SU1726511A1 - Штамм гибридных культивируемых клеток MUS мUSсULUS L, используемый дл получени моноклональных антител к общим антигенным детерминантам инсулина человека и свиньи - Google Patents

Abstract

Использование: штамм гибридных культивируемых клеток Mus musculus L. BCKK (П) № 420. продуцирующий моноклональные антитела (МКА) к общим антигенным детерминантам инсулина человека и свиньи, используемый дл  количественного определени  инсулина с помощью иммуно- ферментного анализа (ИФА) или иммуноб- лоттинга. Сущность изобретени : получение МКА с повышенной константой аффинности к инсулину. Штамм получают в результате гибридизации спленоцитов мышей линии Balb/c с клетками миеломы Sp2/0. Среда дл  культивировани : D MEM с 10% СПК. Схема пассировани :.один раз в течение 4-5 дней in vitro. В виде асцита клетки перевивают в течение 8-10 пассажей . Концентраци  МКА в культуральной жидкости на 7-й день культивировани  составл ет 40 мкг/мл, а в асцитной - 5-8 мг/мл. С помощью ИФА при использовании полученных МКА вы вл ют 30 пкг гормона/мл .

Description

Изобретение относитс  к биотехнологии и может быть использовано дл  определени  инсулина.

Известно большое количество гибридом , продуцирующих моноклональные антитела к инсулину. Однако значительна  часть гибридом синтезирует моноклональные антитела к инсулину быка, которые со значительно меньшим сродством взаимодействуют с инсулином человека, или к инсулину человека, которые менее эффективно взаимодействуют с гормоном другой видовой принадлежности. Наиболее широко используют инсулин свиньи. Это обусловлено тем, что инсулин свиньи отличаетс  от инсулина человека только одним аминокислотным остатком, что снижает веро тность побочных реакций при терапевтическом лечении.

Поэтому дл  иммунодиагностики, а также регул рного определени  концентраций инсулина необходимы препараты монокло- нальных антител, способные в одинаковой степени хорошо взаимодействовать как с инсулином свиньи, так и с инсулином человека .

Наиболее близок к предложенному штамм гибридных клеток, синтезирующий моноклональные антитела к инсулину свиньи (1), обозначенный как 5Н. 1В. 10D. Однако данные антитела не взаимодействуют с инсулином человека.

Цель изобретени  - получение штамма гибридных культивируемых клеток мыши, используемого дл  получени  монокло- нальных антител с более высокой константой афинности, взаимодействующих с инсулином человека, на основе которых может быть создан высокочувствительный ди- агностикум дл  определени  инсулина.

Штамм получают следующим образом.

