JPH02219596A

JPH02219596A - 心筋ミオシン重鎖に対する単一クローン抗体

Info

Publication number: JPH02219596A
Application number: JP1319321A
Authority: JP
Inventors: Yoshio Yazaki; 矢崎　義雄; Masato Sugi; 正人杉
Original assignee: Yamasa Shoyu KK
Current assignee: Yamasa Shoyu KK
Priority date: 1989-12-09
Filing date: 1989-12-09
Publication date: 1990-09-03
Also published as: JPH0320240B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】本発明は、ヒト心筋ミオシン重鎖のアイソザイムに対し
て特異性を有する新規な単一クローン抗体に関するもの
である。

近年、特異性の高い抗体を大量に得る方法として、抗体
産生細胞と骨髄腫細胞を融合し、ハイブリドーマ（融合
細胞）を作製し、これを培養することにより単一クロー
ン抗体を産生ずる方法（ミルシュタインら、　Ｎａｔｕ
ｒｅ、　Ｖｏｌ、　２５６．ｐ　４９５（１９７５））
が知られ、多数の単一クローン抗体が取得されている。

一方、筋研究の分野において筋蛋白質に対する抗体を利
用することは以前から行われている。筋は、横紋筋と平
滑筋の２つに大別され、さらに横紋筋は心筋と骨格筋に
、骨格筋では速筋と遅筋に分けることができる。これら
は筋の主要構成成分であるミオシン分子の抗原性の差に
よっても免疫化学的に区別できる二とが報告されている
（真暗ら、Ｊ、Ｂｉｏ、Ｃｈａｍ、、　Ｖｏｌ、　７６
、　ｐ４４１　（１９７４））。

最近、心筋に関しても、ＡＴＰａｓｅ活性の高いＶ、（
（Ｅ型）とＡＴＰａｓｅ活性の低いＶａ（β型）の２つ
のアイソザイムのあることが明らかになった（矢崎ら、
　Ｃ１ｒｃｕｌａｔｉｏｎ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、Ｖｏｌ
、　３５　。

ｐ１５　（１９７４）、ホーら、　Ｊ、Ｍｏ１．Ｃｅ１
ｌ。

Ｃａｒｄｉｏｌ、　Ｖｏｌ、　１０．　Ｐ　１０５３　
（１９７８）　）　−一般にヒト、ウシ、イヌなどの動
物では、心房筋はすべてＶユ（α型）であり、心室筋は
ほとんどＶ３（β型）と考えられる。したがって、α型
。

β型を識別できるような単一クローン抗体を作ることが
できれば、心房筋と心室筋をビオチンーアビジン系染色
方法などにより染め分けることができる。さらに、これ
らの抗体を放射性同位元素でラベルして心筋梗塞の部位
別診断に用いることもできる。

クラークらは、ニワトリおよびウサギ心筋ミオシンをマ
ウスおよびラットに免疫し、心筋ミオシン重鎖と反応す
る単一クローン抗体を取得している（Ｂｉｏｃｈａｍ、
Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍｕｎ、　Ｖｏｌ、　
９５　。

ｐ１６８０　（１９８０））、このうちの１株はニワト
リの心筋に特異的でヒト心筋とは反応しない。

他の２株は、ニワトリ、ウサギ、ラットの心筋と反応し
、ヒト心筋とも反応すると述べているが、骨格筋との反
応も見られ、心筋に対して特異的なものではない、また
、ヒトの心筋ミオシンのα型とβ型を識別できるもので
はない。

さらに、クラークらは、ニワトリ心筋ミオシンまたはウ
サギ心筋ミオシンで免疫して心筋ミ重鎖ノ重鎖ｖ２型お
よび心筋ミ重鎖ノ重鎖ｖ３型に対する単一クローン抗体
を得ている（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　。

Ｖｏｌ、２５７．ｐ５４４９　　（１９８２））、　し
かしながら、これらの抗体は、互いのアイソザイムにも
交差反応性を示し、またヒト心筋ミオシンに対する特異
性も明らかではない。

