものであり：そしてレーン３
は精製されたＭ、ニューモニア膜調製物をＭＡｂ　ＭＰ
１６Ｃ９によりプローブしたものである。結合した抗体
を抗ラビット又は抗マウス−ボースラブイソシュバーオ
キシダーゼ接合抗血清により検出した。３，３′−ジア
ミノベンジジン四塩酸塩を塩化ニッケルと共に色原体と
して使用した。 第２図は５Ｏ５−ＰＡＧＥゲル上でのマイコプラズマ種
のプロフィールを示す。この６〜２０％アクリルアミド
・スラブ・グラジェントゲルは銀染色したものである。 レーン１はＭ、ニューモニア、レーン２はＭ、オラレ（
Ｍ、　ｏｒａｌｅ）　、レーン３はＭ。 サリバリウム（Ｍ、ｓａｌｉｖａｒｉｕｍ）、レーン４
はＭ。 ブッカレ（Ｍ、　ｂｕｃｃａｌｅ）　、レーン５はＭ、
ファウシウム（Ｍ、　ｆａｕｃｉｕｍ）、レーン６はＭ
、ホミニス７１国）、レーン７はＭ、リポフィルム（Ｌ
ｕＬ餅旦憇）　、そしてレーン８はＭ、ファーメンタン
ス（Ｍ、ｆｅｒｍｅｎ　ｔａｎｓ）についての結果を示
す。 第３図はＭＡｂ　ＭＰ１６Ｃ９を用いるマイコプラズマ
種のイムノブロット分析を示す。種々のマイコプラズマ
種の全体生物体の５Ｏ５−ＰＥＧＥゲルを電気泳動的に
ニトロセルロース紙に移し、そしてＭＡｂ　ＭＰ１６Ｃ
９腹水のｌ二５０００稀釈物でプローブした。レーン１
はＭ、ニューモニア、レーン２はＭ、サリバリウム、レ
ーン３はＭ、オラレ、レーン４はＭ、リポフィルム、レ
ーン５はＭ、ホミニス、レーン６はＭ、ファウシウム、
レーン７はＭ、ファーメンタンス、そしてレーン８はＭ
、プソカレについての結果を示す。 第５図は異型肺炎患者からの喀痰検体中の４３、ＯＯＯ
ＭＷのＭ、ニューモニアポリペプチドについてのイムノ
ブロット分析を示す。レーン１は４３、ＯＯＯＭＷポリ
ペプチドの位置のための陽性対照としてのＰＢＳ中Ｍ、
ニューモニア、そしてレーン２〜１３は喀痰検体につい
ての結果を示す。Ｍ。 ニューモニア４３．０００ＭＷポリペプチドと同時移動
する単一バンドがレーン３．５，６．７，１０、及びｌ
ｌ中の喀痰において現われた。２ 第６図は喀痰中のＭ、ニューモニア４３．０００　Ｍ　
ＷポリペプチドについてのＭＡｂイムノブロット・アッ
セイの感度を示す。レーン１はあらかじめ染色された分
子量マーカーであり、レーン２は１６００ｎｇ／ｍＪの
スパイクされた（ｓｐｉｋｅｄ）　Ｍ、ニューモニア、
レーン３は８００ｎｇ／ｍｌ、レーン４は４００ｎｇ／
ｍｊ！、レーン５は２００ｎｇ／ｍｌ。 レーン６は１１００ｎ／ｍｊ！、レーン７はｓｏｎｇ／
　ｍ　ｌ　、レーン８は２５ｎｇ／ｍＡ、レーン９は１
２．５ｎｇ／ｍｌ、レーン１０はスパイクされない喀痰
についての結果を示す。４３．０００ＭＷイムノプイム
ノブロットはレーン２〜６において検出された。 ８７０は、Ｍ、ニューモニア培養確認された喀痰及び培
養されない異型肺炎喀痰のＭＡｂイムノブロット分析を
示す。レーンｌはあらかじめ染色された分子量マーカー
であり、レーン２はＭ。 ニューモニア４３．ＯＯＱＭＷ陽性対照、レーン３，４
及び５は培養確認された喀痰、そしてレーン５〜１０は
異型肺炎喀痰についての結果を示す。 第８図は、咽頭炎を有する患者からのＭ、ニューモニア
培養確認された咽喉綿棒のイムノブロット分析を示す。 レーン１はあらかじめ染色された分子量マーカーであり
、レーン２はＭ、ニューモニア４３．ＯＯＯＭＷ陽性対
照であり、レーン３〜１０は咽頭炎患者からの咽喉綿棒
についての結果である。Ｍ、ニューモニア４３．ＯＯＯ
ＭＷポリペプチドと同時泳動するイムノブロットのバン
ドはレーン２〜７，９、及び１０において検出された。 第９図は臨床検体の試験の結果を示す。 レーン１：マイコプラズマ・ニューモニアの陽性対照４