В качестве иммуногена используют препарат инсулина свиньи. 4-недельных мышей линии Balb/c иммунизируют в течение мес ца 3 раза 30 мкг инсулина. При первой инъекции раствор инсулина суспендируют в равном обьеме адъюванта Фрейнда, последующие инъекции провод т без него. Титр антител в сыворотке крови животных, определ емый методом ELISA, 1:15000. Зачеты- ре дн  до сли ни  мышей иммунизируют раствором инсулина в физиологическом растворе. Через 4 дн  у мыши в стерильных услови х извлекают селезенку, гомогенизируют в физиологическом растворе, содержащем 10% глюкозы, и оставл ют сто ть 3 мин. Грубый осадок отбрасывают а взвесь клеток перенос т в центрифужный стакан и центрифугируют 8 мин при 800 об/мин. Надосадочную жидкость отбрасывают, а осадок суспендируют в 50 мл физиологического раствора. Повторно центрифугируют в тех же услови х. Эту операцию повтор ют дважды. Аналогичным образом трижды промывают физиологическим раствором клетки миеломы линии Sp2/0. затем спленоциты смешивают с клетками миеломы в соотношении 10:1 и осаждают центрифугированием . Надосадочную жидкость сливают и к осадку медленно по капл м добавл ют 1 мл 50%-ного полиэтиленгликол  в физиологическом растворе, содержащего 10% диме- тилсульфоксида. Через 3 мин медленно в течение 5 мин добавл ют физиологический раствор, содержащий глюкозу, до объема 50 мл, Клетки осаждают центрифугированием и осадок суспендируют .в среде Игла, модифицированной Дульбекко (ДМЕМ), содержащий 10% сыворотки плода коровы (СПК) скота, 3,5 мМ глутамина, 17,5 мкМ пирувата натри , 50 мкМ 2-меркаптозтано- ла, 100 мкМ гипоксантина, 16 мкМ тимиди- на, 0,4 мкМ аминоптерина. Клетки распредел ют в п ти 96-луночных панел х дл  микротитровани  (Dynatech) и культивируют в С02-термостате при 37°С и содержании в атмосфере 5% С02. Через 5 дней клетки подкармливают, убира  из каждой лунки 50 мкл среды и добавл   50 мкл свежей. Через 2 недели после начала сли ни  тестируют культуральную жидкость на моноклональные антитела методом ELISA. Гибридомы, положительные по результатам тестировани , помещали в среду, содержащую все указанные компоненты, за исключением аминоптерина (НТ-среда). Клетки наращивают в 24-луночных панел х дл  микротитровани , часть клеток замораживают , а остальные трижды клонируют в полужидком агаре. Клонирование гибридо- мы повтор ли трижды. Клонированную гиб- ридому 6Е 6G 2А перевивают на мышах Balb/c дл  получени  асцитной жидкости.

Полученный штамм гибридных клеток продуцирующий моноклональные антитела к общим антигенным детерминантам инсулина человека и свиньи, депонирован в спе0 циализированой коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных Всесоюзной коллекции клеточных культур Института цитологии АН СССР под № ВСКК (П) 420 Д и характеризуетс  следующими признаками.

5 Культуральные свойства. Дл  выращивани  штамма используют культуральные флаконы. Во флакон с 3 мл среды DMEM, содержащей 10% СПК, 3,5 мМ глютамина, 17,5 мкМ пирувата натри  и 50 мМ 2-меркап0 тоэтанола, засевают 250000 клеток гибридо- мы 6Е. 6G. 2А и провод т пассировани  1 раз в 4-5 дней с подсчетом клеток. Дл  получени  асцита мышам BALB/c за 7 дней во введени  гибридомных клеток в/б ввод т

5 0,5 мл 2,6,10,14-тетраметилпентадекана. На 7 день животным в/б инъецируют по 500000 клеток, Асцитную жидкость собирают на 12- 14 день. Объем асцита 5-6 мл. Клетки из асцита перевивают в течение 8-10 пассажей

0 без заметного изменени  титра монокло- нальных антител васцитной жидкости.

Характеристика полезного продукта. Моноклональные антитела относ тс  к lgG2a. Константа аффинности .

5 Кариологическа  характеристика штамма: Модальное число хромосом 80. Маркерных хромосом не вы влено.

Продуктивность штамма. Концентраци  моноклональных антител в культуральной

0 жидкости на 7-ой день культивировани  40 мкг/мл в асцитной жидкости 5-8 мг/мл при определении по методу Лоури и с помощью ELISA.

Криоконсервирование. Клетки штамма

5 ресуспендируют в смеси, содержащей 10% ДМСО, 30% СПК и 60% среды ДМЕМ, в концентрации 1х606 клеток на 1 мл. разливают при 4°С в пластиковые ампулы, помещают в полиуретановые контейнеры и

0 перенос т в холодильник (-70)°С на 18 ч. Затем клетки перенос т в жидкий азот на длительное хранение. Размораживают при 37°С в вод ной бане. Жизнеспособность клеток оценивают путем окрашивани  три5 Пановым синим: она составл ет 60%.