本発明は、このような技術背景のもとに完成されたもの
であり、ヒト心筋ミオシン重鎖のアイソザイムに対して
特異性を有する単一クローン抗体を提供するものである
。さらに具体的には、ヒト心筋ミオシン重鎖α型に対し
て特異性を有し、ヒト心筋ミオシン重鎖β型およびヒト
骨格筋を実質的に認識しないＩｇＧクラスに属する単一
クローン抗体、ならびにヒト心筋ミオシン重鎖β型に対
して特異性を有し、ヒト心筋ミオシン重鎖α型およびヒ
ト骨格筋を実質的に認識しないＩｇＧクラスに属する単
一クローン抗体を提供するものである。

本発明抗体は、心筋ミオシンのアイソザイムを識別し、
ヒト骨格筋を実質的に認識しない特性を有する点で従来
公知の抗体と区別される。

本発明抗体の調製法、調製形態については特に限定され
ず、目的に応じて適宜に選択されるべきである０本発明
抗体を産生ずるハイブリドーマは一般の細胞融合法を応
用して得ることができる。

このような細胞融合法について説明すれば次のとおりで
ある。

■　抗体産生細胞の調製抗体産生細胞の調製は、ヒト心房筋ミオシン（α型）、
ヒト心室筋ミオシン（β型）、あるいはウシ、ウマ、ブ
タなどから調製された免疫化学的にヒト心筋ミオシンα
型もしくはβ型と同等の心筋ミオシンをマウス、ラット
、ウサギ。

ヒツジ、ウマ、ウシなどの異種動物に免疫し。

その免疫を獲得した肺細胞、胸腺細胞、リンパ節細胞お
よび／または抹梢血細胞の抗体産生細胞を取得すること
により行う。

■　ミエローマ細胞の調製ミエローマ細胞としては、マウス、ラット。

ウサギ、ヒトなどの種々の動物の細胞株を適用できる。

使用する細胞株は、好ましくは薬剤抵抗性のものであり
、未融合の状態では選択培地で生存できず、融合した状
態で生存できる性質を有するものであることが好ましい
。最も普通に用いられるのは、８−アザグアニン抵抗性
の細胞株であり、これはヒボキサンチン・ホスホリボシ
ルトランスフェラーゼ（ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅｐｈ
ｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌ　ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）
を欠損し、ヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジン
（ＨＡＴ）培地に生育できない性質を有する。また。

いわゆる「非分泌型」の細胞株であることが好ましい、
このような細胞株の具体例としては、マウスミエローマ
・ＭＯＰＣ−２１ライン由来のＰ３／　Ｘ　ｓ　３−Ａ
ｇ３　Ｕｌ　（Ｐ３　ＵＫ）　、ｐｉ／　ｘ６３−Ａｇ
８−６−５−３　（Ｘ６３，６−５−３）。

Ｐ３／　ＮＳ　Ｉ　　Ｉ　　Ａｇ４−１　（ＮＳ　　１
）　、　Ｓｐ２１０−Ａｇ１４　（ＳＦ３）、ラットミ
エローマ２１ＣＩＲＣＹ３Ａｇｌ・２・３（Ｙ３・Ａｇ
ｌ。

２．３）　、ヒトミエローマＵ−２６６−ＡＲい０Ｍ１
５００などを挙げることができる。

■　細胞融合細胞融合は、イーグル最少基本培地（ＭＥＭ）、ＲＰＭ
Ｉ　　１６４０などの動物細胞培養用培地中で１０’〜
１０”のミエローマ細胞と抗体産生細胞を混合比１：４
〜１０で混合して行う。融合促進剤としては平均分子斌
１０００〜６０００のポリエチレングリコール（ＰＥＧ
）をはじめ、ポリビニルアルコール、ウィルスなどが使
用される。

■　選択培地におけるハイブリドーマの選別細胞融合処
理後の胴胞からハイブリドーマを選別するには選択培地
における選択的増殖により行う、たとえば、細胞を１５
％ウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ　　１６４０培地などで適
当に希釈し、マイクロタイタープレート上に１０ｓ〜１
０６／ウ工ル程度にまき、各ウェルに選択培地（たとえ
ば、ＨＡＴ培地など）を加え、以後適当に選択培地を交
換して培養する。たとえばミエローマ細胞として８−ア
ザグアニン抵抗性株１選択培地としてＨＡＴ培地を用い
れば、未融合のミエローマ細胞は培養１０日目前らいま
でに死滅し、また正常細胞である抗体産生細胞もｉｎ　
ｖｉｔｒｏでは長期間生育できない。したがつて、培養
１０〜１４日目から目前してくる細胞はすべてハイブリ
ドーマとなる。