３Ｋ、 レーン２：レジオネラ・ニューモフィラの陽性対照２９
Ｋ、 レーン３，４、及び５：異型肺炎患者からのマイコプラ
ズマ・ニューモニア培養も育認陽性喀痰検体、 レーン６．７、及び８：異型肺炎患者からのレジオネラ
・ニューモフィラ培養確認陽性 喀痰検体。 第１０図は、スパイクされた喀痰検体における、約４３
にの分子量を有するＭ、ニューモニアのポリペプチド、
及び約２９にの分子量を有するレジオネラ・ニューモフ
ィラのポリペプチドの検出における同時モノクローナル
抗体イムノブロット・アッセイの感度を示す結果である
。 Ｍ、ニューモニア　　Ｌ、ニューモフィーレーン１　：
　　３２００ｎ　ｇ／ｍｌ　　　　　８００ｎ　ｇ／ｍ
ｌレーン２　：　　１６００ｎ　ｇ／ｍｌ　　　　　４
００ｎ　ｇ／ｍｌレーン３　：　　　８００ｎ　ｇ／ｍ
ｌ　　　　　２００ｎ　ｇ／ｍｌレーン４：　　　４０
０ｎｇ／ｍｌ　　　　１１００ｎ／ｍ／レーン５　：　
　　２００ｎ　ｇ／ｍ　ｌ　　　　　５０ｎ　ｇ／ｍ　
ｌレーン６：　　　１１００ｎ／ｍｌ　　　　２５ｎｇ
／ｍｌレーン７：　　　５０ｎｇ／ｍＪ　　　１１２−
５ｎ／ｍ／レーン８：　　　２５ｎｇ／ｍｊ２　　６６
−３ｎ／ｍｌレーン９：スパイクされない喀痰 レーン１〜６において約４３にの分子量を有するＭ、ニ
ューモニア抗原、及びレーン１〜４において約２９にの
分子量を有するし、ニューモニア抗原について、陽性の
イムノブロットのバンドが検出された。両抗原について
の感度レベルは１１００ｎ／ｍ７！であった。 Ｗ ２９に− ＦＩＧ、　ｔ Ｆ９４，２　　　　　１２　３４　５　６　　７８Φ　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　σノー寸 Ｉ４Ｗ　　ｉ　　　２　　　３　　４　　５　　　　Ｑ
　　　７　　８ＦＩＧ、　９

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、約４３キロダルトンの分子量を有するマイコプラズ
   マ・ニューモニア（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ　ｐｎｅｕｍ
   ｏｎｉａｅ）膜ポリペプチド上のエピトープに結合する
   種特異的モノクローナル抗体。 ２、ＭＰ１６Ｃ９と命名される特許請求の範囲第１項に
   記載のモノクローナル抗体及びその機能的同等物。 ３、約４３キロダルトンの分子量を有するマイコプラズ
   マ・ニュモニア（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ　ｐｎｅｕｍｏ
   ｎｉａｅ）膜ポリペプチド上のエピトープに結合する種
   特異的モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ及
   びその子孫。 ４、Ｍ．ニューモニア（Ｍ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）と
   反応するが正常菌相のマイコプラズマ種とは反応しない
   特許請求の範囲第１項に記載のモノクローナル抗体。 ５、Ｍ．ニューモニア（Ｍ．Ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）感
   染を診断するためのウェスタン・イムノブロット・アッ
   セイにおいて使用することができる特許請求の範囲第１
   項に記載のモノクローナル抗体及びその機能的同等物。 ６、ウェスタン・イムノブロット・アッセイにおいて前
   記抗原に結合するモノクローナル抗体を用いることによ
   り臨床検体中の特定の疾患関連抗原を検出する方法。 ７、前記抗原が約４３キロダルトンの分子量を有するＭ