Контаминаци , При длительном наблюдении бактерии и грибы в культуре не обнаружены . Тест на микоплазму отрицателен. Пример 1. Моноклональные. антитела используют дл  определени  концентрации

инсулина методом иммуноферментного анализа. В 96-луночные полистироловые панели дл  микротитровани  помещают 100 мкл (10 мкг/мл) раствора моноклональных антител в 0,1 М карбонатном буфере, рН 9,0, и инкубируют 2 ч. Затем в каждую лунку добавл ют 0,1% бычий сывороточный альбумин (БСА) в том же буфере и инкубируют 2 ч. Лунки промывают 0,015 М фосфатным буфером, рН 7,4, содержащим 0,15 М NaCI и 0,05% твин-20 (ФБТ). К адсорбированным -на полистироле моноклональным антителам добавл ют 100 мкл раствора, содержащего исследуемый образец инсулина и конъюгат инсулина с ковалентно пришитой к нему пероксидазой в ФБТ. В контрольные лунки помещают аналогичный образец, но не содержащий инсулин. Инкубируют 1 ч при 37°С. Промывают ФБТ и добавл ют в каждую лунку субстратную смесь: 0,03% Н202, 2 мМ ABTS (2,2-азинодиэтилбензоти- озолин-6)-сульфонова  кислота, 0,05М цит- ратный буфер рН 4,0. Оптическую плотность определ ют при 412 нм на специальном автоматическом устройстве. Концентрацию инсулина вычисл ют по построенной в параллельном эксперименте калибровочной кривой, полученной как описано выше, добавл   в лунки панелей известные концентрации инсулина.

Чувствительность определени  инсулина 30 пкг гормона/мл. Специфичность взаимодействи  моноклональных антител с инсулином оценивают методом конкурентного иммуноферментного анализа в следующей системе. К моноклональным антителам, адсорбированным на полистироле , добавл ют инсулин свиньи, меченный пероксидазой, а также немеченый инсулин человека и быка. Специфичность моноклональных антител оценивают по проценту ингибировани  св зывани  конъюгата инсулин-пероксидаза, немеченым инсулином свиньи в качестве конкурирующего агента.

0

5

Моноклональные антитела 6E.6G.2A одинаково эффективно взаимодействуют с инсулином человека и свиньи, однако дл  ингибировани  св зывани  конъюгата инсулин свиньи-пероксидаза на 50% требуютс  в 10 раз более высокие концентрации инсулина быка, чем немеченого инсулина свиньи и человека. Таким образом, полученные моноклональные антитела могут быть использованы дл  количественного определени  инсулина человека.

П р и м е р 2. Моноклональные антитела 6E.6G.2A могут быть использованы дл  обнаружени  инсулина методом блоттинг-гиб- ридизации. На нитроцеллюлозную

мембрану нанос т 10 - М инсулина, растворенного в 0,15 М ФБР, инкубируют 1 ч при 37°С, а затем 1 ч в 20%.СПК. После этого отмывают в растворе ФБРТ, и нитро0 целлюлозную мембрану помещают в рас- твор, содержащий моноклональные антитела к инсулину, растворенные в концентрации 0,01 мг/мл в ФБРТ. Инкубируют 1 ч при 37°С 1 ч, затем отмывают ФБРТ.

5 Затем нитроцеллюлозную мембрану помещают в ФБРТ, содержащий конъюгат кроличьих Ig к антителам, мыши, меченных пероксидазой (в концентрации 2 мкг/мл по пероксидазе). После отмывани  ФБРТ до0 бавл ют субстрат диаминобензидин (2 мг/мл) в 0,1 М фосфатном буфере рН 7,2, содержащем 0,2% CoCte 2,6 мМ НзОа. О результатах реакции суд т по по влению окрашенного нерастворимого продукта ре5 акции в местах локализации иммунофер- ментных комплексов.

Claims (1)

1. Формула изобретени 

   Штамм гибридных культивируемых клеток Mus musculus L ВСКК (П) Ms 420Д, используемый дл  получени  моноклональных антител к общим антигенным детерминантам инсулина человека и свиньи.