■　抗ヒト心筋ミオシン重鎖α型抗体および抗ヒト心筋
ミオシン重鎖β型抗体産生ハイブリドーマの検索抗ヒト心筋ミオシン重鎖α型抗体産生ハイブリドーマお
よび抗ヒト心筋ミオシン重鎖β型抗体産生ハイブリドー
マの検索は、酵素免疫測定法（Ｅｎｚｙｍｅ　Ｌｉｎｋ
ｅｄ　Ｉｍｍｕｎｏ　５ｏｒｂｅｎｔ　Ａｓ５ａｙ。

ＥＬＩＳＡ）によって行った。

すなわち、ウシ心房筋ミオシンなどの心筋ミオシン重鎖
α型またはヒト心筋ミオシンなどの心筋ミオシン重鎖β
型を予め１０〜１１００ＩＩ／ＩＩＩＱにりん酸緩衝生
理食塩水（ＰＢＳ）、炭酸水素ナトリウム（ｐＨ８，０
）などの緩衝液に溶解させ、ＥＬＩＳＡ用ポリ塩化ビニ
ル（ＰＶＣ）などのソフトプレート（９６穴）に５０７
Ｊずつ添加し、４℃で一晩放置する１次に上記抗原を捨
て、ＰＢＳで洗浄後、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ
）含有ＰＢＳを加えて室温で１時間静置し、抗原の結合
していない部位をＢＳＡでブロックする。ハイブリドー
マの上清を５０−ずつ加え、室温で１時間放置し、ＰＢ
Ｓで３回洗浄する０次に抗マウスイムノグロブリン抗血
清（第２抗体）をビオチン化したものを加え、室温で１
時間放置する。ＰＢＳで３回洗浄後、アビジンＤ−酵素
結合体を加え、室温で１５分間静置する。ＰＢＳで４回
洗浄後、酵素の基質を加えて発色させる。

抗原と結合力のある抗体を産生じている培養上清を加え
たウェルは１以上の操作で容易に判別でき、ハイブリド
ーマの検索を行うことができる。

■　クローニング各ウェル中には２種以上のハイブリドーマが生育してい
る可能性があるので、限界希釈法などによりクローニン
グを行い、単一クローン抗体産生ハイブリドーマを取得
する。

■　抗体の産生最も純粋な単一クローン抗体は、その産生ハイブリドー
マを１０〜１５％ウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ　　１６４
０培地などの動物細胞培養用培地または無血清培地で培
養し、その培養上清液から得ることができる。その細胞
培養法および条件は、通常の動物細胞培養法のものを適
宜に応用すればよい。

一方、さらに大量に抗体を生産する方法として、ハイブ
リドーマの親ミエローマ細胞の由来動物と同系動物にブ
リスタン（２，６，１０゜１４−テトラメチルペンタデ
カン）などの鉱物油を腹腔内に投与した後、ハイブリド
ーマを腹腔的投与して大量に増殖させる方法を採用する
ことができる。ハイブリドーマは１０〜１８日はどで腹
水腫瘍を形成し、血清および腹水中に高濃度（約１〜２
０■／　ｍＱ　）の抗体が生産される。精製を必要とす
る場合には、腹水を硫安分画後、ＤＥＡＥセルロースイ
オン交換クロマトグラフィー、心筋ミオシンを結合させ
たセファロース４Ｂなどを用いたアフィニティカラムク
ロマトグラフィー１分子ふるい力ラムクロマトグラフィ
ーなどによって精製することにより目的を達成すること
ができる。

本発明抗体を生産するに好適なハイブリドーマの例とし
て、ヒト心筋ミオシン重鎖α型に特異性を有する抗体産
生株としてはハイブリドーマＣＭＡ−１９株、ヒト心筋
ミオシン重鎖β型に特異性を有する抗体産生株としては
ハイブリドーマＨＭＣ−１４株１ＭＭＣ−４８株、ＨＭ
Ｃ−５０株などが取得されている。