   ．ニューモニア（Ｍ．Ｐｎｅｕｒｍｏｎｉａｅ）膜ポリ
   ペプチドである、特許請求の範囲第６項に記載の方法。 ８、約４３キロダルトンの分子量を有するマイコプラズ
   マ・ニューモニア（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ　ｐｎｅｕｍ
   ｏｎｉａｅ）膜ポリペプチド上のエピトープに結合する
   種特異的モノクローナル抗体を含む、ウェスタン・イム
   ノブロット法を用いるＭ．ニューモニア（Ｍ．ｐｎｅｕ
   ｍｏｎｉａｅ）を検出するための診断キット。 ９、結合したモノクローナル抗体を検出するための指示
   系をさらに含む、特許請求の範囲第８項に記載の診断キ
   ット。 １０、検出されるべき各抗原に対して特異的なモノクロ
   ーナル抗体により単一のウェスタン・イムノブロット・
   アッセイにおいて種々の抗原を同時に検出する方法。 １１、２〜１０種類の抗原がイムノアッセイの標的であ
   る特許請求の範囲第１０項に記載の方法。 １２、使用されるモノクローナル抗体の１つが、約４３
   キロダルトンの分子量を有するＭ．ニューモニア（Ｍ．
   Ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）膜ポリペプチドに結合するネズ
   ミＩｇＧ１モノクローナル抗体である、特許請求の範囲
   第１０項に記載の方法。 １３、使用される他のモノクローナル抗体が、約２９キ
   ロダルトンの分子量を有するレジオネラ・ニューモフィ
   ラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ　ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）
   の種特異的抗原に結合する抗体である、特許請求の範囲
   第１２項に記載の方法。 １４、使用されるその他のモノクローナル抗体が、約５
   キロダルトンの分子量を有するクラミジア・トラコマチ
   ス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ　ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）又
   はクラミジア・プシッタシ（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ　ｐｓ
   ｉｔｔａｃｉ）の属特異的リポポリサッカラードに結合
   する抗体である、特許請求の範囲第１３項に記載の方法
   。 １５、分別診断法であって、 （ａ）診断のもとで患者により示される臨床症状の病因
   体（ｅｔｉｏｌｏｇｉｃ　ａｇｅｎｔ）についてそれぞ
   れが診断的（ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ）である複数のモノ
   クローナル抗体から成る適切なパネルを選択し； （ｂ）ウェスタン・イムノブロット・アッセイにおいて
   前記モノクローナル抗体を使用して前記患者からの１又
   は複数の臨床検体を試験し；（ｃ）試験結果において前
   記病因体からの標的抗原の適切な分子量に対応する特異
   的バンドの出現又は非出現を試験することにより、１又
   は複数の病因体を有するものとして患者を診断し、又は
   イムノブロットにより試験された病因体の１又は複数を
   病原体（ｃａｕｓａｔｉｖｅ　ａｇｅｎｔ）として除去
   する；段階を含んで成る方法。 １６、症状的に関連する病因体にそれぞれが結合する複
   数のモノクローナル抗体を含んで成るキット。