以下、こられのハイブリドーマの調製法と、それらから
生産される本発明抗体の性質についてより具体的な説明
を加える。

■、ハイブリドーマの　得ウシ心房筋ミオシン（１■／鵬Ｑ）またはヒト心室筋ミ
オシン（１■／−）を生理食塩水に溶解させ、完全フロ
インドアジュバントと１＝１で混合してエマルジョンと
したものを、ＢＡＬＢ／Ｃマウス（雌、６週令）に２週
問おきに５０尾を数回腹腔内投与し、最後にウシ心房筋
ミオシンまたはヒト心室筋ミオシン３０７４を静注した
。

最終免疫から３日後にマウスの牌細胞を取り出し、ＭＥ
Ｍで洗浄した。マウスミエローマＰ、Ｕ工をＭＥＭで洗
浄し、牌細胞とＰ、Ｕｌを１０：１で混合して遠心後、
ペレットに５０％ＰＥＧ１００ＯＭＥＭ溶液１−を徐々
に加えて細胞融合を行わせた。さらにＭＥＭ溶液を徐々
に加え、最終的に１０−とじた。再び遠心し、ペレット
を１５％ウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ　　１６４０培地に
Ｐ、Ｕｌとしてｌ　Ｘ　１０’ｃａｌｌ／　０　、１　
ｍＱとなるように懸濁させ、９６ウエルマイクロプレー
トにＯ，１ＷａＱずつまいた。

１日後、ＨＡＴ培地を０．１−ずつ添加し、その後３〜
４日ごとに培地の半分量を新しいＨＡＴ培地で交換した
。７日目あたりから、いくつかのウェルでハイブリドー
マの生育が認められた。

ハイブリドーマが生育してきたウェルの上清５０縛ずつ
をそれぞれ予めウシ心房筋ミオシン（α型）またはヒト
心室筋ミオシン（β型）でコートした９６穴ソフトプレ
ートに添加した。アビジンロー酵素結合体としてアビジ
ンローペルオキシダーゼ（ベクター社製）、基質および
発色剤として過酸化水素、゛４−アミノアンチピリン、
フェノールを用いて前記したＥＬＩＳＡ法により、ウシ
心房筋ミオシンとは反応するが、ヒト心室筋ミオシンと
は反応しなもの（この上清中に心筋ミオシン重鎖α型に
特異性を有する単一クローン抗体が含まれる）、および
ヒト心室筋ミオシンとは反応するが、ウシ心房筋ミオシ
ンとは反応しないもの（この上清中に心筋ミオシンβ型
に特異性を有する単一クローン抗体が含まれる）を選び
、限界希釈法によりクローニングを行った。

その結果、心筋ミオシン重鎖α型に特異性を有する抗体
を産生ずるハイブリドーマＣＭＡ−１９株と、心筋ミオ
シン重鎖β型に特異性を有する抗体を産生ずるＨＭＣ−
１４株、ＨＭＣ−４８株、ＭＭＣ−５０株を取得した。

■、単一クローン　体の産生ハイブリドーマＣＭＡ−１９株、ＨＭＣ−１４株、ＨＭ
Ｃ−４８株、ＨＭＣ−５０株をそれぞれ１５％ウシ胎児
血清含有ＲＰＭＩ　　１６４０培地で９６ウエルプレー
ト、２５ｄフラスコ、７５ａＪフラスコとスケールアッ
プしながら培養し、培養上清を集めた。

これらの上清中の抗心筋ミオシン抗体の力価をＥＬＩＳ
Ａ法により測定した結果を第１表に示した。なお、力価
は、固定化された抗原に対して十分社の抗体が存在する
試料についてＥＬＩＳＡ法により得られた吸光度を１０
０％とし、その値の５０％を与える抗体試料の原液から
の希釈倍率で表わした。

なお、これらの抗体のヒト骨格筋との交差性はほとんど
認められなかった。

■、　　のサブクラ゛スの９６穴ソフトマイクロプレートに各単一クローン抗体を
コートし、１％ＢＳＡ含有ＰＢＳでブロッキングした後
、ＭＯＮＯＡＢＩＤ　　ＥＩＡ　　ＫＩＴ　（ＺＹＭＥ
Ｄ社製）により抗ＩｇＡ抗体、抗ＩｇＧ、抗体、抗Ｉｇ
Ｇ、ａ抗体、抗ＩｇＧ、ｂ抗体。

抗ＩｇＧ、抗体、抗ＩｇＡ抗体との反応をみて。

各単一クローン抗体のサブクラスを決定した。

またＬ鎖の抗に抗体、抗λ抗体との反応性を調べてタイ
プを決定した。

その結果、ＣＭＡ−１９株の産生ずる抗体はＩｇＧ１／
に、ＨＭＣ−１４株の産生ずる抗体はＩ　ｇ　Ｇ、ａ／
　Ｘ、ＨＭＣ−４８株およびＭＭＣ−５０株の産生ずる
抗体はＩ　ｇ　Ｇ　、ｂ／にであることが判明した。

■、−日　　による組　染心臓弁膜症等の心臓手術時に採取したヒト心房筋、心室
筋をＴｉ５ｓｕｅ−Ｔ　Ｅ　Ｋ　ＩＩにより固定した後
。

クリオスタットにより切片標本を作製した。

これらの切片標本を本発明抗体を用いてビオチすなわち
、切片標本をＰＢＳ　（０，５１Ｍ。

ｐＨ７，２）にて、−次抗体として本発明抗体と４０分
間、３７℃でインキュベーションした。その後、再度洗
浄した後、二次抗体として抗マウスＩｇＧビオチン標識
抗体（Ｔａ２Ｏ社、ヒト肝ホモジネートおよび血清で吸
収後、２０倍希釈したものを使用）を同様に反応させた
。さらに再度洗浄後、フルオレセイン標識アビジン（Ｅ
、Ｙラボラトリーズ社、ヒト肝ホモジネート、血清にて
吸収したものを２０倍希釈したものを使用）と同様に反
応させ、これを洗浄したものをグリセリンにて封入し、
染色標本を作製した。

これらの標本を蛍光顕微鏡により検鏡した。その結果、
ＣＭＡ−１９株の産生ずる抗体を用いた場合は、正常人
心房筋では９５〜９６％の細胞が染色され（写真１参照
）、心室筋は１０％以下しか染色されなかった（写真２
参照）、また、ＨＭＣ−１４株の産生ずる抗体を用いた
場合は、心室筋がｌＯＯ％染色され（写真３参照）、心
房筋は２０〜３０％しか染色されなかった（写真４参照
）。

（正常人心房筋では２０〜３０％はαβの形で存在する
。）一方、心臓弁膜症の患者の心筋では、心房筋でＨＭＣ−
１４株の産生ずる抗体で染色される細胞が増加しく写真
５参照）、ＣＭＡ−１９株の産生ずる抗体で染色される
部分がその分だけ減少していた（写真６参照）、この現
象は、心臓弁膜症において心房筋がα型からβ型に変換
する病理学的変化を示唆している。

また、本発明抗体を用いた組織染色により心房圧と心房
筋中のＶ、ミオシンアイソザイム（β型）の割合との相
関をみた結果は第１図のとおりである。すなわち、正常
人では心房圧は５ｍｍ）１ｇ以下であり、β型アイソザ
イムは１０％以下と少ない。

一方、心臓弁膜症患者においては、心房圧が１０＋ｍＨ
ｇ以上となり、心房筋ミオシンのアイソザイムパターン
はα型が減少し、β型が増加する。

本発明抗体は１以上のようにヒト心筋ミオシン重鎖のア
イソザイムに特異性を有し、心筋についての生化学的、
病理学的研究に重要な試薬として有用である。さらに１
本発明抗体をテクネチウム、インジュウム等の放射性同
位元素で標識し、患者に投与後全身オートガンマ−で測
定するイムノデイテクションに応用すれば、心筋梗塞の
部位別診断が可能となる。特に心室筋梗塞と約２０％の
確立で合併がみられる心房筋梗塞の診断も可能となる点
で有用である。また１本発明抗体でイムノアッセイを行
うことにより、心筋梗塞時におけるミオシン重鎖の血中
への漏出を検出することも可能と考えられ、心筋梗塞の
予後の判定等に使用できる可能性がある。

【図面の簡単な説明】

第１図は１本発明抗体を用いた組織染色による心房圧と
心房筋中のｖ３ミオシンアイソザイム（β型）の割合と
の相関を示すものである。

Claims

【特許請求の範囲】

１）ヒト心筋ミオシン重鎖α型に対して特異性を有し、
ヒト心筋ミオシン重鎖β型およびヒト骨格筋を実質的に
認識しないＩｇＧのクラスに属する単一クローン抗体。